CN1774263A - 长效的可注射胰岛素组合物及其制备方法和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在哺乳动物中降低血糖的方法，该方法包括对哺乳动物注射治疗有效量的结晶的葡聚糖微粒和胰岛素，以降低该哺乳动物的血糖。所述的组合物可以是单相或结构化的多相组合物，该组合物用于在很长时间内控释释放胰岛素。

Description

长效的可注射胰岛素组合物及其制备方法和使用方法

技术领域

本申请要求以下美国临时申请的权益：2003年3月4日提交的序列号为60/451,245的美国临时申请；2003年5月5日提交的序列号为60/467,601的美国临时申请；2003年5月9日提交的序列号为60/469,017的美国临时申请和2003年8月15日提交的序列号为60/495,097的美国临时申请，将其所有内容以参考的方式引入本文。

本发明主要涉及胰岛素组合物，特别地，本发明涉及含有胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的可注射胰岛素组合物。

背景技术

葡聚糖是通过一些微生物或生物化学方法合成的高分子量多糖。平均分子量约为75kDa的葡聚糖具有与血浆类似的胶体渗透压，因此其水溶液在临床中作为血浆膨胀剂使用。珠子形式的交联葡聚糖是蛋白的GPC(凝胶渗透层析)中使用的“Sephadex”^的基础并作为由Pharmacia研发的“Cytodex”^的基础，该“Cytodex”^用以满足微载体细胞培养物的特殊需要。例如，专利号为6,395,302和专利号为6,303,148的美国专利(Hennink等)披露了将各种生物材料附着到交联的葡聚糖微粒上。但是，由于应用了交联剂，使基于交联葡聚糖的珠子具有潜在的毒性，所以该珠子通常不能用于植入体的制造(Blain J.F.，Maghni K.，Pelletier S.和Sirois P.炎症研究(Inflamm.Res.)，48(1999)：386～392)。

专利号为4,713,249的美国专利(Schroder)描述了用于生物活性物质的贮存基质的生产方法。根据该专利，所述的贮存基质据说由碳水化合物微粒组成，通过结晶使其稳定，这意味着使用了非共价键。以下是Schroder描述的生产所谓的结晶的碳水化合物微粒的方法。在一种或多种的亲水溶剂中形成碳水化合物聚合物和生物活性物质的溶液，然后在液体疏水介质中将所述的碳水化合物和生物活性物质的混合物乳化，以形成球形小滴。然后将该乳剂导入到含有丙酮、乙醇或甲醇的结晶介质中，以形成具有非共价键交联的结晶碳水化合物聚合物基质的球状体。所述基质混合有0.001重量％～50重量％的生物活性物质。因而，在使该球状体结晶前，在所述溶液中加入生物活性物质。Schroder并没有描述通过所述多步法制备的微粒的微结构。Schroder的多步法是复杂的，并且用到了对细胞具有潜在毒性并需要去除的有机溶剂。

发明内容

在哺乳动物中降低血糖的方法，该方法包括给哺乳动物注射治疗有效量的结晶的葡聚糖微粒和胰岛素以降低该哺乳动物的血糖。该组合物可以是单相或结构化的多相组合物，该组合物用于在很长时间内控释释放胰岛素。

附图说明

图1是分子量为70.0kDa的葡聚糖在55.0重量％的水溶液中自发形成的结晶的葡聚糖微粒的照片。

图2A是在图1中显示的结晶的葡聚糖微粒的横截面照片。

图2B是在图2A中显示的微粒的横截面照片，在该照片中可以看到该微粒的微孔结构。

图3是结晶的葡聚糖微粒的聚集体的照片。

图4是肌肉间注射后第14天荧光标记大分子从包括结晶的葡聚糖微粒的植入体缓慢释放到小鼠肌肉组织中的照片。

图5是在葡聚糖(分子量为500kDa)水溶液中的PEG(聚乙二醇)水溶液的乳剂的照片，所述的葡聚糖水溶液含有图1中显示的结晶的葡聚糖微粒。

图6是在PEG水溶液中的葡聚糖(分子量为500kDa)水溶液的乳剂的照片，所述葡聚糖水溶液含有图1中显示的结晶的葡聚糖微粒。

图7是葡聚糖(分子量为500kDa)水溶液中的PEG水溶液的乳剂的肌肉内注射照片，所述葡聚糖水溶液含有图1中显示的结晶的葡聚糖微粒。

图8是葡聚糖(分子量为500kDa)水溶液中的PEG水溶液的乳剂的皮下注射照片，所述葡聚糖水溶液含有图1中显示的结晶的葡聚糖微粒。

图9A和图9C示意性地图解了在水性两相体系中不同类型颗粒和各相的分配行为。

图9B是基于两相体系的植入体结构的横截面照片。

图10和图11示意性地图解了本发明的一个实施方案的治疗剂递送方法。

图12A和图12B是针对含有各种胰岛素的组合物的相对标准化血糖浓度相对于时间的曲线图。

具体实施方式

本发明人已发现，将结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物注射入哺乳动物中，与单独注射相同剂量的相同胰岛素相比，意外地延长了胰岛素的效力持续时间。该组合物可以是单相组合物或是在哺乳动物内形成结构化的植入体的多相组合物。

以下第一部分描述结晶的葡聚糖微粒，第二部分描述来自多相组合物的结构化的植入体的形成，而随后的部分描述组合物在哺乳动物中的注射以及可注射组合物的制备方法的具体实施例。

A.结晶的葡聚糖微粒

本发明人通过实验发现，在20℃～90℃的温度范围内，在分子量为1.0kDa～200.0kDa的葡聚糖的浓缩水溶液(40重量％～65重量％)中自发形成平均直径为0.5微米～3.5微米的结晶的葡聚糖微粒。如果需要在室温形成微粒，可以使用2kDa～18kDa的葡聚糖溶液。当然，如果需要，也可以由2kDa～18kDa的葡聚糖溶液在高于室温的温度形成该微粒。该微粒可以在高于室温的温度(例如约40。℃～约70℃)由较高分子量的葡聚糖的溶液(例如20kDa～75kDa的溶液)自发形成。该微粒可以具有诸如规则或不规则等适宜的任何形状，但是优选为球状，并且优选直径为10微米，或者更小，例如0.5微米～5微米。

