CN1777441A - 使用荧光偏振技术对副结核病的快速血清学检测 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了副结核杆菌的血清抗体的检测方法。将示踪剂加入来自动物的血清样品形成混合物，所述示踪剂含有从副结核杆菌分离出的、与荧光团相偶联的糖类抗原。然后测定混合物的荧光偏振。混合物的荧光偏振值高于对照的荧光偏振值则表示副结核杆菌的血清抗体的存在。本发明还提供了用于副结核杆菌特异性抗体的荧光偏振检测的示踪剂。该示踪剂包括从副结核杆菌分离出的并与荧光团相偶联的糖类抗原，因此该示踪剂能够与副结核杆菌特异性抗体结合并产生可检测到的荧光偏振变化。

Description

使用荧光偏振技术对副结核病的快速血清学检测
相关申请的对比文献
本申请要求200110月31日提交的美国专利申请60/335,253为优先权。在不相矛盾的情况下，本申请在此引入上述申请的所有专利、专利申请以及其所有的科学和/或技术作品作为参考。
背景技术
技术领域
本发明涉及诊断检测领域。更具体地，本发明涉及使用荧光偏振技术检测牛血清中的副结核杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)抗体的均相检测(homogeneous assay)。
相关技术描述
目前，采用ELISA来检测诸如牛等动物的副结核杆菌感染。然而，ELISA技术有很多缺点。例如，由于ELISA方法通常牵涉一些洗涤、液体转移和培育时间，因此该方法的劳动强度大，使一种不受欢迎的方法。
因此本领域需要一种快速、简便的检测副结核杆菌的方法。
发明概述
在第一主要方面，本发明提供了一种针对副结核杆菌的血清抗体的检测方法。将示踪剂加入到来自动物的血清样品形成混合物，其中所述示踪剂含有与从副结核杆菌分离出的抗原相偶联的荧光团。然后检测混合物的荧光偏振。根据混合物测得的荧光偏振值确定针对副结核杆菌的血清抗体的存在，例如，该值高于对照样品的荧光偏振值。该示踪剂可以是从副结核杆菌分离出的糖类抗原(carbohydrate antigen)。
在第二个主要方面，本发明提供了用于副结核杆菌特异性抗体的荧光偏振检测的示踪剂。该示踪剂可以包括包括从副结核杆菌分离出的糖类抗原。该示踪剂与荧光团偶联，使得该示踪剂能够与副结核杆菌特异性抗体结合从而产生可检测的荧光偏振变化。
优选实施方案的详细描述
本方法利用了从副结核杆菌提纯的抗原，然后以荧光团标记。该抗原可以是糖类抗原。为实施本方法，用加入了0.1％叠氮化钠和0.05％十二烷基硫酸锂的磷酸缓冲盐水(PBSALDS)稀释血清，并在荧光偏振分析仪(FPM-1，Diachemix Corporation)中得到基线读数(baseline reading)。然后将荧光标记的抗原加入到含有稀释血清的检测管中，得到荧光偏振读数。当荧光偏振值高于稀释缓冲液或已知的阴性血清对照样品的荧光偏振值时，表示副结核杆菌特异性抗体的存在。
与ELISA法相比，由于仅要求加入单一试剂而没有更多的分离或洗涤步骤，因此本方法是快速的，而且实施起来技术简单。通常，几分钟内即可得到结果。
实施例1
培养条件
副结核杆菌的II，III，IV，V，C286和C300菌株(culture collection ofAnimal Diseases Research Institute，Nepean，Ontario，Canada)分别在Reids培养基和Longs培养基中于37℃培养7-10天。然后将在Longs培养基中生长的种子培养物(seed culture)接种于多个含有500mL的Longs培养基的1升烧瓶中，将Reids培养基中生长的种子培养物接种于多个含有500mL的Reids培养基的1升烧瓶中。将烧瓶于37℃培育90天。
实施例2
标记抗原的制备
将生长于两种培养基中的上述副结核杆菌所有菌株的90天培养物在玻璃瓶中汇集，然后用4N氢氧化钠调节混合物的pH值至8。将该混合物于4℃储存2周并每2-3天进行摇动。将所得混合物在流动蒸汽中高压灭菌3小时，然后将瓶子静置2天使细胞沉降到底部。虹吸出液体后，通过无菌Whatman#2滤纸过滤细胞。然后将细胞干燥、称重，储存于-20℃。将细胞的等分试样于在4℃过夜解冻后加入水制成浆液。然后向浆液中加入液体苯酚(90％)使得苯酚的最终浓度为30.3％(v/v)。接下来在室温下用装有PT 20探针的Polytron匀浆器(Brinkmann Instrument，Ontario，Canada)匀浆2分钟，将所得匀浆液在室温下搅拌30分钟，然后用摇摆桶转子(swinging bucket rotor)离心(4C，30,000×g，30分钟)。离心后，用巴氏吸液管吸出每个试管中的大部分液相并汇集。然后向每个试管加入水(5ml)，与剩余的液相轻柔混合。如前再次离心试管，移出液相并与第一次液相提取物汇集。然后用自来水透析液相提取物的汇集物(以分子量3000k Dalton为取舍值)24小时，然后用蒸馏水再透析48小时。用装有Amicon YM-1膜(Millipore)的Amicon UltratiltrationCell(Millipore，Ottawa，Canada)浓缩提取物约15倍。将该提取物的等分试样(600μl)与1M氢氧化钠(60μl)混合并在37℃培育1小时。然后将混合物加入到2ml的多粘菌素B琼脂糖中(Sigma-Aldrich Canada Limited，Oakille，Ontario，Canada)，该多粘菌素B琼脂糖在使用前采用磷酸缓冲盐水(PBS，0.01M磷酸钠+0.85％氯化钠，pH值7.2)洗涤。将多粘菌素B琼脂糖-抗原混合物在37℃培育2小时。然后将混合物离心(15,000×g，2分钟)，移出上清液。向1.2mg异硫氰酸荧光素异构体I(fluorescein isothiocyanate isomer I，FITC，Sigma)加入上清液(约600μl)，并在37℃培育1小时。然后将标记的抗原加入SephadexG-25Fine(Pharmacia，Baie D’Urfe，Quebec，Canda)柱(1x25cm)中，该柱以pH为7.0的0.1M磷酸钠缓冲液预平衡。然后用0.1M磷酸缓冲液洗脱，从而分离游离的FITC和FITC标记的抗原。以492nm的波长监测馏分，得到两个峰，汇集第一个峰的馏分，将其用作副结核杆菌特异性抗体的荧光偏振检测中的标记的抗原。
实施例3
荧光偏振检测的步骤
用添加了0.1％叠氮化钠(Sigma)和0.05％十二烷基硫酸锂(Sigma)的PBS(PBSALDS)按照1∶25的比例稀释牛血清。然后得到荧光偏振分析仪的基准读数(FPM-1，Diachemix Corporation，Grayslake，Illinois)。向稀释的血清中加入FITC标记抗原的等分试样(预定得到总强度值为约300,000)。然后得到荧光偏振读数。已经发现特异性抗体的存在使荧光偏振值高于稀释缓冲液或已知阴性血清对照样品的荧光偏振值。
实施例4
在感染的动物中检测副结核杆菌抗体
通过本领域的已知方法获得一千多份副结核杆菌感染的和未感染的家畜血清。使用如上述荧光偏振检测中制备的示踪剂检测血清中的副结核杆菌抗体。也用ELISA检测法检测血清中的副结核杆菌抗体。
ELISA法检测到23份副结核杆菌感染的血清；荧光偏振法检测到上述23份副结核杆菌感染的血清中的20份。因此，荧光偏振法的相对灵敏度是约87％。
用ELISA法检测到1013份血清为阴性；用荧光偏振法检测到上述1013份未感染血清中的1003份为阴性。因此，荧光偏振法的相对特异性约为99％。
本发明的上述描述是用于说明的目的而不是也不应该理解为是本发明的全部或将本发明限制在具体公开的内容。选择说明的方式以最佳地揭示本发明的原理和这些原理的实际应用，使本领域的其他技术人员能够最佳地利用所构思的适合于具体用途的本发明各种实施方案和各种改进。本发明的范围并不局限于说明书，而是由权利要求书限定的。

