CN1772782A

CN1772782A - 荧光两亲性聚合物及制法和用途

Info

Publication number: CN1772782A
Application number: CN 200510019796
Authority: CN
Inventors: 孟令芝; 武照强; 何永炳
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2005-11-14
Filing date: 2005-11-14
Publication date: 2006-05-17
Anticipated expiration: 2025-11-14
Also published as: CN100503672C

Abstract

本发明涉及荧光两亲性聚合物，其结构式为(如图)；它们是由具有与生物大分子如DNA，蛋白质相互作用部位和强荧光响应的功能单体与N－乙烯基吡咯烷酮预聚物共聚合的反应产物。该聚合物具有优良的生物相容性、载药和靶向给药能力，并能通过高灵敏的荧光示踪检测技术，在物大分子分离与识别、生物传感器、医学诊断、药物输送及靶材料等方面有着广阔的应用前景。其合成路线合理，合成方法简单，原料易得，具有重要的推广和应用价值。

Description

荧光两亲性聚合物及制法和用途

技术领域

本发明涉及荧光两亲性聚合物及制法和用途。

背景技术

荧光技术对生物大分子的研究(如蛋白质构象、DNA的分离及测序等)、对细胞的生长、凋亡、变异的原位研究迄今为止还主要集中于在研究体系中引入小分子荧光探针进行标记，该法虽然简单、快速、灵敏，但一些小分子荧光探针的非水溶性及可能引起的某些副作用(如诱发癌变作用)，加之所需添加剂(如表面活性剂)的优化困难及重复性差，使其在生命科学、医学等领域中的应用受到了限制。

发明内容

本发明的目的在于提供荧光两亲性聚合物及其制法和用途，这类荧光两亲性聚合物易溶于水，既具有强的荧光响应、自组装行为、靶向载药能力，又具有对生物大分子如蛋白质、DNA等非共价键相互作用时的荧光表达行为。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

可聚合荧光功能单体，其结构式如下所示：

R＝H，X＝NHNH (I)R＝CH₃，X＝NHNH (II)R＝H，X＝NHCSNHNH (III)

上述可聚合荧光功能单体的合成方法：

按摩尔比1∶1.2-1.8的比例，将芘丁酰肼与丙烯酰氯在二甲基甲酰胺溶剂中、0±5℃搅拌反应，反应产物经DMF-EtOH-H₂O混合溶剂重结晶得到功能单体(I)。

按摩尔比1∶1.2-1.8的比例，将芘丁酰肼与甲基丙烯酰氯在甲苯与二甲基甲酰胺混合溶剂中、0±5℃，搅拌反应，反应产物经柱色谱分离得到功能单体(II)。

按摩尔比1∶1.2-1.8的比例，将芘丁酰肼与丙烯酸异硫氰酸酯在乙腈溶剂中、室温下搅拌反应，反应产物经过滤、洗涤得到功能单体(III)。

荧光两亲性聚合物，其结构式如下：

式中X为NHNH或NHCSNHNH；m＝4-12、n＝1-3、z＝40-70。

上述荧光两亲性聚合物的合成方法：

N-乙烯基吡咯烷酮在二氧六环溶剂中，以2-巯基乙醇作为链转移剂，在65±5℃，偶氮二异丁氰(AIBN)引发聚合，聚合反应4-8h，得到端羟基N-乙烯基吡咯烷酮聚合物；在二氧六环溶剂中，室温下按1∶1.2-1.8摩尔比的比例，端羟基N-乙烯基吡咯烷酮聚合物与丙烯酰氯，反应15-24h，经乙醚沉淀，去离子水洗涤，透析，得到端乙烯基N-乙烯基吡咯烷酮预聚物(PVP-Vinyl)；以二甲基甲酰胺为溶剂，AIBN作引发剂，上述可聚合的荧光功能单体与端乙烯基N-乙烯基吡咯烷酮预聚物在65±5℃聚合反应15-24h，经乙醚沉淀、二氧六环再溶解、再经乙醚沉淀，透析，干燥，得到荧光两亲性聚合物。

通过调整PVP-Vinyl预聚物的分子量(调整链转移剂2-巯基乙醇的用量)及其和荧光功能单体、引发剂AIBN的用量，使聚合物分子量控制在20 000-100 000范围。

