CN1784493B - 修饰的β-内酰胺酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
希望有一种能针对一组不同的β-内酰胺类抗生素筛选细菌以鉴定β-内酰胺酶的工具。一种将指示分子导入β-内酰胺酶而形成的生物传感器可达到该目的,但要求导入的指示分子基本上不会削弱蛋白质结合的亲和力,以保证较高的灵敏度。本发明研发了一种经修饰的β-内酰胺酶,该β-内酰胺酶的Ω环上或Ω环的外侧但接近其活性部位的残基被活性残基置换。
Description
技术领域
本发明涉及经修饰的Beta-内酰胺酶(β-内酰胺酶),其可用于检测β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂,和/或针对一组β-内酰胺类抗生素筛选细菌以鉴定β-内酰胺酶。
背景技术
β-内酰胺类抗生素(如青霉素和头孢菌素)是一类广泛用于临床治疗的重要抗菌剂,并可在动物饲料中用作健康促进剂。β-内酰胺类抗生素的临床功能是基于它们对产生合成细菌细胞壁作用的青霉素结合蛋白的活性有抑制功能。然而,β-内酰胺类抗生素的临床疗效已经由于β-内酰胺酶的存在而面临挑战,因为β-内酰胺酶会使β-内酰胺类抗生素中的β-内酰胺环水解成羧酸而丧失抗菌活性。为了解决这一临床问题,制药工业已经生产出各种β-内酰胺类抗生素(对β-内酰胺酶引起的水解作用具有较强的抗性)和新型的β-内酰胺酶抑制剂(它们通过共价修饰而会不可逆地封闭酶的活性部位)。为了能迅速地从大量的候选药物中寻找具有潜质的抗生素,希望有一种能针对各种β-内酰胺类抗生素筛选细菌以鉴定β-内酰胺酶的简便手段。而且能够检测β-内酰胺酶抑制剂和β-内酰胺类抗生素的灵敏手段也是很有用的。这一手段可用于β-内酰胺类抗生素和新型β-内酰胺酶抑制剂的发现,并可用于液态食品试样(如牛奶)中抗生素残留的常规测定。
发明目的
本发明的目的是解决上述现有技术中存在的至少一个或多个问题。就最低限度来说,本发明的目的是为公众提供一种适用的选择。
发明概述
因此,本发明提供了其中的非活性残基已被活性残基置换的β-内酰胺酶。
优选地,活性残基选自含游离醇基团的氨基酸、含游离羧酸基团的氨基酸或含游离胺基团的氨基酸。更优选的是,活性残基为半胱氨酸。
优选的是,非活性残基位于所述β-内酰胺酶的Ω环上。
优选的是,活性残基还进一步与指示分子反应以产生检测β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂的信号。更优选的是,该指示分子是荧光团。
任选的是,非活性残基为Glu-166残基。
优选的是,β-内酰胺酶是突变体。更优选的是,该β-内酰胺酶是单突变的突变体。或者,该β-内酰胺酶是多重突变的突变体。例如,在一个具体的实施方案中,该β-内酰胺酶是E166C突变体。
本发明的第二个方面提供一种检测试样中β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂的方法,该方法包括如下步骤:
-将试样与其中Ω环上的非活性残基已被活性残基置换的β-内酰胺酶相接触,以使所述β-内酰胺酶与所述β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂相结合;
-检测由已与所述β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂相结合的β-内酰胺酶发出的信号。
优选的是,本发明方法还包括将已与所述β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂相结合的β-内酰胺酶发出的信号与由不含β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂的对照试样中的β-内酰胺酶发出的信号作比较的步骤。
本发明的另一个方面是提供一种检测已加入了其中Ω环上的非活性残基已被活性残基置换的β-内酰胺酶的试样中β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂的装置。
附图说明
本发明的优选实施方案将通过实施例和参考以下附图进行说明:
图1所示的是β-内酰胺酶I的三级结构;
图2所示的是(A)E166C突变体和(B)E166Cf突变体的电喷雾电离(ESI)质谱;
图3所示的是浓度相同(6.0×10-6摩尔/升(M))的野生型β-内酰胺酶I、E166C突变体和E166Cf突变体在50毫摩尔/升(mM)磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的圆二色性光谱(CD谱);
图4所示的是在1.0×10-4摩尔/升青霉素G(a)、1.0×10-5摩尔/升青霉素G(b)、1.0×10-6摩尔/升青霉素G(c)、1.0×10-7摩尔/升青霉素G(d)、1.0×10-8摩尔/升青霉素G(e)和0摩尔/升青霉素G(f)的存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的荧光光谱。在测定前,E166Cf酶在室温与不同浓度的青霉素G温育130秒钟。激发波长:494纳米;
图5所示的是在1.0×10-4摩尔/升青霉素G(a)、1.0×10-5摩尔/升青霉素G(b)、1.0×10-6摩尔/升青霉素G(c)、1.0×10-7摩尔/升青霉素G(d)和1.0×10-8摩尔/升青霉素G(e)的存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在515纳米处的时间分辨(Time-resolved)荧光测定结果。激发波长:494纳米。插图所示为荧光强度(在最大峰值处)随log(青霉素G,摩尔/升)的变化曲线;
图6所示的是在1.0×10-4摩尔/升青霉素V(a)、1.0×10-5摩尔/升青霉素V(b)、1.0×10-6摩尔/升青霉素V(c)、1.0×10-7摩尔/升青霉素V(d)和1.0×10-8摩尔/升青霉素V(e)的存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在515纳米处的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米。插图所示为荧光强度(在最大峰值处)随log(青霉素V,摩尔/升)的变化曲线;