透射电子显微术揭示了结晶的葡聚糖微粒的微孔结构(见图2A和图2B)。优选地，按体积计算该微粒的孔隙率至少为10％，例如约10％～约50％，更优选为约20％～约40％。因而，该结构包含具有位于颗粒之间的大孔性区域的微孔性微粒。

对结晶的葡聚糖微粒的水性悬浮液进行喷雾干燥证明了可以生产结晶的葡聚糖微粒的聚集体，所述聚集体基本上为球状，直径为10.0微米～150.0微米(见图3)。

以下是形成葡聚糖微粒的方法的非限制性的实施例。向500ml实验烧杯中的50.0g无菌蒸馏水中加入50.0g来自安森生物科学(AmershamBiosciences)的葡聚糖T40(分子量为40kDa)，以在层流下获得50重量％的溶液。将该混合物在60℃(水浴)中在磁力搅拌器上以50rpm(转/分)的转速进行搅拌，直到葡聚糖完全溶解，并获得澄清的溶液。可以通过抽真空去除该溶液中所包含的气体。盖上蒂维克盖(Tyvek^lid)后将该澄清的溶液放在60℃的实验烘箱中。在3.5小时后，作为结晶的葡聚糖微粒形成的结果，形成了混浊的粘性悬浮液。

为了去除非结晶的葡聚糖，用3×250ml的无菌蒸馏水通过离心(例如3,000g，30分钟)对该微粒进行洗涤，或者对稀释的微粒的悬浮液例如1份的微粒和10份的水(3×250ml的无菌蒸馏水通过除菌滤器)进行过滤。所述离心/洗涤是在层流下进行的。在将该微粒放入500ml的实验烧杯中并盖上蒂维克盖，并在60℃的实验烘箱中干燥8小时，使其水分含量达到约5％。所获得的干粉由平均直径约为2微米的颗粒组成。

结晶的微粒优选含有通过多个氢键、范德华力和/或离子键集合在一起的葡聚糖分子(即聚合物分子)并且在葡聚糖分子间基本上没有共价键。因而，微粒中的分子优选没有特意地进行交联(即不进行交联步骤)并且该微粒在分子间不含有共价键或者在分子间含有低于10％的共价键。

在实验中，已经证明了大分子从植入体中缓慢释放，在该实验中，注射前大分子在结晶的葡聚糖微粒或其聚集体的水性悬浮液中溶解。图4显示含有荧光标记的大分子(FITC-葡聚糖，分子量为500kDa)的植入体和肌肉间注射后第14天该大分子从植入体到小鼠肌肉组织中的缓慢释放。

B.两相体系

可以在两相系统的基础上形成植入体的自组装结构，该植入体的自组装结构基于结晶的葡聚糖微粒和它们的聚集体。

诸如油、脂质体、微粒和毫微粒的小滴的胶状体系可以分散在结晶的葡聚糖微粒的悬浮液中，并且可以进行注射以在被施用到哺乳动物中后形成释放治疗试剂的植入体。

例如，在油的情况中，可以形成一种特殊类型的植入体结构，其中，油核被由分散在水或诸如多糖(例如葡聚糖)等有机聚合物的水溶液中的结晶的葡聚糖微粒或其聚集体组成的外层包围。所述结构可以称为囊。应该提到的是，所述外层可以包括当该囊被组织包围时所形成的粗糙的球状外层。但是，当该囊位于例如基质、骨头或肠壁等障壁的附近时，该囊所包括的核可以位于一个或更多个微粒壁的一侧与障壁的另一侧之间。而且，虽然将油用作示例性例子，但是所述核可以含有其它材料，例如其它聚合物、细胞等。

为了形成囊结构，可以应用两相水性体系。当不同聚合物的水溶液以高于某浓度进行混合时，它们经常形成不相溶液体的两相溶液。各相通常含有超过90％的水，其可以被缓冲并且变为等渗。如果将细胞悬浮液或颗粒悬浮液加到该体系中，经常会发现该细胞或颗粒在各相间进行不均分配。由于在这些体系中的分配直接取决于细胞或颗粒的表面特性，所以可以利用这种优先分配行为作为基础对不同细胞群或颗粒进行分离。具有不同表面特性的细胞或颗粒显示出足够不同的分配行为。

所述的两种聚合物相的竞争性吸附取决于聚合物的化学特性。两相聚合物法已被应用于细胞、蛋白质、核酸和矿物质的分离或分配(“在水性两相体系中的分配(Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems)”，1985，H.Walter，D.Brooks和D.Fisher编辑，Academic Press出版)。

结晶的葡聚糖微粒在来自例如葡聚糖/聚乙二醇(PEG)的混合物的相系中的分布实验显示，如在图5和图6中显示的那样，葡聚糖微粒优先处在葡聚糖相中，而另外的PEG相可以分散在该葡聚糖相中，以形成W/W乳剂，并且，当PEG相的体积大于葡聚糖相的体积时，反过来也是成立的。

图5是在葡聚糖水溶液中的PEG水溶液的乳剂的照片，所述葡聚糖水溶液含有结晶的葡聚糖微粒。在图5的结构中，PEG相的体积小于葡聚糖相的体积。该葡聚糖相含有葡聚糖和结晶的葡聚糖微粒。因而，该PEG相形成由葡聚糖/葡聚糖微粒外层包围的一个或多个球状核(即，封闭的孔结构)。

图6是在PEG水溶液中的葡聚糖水溶液的乳剂的照片，所述葡聚糖水溶液含有结晶的葡聚糖微粒，其中，PEG相的体积大于葡聚糖相的体积。在这种情况中，葡聚糖相形成一个或多个由PEG相包围的含有葡聚糖微粒的球状核(即当PEG消散在组织液中时，在体内形成的开放的孔结构)。如图6所示，较小体积(小滴)的葡聚糖相形成大的球状的葡聚糖/葡聚糖微粒的核(图6的右边底侧)，含有葡聚糖/葡聚糖微粒的较小的球状体加入到该核上，并与之融合。

因而，当第一相(例如PEG相及其内含物如治疗剂)与第二相(例如葡聚糖相及其内含物如葡聚糖微粒)的体积比小于1时，便自组装形成由第二相(外层)包围的第一相(核)的囊。如果该组合物含有例如胰岛素等优先分配入PEG相的治疗剂，则该治疗剂便选择性地分配入PEG核中，而颗粒通过自组装选择性地进行分配并形成包围在该PEG核周围的外层。