本发明荧光两亲性聚合物的性能：

(1)具有良好的水溶性和低的临界胶束浓度(CMC)，其水溶液可自组装形成稳定的纳米胶束，TEM表明胶束的直径在50-80nm范围。

(2)具有良好的生物相容性。本发明荧光两亲性聚合物的细胞毒性实验通过使用MDCK细胞，MTT法检测。与对照实验相比(细胞的存活率定为100％)，其浓度在1×10^-10～1×10^-1mg/ml范围，MDCK细胞的存活率在120-150％之间。表明该荧光两亲性聚合物具有良好的生物相容性，能促进细胞的生长。

(3)具有强的荧光表达能力。本发明荧光两亲性聚合物的水溶液具有强的荧光表达能力，在342nm的激发波长下，分别于约374、396、475nm出现三个荧光发射谱带。在相同浓度下(w/v)，聚合物的荧光强度随着聚合物中疏水链段含量的增加而增加；同一种聚合物的荧光强度随着其浓度的增大而增大。

本发明荧光两亲性聚合物的用途：

具有荧光响应的两亲性聚合物的合成，将是克服这一不足的有效途径。

PC12细胞的实验表明，本发明具有合适分子量(20000-50000)的荧光两亲性聚合物可以有效的进出PC12细胞并可通过荧光进行表达。

DNA凝胶电泳的实验表明，本发明荧光两亲性聚合物可以有效地与DNA结合，其结合程度与疏水单体的功能基和聚合物的浓度有关。

MDCK细胞的实验表明，本发明荧光两亲性聚合物具有良好的生物相容性，能促进细胞的生长。

荧光发射光谱实验表明，与DNA、蛋白质、碳酸根阴离子相互作用中，本发明荧光两亲性聚合物的荧光表达随识别对象浓度的改变而改变，其变化程度与疏水单体的功能基有关。

具体实施方式

实施例1：

功能单体(I)、(II)的合成方法：将芘丁酰肼在二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中与丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯(摩尔比1∶1.5)0℃反应，搅拌过夜，产品经DMF-EtOH-H₂O混合溶剂重结晶得到功能单体(I)或(II)。产率分别为58％、62％，产品结构经MS，¹H NMR鉴定：功能单体(I)：FAB-MS m/z(RI)：356(38，M⁺)，271(58，M-CH₂CHCONHNH)，215(43，M-CH₂CHCONHNHCOCH₂CH₂)。¹H NMR(DMSO-d₆，δppm)：2.05(t，2H，CH₂CH₂CO)，2.34(m，2H，CH₂CH₂CO)，2.91(t，2H，PyCH₂)，5.70-6.29(m，3H，CH₂＝CH)，7.91-8.42(m，9H，PyH)，9.99，10.12(each s，1H，NHNH)。功能单体(II)：FAB-MS m/z(RI)：371(48，M+1)，271(63，Py(CH₂)₃CO⁺)，215(52，PyCH₂ ⁺)；¹H NMR(CDCl₃，δppm)：1.89(s，3H，CH₃)，2.19(t，2H，CH₂CH₂CO)，2.34(m，2H，CH₂CH₂CO)，3.31(t，2H，PyCH₂)，5.35，5.76(each d，1H，CH₂＝)，7.8-8.2(m，9H，PyH)，8.42，8.51(each b，1H，NHNH)。

实施例2：

功能单体(III)的合成方法为：将芘丁酰肼在乙腈溶剂中与丙烯酸异硫氰酸酯(摩尔比1∶1.2)室温反应，搅拌过夜，产品经过滤，乙腈、H₂O、乙腈洗涤得到，产率是67％，产品结构经MS，¹H NMR确证：FAB-MS m/z(RI)：415(30，M⁺)，344(11，M-CH₂CHCONH₂)。¹HNMR(d₆-DMSO，δppm)：2.19(t，2H，CH₂CH₂CO)，2.34(m，2H，CH₂CH₂CO)，3.31(t，2H，PyCH₂)，5.72-6.31(m，3H，CH₂＝CH)，7.8-8.2(m，9H，PyH)，10.01，10.14，11.03(each s，1H，CONHNHCS，CONHCS)。

实施例3：

端乙烯基N-乙烯基吡咯烷酮预聚物(PVP-Vinyl)的合成：

N-乙烯基吡咯烷酮(3.6g)，AIBN(0.014g)，2-巯基乙醇(0.30)在二氧六环溶剂中，氮气保护下，在60℃聚合反应4h，经乙醚沉淀，二氧六环再溶解、再经乙醚沉淀。得到端羟基聚N-乙烯基吡咯烷酮(PVP-OH)。GPC-MALLS分析，其重均分子量为4200Da。随后在二氧六环溶剂中，PVP-OH与丙烯酰氯(摩尔比1∶1.2)于室温下反应20h，经乙醚沉淀，去离子水洗涤，透析袋(Sigma D-7884)透析72h，得到纯化的端乙烯基PVP预聚物(PVP-Vinyl)。