图7所示的是在1.0×10-4摩尔/升氨苄青霉素(a)、1.0×10-5摩尔/升氨苄青霉素(b)、1.0×10-6摩尔/升氨苄青霉素(c)、1.0×10-7摩尔/升氨苄青霉素(d)和1.0×10-8摩尔/升氨苄青霉素(e)的存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在515纳米处的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米。插图所示为荧光强度(在最大峰值处)随log(氨苄青霉素,摩尔/升)的变化曲线;
图8所示的是在1.0×10-4摩尔/升头孢呋辛(a)、1.0×10-5摩尔/升头孢呋辛(b)、1.0×10-6摩尔/升头孢呋辛(c)、1.0×10-7摩尔/升头孢呋辛(d)和1.0×10-8摩尔/升头孢呋辛(e)的存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在515纳米处的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米。插图所示为荧光强度(在最大峰值处)随log(头孢呋辛,摩尔/升)的变化曲线;
图9所示的是在1.0×10-4摩尔/升头孢西丁(a)、1.0×10-5摩尔/升头孢西丁(b)、1.0×10-6摩尔/升头孢西丁(c)和1.0×10-7摩尔/升头孢西丁(d)的存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在515纳米处的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米。插图所示为荧光强度(在最大峰值处)随log(头孢西丁,摩尔/升)的变化曲线;
图10所示的是在1.0×10-4摩尔/升拉他头孢(moxalactam)(a)、1.0×10-5摩尔/升拉他头孢(b)、1.0×10-6摩尔/升拉他头孢(c)、1.0×10-7摩尔/升拉他头孢(d)和1.0×10-8摩尔/升拉他头孢(e)的存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在515纳米处的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米。插图所示为荧光强度(在最大峰值处)随log(拉他头孢,摩尔/升)的变化曲线;
图11所示的是在未经标记的E166C酶(1.2×10-7摩尔/升)的存在下,分别以(A)1.0×10-5摩尔/升青霉素G、(B)1.0×10-5摩尔/升青霉素V、(C)1.0×10-5摩尔/升氨苄青霉素、(D)1.0×10-5摩尔/升头孢呋辛、(E)1.0×10-5摩尔/升头孢西丁和(F)1.0×10-5摩尔/升拉他头孢作为底物,游离荧光素(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中发射512纳米荧光的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米;
图12所示的是在1.0×10-6摩尔/升青霉素G(a)和1.0×10-7摩尔/升青霉素G(b)的存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在515纳米处的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米;
图13所示的是在1.0×10-4摩尔/升青霉素G(a)和1.0×10-5摩尔/升青霉素G(b)的存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在515纳米的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米;
图14所示的是在1.0×10-4摩尔/升头孢西丁(a)和1.0×10-6摩尔/升头孢西丁(b)的存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中发射515纳米荧光的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米;
图15所示的是在E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)的存在下,头孢呋辛在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的圆二色信号(258纳米)随时间的变化函数;
图16所示的是在E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)的存在下,头孢西丁在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的圆二色信号(264纳米)随时间的变化函数;
图17所示的是在E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)的存在下,拉他头孢在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的圆二色信号(265纳米)随时间的变化函数;
图18所示的是E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在以1.0×10-4摩尔/升的舒巴坦(sulbactam)作为底物的50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在515纳米处的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米;
图19所示的是E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在以1.0×10-3摩尔/升的克拉雏酸盐(clavulanate)作为底物的50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在515纳米处的时间分辨荧光测定结果。激发波长:494纳米;
图20所示的(A)是96孔微量滴定板(Corning Costar),(B)是用于在牛奶及药物筛选实验中测定β-内酰胺类抗生素的设置简图;
