CN1772304A - 柯萨奇病毒b组2型基因疫苗 - Google Patents

Abstract

柯萨奇病毒B组2型基因疫苗，它涉及一种预防柯萨奇病毒感染的疫苗。本发明的目的是针对现有疫苗存在免疫原性差、安全性差的不足，提供一种柯萨奇病毒B组2型基因疫苗，它是一种由真核表达系统pcDNA3和CVB2VP1基因组成的pcDNA3－CVB2VP1真核表达质粒。本发明的基因疫苗有下列优点：直接DNA接种，避免了传统疫苗抗原制备纯化等繁琐过程；免疫应答完整持久，基因免疫时抗原多肽的递呈和自然感染时相似，以天然构象被免疫系统识别，克服了其它疫苗抗原表位改变的缺点；基因疫苗具有共同的理化特征，可在同一质粒嵌合多种目的基因，形成联合免疫；基因疫苗制备简便，成本低，安全稳定，便于贮存和运输。

Description

柯萨奇病毒B组2型基因疫苗

技术领域

本发明涉及一种预防柯萨奇病毒感染的疫苗。

背景技术

传统用于预防CVB(柯萨奇病毒)感染的疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗在其灭活过程中出现抗原性减弱及重要表位丢失，使机体不能产生足够的保护性免疫。减毒活疫苗接种后常常引起免疫抑制，减毒不充分可致临床病毒感染，且活病毒疫苗有回复突变产生致病表型的可能，而过分减毒又造成疫苗效价的降低，削弱其激发机体免疫的能力。新型CVB疫苗有亚单位疫苗和合成肽疫苗。亚单位疫苗安全、无毒、副作用小，但免疫原性差。近年来把病毒的亚单位成分通过DNA重组技术加以表达的疫苗，称为基因工程重组亚单位疫苗。基因工程疫苗己被应用于临床。该疫苗的制备包括基因的分子克隆、表达和蛋白纯化过程，其研制费用较高，技术难度较大且成功率低。常因诱发对载体自身的免疫反应而不能重复使用；活重组疫苗亦有回复突变、造成免疫低下、宿主患病甚至死亡的潜在危险。合成肽疫苗是根据需要有目的地方设计具有中和或保护性抗原的短肽作为疫苗。但由于合成肽是一种直链结构，缺乏天然的三维空间结构，功能不同于天然蛋白。另外合成的短肽分子很小，免疫原性较差。因此人们迫切希望找到新的安全有效的疫苗。90年代人们开展了针对CVB特异性免疫防治的研究工作，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及合成肽疫苗，通过动物实验接种，显示了一定的免疫保护作用。但由于CVB有6个血清型，核酸具有感染性，因此研制灭活疫苗、减毒活疫苗及亚单位疫苗十分困难。上述疫苗本身又有一定的缺陷，故一直未有CVB的疫苗上市，人们迫切希望找到一种安全有效的新疫苗。近几年发展起来的基因免疫(genetic immunization)技术为CVB疫苗的研制开辟了一条新途径。

发明内容

本发明的目的是针对现有疫苗存在免疫原性差、安全性差的不足，提供一种柯萨奇病毒B组2型基因疫苗，即防治柯萨奇病毒B组2型心肌炎的基因疫苗，它是一种由真核表达系统pcDNA3和CVB2VP1基因组成的pcDNA3-CVB2VP1真核表达质粒，其主要优点为：免疫应答完整；免疫应答持久；同种异株交叉保护；联合免疫；制备简便；安全稳定；重复使用。

基因免疫通过直接给动物接种抗原蛋白编码基因使动物获得对该抗原的免疫力，这种编码抗原蛋白的外源基因既是载体又是抗原的来源，并具有疫苗的功能，因此被称为基因疫苗或核酸疫苗(nucleic acid vaccine)。基因疫苗的出现为CVB感染的防治开辟了新的途径。基因疫苗又称核酸疫苗或DNA疫苗，由病原体抗原编码基因和作为真核表达载体的质粒组成。抗原编码基因的表达产物必须是病原体的有效成分，才可引发保护性免疫。与传统疫苗相比，本发明的基因疫苗有下列优点：(1)直接DNA接种，避免了传统疫苗抗原制备纯化等繁琐过程；(2)免疫应答完整持久，基因免疫时抗原多肽的递呈和自然感染时相似，以天然构象被免疫系统识别，克服了其它疫苗抗原表位改变的缺点；(3)基因疫苗具有共同的理化特征，可在同一质粒嵌合多种目的基因，形成联合免疫；(4)基因疫苗制备简便，成本低，安全稳定，便于贮存和运输。