N-乙烯基吡咯烷酮(3.6g)，AIBN(0.014g)，2-巯基乙醇(0.14g)在二氧六环溶剂中，氮气保护下，在70℃聚合反应6h，经乙醚沉淀，二氧六环再溶解、再经乙醚沉淀。得到端羟基聚N-乙烯基吡咯烷酮(PVP-OH)。GPC-MALLS分析，其重均分子量为7300Da。随后在二氧六环溶剂中，PVP-OH与丙烯酰氯(摩尔比1∶1.8)于室温下反应20-24h，经乙醚沉淀，去离子水洗涤，透析袋(Sigma D-7884)透析72h，得到纯化的端乙烯基PVP预聚物(PVP-Vinyl)。

上述产品PVP-Vinyl结构经IR，¹H NMR鉴定。¹H NMR(D₂O，δppm)：5.76(d，H_a，CH₂＝)，5.96(d，H_b，CH₂＝)，6.23(m，1H，CH＝)，1.4-3.5(PVPH)。IR(KBr pellet，cm^-1)：2958.9(m)，1723.5(w)，1654.9(s)，1464.8(m)，1423.3(m)，1291.5(s)，849.5(m)cm^-1。

实施例4：

荧光两亲性聚合物的合成：在DMF溶剂中，AIBN作引发剂，荧光功能单体I-III分别与PVP-Vinyl在65±5℃聚合反应20-24h，经乙醚沉淀，二氧六环再溶解、再沉淀，使用去离子水透析72h，得到纯化的荧光两亲性聚合物。调整PVP-Vinyl预聚物的分子量(通过调节2-巯基乙醇的用量来控制Z值在40-70范围，参见实施例3)及其和荧光功能单体、引发剂AIBN(见实施例5、6、7)的用量(控制m值在4-14范围，n值在1-3范围)，使荧光两亲性聚合物的重均分子量控制在20000-100000范围。

这些荧光两亲性聚合物都具有良好的水溶性。荧光光谱表征：聚合物都具有强的荧光发射，荧光强度随着聚合物中疏水链段(n值)的增加而增加。荧光两亲性聚合物的制备及结构表征见实施例5-7。

实施例5：

荧光两亲性聚合物FAP-I、FAP-II和FAP-III的合成：PVP-Vinyl(2.0g，由M_w 7300PVP-OH得到的PVP-Vinyl)，荧光功能单体II(分别为0.15、0.09和0.045g)，AIBN(0.008g)，在DMF溶剂中，氮气保护下，60℃聚合反应24h，经乙醚沉淀，二氧六环再溶解、再沉淀，使用去离子水透析袋透析72h，得到FAP-I、FAP-II和FAP-III。经GPC-MALLS分析，其重均分子量分别为：67500、67200和69900Da。疏水段含量通过UV-vis分析(以芘丁酸/DMF溶液在λmax：344nm的紫外吸收作标准曲线，吸光系数ε＝44680L·mol^-1·cm^-1计算)分别为31.4、18.3和8.6μmol/g。¹H NMR(CDCl₃，δppm)：1.18(b，CCH₃)，1.61，2.20and 3.18(b，CH₂ of PVP andPy(CH₂)₃CO)，1.96 and 3.64(b，CH₂ and CH of main chain)，7.8-8.4(b，PyH)；IR(KBr pellet，cm^-1)：3434.1(w)，2958.9(m)，1653.2(s)，1462.8(m)，1423.3(m)，1289.5(s)，843.9(m)cm^-1。