图21所示的是在1.0×10-4摩尔/升青霉素G(a)、1.0×10-5摩尔/升青霉素G(b)、1.0×10-6摩尔/升青霉素G(c)、1.0×10-7摩尔/升青霉素G(d)的存在下和没有青霉素G(e)存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在未经处理的牛奶中在520纳米处的时间分辨荧光测定结果。激发波长:485纳米。插图所示为荧光强度(在最大峰值处)随log(青霉素G,摩尔/升)的变化曲线;
图22所示的是在1.0×10-4摩尔/升氨苄青霉素(a)、1.0×10-5摩尔/升氨苄青霉素(b)、1.0×10-6摩尔/升氨苄青霉素(c)、1.0×10-7摩尔/升氨苄青霉素(d)的存在下和没有氨苄青霉素(e)存在下,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在未经处理的牛奶中在520纳米处的时间分辨荧光测定结果。激发波长:485纳米。插图所示为荧光强度(在最大峰值处)随log(氨苄青霉素,摩尔/升)的变化曲线;
图23所示的是在没有β-内酰胺酶II(a)和β-内酰胺酶II存在(b)的情况下,分别以(A)青霉素G(1.0×10-4摩尔/升)、(B)青霉素V(1.0×10-4摩尔/升)、(C)氨苄青霉素(1.0×10-4摩尔/升)、(D)头孢呋辛(1.0×10-4摩尔/升)、(E)头孢西丁(1.0×10-4摩尔/升)和(F)拉他头孢(1.0×10-4摩尔/升)作为底物,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的时间分辨荧光测定结果。激发波长:485纳米;
图24所示的是在没有penPCβ-内酰胺酶(a)和penPCβ-内酰胺酶存在(b)的情况下,分别以(A)青霉素G(1.0×10-4摩尔/升)、(B)青霉素V(1.0×10-4摩尔/升)、(C)氨苄青霉素(1.0×10-4摩尔/升)、(D)头孢呋辛(1.0×10-4摩尔/升)、(E)头孢西丁(1.0×10-4摩尔/升)和(F)拉他头孢(1.0×10-4摩尔/升)作为底物,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的时间分辨荧光测定结果。激发波长:485纳米;
图25所示的是在没有penPβ-内酰胺酶(a)和penPβ-内酰胺酶存在(b)的情况下,分别以(A)青霉素G(1.0×10-4摩尔/升)、(B)青霉素V(1.0×10-4摩尔/升)、(C)氨苄青霉素(1.0×10-4摩尔/升)、(D)头孢呋辛(1.0×10-4摩尔/升)、(E)头孢西丁(1.0×10-4摩尔/升)和(F)拉他头孢(1.0×10-4摩尔/升)作为底物,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的时间分辨荧光测定结果。激发波长:485纳米;
图26所示的是在没有TEM-1β-内酰胺酶(a)和TEM-1β-内酰胺酶存在(b)的情况下,分别以(A)青霉素G(1.0×10-4摩尔/升)、(B)青霉素V(1.0×10-4摩尔/升)、(C)氨苄青霉素(1.0×10-4摩尔/升)、(D)头孢呋辛(1.0×10-4摩尔/升)、(E)头孢西丁(1.0×10-4摩尔/升)和(F)拉他头孢(1.0×10-4摩尔/升)作为底物,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的时间分辨荧光测定结果。激发波长:485纳米。
优选实施方案详述
下面通过实施例并参照附图对本发明进行说明。
本发明的目的、特征和内容已公开在下述说明书中,或者根据以下说明是显而易见的。本领域的普通技术人员都会理解,本文所讨论的只是例证性实施方案的说明,不是对本发明宽泛内容的限制,这些宽泛内容体现在例证性阐述中。
达到上述目的的一种方法是通过将报告基团或指示分子(如荧光探针)导入生物分子(如β-内酰胺酶或任何青霉素结合蛋白)中来研制一种生物传感器,其中报告基团能使底物或抑制剂-结合事件转变成可测量的信号。可通过采用定点诱变将活性残基(如含巯基的半胱氨酸)引入蛋白质中,然后用指示分子(如巯基活性的报告基团)对半胱氨酸残基进行标记来实现。这类生物传感器具有包括高灵敏度、高特异性、简单性和低成本的许多优点。然而,这种方法要求导入的指示分子基本上不会削弱蛋白质的结合亲和力以保证较高的灵敏度。
β-内酰胺酶的结构和氨基酸序列可分别在下列文献1-5中找到:
1.Madgwick,P.J.and Waley,S.G.β-lactamase I from Bacillus cereus.Structure and site-directed mutagenesis(1987)Biochem.J.248,657-662.
2.Aschaffenburg,R.,Phillips,D.C,Sutton,B.J.,Baldwin,G.,Kiener,P.A.,Waley,S.G.Preliminary crystallographic data forβ-lactamase Ifrom Bacillus cereus 569.(1978)J.Mol.Biol.120,447-449.
3.Samraoui,B.,Sutton,B.J.,Todd,R.J.,Artymiuk,P.J.,Waley,S.G.,Phillips,D.C.Tertiary structural similarity between a class Aβ-lactamase and a penicillin-sensitive D-anlanylcarboxypeptidase-transpeptidase.(1986)Nature 320,378-380.
4.Moews,P.C.,Knox,J.R.,Dideberg,O.,Charlier,P.,Frere,J.M.,β-lactamase Bacillus licheniformis 749/C atresolution.(1990)Proteins 7,156-171.
5.Ambler,R.P.;Coulson,A.F.W,Frére,J.-M.;Ghuysen,J.-M.;Joris,B.;Forsman,M.;Levesque,R.C.;Tiraby,G.;Waley,S.G.A standardnumbering scheme for the Class Aβ-lactamase,(1991),Biochem.J.276,269-272.