可以通过将分开制备的葡聚糖相和PEG相混合来制备乳剂，两者均可以是分别优先处在PEG相或处在葡聚糖相中的不同类型颗粒的悬浮液。其原理是，颗粒在不同聚合物相中的分配取决于它们的表面结构和颗粒在该聚合物溶液中的界面能。

用含有结晶的葡聚糖微粒的水性的两相体系对实验动物组织进行的注射显示了如图7和图8所示的具有囊结构的植入体的形成。在该两相体系中，葡聚糖相的体积大于PEG相的体积。图7和图8均显示，具有PEG核和葡聚糖/葡聚糖微粒外层的囊在体内通过自组装形成(即注射到哺乳动物组织后)。该外层含有在相邻的微粒间的大孔区和在微粒本身中的微孔区。

以下是由两相体系形成囊结构的方法的非限制性实施例。将10g葡聚糖T40(分子量为40kDa)和2g PGE溶解在88ml含有1,000IU胰岛素(Actrapid^)的溶液中，所述溶液中加有25g结晶的葡聚糖微粒。这些步骤在层流条件下进行。在磁力搅拌器上，将该混合物在室温以100rpm搅拌30分钟，以形成均匀的混合物(即悬浮液)。1.0g的该悬浮液中含有8IU胰岛素。

应该提到的是，葡聚糖微粒可以由与两相体系中提供的葡聚糖溶液分子量不同的葡聚糖溶液来制备。因而，可以在分子量比提供到两相体系中的葡聚糖溶液低的葡聚糖溶液(例如2kDa～20kDa的溶液)中形成该结晶的葡聚糖微粒，所述提供到两相体系中的葡聚糖溶液可以是40kDa～500kDa的葡聚糖溶液，例如可以是40kDa～75kDa的溶液。这样是有利的，因为较高分子量的葡聚糖溶液(例如40kDa～70kDa的溶液)得到了更广泛的规章的认可，并且可以在较低浓度下形成囊的外层。虽然较低分子量的溶液可用以降低结晶时间，但是实际上并没有在体内提供较低分子量的葡聚糖溶液。而且，较低分子量颗粒在体内可更容易溶解。

由两相体系形成的囊结构是有利的，因为该囊结构使治疗剂从核内的释放比从包含含有微粒的单相的组合物中的释放更均匀、更持续。而且，据信通过使用囊结构，需要较少的微粒就可以获得比使用单相体系相同的或更好的治疗剂的时控释放。而且，据信可以通过控制在两相体系中的微粒量，从而控制该微粒的外层的厚度。在两相体系中，微粒量越大，得到的外层就会越厚。因而，可以通过控制外层的厚度来控制治疗剂从囊核中释放的量、持续时间和/或时机。因此，可以针对每位患者或每组患者定制治疗剂的释放概况。

应该提到的是，虽然将PEG和葡聚糖用作两相体系的材料的例子，但是可以使用显示以下分配行为的任何其它适宜材料进行替换。图9A示意性地图解在水性的两相体系中不同类型颗粒的分配特性。例如，在图9A中显示了三种类型的分子或分子聚集体的优选颗粒10、12、14，以及相16和相18两相。但是，可以是两种类型或超过三种类型的颗粒。这些颗粒可以是由有机材料和/或无机材料、脂质体、活细胞、病毒或大分子制得的微粒，例如微球体或纳米球体。第一类型的颗粒10优先分离入第一相16。第二类型的颗粒12优先分离到第一相16和第二相18的界面。第三类型的颗粒14优先分离入第二相18中。因而，通过模拟以前的非限制性例子，第一颗粒10可以包含治疗剂，第二颗粒12和/或第三颗粒14可以包含结晶的葡聚糖微粒，第一相16可以包含PEG相，而第二相18可以包含葡聚糖相。

如图9A的区域20所示，如果在较大量的第二相18中提供较小量的第一相16，便形成位于第二相18中的囊型结构，该囊型结构包含第一相16的离散球状体，所述第一相16含有一定浓度的第一类型颗粒10。第二类型颗粒12可以位于相16和相18的界面，并起到囊外层的作用。颗粒14分散到第二相18中和/或形成囊外层。

相反地，如图9A的区域22所示，如果在较大量的第一相16中提供较小量的第二相18，便形成位于第一相16中的囊型结构，该囊型结构包含第二相18的离散球状体，所述第二相18含有一定浓度的第三类型的颗粒14。第二类型的颗粒12可以定位于相16和相18的界面，并起到囊外层的作用。颗粒10分散到第一相16中和/或形成囊外层。可以将两相体系20和22用作植入体，例如将其注射到哺乳动物(例如动物或人)中。因而，该囊形成结构化的三维植入体，该植入体具有作为贮存池或贮存库的核，以对治疗剂经过外层进行控释。相反地，微粒均匀分布的植入体是未结构化的植入体。

而且，颗粒10、12和14可以由选择性分配入各相之一的液体材料(例如油)或大分子替换。例如，诸如胰岛素的治疗剂可以分配入PEG/葡聚糖两相体系的PEG相中。由于胰岛素选择性地分配到PEG相中，所以该PEG相形成囊结构的含有胰岛素的核。应该提到的是，尽管特定的颗粒和治疗剂进行选择性分配，但是术语“选择性地分配”并不一定意为100％的该颗粒或治疗剂都分配到其中一相中。但是，多数的选择性分配物质，优选80％的该分配物质，分配到其中一相中。例如，虽然多数的胰岛素分配到PEG相，但是一部分胰岛素可以保留在葡聚糖相中。

图9B显示植入体结构的横截面的扫描电子显微图，所述植入体结构基于在图9A中进行示意性图解的两相体系。将含有葡聚糖第一相、PEG第二相和结晶的葡聚糖微粒的两相水性组合物注射到琼脂糖凝胶中。该凝胶组成通过防止结晶的葡聚糖微粒从注射侧扩散来模拟哺乳动物组织。图9B中的图显示核-外层植入体结构的形成。该核包括被外层34包围的区30和区32。在切开凝胶进行横截面SEM(扫描电子显微)成像前，区30为填充有PEG相区的空间。在横切的过程中，凝胶被切开时PEG相区从凝胶中滴出。区32是位于结晶的葡聚糖微粒中的含有PEG小滴的核的外部。区34是含有结晶的葡聚糖微粒的外层，其包围含有PEG的核并维持含有PEG的核的位置。