实施例6：

荧光两亲性聚合物FAP-IV、FAP-V和FAP-VI的合成：PVP-Vinyl(2.0g，由Mw 4200PVP-OH得到的PVP-Vinyl)，荧光功能单体I(0.24、0.20和0.14g)，AIBN(0.02g)，在DMF溶剂中，氮气保护下，65℃聚合反应22h，经乙醚沉淀，二氧六环再溶解、再沉淀，使用去离子水透析袋透析72h，得到FAP-IV、FAP-V和FAP-VI。GPC-MALLS分析，FAP-IV、其重均分子量分别为：20030、35280和50050Da。疏水段含量通过UV-vis分析(以芘丁酸/DMF溶液在λmax：344nm的紫外吸收作标准曲线，吸光系数ε＝44680L·mol^-1·cm^-1计算)分别为59.4、38.3和18.6μmol/g。¹H NMR(CDCl₃，δppm)：1.61，2.20 and 3.18(b，CH₂ of PVP andPy(CH₂)₃CO)，1.96 and 3.64(b，CH₂ and CH of main chain)，7.8-8.4(b，PyH)；IR(KBr pellet，cm^-1)：3434.1(w)，2958.9(m)，1653.2(s)，1462.8(m)，1423.3(m)，1289.5(s)，843.9(m)cm^-1。

实施例7：

荧光两亲性聚合物FAP-VII、FAP-VIII和FAP-IX的合成：PVP-Vinyl(2.0g，由M_w 7300PVP-OH得到的PVP-Vinyl)，荧光功能单体III(0.18、0.14和0.10g)，AIBN(0.02g)，在DMF溶剂中，氮气保护下，70℃聚合反应20h，经乙醚沉淀，二氧六环再溶解、再沉淀，使用去离子水透析袋透析72h，得到FAP-VII、FAP-VIII和FAP-IX。GPC-MALLS分析，其重均分子量分别为：44400、65180和98350Da。疏水段含量通过UV-vis分析(以芘丁酸/DMF溶液在λmax：344nm的紫外吸收作标准曲线，吸光系数ε＝44680L·mol^-1·cm^-1计算)分别为30.8、22.3和14.6μmol/g。¹H NMR(CDCl₃，δppm)：1.61，2.20 and 3.18(b，CH₂ of PVP andPy(CH₂)₃CO)，1.96 and 3.64(b，CH₂ and CH of main chain)，7.8-8.2(b，PyH)；IR(KBr pellet，cm^-1)：3434.1(w)，2958.9(m)，1653.2(s)，1462.8(m)，1423.3(m)，1289.5(s)，843.9(m)cm^-1。

Claims

1.荧光两亲性聚合物，其结构式为：

式中X为NHNH或NHCSNHNH；m＝4-12、n＝1-3、z＝40-70。

2.权利要求1所述荧光两亲性聚合物的合成方法，其特征在于：N-乙烯基吡咯烷酮在二氧六环溶剂中，以2-巯基乙醇作为链转移剂，在65±5℃，偶氮二异丁氰引发聚合，聚合反应4-8h，得到端羟基N-乙烯基吡咯烷酮聚合物；在二氧六环溶剂中，室温下按1∶1.2-1.8摩尔比的比例，端羟基N-乙烯基吡咯烷酮聚合物与丙烯酰氯，反应15-24h，经乙醚沉淀，去离子水洗涤，透析，得到端乙烯基N-乙烯基吡咯烷酮预聚物：以二甲基甲酰胺为溶剂，偶氮二异丁氰为引发剂，可聚合的荧光功能单体与端乙烯基N-乙烯基吡咯烷酮预聚物在65±5℃聚合反应15-24h，经乙醚沉淀、二氧六环再溶解、再经乙醚沉淀，透析，干燥，得到荧光两亲性聚合物；上述可聚合的荧光功能单体为

R＝H，X＝NHNH (I)R＝CH₃，X＝NHNH (II)R＝H，X＝NHCSNHNH (III)。

3.根据权利要求1所述荧光两亲性聚合物的合成方法，其特征在于：按摩尔比1∶1.2-1.8的比例，将芘丁酰肼与丙烯酰氯在二甲基甲酰胺溶剂中、0±5℃搅拌反应，反应产物经DMF-EtOH-H₂O混合溶剂重结晶得到可聚合的荧光功能单体(I)；或者，按摩尔比1∶1.2-1.8的比例，将芘丁酰肼与甲基丙烯酰氯在甲苯与二甲基甲酰胺混合溶剂中、0±5℃，搅拌反应，反应产物经柱色谱分离得到可聚合的荧光功能单体(II)；或者，按摩尔比1∶1.2-1.8的比例，将芘丁酰肼与丙烯酸异硫氰酸酯在乙腈溶剂中、室温下搅拌反应，反应产物经过滤、洗涤得到可聚合的荧光功能单体(III)。

4.权利要求1所述荧光两亲性聚合物作为生物大分子的分离材料、荧光示踪材料、医学诊断材料、荧光探针材料、载药缓释材料或荧光靶材料的应用。