附图说明

图1为PMD18-T质粒结构图谱；图2为pcDNA3质粒结构图谱；图3为CVB2云南分离株VP1基因RT-PCR结果图，其中1为The products of RT-PCR，2为MarkerDL2000；图4为pMD18-T CVB2 VP1 PCR鉴定结果图，其中1.ThePCR product of CVB2 VP1，2为DL2000Marker；图5为pMD18-T CVB2 VP1酶切鉴定结果图，其中1为pMD18-T CVB2 VP1/EcoRI，2为pMD18-T/EcoRI，3为DL2000Marker；图6为柯萨奇病毒B2VP1氨基酸(165位-263位)的进化树分析图；图7为pMD18-T-CVB2 VP1 PCR及酶切鉴定结果图；图8为pcDNA3-CVB2 VP1 PCR及酶切鉴定结果图；图9为pcDNA3-CVB2 VP1转染细胞后RT-PCR检测CVB2VP1mRNA的表达结果图；图10为pcDNA3-CVB2 VP1转染HeLa细胞间接免疫荧光检测图，图11为pcDNA3-CVB2 VP1转染HeLa细胞间接免疫荧光检测图；图12为pcDNA3-CVB2 VP1转染HeLa细胞间接免疫荧光检测图；图13为小鼠基因免疫后CVB2酶联免疫吸附试验检测结果图；图14为基因免疫后小鼠T淋巴细胞增殖的动态观察结果图；图15为免疫后小鼠CD4⁺T细胞的变化结果图；图16为免疫后小鼠CD8+T细胞的比较结果图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的柯萨奇病毒B组2型基因疫苗是一种由真核表达系统pcDNA3和CVB2VP1基因组成的pcDNA3-CVB2VP1真核表达质粒，CVB2VP1和pcDNA3-CVB2VP1的基因序列参见基因序列表。

具体实施方式二：本实施方式对CVB2基因疫苗进行详细介绍。

一、材料：

(一)病毒、细胞系、载体与菌株：CVB2云南分离株、HeLa细胞由哈尔滨医科大学提供。克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司(如图1所示)，真核表达载体pcDNA3购自Invitrogen公司(如由图2所示)，宿主菌株为E.coliJM83，P-815小鼠肥大细胞瘤细胞(H-2^d基因型)由中国农业科学院生物技术国家重点实验室提供。参考毒株及GenBank登录号如表1所示。

表1  CVB2参考毒株及GenBank登录号

参考毒株	GenBank登录号
		Ohio-1jo/Roma98fr/Roma98sp/Roma88816/84China-1China-2MD84-5914HON84-6016NC95-2135FL92-1512	AF081312AJ309267AJ309266AJ309252AF295491AF225467AF225468AF152263AF152260AF081621AF081604

(二)主要试剂和工具酶：rTaqDNA聚合酶、T₄DNA连接酶、RNase A、限制性内切酶XbaI、BgLII、EcoRI、Marker(DL2000，DL15000)为PROMEGA、Invitrogen、GIBCO/BRL及大连宝生物公司产品。QIAgen Mini Extraction Kit为Qiagen公司产品，DNA片段凝胶回收试剂盒购自上海生物工程技术有限公司，总RNA提取试剂TRIzol、Eagle′sMEM，RPMI-1640细胞培养液等为GIBCO/BRL产品。FITC的标记羊抗鼠IgG、HRP标记羊抗鼠IgG购自北京中山生物技术有限公司。CVB2IgG ELISA检测试剂盒购自万太公司，CVB2 IgG购自美国USB公司。FITC标记的大鼠抗小鼠CD4抗体，R-PE标记的大鼠抗小鼠CD8抗体购自晶美生物技术公司，小牛血清、淋巴细胞分离液购于天津血液研究所，其它试剂均为分析纯。