虽然不希望受到特定的理论束缚，但发明人认为，如图9B所示的核-外层结构通过如在9C示意性显示的自组装而形成。当第一相16和第二相18(例如不同的不相溶聚合物的水溶液)处在适宜的贮存容器19(例如玻璃烧杯或小瓶)中时，相16升到另一相18的上面。当该两相组合物被注入诸如哺乳动物组织或基质材料(如模拟组织的凝胶)等的限制相16和相18自由流动的材料中时，该组合物自组装成所述的核-外层结构。首先，体积较小的一相形成如图9C中间部分所示的近似球形的球状体。然后，如图9C底部所示，球状体结合以形成被另外一相的外层包围的一个相的近似球形的核。虽然显示了多相体系的两相体系的例子，但是如果需要，多相体系可以多于两相。

C.可注射胰岛素的递送载体

本发明人已发现，将结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物注射入哺乳动物，例如小鼠和兔子中，与单独注射相同剂量的相同胰岛素相比，意外地延长了胰岛素的效力持续时间。图10示意性地图解了用注射器56通过注射含有微粒12、14和胰岛素46的单相组合物，植入体40在哺乳动物53中的形成。图11示意性地图解了通过注射包括葡聚糖相18和PEG相16的两相组合物，结构化的植入体40在哺乳动物53中的形成，所述葡聚糖相18含有选择性分配的结晶的葡聚糖微粒12、14，所述的PEG相16含有选择性分配的含有胰岛素的治疗剂10。所述葡聚糖相18形成位于所述PEG相16核周围的外层。由于小鼠和兔子是在药物试验中人的常用模型，所以本发明人认为，当被注入成人和小孩中时，含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物也将有效地延长胰岛素的效力持续时间。

实施例1～实施例8显示了与单独注射胰岛素相比，使用结晶的葡聚糖微粒作为可注射胰岛素的递送载体的优势。该实验涉及小鼠并观察它们对皮下注射由结晶的葡聚糖微粒和人重组胰岛素(NovoNordiskActrapid HM Penfill^，40UI/ml)组成的水性悬浮液的反应。

所述悬浮液按以下方法进行制备。在20.0g的水中溶解5.0g的葡聚糖T10(Pharmacia，Uppsala，瑞典)。用0.22μm的过滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤该溶液，并将其并冻干。将3.0g所得的粉末溶解在3.0g的无菌水中，并放入温度为60℃的盒子中。6小时后，用3×5.0ml的无菌水通过在3000g离心对结晶的葡聚糖微粒进行洗涤。最后，将制得的结晶的葡聚糖微粒悬浮液与胰岛素水溶液混合，并用于小鼠的实验中。将该悬浮液的样品导入小鼠的腿中，并从各小鼠的尾巴采集动物血样，对葡萄糖浓度进行分析。采用葡萄糖氧化酶法通过正确校准的“单触系统葡萄糖分析仪(one-touch system glucose analyzer)”(LifescanJohnson & Johnson，Milpitas，CA，美国)对血糖进行测定。

在比较例1中，没有将胰岛素注入小鼠中。在比较例2、3和7中，只将胰岛素(0.5UI)注入3只小鼠中。在实施例4～实施例6和实施例8中，将胰岛素(0.5UI)和结晶的葡聚糖微粒的植入体注入4只小鼠中。该结果总结在表I中。

                                                            表I

例#		0分钟葡萄糖mmol/l	15分钟葡萄糖mmol/l	30分钟葡萄糖mmol/l	45分钟葡萄糖mmol/l	120分钟葡萄糖mmol/l	210分钟葡萄糖mmol/l	270分钟葡萄糖mmol/l	390分钟葡萄糖mmol/l
										1	未处理的小鼠	7.9	8.1	8.2	8.4	-	-	-	-
										2	胰岛素0.5UI	5.9	3.3	2.7	1.8	0.9	3.5	3.0	3.2
3	胰岛素0.5UI	8.1	3.8	2.8	1.9	0.9	3.7	3.4	3.5
4	胰岛素0.5UI和结晶的葡聚糖微粒	6.0	4.3	3.2	2.5	0.8	0.8	0.9	0.7
										5	胰岛素0.5UI和结晶的葡聚糖微粒	6.9	5.6	4.1	3.4	-	1.2	-	1.6
6	胰岛素0.5UI和结晶的葡聚糖微粒	5.9	3.5	2.9	1.9	1.2	1.0	1.0	0.7
7	胰岛素0.5UI(平均)	7	3.6	2.8	1.9	0.9	3.6	3.2	3.4
										8	胰岛素0.5UI和结晶的葡聚糖微粒(平均)	6.3	4.5	3.4	2.6	1.0	1.0	1.0	1.0

当0.5UI的胰岛素与或不与结晶的葡聚糖微粒一起进行i.m.(肌肉内注射)应用时，动物血液中的糖(即血糖)的平均降低量非常不一样。如表I所示，注射后的前45分钟期间，比较例2、3或7的小鼠中的葡萄糖水平与实施例4～实施例6和实施例8的小鼠中的葡萄糖水平几乎相同或较低。注射后120分钟，比较例2、3或7的小鼠中的葡萄糖水平与实施例4～实施例6和实施例8的小鼠中的葡萄糖水平几乎相同。但是，注射后210分钟～390分钟，比较例2、3或7的小鼠中的葡萄糖水平比实施例4～实施例6和实施例8的小鼠中的葡萄糖水平高约3倍。实际上，注射后120分钟～390分钟，实施例4～实施例6和实施例8的小鼠中的葡萄糖水平基本上没有上升(即升高没有超过10％，保持相同水平或下降)。相反地，注射后120分钟～390分钟，比较例2、3或7中注射了相同量胰岛素的小鼠中的葡萄糖水平确实显著上升。与单独注射相同剂量的胰岛素相比，注射结晶的葡聚糖微粒/胰岛素能更长时间地降低血糖。因而，含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物可以用于注射给药。