在本发明中,通过将指示分子结合在靠近β-内酰胺酶的活性部位而提供了一种用于检测β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂的生物传感器。在本发明的具体实施方案中,指示分子是对环境敏感的荧光素分子,β-内酰胺酶是突变体。突变体(E166C)是通过野生型β-内酰胺酶I的Ω环上的残基被活性残基所置换的定点诱变而构建的。该活性残基可以是任何具有能与指示分子反应的游离官能团的残基。例如,可采用含游离醇基团的氨基酸如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。这些氨基酸可以用水杨醛进行衍生,进而可与荧光试剂如1,2-二氨基-4,5-二甲氧基苯偶联。也可以采用含游离羧酸基团的氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸,这些氨基酸可与能与荧光试剂反应的碳二亚胺相偶联,或者可与含荧光团的碳二亚胺相偶联。还有一种选择是采用含游离胺基团的氨基酸如赖氨酸,该氨基酸可与异硫氰酸酯或琥珀酰亚胺基酯(succinimidyl ester)相偶联。
在一个具体的实施方案中,被置换的残基是Glu-166残基(根据ABL编号系统,参考文献5),活性残基是半胱氨酸残基。然后,用指示分子对突变体进行标记,在一个具体的实施方案中,用具有巯基活性的荧光素-5-马来酰亚胺对突变体的活性残基即半胱氨酸残基进行标记,从而形成本发明具体的经修饰的β-内酰胺酶E166Cf。
应该强调的是,本发明不限于所构建的E166Cf。虽然优选的是Glu166残基,野生型β-内酰胺酶Ω环上将被置换的残基可以是处于不同部位上的残基,包括Asn163、Arg164、Phe165、Glu166、Thr167、Glu168、Leu169、Asn170、Glu171、Ala172、Ile173、Pro174、Gly175、Asp176、Ile177、Arg178。此外,也可采用位于Ω环外侧但接近活性部位的残基,如Ser70、Lys73、Asp104、Ser130和Lys234。β-内酰胺酶可以是野生型β-内酰胺酶或其突变体,不管是单突变或经多重突变的突变体,其中单突变的突变体只含有一个氨基酸取代,而多重突变的突变体包含一个以上的氨基酸取代。此外,指示分子可以是任何其它能发射除荧光信号外的可检测信号的分子。然而,能发射荧光信号的荧光团对酶结构的影响较小。
就特定的E166Cf来说,由于野生型β-内酰胺酶I不含半胱氨酸,因而将半胱氨酸残基导入蛋白质能使荧光团被特异性地结合在所希望的位置。选择Glu-166残基作为标记部位,不仅是由于它接近酶的活性部位,而且还由于Ω环的柔性,因而在底物进入活性部位时结合的荧光素分子可发生移动。因此,E166Cf突变体可作为检测β-内酰胺类抗生素的高灵敏、特异性无试剂工具。此外,由于标记酶(E166Cf)与细菌的β-内酰胺酶之间对底物的竞争会改变抗生素浓度(例如抗生素浓度由于细菌β-内酰胺酶引起的水解作用而降低),因此会产生不同的荧光信号,从而使标记酶可简便地用于药物的筛选,为被细菌感染的病人选择最适用的β-内酰胺类抗生素。
下面将对E166Cf的合成及其在检测β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂方面,和/或针对一组β-内酰胺类抗生素筛选细菌以鉴定β-内酰胺酶方面的应用进行详细的说明。然而,由于对上述修饰的β-内酰胺酶的设计存在各种选择,因此对下述方法可能有必要作适当的修改,这对本领域的技术人员是容易做到的。
按照以前所述(参考文献6:Leung,Y.C.Robinson,C.V.,Alpin,R.T.,Waley,S.G.,Site-directed synthesis ofβ-lactamase I:role of Glu-166(1994)Biochem.J.299,671-678)并稍作修改,对野生型β-内酰胺酶I和E166C突变体进行表达和纯化。将野生型β-内酰胺酶I和E166C突变体在枯草芽孢杆菌1A304(φ105MU331)中进行表达。以划线方式将菌株接种在含5微克/毫升氯霉素的琼脂培养板上,然后将培养板在37℃下培养24小时。其后将琼脂培养板上培养的单个菌落接种在100毫升经灭菌的、含5微克/毫升氯霉素的BHY培养基(37克/升脑心浸液和5克/升酵母提取液)中,以每分钟300转的转速于37℃振荡培养过夜。各取约2毫升培养过夜的接种液添加到四个各含100毫升经灭菌的BHY培养基的锥形瓶中,然后将该经接种的培养基以每分钟300转的转速于37℃振荡培养。当OD600达到3.5-4.0时,将该细菌培养物在51℃的水浴中加热5分钟,然后以每分钟300转的转速于37℃再振荡培养6小时。在4℃经离心分离(每分钟9000转)25分钟后,收集细菌培养液的上清液,用浓HCl调节pH值至7.0。将该上清液与40克硅藻土545在冰浴中混合30分钟提取β-内酰胺酶。弃去上清液后,用300毫升去离子水洗涤硅藻土3-4次。通过将硅藻土与100毫升蛋白质洗脱缓冲液(100毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)、2摩尔/升NaCl和100毫摩尔/升柠檬酸三钠,pH7.0)混合三次来收集β-内酰胺酶。抽吸过滤蛋白质溶液,然后采用装有一片YM-1膜(MWCO=1000)的浓缩器(Amico),在4℃将该蛋白质溶液浓缩至10毫升。将经浓缩的蛋白质溶液与20毫摩尔/升NH4HCO3进行交换,然后进行冷冻干燥。酶粉在-80℃下贮存。通过上述步骤可获得约15毫克的野生型β-内酰胺酶I和20毫克的E166C突变体。