(三)实验动物：实验动物为3周龄BALB/c小鼠(H-2^d基因型)，体重15±3g。

二、方法：

(一)pcDNA3-CVB2 VP1真核表达质粒的构建及其体外真核表达：

1、CVB2 RNA的提取：将TCID₅₀为10^-9的CVB2病毒接种HeLa细胞，37℃培养，待细胞病变为+++～++++时收获。将细胞反复冻融三次，取0.4ml置于1.5ml微量离心管中，加入0.4ml TRIzol，剧烈振摇，15～30℃放置5min。加入0.4ml氯仿，剧烈振摇15s，室温放置10min。4℃12000g离心15min。取上层水相，加入1.0ml异丙醇，15～30℃放置10min。4℃12000g离心15min，去上清，干燥沉淀，加33μl DEPC处理的ddH₂O重悬沉淀，-70℃保存备用。

2、CVB2 VP1的反转录和PCR扩增：

(1)CVB2 VP1反转录：取0.5ml微量离心管加入23μl RNA模板，AMV逆转录酶1μl，5×1st strand buffer 8μl、10mM dNTP2μl、RNase out 1μl、20pM下游引物5μl。37℃水浴作用150min，煮沸5～7min，冰浴，所得溶液即为cDNA溶液，-20℃保存待用。

(2)CVB2 VP1的PCR扩增：扩增CVB1 VP1基因的引物是用Oligo5.0软件设计，上游引物(P1)序列：5’-AGCCCAGTGGAGGAATCCATTGAG-3’，下游引物(P2)序列5’-CGTGGTCGTGAGACTATCTCTCTTT-3’。取0.2ml微量离心管加入CVB2 RNA反转录产物1.0μg、10×rTaq DNA聚合酶反应buffer5μl、dNTP终浓度20μM、上游引物20pM、下游引物20pM、rTaq DNA聚合酶2U、ddH₂O 28.5μl。进行PCR扩增，PCR反应条件为95℃预变性5min；94℃30s、55℃45s、72℃1min，共30个循环；最后一次延伸为72℃10min。取5μl扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，其余-20℃保存。

3、pMD18-T-CVB2 VP1的克隆与核苷酸序列分析：

(1)CVB2 VP1基因的PCR产物回收与纯化：将25μlPCR扩增产物加至1％琼脂糖凝胶中，5V/cm电泳40min。回收纯化方法按照上海生物工程有限公司DNA回收试剂盒说明书进行：在UV照射下将0.85kb片段用清洁刀片切下，放入1.5ml离心管，加入500μl的Binding buffer，置55℃温育10min至凝胶完全融化，将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，室温2分钟，10000g离心1min，倒掉收集管中的液体，在吸附柱内加入500μl Binding buffer，10000g离心1min，倒掉收集管中的液体，在吸附柱内加Washing solution500μl，10000g离心1min，将柱放在同一收集管上，让盖开着，再12000g离心1min，将柱放于无菌的1.5ml离心管上，在吸附膜中央加入30μl Elusion buffer，55℃静置2min，12000g离心1min，管内即为回收的PCR产物。

(2)CVB2 VP1和pMD18-T的连接：在1.5ml离心管中加入纯化的CVB2VP1 PCR产物11μl、pMD18-T 1μl、Ligation solusion I 8μl，于16℃反应过夜。

(3)感受态细菌的制备和转化：用灭菌的接种针刮拭甘油冻存的E.coliJM83细菌，快速划于加有氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。挑单菌落接种于100ml新鲜的含Amp LB培养基，37℃振摇至OD₆₀₀值为0.5时将培养液置于冰上预冷10min，于4℃1600g离心10min。细胞沉淀用10ml冰预冷时CaCl₂溶液重悬，于4℃1100g离心5min。细胞沉淀用10ml冰预冷的CaCl₂溶液重悬，冰上放置30min，于4℃1100g离心5min。用2ml冰预冷的CaCl₂溶液重悬细胞，分装-70℃冻存。