以下对兔子进行的实验也证明了与单独注射相同剂量的相同胰岛素相比，注射结晶的葡聚糖微粒/胰岛素如何降低血糖以及如何使血液中的胰岛素的基础水平保持较长的时间。皮下注射含有Actrapid HM^短效胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的组合物，意外地发现该短效胰岛素的效力持续时间延长到超过单独皮下注射的长效胰岛素Monotard HM^的效力持续时间。

术语“效力持续时间”的意思是独立于引起血糖峰的外部因素(例如进食)，使血糖浓度降低到所需水平和/或使血液中的胰岛素浓度的基础水平保持在所需水平。因而，术语“效力持续时间”是将胰岛素和微粒的组合物的效力与单独的相同剂量的相同胰岛素的效力相比较的相对术语。换句话说，效力持续时间是作用持续时间或药理学效果的持续时间，该持续时间可以通过在患者禁食状态比较胰岛素和微粒的组合物的效力和单独的相同剂量的相同胰岛素的效力来进行测定。

如图12A和12B所示，与单独的Actrapid HM^胰岛素的约2小时～约8小时的效力持续时间(图12B)和单独的“Monotard HM”^长效胰岛素的约17小时～24小时的效力持续时间(图12A)相比，含有ActrapidHM^短效胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的组合物延缓了对胰岛素的吸收，并延长了降低血糖效果(即，胰岛素的效力持续时间)到至少24小时，例如约28小时～约31小时。Actrapid HM^胰岛素和Monotard HM^胰岛素都是Novo Nordisk的产品，获自该公司的信息宣传这些胰岛素组合物在人体内的效力持续时间分别是8小时和24小时。

在图12A和12B中，上面的线显示未处理(即，没有施用胰岛素)的兔子对照线。图12A和12B的y-轴是对于相同的8IU剂量的胰岛素的血糖浓度的相对标准化刻度。图中数据都经过调整以使各图显示在一张曲线图中，该数据显示了注射胰岛素后动物血液中的血糖水平。

在图12A和图12B中显示的数据是按如下获得的。监测秘鲁(Chinchilla)兔(2.3±0.3kg)对注射由结晶的葡聚糖微粒和ActrapidHM^短效胰岛素组成的制剂的反应。该制剂样品通过皮下注射到兔子中。将没有微粒的Monotard HM^长效胰岛素(40IU/ml)和Actrapid HM^短效胰岛素通过皮下注射到不同的兔子中作为对照。从兔子的耳静脉采集动物血样，并对葡萄糖浓度进行分析。采用葡萄糖氧化酶法通过正确校准的葡萄糖分析仪(One-touch^Lifescan，Johnson & Johnson，Milpitas，CA，美国)测定血糖浓度。

在比较例9和比较例10中，2只兔子没有被提供任何胰岛素。在比较例11和比较例12中，Monotard HM^长效胰岛素的水溶液以8IU的剂量通过皮下导入到2只兔子中。在实施例13～实施例15中，结晶的葡聚糖微粒和Actrapid HM^短效胰岛素的悬浮液以8IU的剂量通过皮下导入到3只兔子中。该实验的结果总结在表II中。

                            表II

例#	胰岛素剂量	0小时葡萄糖mmol/l	0.5小时葡萄糖mmol/l	1小时葡萄糖mmol/l	1.5小时葡萄糖mmol/l	2小时葡萄糖mmol/l	2.5小时葡萄糖mmol/l	16小时葡萄糖mmol/l	24小时葡萄糖mmol/l	31小时葡萄糖mmol/l
											9	0.0	5.4	5.0	5.2	5.2	5.2	5.4	4.7	5.4	5.4
10	0.0	6.0	6.3	6.3	6.3	6.3	6.4	5.7	5.6	5.8
											11	8IU	5.4	5.8	3.8	3.2	2.4	2.6	3.9	5.6	N.A
12	8IU	5.4	5.0	4.2	2.9	2.5	2.4	4.0	5.1	N.A
											13	8IU	5.8	3.7	1.9	1.9	1.9	2.8	4.1	4.3	4.1
14	8IU	6.6	5.7	4.3	3.9	3.7	3.9	4.6	4.1	3.9
											15	8IU	6.2	5.1	3.6	3.2	3.1	2.9	4.2	4.4	4.7

以上的实施例13～实施例15证明，Actrapid HM^短效胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的组合物提供了超过Monotard HM^长效胰岛素效果的延长效果，并且据认为与来自安万特(Aventis)(见www.aventis-us.com/Pls/lantus TXT.html)的长效(一天给药一次)胰岛素glargine Lantus^的效果相当。另外，不能将Lantus^胰岛素与任何其它胰岛素或溶液进行稀释或混合。如果稀释或混合Lantus^胰岛素，Lantus^胰岛素和/或该混合胰岛素的药学动力学/药效的概况(即作用的起始、到达效果峰的时间)可能以不可预测的方式发生改变。相反地，结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物就没有受到这些限制，因为可以使用任何适宜的胰岛素，例如人胰岛素。在所述结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物中，可以根据需要而改变胰岛素和微粒的比例。而且，可以使用任何适宜的胰岛素以对个别的患者定制适当的胰岛素疗法。因而，在所述组合物中使用Actrapid HM^作为典型胰岛素的说明性例子，但是该组合物并不限于该品牌的胰岛素。

如实施例9～实施例15所示，与没有微粒的相同剂量的相同胰岛素相比，含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物在保持胰岛素的效力持续方面是有效的，其持续时间至少延长30％，例如至少延长100％，优选延长100％～400％。与没有微粒的相同剂量的相同胰岛素相比，含有微粒的胰岛素组合物在保持所需要的血液中胰岛素和血糖浓度的基础水平方面是有效的，其基础水平持续时间至少延长30％，例如延长100％～400％。因而，含有微粒的组合物的效力持续时间至少为24小时，这样使得在哺乳动物(例如需要的人)中每天只需注射一次。

耐久的胰岛素的结晶的葡聚糖微粒组合物比现有技术中的耐久的胰岛素组合物更安全，因其不用象现有技术的组合物那样使用更多剂量即可以获得耐久的效力。例如，如果8IU剂量的短效胰岛素在医药上已被确定为对患者是安全的而没有显著的用药过量危险，那么，含有相同的短效胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的组合物在短效胰岛素的剂量同样为8IU时，即便所有的这些胰岛素立刻在患者中释放，也可以提供作用更长的作用时间而没有显著的用药过量危险。而且，因为该组合物在没有增加胰岛素的量的情况下延长了其效力，所以与现有技术的组合物相比，该组合物节省了费用。目前现有技术的长效的糖尿病疗法使用了胰岛素的类似物，例如，来自安万特的Lantus^。相反地，含有结晶的葡聚糖微粒的组合物优选含有安全概况已经确认的人重组胰岛素。因而，该组合物降低了不良反应的危险性，并减少了对糖尿病患者的注射次数，据此提高了糖尿病患者的生命质量。