Claims (9)

1.检测针对副结核杆菌的抗体的方法，该方法包括：
向来自动物的样品中加入示踪剂形成混合物，其中该示踪剂含有与从副结核杆菌分离出的抗原相偶联的荧光团；
测量该混合物的荧光偏振；和
利用测得的混合物的荧光偏振来检测该混合物中针对副结核杆菌的抗体的存在。
2.权利要求1的方法，还包括：
测量对照的荧光偏振；和
将该混合物的荧光偏振与对照的荧光偏振比较；和
3.权利要求1的方法，其中所述样品是血清。
4.权利要求1的方法，其中所述荧光团是异硫氰酸荧光素。
5.用于在荧光偏振检测中检测针对副结核杆菌的抗体的示踪剂，该示踪剂包括：
与从副结核杆菌分离出的抗原相偶联的荧光团，其中的抗原通过下述方法分离出：
(a)对分支杆菌类培养物进行培养；
(b)从培养物中回收副结核杆菌细胞；
(c)向细胞中加入液体苯酚形成以混合物；
(d)匀浆该混合物；
(e)从匀浆的混合物中分离出水相；
(f)透析该水相；
(g)浓缩该水相；
(h)向该水相中加入氢氧化钠；
(i)向该水相中加入多粘菌素B琼脂糖；
(j)从该水相中除去多粘菌素B琼脂糖；和
(k)回收含有所述抗原的该水相。
6.权利要求5的示踪剂，其中该示踪剂包含与从副结核杆菌分离出的糖类抗原相偶联的荧光团。
7.权利要求6的示踪剂，其中该示踪剂与副结核杆菌特异性抗体结合从而产生可检测到的荧光偏振变化。
8.权利要求7的示踪剂，其中的荧光团是异硫氰酸荧光素。
9.检测副结核杆菌抗体的试剂盒，其中该试剂盒包含权利要求5的示踪剂，其中的抗体通过荧光偏振检测。
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