蛋白质的标记
将约2.5毫克E166C突变体溶于4毫升6M盐酸胍中。在室温下,将该蛋白质溶液温育30分钟以使突变体解折叠。将溶于二甲亚砜中的过量10倍摩尔量的荧光素-5-马来酰亚胺(购自Molecular Probes)添加到蛋白质溶液中,并用0.2摩尔/升的NaOH将所得到混合物的pH值调整至7.5。在暗处和室温下搅拌该混合物2小时,然后用透析管(MWCO=12000)和逆向流动的1升20毫摩尔/升的NH4HCO3缓冲液(pH7.0),在4℃对混合物透析3天以除去游离染料。透析期间缓冲液应定时更换。透析完毕后,对经标记的突变体(E166Cf)进行冷却干燥并在-80℃贮存。
E166Cf酶的表征
E166Cf突变体的荧光素-5-马来酰亚胺标记可由电喷雾电离质谱法(ESI/MS)进行监控。质谱测定是在配备有电喷雾界面的VG Platform质谱仪(Micromass)上进行的。用环形注射器将蛋白质样品(20微升)以含甲酸(0.2%,体积/体积)的H2O/CH3CN(1∶1)溶液注入电喷雾源中。E166C突变体与E166Cf突变体之间的质量差(图2)与荧光素-5-马来酰亚胺的分子质量(MW=427)加上钠离子的质量相一致。E166Cf酶的质谱显示,几乎所有E166C突变体已被荧光素分子进行了标记。
野生型β-内酰胺酶I、E166C和E166Cf的二级结构是通过圆二色性(CD)旋光分光法进行研究的。CD测定是在Jasco J810旋光分光计(JascoCo.)上进行的。相同浓度(6.0×10-6摩尔/升)的野生型β-内酰胺酶I、E166C突变体和E166Cf突变体在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的远紫外区的CD谱如图3所示。CD信号显示,两者没有明显的区别,这表明E166Cf酶仍保持了荧光素标记前的二级结构。
野生型β-内酰胺酶I、E166C突变体和E166Cf突变体对青霉素G、青霉素V和氨苄青霉素(Sigma)的水解活性是通过分光光度法来监控的。分光光度测定是在Perkin Elmer Lambda Bio20UV/Vis分光光度计上进行的。以固定波长实施对底物水解的监控:氨苄青霉素:235纳米;青霉素G和青霉素V:232纳米。以两个重复,于20℃测定在50毫摩尔/升磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的六个不同浓度的底物在5分钟内发生底物水解的起始速率。然后将测得的起始速率按参考文献5所述进行处理,对方程(1)进行非线性回归分析,计算米氏常数(Km)和转换数(kcat)
其中v是底物水解的起始速率,Vmax为最大反应速率,[S]为起始底物浓度,Km为米氏常数,kcat=Vmax/[酶]。
测得的由野生型β-内酰胺酶I、E166C突变体和E166Cf突变体引起青霉素G、青霉素V和氨苄青霉素的水解的稳态动力学参数汇总于表1。表中结果显示,经荧光素标记后的标记酶保持了其水解活性。
表1
在青霉素类抗生素和头孢菌素类抗生素的存在下,E166Cf酶的荧光测定
在青霉素G、青霉素V、氨苄青霉素、头孢呋辛、头孢西丁和拉他头孢的存在下,E166Cf酶的荧光测定是在Perkin Elmer LS50B分光光度计上进行的。对于时间分辨荧光测定来说,激发波长和发射波长分别设定为494纳米和515纳米。激发和发射的狭缝宽度都设定为5纳米。所有荧光测定都在室温下进行。
以青霉素G作为底物,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的515纳米荧光信号随抗生素浓度的增加而增强(图4)。也测定了以各种浓度青霉素G为底物时,E166Cf酶在515纳米处的时间分辨荧光信号(图5)。在低抗生素浓度(1.0×10-7和1.0×10-6摩尔/升)时,E166Cf酶的荧光强度随时间逐渐增强至最大,然后逐渐下降。在高抗生素浓度(1.0×10-5和1.0×10-4摩尔/升)时,荧光信号瞬时增强并形成平顶。荧光信号平稳保持一定时间后逐渐下降。对青霉素V和氨苄青霉素也得到类似的结果(图6和图7)。
以头孢呋辛、头孢西丁和拉他头孢作为底物,E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的515纳米荧光强度也随抗生素浓度的增加而增强(图8-10)。由图可见,E166Cf酶的荧光信号随抗生素浓度的增加而增强,甚至在1小时后也没有观察到信号强度的下降。