所述可注射组合物可以包含含有胰岛素和微粒的单相体系或包含形成PEG和胰岛素的核以及葡聚糖和葡聚糖微粒外层的两相体系，该两相体系用于使效力持续时间甚至更长。而且，该组合物包含注入哺乳动物相对容易的流动性的单相或多相的胶状体系(即悬浮液或乳剂)。

以下实施例显示了含有葡聚糖相、PEG相、胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的可注射两相组合物的用途。据认为当注入哺乳动物中时，该组合物形成具有三维囊结构的结构化的贮存库型植入体。在该囊结构中，所述微粒选择性地分配到葡聚糖相，而胰岛素则被选择性地分配到PEG相中。含有微粒的葡聚糖相在包含PEG相的核的周围形成外层，所述PEG相含有胰岛素。该结构化的植入体使得从核中通过外层可以进行控释释放。

在比较例16中，将0.5IU的Actrapid HM^胰岛素(100IU/ml)通过皮下注入到小鼠中。在实施例17中，将0.4g的结晶的葡聚糖微粒分散在0.6ml的20％(重量比)的分子量为70kDa的葡聚糖(Pharmacia，瑞典)的水溶液中以形成悬浮液。将10mg的分子量为6kDa的PEG(Fluka)溶解在0.1ml的Actrapid HM^胰岛素(100IU/ml)中以形成溶液。将0.05ml的PEG和胰岛素溶液与0.15ml的微粒和葡聚糖悬浮液混合，以形成两相组合物或混合物。将0.02ml含有0.5IU的胰岛素的所述两相混合物通过皮下注射到小鼠中。结果显示在表III中。

                               表III

例#	0分钟葡萄糖mmol/l	15分钟葡萄糖mmol/l	30分钟葡萄糖mmol/l	45分钟葡萄糖mmol/l	60分钟葡萄糖mmol/l	120分钟葡萄糖mmol/l
							16	7.8	3.7	2.3	1.7	2.9	6.7
17	7.9	5.9	4.3	4.1	4.3	4.0

如表III所见，所述的两相组合物的效力持续时间长于单独的胰岛素的效力持续时间。而且，该两相组合物对血糖浓度的降低作用比单独的胰岛素更缓慢。尽管没有期望受到特定理论的束缚，据认为这些效果是由于胰岛素从囊结构的核中控释释放的缘故。

而且，可以通过调整胰岛素和/或微粒的量来为每位患者定制含有微粒的组合物，使得可以在每天的同一时间将该组合物注射给该患者(即每24小时一次，每48小时一次，等等)。因而，用于每位患者的所述组合物的效力持续时间是可调的。对于两相体系，胰岛素从囊核中的释放概况可以通过控制微粒的量以控制该囊外层的厚度来进行调节。

虽然发明人不期望受到特定理论的束缚，但是据认为相同剂量的与结晶的葡聚糖微粒在一起的胰岛素在小鼠和兔子中的耐久效果可以通过该胰岛素分子从基于结晶的葡聚糖微粒的植入体中的扩散(即胰岛素的自我控制释放)来解释。由于小鼠和兔子是药物试验中人的共同模型，显示在上表I～表III中的数据表明，通过使用基于结晶的葡聚糖微粒的植入体，可以开发药效动力学特性和药代动力学特性得到改善的控释释放递送体系，从而更好地满足基础胰岛素患者(例如人)的需要。

D.材料

在本发明的一个优选方案中，治疗剂含有胰岛素。换句话说，该治疗剂可以基本上只由胰岛素组成或者含有胰岛素和另外的物质。术语“胰岛素”应该解释为包括胰岛素类似物、天然提取的人胰岛素、重组体产生的人胰岛素、牛源和/或猪源提取的胰岛素、重组体产生的猪和牛的胰岛素以及任何这些胰岛素产品的混合物。该术语意欲包括通常用于治疗糖尿病的充分纯化形式的多肽，但使用该术语包括其商购的药物形式，这种商购的药物形式包含另外的赋形剂。所述胰岛素优选为重组产生的并且可以是脱水的(完全干燥)或在溶液中。

术语“胰岛素类似物”、“单体胰岛素”等在这里交互使用，并且意欲包括任何形式的如上所述的“胰岛素”，其中，该多肽链中的一个或多个氨基酸已被替换氨基酸所置换和/或其中一个或多个氨基酸已缺失或其中一个或多个另外的氨基酸已被添加到该多肽链或氨基酸序列上，所述多肽链或氨基酸序列作为胰岛素在降低血糖水平中起作用。一般地，在本发明的优选实施方案中的术语“胰岛素类似物”包括专利号为No.5,547,929的美国专利所披露的“速效胰岛素(胰岛素lispro)类似物”，将所述专利的全部内容以参考的方式引入本文；胰岛素类似物包括LysPro胰岛素和优泌乐(humalog)胰岛素，以及其它“超胰岛素类似物”，其中，与传统的胰岛素和在肝中比在脂肪组织中更有活性的肝选择性胰岛素相比，所述胰岛素类似物影响血清中的葡萄糖水平的能力得到相当大的提高。优选的类似物是单体胰岛素类似物，其为用于与胰岛素的主要目的相同的胰岛素样化合物，例如，胰岛素lispro，即通过施用以降低血糖水平的化合物。

术语“类似物”是指与被认为是与其相当的分子具有共同功能活性并且通常具有共同结构特征的分子。

术语“重组体”是指任何类型的在原核细胞中表达的克隆的治疗剂或遗传工程分子或可以被处理成为另一种状态以形成另一个组合文库的组合分子文库，尤其是含有提高该治疗剂的物理化学的、药理学的和临床上的安全性的保护基团的分子。