由于已知荧光素的荧光强度会随pH值而变化,因此对于观察到的荧光强度变化是否是基于抗生素被标记酶水解而导致的pH值变化所引起的也进行了研究。首先,已知荧光素的荧光强度在pH值降低时是下降的,因此,在抗生素存在下,观察到的荧光强度的增强与由于酶的水解作用而产生了羧酸是不相符的。对于青霉素G(1.0×10-5摩尔/升)来说,在水解完成后,通过pH电极监控的大量磷酸盐缓冲液的pH值总的变化小于0.5pH单位。在未经标记的E166C酶(1.2×10-7摩尔/升)存在下,测定游离荧光素(1.2×10-7摩尔/升)分别与青霉素G、青霉素V、氨苄青霉素、头孢呋辛、头孢西丁和拉他头孢(1.0×10-5摩尔/升)在50毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的荧光强度,虽然E166C酶正在水解青霉素抗生素(数据未示出),但整个实验中荧光强度几乎不变(图11)。而且,已知是E166C酶的不良底物的头孢菌素类抗生素也能增强荧光信号。因此,由于大量溶液的pH值改变而引起E166Cf酶的荧光信号增强的可能性可被排除。此外,由于在酶的活性部位局部pH值改变而观察到荧光信号变化的可能性也可被排除,这是因为在活性部位的这种pH值变化需耗时几百秒至几千秒(如时间分辨荧光测定图所示)是不可能的。
虽然不受任何理论所束缚,但可认为,观察到的荧光信号是由于与底物相结合而引起活性部位的构象改变所致。当活性部位与抗生素相结合时,结合在柔性Ω环上的荧光素标记可从催化袋(catalytic pocket)移出,以致荧光素标记与活性部位的猝灭剂(氨基酸)彻底分离。结果,荧光素分子的荧光得以复原。
在不同浓度的青霉素类和头孢菌素类抗生素的存在下,所得到的E166Cf酶的时间分辨荧光信号可由下述三步模式作合理解释:
其中E是游离β-内酰胺酶,S是β-内酰胺底物,ES是非共价酶-底物复合物,ES*是酰基-酶复合物,P是羧酸。
在低底物浓度(1.0×10-7摩尔/升和1.0×10-6摩尔/升)情况下,E166Cf酶(E)与青霉素底物(S)间的结合会导致ES复合物的形成,因而会增强荧光信号。当抗生素进行水解时,大部分青霉素底物转变成游离羧酸(P)。因此,大部分E166Cf酶回复到它们的无底物构象(E),从而也回复到原来的弱荧光信号(图12)。这就可解释荧光信号达到峰值后会随时间而缓慢下降。
在高底物浓度(1.0×10-5摩尔/升和1.0×10-4摩尔/升)情况下,青霉素底物会迅速占据活性部位而形成ES复合物,从而立即启动荧光素标记的荧光。由于抗生素浓度高,抗生素连续水解仍会使E166Cf酶处于ES*状态一段时间,因此荧光信号趋于平稳形成平顶(图13)。这可从“平顶时间”(对于浓度为1.0×10-5摩尔/升和1.0×10-4摩尔/升的青霉素G分别为8分钟和22分钟)与由分光光度分析测得的“底物水解时间”(对于浓度为1.0×10-5摩尔/升和1.0×10-4摩尔/升的青霉素G分别为7分钟和20分钟)相符合的事实得到证实。当大部分青霉素底物已水解成羧酸时,标记酶的荧光信号会随着下降。
对头孢呋辛、头孢西丁和拉他头孢来说,没有观察到荧光信号下降现象,这可归因于E166Cf酶对这些抗生素的水解活性很低(很低的k2和/或k3)(图14)。因此头孢菌素类底物滞留在活性部位。为了证实这一点,采用圆二色性(CD)旋光分光光度法对以头孢呋辛、头孢西丁和拉他头孢作为底物的标记酶的活性进行监控。这种检测方法的原理是基于β-内酰胺类抗生素中的稠合环体系具有不对称性,因而会呈现强的CD信号,但当它们受β-内酰胺酶的作用而发生水解时则会变成非CD旋光活性。因此,可通过在E166Cf酶(1.2×10-7摩尔/升)的存在下,分别测定在258、264和265纳米处头孢呋辛、头孢西丁和拉他头孢(1.0×10-4摩尔/升)的CD信号随时间的变化函数,来监控标记酶对于这些抗生素的水解活性。如图15-17所示,将E166Cf酶与头孢菌素类抗生素温育1小时后,CD信号未发生明显的变化。这一结果表明,头孢呋辛、头孢西丁和拉他头孢是耐标记酶水解活性的。
在β-内酰胺酶抑制剂的存在下E166Cf酶的荧光测定
用Perkin Elmer LS50B分光荧光计测定在舒巴坦和克拉维酸盐(clavulanate)存在下,E166Cf酶的时间分辨荧光信号,激发和发射波长分别设定为494纳米和515纳米。激发和发射的狭缝宽度都设定为5纳米。所有荧光测定都在室温下进行。
在50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中,分别以舒巴坦(1.0×10-4摩尔/升)和克拉维酸盐(1.0×10-3摩尔/升)为底物测得的标记酶(1.2×10-7摩尔/升)的荧光信号是完全不同的(图18和图19)。对舒巴坦来说,荧光强度在起始阶段迅速增强,然后缓慢下降。对克拉维酸盐来说,底物的添加促使荧光信号瞬时增强,并在200秒钟内迅速下降,然后趋向平稳。这些结果表明,E166Cf可用来检测β-内酰胺酶抑制剂。