术语“葡聚糖微粒”包括未取代的葡聚糖微粒和取代的葡聚糖微粒。例如，取代的葡聚糖微粒包括用适当基团(例如甲基)取代的葡聚糖，其取代程度达到不损害该葡聚糖微粒的结晶(例如高至3.5％或更低百分比的分支)的程度。微粒的平均直径优选为约0.5微米～约5微米，更优选为约1微米～约2微米。

而且，虽然优选与治疗剂一起使用多孔的非交联的葡聚糖微粒(例如结晶的微粒)，但是也可以替代性使用其它适宜的有机或无机微粒，例如其它的聚合物微粒，包括多糖、PLA、PLGA、PMMA、聚酰亚胺、聚酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙酸乙烯酯或其它聚合材料；生物材料微粒例如海藻酸盐和细胞；或者无机颗粒例如二氧化硅、玻璃或磷酸钙。优选该微粒是生物可降解的。优选地，使用多孔性微粒。最优选地，该微粒具有足够的孔隙度，以将治疗剂容纳孔中，并提供该治疗剂从孔隙中的时控释放。换句话说，该治疗剂随着时间进程从孔隙中释放，例如超过5分钟，优选超过30分钟，最优选超过1小时，例如数小时到数天，而不是突然释放。因此，可以基于所用的治疗剂类型、进行递送所需的治疗剂的体积、治疗剂的递送持续时间、药剂将要被递送到的环境以及其它因素，对颗粒材料、孔径和孔隙体积进行选择。

因而，在本发明的一个优选方面，治疗剂至少部分地位于该多孔性微粒的孔隙中。优选地，治疗剂没有被包封在微粒中(即，该微粒没有作为其中装有治疗剂核的外层)并且没有被附到该微粒的表面上。但是，如果需要，除了位于该多孔性微粒的孔隙中外，一部分治疗剂也可以被包封在微粒外层中和/或被附到微粒的表面上。治疗剂在孔隙中的定位提供了该治疗剂最适宜的时控释放。相反地，附到微粒表面的治疗剂通常释放过快，而包封在微粒中的治疗剂经常释放得不够快，并且当该微粒外层崩解时突然释放。在两相体系中，至少80％的治疗剂优选位于被含有该微粒的壁或外层包围的核中。

E.制备方法

可以通过任何适宜的方法制备所述微粒。优选地，在该微粒形成后，将该微粒与治疗剂组合。这样，通过任何适宜的方法形成微粒(例如结晶的葡聚糖微粒)，然后通过任何适宜的方法将治疗剂与该微粒组合。相反地，在一些现有技术方法中，通过在溶液中提供颗粒前体材料和治疗剂，然后将该前体材料(例如单体或寡聚体材料)进行结晶或交联以将治疗剂核包封在微粒外层中，从而将治疗剂封装在微粒外层中。

优选地，微粒形成后，将治疗剂提供到该多孔性微粒的孔隙中。这样，首先形成多孔性微粒，然后将治疗剂提供到含有该微粒的溶液中，以使治疗剂渗入该微粒的孔隙中。当然，在该步骤中，一些治疗剂也可以变为附着在该微粒的表面。

因而，制备非交联的多孔性的结晶的葡聚糖微粒的方法包括：制备葡聚糖溶液(例如水性葡聚糖溶液)，进行结晶步骤以形成结晶的多孔性的葡聚糖微粒，并且如果需要，从溶液中分离出结晶的多孔性葡聚糖微粒。通过将治疗剂提供到含有微粒的结晶溶液中或通过将该分离的微粒和该治疗剂提供到另外的溶液中(例如另外的水性溶液)中，从而将该治疗剂渗入该微粒的孔隙中。例如，可以在第一低分子量葡聚糖水溶液中(例如2kDa～20kDa的葡聚糖溶液)形成结晶的葡聚糖微粒。然后将该微粒从第一溶液中取出，将其放入分子量较高的葡聚糖的第二葡聚糖水溶液中，例如40kDa～500kDa的溶液，例如，40kDa～75kDa的溶液。第二溶液可以含有两相体系中的第一相，然后将所述第二溶液与第二相(例如含有治疗剂的PEG相)组合。类似的方法可以用于其它多孔性微粒，其中，通过任何适宜的微粒形成方法(包括但不限于结晶)形成多孔性微粒后，将该治疗剂渗入该微粒的孔隙中。可以将该组合物的诸如胰岛素、微粒和一种或多种水性相等成分按任何适宜的顺序或同时进行组合。

优选地，所述微粒在不含有有机溶剂和有机反应促进剂的溶液中通过自组装形成，其中所述有机溶剂和有机反应促进剂在微粒中留下有机残留。因而，例如，葡聚糖微粒优选由葡聚糖水溶液通过自组装形成。但是，如果需要，也可以使用有机溶剂和/或有机反应促进剂。在这种情况中，可以在后续使用之前对该微粒进行纯化，以去除有害的有机残留。

如上所述，具有第一相核和第二相壁或外层的囊结构可以由两相组合物在体内或体外形成。该组合物可以是干燥的粉末，例如作为粉末或多孔性块状物贮存的冻干粉末。当准备将该组合物施用至哺乳动物时，将其与水化合并通过注射施用至哺乳动物。

优选地，当将包含所述微粒和治疗剂的所述组合物的剂量定制为适于(dosed for)进行注射时，所述组合物是流动性的胶状体系，所述流动性的胶状体系包括乳剂和悬浮液，所述乳剂和悬浮液可利用常规型号的注射器或针容易地注入至哺乳动物中。相反地，一些现有技术的组合物包含在葡聚糖水凝胶中或交联的葡聚糖基质中的治疗剂。如果没有进行特定制备的话，葡聚糖水凝胶和交联的葡聚糖基质不是流动性的组合物。

在本发明的另一个优选方面，所述微粒包括对哺乳动物黏膜具有粘附性的微粒。优选地，所述粘附性微粒为上述的多孔性微粒。这进一步促进了所述治疗剂的有效递送。

在本发明的另一个优选方面，所述微粒包括其表面经过特别改进的微粒以提高所述治疗剂对该微粒表面的粘附性并优化该治疗剂的递送。该微粒表面可以含有适宜的提高该治疗剂的粘附性的任何改进。

提供本发明的上述描述的目的是进行例证和说明，而非旨在穷尽或将本发明限于所披露的精确形式，并且在上述的教导下可以进行修改和变化，或可以从本发明的实践中获得修改和变化。选择附图和描述的目的是对本发明的原理及其实际应用进行解释。本发明的范围意欲由所附权利要求和其等同物来限定。

本说明书中引用的所有的出版物和专利申请和专利都以参考的方式引入本文。

Claims (21)

1.一种在哺乳动物中降低血糖的方法，该方法包括对哺乳动物注射治疗有效量的含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物以降低该哺乳动物的血糖，其中，所述微粒是在胰岛素和该微粒于所述组合物中进行组合之前形成的。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的组合物包含流动性的胶状组合物，并且所述微粒包含平均直径为0.5微米～5微米的结晶的葡聚糖微粒。

3.如权利要求2所述的方法，其中：

所述组合物包含两相组合物，该两相组合物含有葡聚糖相和PEG相；

所述胰岛素选择性地分配到PEG相中，所述微粒选择性地分配到葡聚糖相中；和

该组合物在被注射到哺乳动物体内后形成结构化的植入体，该植入体含有PEG相核和葡聚糖相外层。

4.如权利要求3所述的方法，该方法进一步包括基于接受所述组合物的哺乳动物的身体而控制所述外层的厚度以控制胰岛素从植入体中的释放。

5.如权利要求1所述的方法，其中，对糖尿病病人提供所述组合物，以降低所述病人体内的血糖浓度。

6.一种定制剂量的药物组合物，该定制剂量的药物组合物含有结晶的葡聚糖微粒和治疗有效量的胰岛素，其中，将该组合物的剂量定制为适于对人进行注射，并且所述微粒是在胰岛素和该微粒于所述组合物中进行组合之前形成的。

7.如权利要求6所述的组合物，其中：

所述组合物包含流动性的胶状组合物；和

所述微粒包含平均直径为0.5微米～5微米的结晶的葡聚糖微粒。

8.如权利要求7所述的组合物，其中：

所述组合物包含两相组合物，该两相组合物含有葡聚糖相和PEG相；

所述胰岛素选择性地分配到PEG相中，所述微粒选择性地分配到葡聚糖相中；和

该组合物在被注射到哺乳动物体内后形成结构化的植入体，该结构化的植入体含有PEG相核和葡聚糖相外层。

9.一种定制剂量的药物组合物，该定制剂量的药物组合物含有结晶的葡聚糖微粒和治疗有效量的第一胰岛素，其中，将该组合物的剂量定制为适于对哺乳动物进行注射，并且当将该组合物注射到哺乳动物中时，其效力持续时间比没有微粒的相同剂量的相同第一胰岛素在哺乳动物中的效力持续时间至少延长30％。

10.如权利要求9所述的组合物，其中：

所述组合物包含流动性的胶状组合物；

所述微粒包含平均直径为0.5微米～5微米的结晶的葡聚糖微粒；和

所述微粒是在第一胰岛素和该微粒于所述组合物中进行组合之前形成的。

11.如权利要求10所述的组合物，其中：

所述组合物包含两相组合物，该两相组合物含有葡聚糖相和PEG相；

所述第一胰岛素选择性地分配到PEG相中，所述微粒选择性地分配到葡聚糖相中；和

所述组合物在被注射到哺乳动物体内后形成结构化的植入体，该结构化的植入体含有PEG相核和葡聚糖相外层。

12.如权利要求9所述的组合物，其中：

当被注射到哺乳动物时，所述组合物的效力持续时间至少为24小时；和

当被注射到哺乳动物时，所述组合物的效力持续时间比没有微粒的相同剂量的相同第一胰岛素在哺乳动物中的效力持续时间至少延长100％。

13.一种在哺乳动物中降低血糖的方法，该方法包括对哺乳动物注射治疗有效量的含有结晶的葡聚糖微粒和第一胰岛素的组合物以降低该哺乳动物的血糖，其中，该组合物在哺乳动物中的效力持续时间比没有微粒的相同剂量的相同第一胰岛素在哺乳动物中的效力持续时间至少延长30％。

14.如权利要求13的方法，其中：

所述组合物包含流动性的胶状组合物；

所述微粒包含平均直径为0.5微米～5微米的结晶的葡聚糖微粒；和

所述微粒是在第一胰岛素和该微粒于所述组合物中进行组合之前形成的。

15.如权利要求14的方法，其中：

所述组合物包含两相组合物，该两相组合物含有葡聚糖相和PEG相；

所述胰岛素选择性地分配到PEG相中，所述微粒选择性地分配到葡聚糖相中；和

所述组合物在被注射到哺乳动物体内后形成结构化的植入体，该结构化的植入体含有PEG相核和葡聚糖相外层。

16.如权利要求13的方法，其中：

当被注射到哺乳动物时，所述组合物的效力持续时间至少为24小时；和

所述组合物在哺乳动物中的效力持续时间比没有微粒的相同剂量的相同第一胰岛素在哺乳动物中的效力持续时间至少延长100％。

17.如权利要求16的方法，其中，所述组合物在哺乳动物中的效力持续时间比没有微粒的相同剂量的相同第一胰岛素在哺乳动物中的效力持续时间延长100％～400％。

18.一种制备定制剂量的药物组合物的方法，该方法包括：

提供结晶的葡聚糖微粒；

该葡聚糖微粒结晶后，将治疗有效量的胰岛素和所述结晶的葡聚糖微粒在溶液中进行组合，以形成胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的组合物；和

将所述组合物的剂量定制为适于对哺乳动物进行注射。

19.如权利要求18所述的方法，其中：

所述组合物包含流动性的胶状组合物；和

所述微粒包含平均直径为0.5微米～5微米的结晶的葡聚糖微粒。

20.如权利要求19所述的方法，其中：

所述组合物包含两相组合物，该两相组合物含有葡聚糖相和PEG相；

所述胰岛素选择性地分配到PEG相中，所述微粒选择性地分配到葡聚糖相中；和

所述组合物在被注射到哺乳动物体内后形成结构化的植入体，该结构化的植入体含有PEG相核和葡聚糖相外层。

21.如权利要求18所述的方法，其中：

当被注射到哺乳动物时，所述组合物的效力持续时间至少为24小时；和

所述组合物在哺乳动物中的效力持续时间比没有微粒的相同剂量的相同胰岛素在哺乳动物中的效力持续时间至少延长100％。

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