牛奶中β-内酰胺类抗生素的检测
用配置有两个试样注射器的FLUOstar微量培养板读出器(BMGLabtechnologies)分别测定在青霉素G和氨苄青霉素存在下牛奶中E166Cf酶的荧光信号。分别采用485纳米激发滤光片和520纳米发射滤光片。牛奶(经巴氏消毒和均化,Nestle Dairy Farm)购自当地超级市场。将标记酶与牛奶试样在96孔微量滴定板(Corning Costar)中进行混合。然后用注射器将抗生素添加到混合物中。实验设置如图20所示。
图21和图22分别图示了在不同浓度的青霉素G和不同浓度的氨苄青霉素的存在下,未经处理牛奶中标记酶(1.2×10-7摩尔/升)的时间分辨荧光测定结果。结果表明,标记酶对青霉素G和氨苄青霉素的检测浓度可低至10-6摩尔/升。因此,标记酶可用于液体试样(如牛奶)中抗生素的常规测定。
E166Cf酶在针对一组β-内酰胺类抗生素筛选细菌以鉴定β-内酰胺酶
方面的应用
已对E166Cf酶在针对各种β-内酰胺类抗生素筛选细菌以鉴定β-内酰胺酶方面的应用作了研究。我们的方法原理是基于:当E166Cf、细菌的β-内酰胺酶与“β-内酰胺酶不稳定性的”抗生素一起温育时,由于细菌酶对该抗生素有较高的催化效率,因而E166Cf酶的荧光会受到抑制。反之,当针对“耐β-内酰胺酶”抗生素筛选细菌以鉴定β-内酰胺酶时,由于细菌酶对该抗生素的水解活性很低,因而E166Cf酶的荧光就会增强。因此,在细菌的β-内酰胺酶的存在下,能增强标记酶荧光强度的任何β-内酰胺类抗生素都可用于临床治疗。
在本发明中,对蜡状芽孢杆菌(B.cereus)pen PCβ-内酰胺酶、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)pen Pβ-内酰胺酶、大肠杆菌TEM-1β-内酰胺酶和蜡状芽孢杆菌β-内酰胺酶II进行了实验。其中蜡状芽孢杆菌β-内酰胺酶II归为B类β-内酰胺酶,而其它β-内酰胺酶归为A类β-内酰胺酶。
因此,我们的兴趣是研究标记酶是否可用于针对各种β-内酰胺类抗生素筛选不同类型的β-内酰胺酶。
细菌的β-内酰胺酶的制备
用于药物筛选实验的细菌的β-内酰胺酶是蜡状芽孢杆菌pen PCβ-内酰胺酶、地衣芽孢杆菌pen Pβ-内酰胺酶、大肠杆菌TEM-1β-内酰胺酶和蜡状芽孢杆菌β-内酰胺酶II。
将β-内酰胺酶II、pen PCβ-内酰胺酶和pen Pβ-内酰胺酶在枯草芽孢杆菌1A304(φ105MU331)中进行表达。这些酶是根据以前的程序(参考文献7:Thornwell,S.J.East,A.K.,Errington,J.An efficient expression and secretionsystem based on Bacillus subtilis phage phi 105 and its uses for the production forB.cereusβ-lactamase I.(1993)Gene 133,47-53)稍微修改制得的。以划线方式将菌株接种在含5微克/毫升氯霉素的琼脂平板上,将该琼脂平板在37℃培养24小时。从琼脂培养板上取出单个菌落接种在100毫升经灭菌的BHY培养基(37克/升脑心浸液和5克/升酵母提取物)中,然后将该培养基置于37℃在以每分钟300转的转速振荡培养过夜。其后将约7毫克的培养过夜的接种物添加到含100毫升经灭菌的BHY培养基并带有折流板的锥形烧瓶中。然后将经接种的培养基置于37℃、以每分钟300转的转速进行振荡培养。当该细菌培养物在600纳米的光密度达到3.5-4.0时,将该细菌培养物置于51℃水浴中加热5分钟。随后,再将该细菌培养物在37℃、每分钟300转的转速再振荡培养6小时。于是获得了细菌培养物并在-20℃贮存。
将TEM-1β-内酰胺酶在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。TEM-1β-内酰胺酶的制备步骤如下。以划线方式将菌株接种在含100微克/毫升氨苄青霉素的琼脂平板上,将该平板在37℃培养24小时。从琼脂平板上取出单个菌落接种在100毫升经灭菌的LB肉汤(28克/升)中,然后将其置于37℃以每分钟280转的转速振荡培养过夜。培养过夜后,获得细菌培养物并在-20℃下贮存。
枯草芽孢杆菌1A304(φ105MU331)和大肠杆菌BL21(DE3)培养物的制备
枯草芽孢杆菌1A304(φ105MU331)培养物和大肠杆菌BL21(DE3)培养物(它们不产生β-内酰胺酶)都是作为药物筛选实验的阴性对照(negative controls)而制备的。枯草芽孢杆菌1A304(φ105MU331)和大肠杆菌BL21(DE3)培养物的制备步骤如下。
对枯草芽孢杆菌1A304(φ105MU331)来说,以划线方式将菌株接种在含5微克/毫升氯霉素的琼脂培养板上于37℃培养24小时。将单个菌落接种在100毫升经灭菌的BHY培养基(37克/升脑心浸液和5克/升酵母提取物)中,然后在37℃以每分钟300转的转速振荡培养过夜。培养过夜后,可获得细菌培养物并在-20℃下贮存。对大肠杆菌BL21(DE3)来说,以划线方式将菌株接种在含100微克/毫升氨苄青霉素的琼脂平板上并将平板于37℃培养24小时。将单个菌落接种在100毫升灭菌的LB肉汤(28克/升)中,然后在37℃以每分钟280转的转速振荡培养过夜。培养过夜后,可获得细菌培养物并在-20℃下贮存。
药物筛选实验
用配置有两个试样注射器的FLUOstar微量培养板读出器(BMGLabtechnologies)在细菌培养物和β-内酰胺类抗生素存在下进行E166Cf酶的荧光测定。分别采用485纳米激发滤光片和520纳米发射滤光片。对于蜡状芽孢杆菌penPCβ-内酰胺酶、地衣芽孢杆菌penPβ-内酰胺酶和蜡状芽孢杆菌β-内酰胺酶II来说,将标记酶与细菌培养物相混合,将混合物在96孔微量滴定板(Corning Costar)中用50毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)配制为300微升。为了比较起见,将不会产生β-内酰胺酶的枯草芽孢杆菌培养物设置为阴性对照。对大肠杆菌TEM-1β-内酰胺酶来说,使标记酶与未经稀释的细菌培养物相混合。为了进行比较,将不会产生β-内酰胺酶的大肠杆菌培养物设置为阴性对照。用注射器将抗生素添加到细菌试样中。实验设置如图20所示。
在各种细菌培养物和β-内酰胺类抗生素(1.0×10-4摩尔/升)存在下,标记酶(1.2×10-7摩尔/升)的时间分辨荧光测得结果如图23-26所示。表2汇总了这些时间分辨荧光测定的结果。
表2
-荧光信号下降(发生β-内酰胺水解)
+荧光信号未下降(不发生β-内酰胺水解)
结果表明,头孢西丁和拉他头孢是耐细菌的β-内酰胺酶水解活性的,因此可用于对感染了会产生这样的β-内酰胺酶的细菌的病人的临床治疗。
虽然已以实施例对本发明优选实施方案进行了详细说明,但对于本领域的技术人员来说,本发明显然还可有各种变体和修改。此外,不能将本发明的实施方案解释为只限于这些实施例或附图。然而,应该清楚地知道,这类变体和修改都属于附后的权利要求所规定的本发明范围。例如,作为实施方案一部分的所述特征可用于另一个实施方案,从而再产生一个实施方案。因此,本发明应包括此类属于权利要求范围内以及同等物的变体和改变。
Claims (3)
1.一种用作生物传感器检测试样中β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂的β-内酰胺酶,该β-内酰胺酶为野生型酶的Glu166残基经Cys残基置换且所述Cys残基进一步与荧光团指示分子反应而被修饰的酶;
其中所述Cys残基进一步与荧光团指示分子反应使得该β-内酰胺酶与β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂相结合能产生荧光变化。
2.一种检测试样中的β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂的方法,该方法包括步骤:
-将试样与权利要求1所述的β-内酰胺酶相接触,以使所述β-内酰胺酶与所述β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂相结合;
-检测由已与所述β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂相结合的β-内酰胺酶发出的信号。
3.权利要求2所述的方法,还包括将已与所述β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂相结合的β-内酰胺酶发出的信号与由不含β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂的对照试样中的β-内酰胺酶发出的信号作比较的步骤。
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Rosemary M. GIBSON,et al..Site -directed mutagenesis ofβ-Lactamase I single anddouble mutants of Glu-166 and Lys-73.Biochem. J.272.1990,272613-619. |
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Walter A.Escobar,et al ..Site-Directed Mutagenesis of Glutamate-166 in β-LactamaseLeads to a Branched Path Mechanism.Biochemistry33.1994,7619-7626. * |
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