(4)CVB2 VP1和pMD18-T的连接产物转化E.coli JM83：取20μl连接产物加至100μl感受态E.coli JM 83，冰浴30min，42℃60s，冰浴2min，加入800μl SOC培养基，37℃振摇60min。将200μl培养物涂布于含Amp(氨苄)(100μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养8小时。

(5)质粒DNA的粗提：随机挑取生长在LB琼脂平板上的17个菌落分别接种于含Amp LB液体培养基37℃振摇过夜培养。取1.5ml含重组质粒的细菌菌液，12000g离心1min弃上清，加入100μl预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，pH8.0、10mM EDTA，pH8.0、50mM葡萄糖)重悬细胞，然后加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH、1％SDS)，颠倒数次，再加150μl冰预冷的溶液III(5M KAc60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，颠倒混匀，冰浴5min。12000g离心10min，将上清移至另一个微量离心管，加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置10min。4℃12000g离心10min，去上清，干燥后加30μl ddH₂O。取4μl进行琼脂糖凝胶电泳分析，挑选分子量大的质粒，待进一步鉴定。

(6)PCR鉴定：取1μl可疑阳性重组质粒加99μl灭菌ddH₂O，取其中的1μl作为模板，加10×buffer 2.5μl，dNTP终浓度为20μM，上游引物50pM，下游引物50pM，rTaq DNA聚合酶2U，灭菌纯水加至终体积为25μl，95℃5min；94℃30s、55℃30s、72℃1min；共25个循环。PCR反应结束后，取4μl PCR产物于1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭，1×TAE)中电泳，以DL2000为DNA分子量Marker，凝胶成像系统观察电泳结果并照像。

(7)质粒DNA的精提：将PCR阳性的质粒菌液中加Amp LB液体培养液2ml，37℃振摇过夜培养。取1.5ml含重组质粒的细菌菌液，12000g离心1min弃上清，加入100μl预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA，pH8.0；50mM葡萄糖)重悬细胞，然后加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH；1％SDS)，颠倒数次，再加150μl冰预冷的溶液III(5M KAc 60ml；冰乙酸11.5ml；水28.5ml)，颠倒混匀，冰浴5min。12000g离心10min，将上清移至另一个微量离心管，加饱和酚和氯仿各200μl，12000g离心5min，将上清移入另一1.5ml微量离心管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置10min。4℃12000g离心10min，去上清，干燥后加30μl含20μg/μl RNase A的TE溶解沉淀。取4μl进行琼脂糖凝胶电泳分析，待进一步鉴定。

(8)酶切鉴定：在2个0.5ml离心管中各加入4μl提取的质粒，用EcoR I 1μl相应10×buffer H 1μl，ddH₂O 4μl，共10μl体积，37℃酶切1小时，判断目的基因的插入。

(9)CVB2 VP1的生物信息学分析：应用ExPASy Molecular Biology Server(http://www.expasy.org)在线分析CVB2 VP1云南分离株氨基酸的特点，应用Blastn在线分析CVB2 VP1云南分离株核苷酸的同源序列，应用BioEdit软件分析CVB2 VP1的酶切位点，采用Clustal X1.83软件进行多序列联配比对，邻位相连法(Neighbor-joining method)构建CVB2氨基酸种系进化树，为保证进化树的准确性，采用10000次bootstrap trial，随机数字generator seed是1000，应用ANTHEPROT5.0预测蛋白质二级结构。

4、pcDNA3-CVB2 VP1的构建与鉴定：

(1)pMD18-T-CVB2 VP1重新构建：根据已测定的CVB2云南株VP1基因序列和Kozak原则重新设计引物，上游引物(P3)中设计了VP1基因的起始密码子及EcoR I酶切位点，引物序列为：P3：5’-GAATTCGTCATGAGCCCAGCGGAGGAATC-3’。下游引物(P2)序列5’-CGTGGTCGTGAGACTATCTCTCTFT-3’。

(2)同前进行PCR鉴定。

(3)酶切鉴定筛选目的质粒：同前用EcoR I进行酶切，判定目的质粒。

(4)pcDNA3-CVB2 VP1连接：取10μl正向pMD18-T-VP1和5μl pcDNA3-分别同时用XbaI+HindIII酶切消化，体系如下：pMD18-T-VP1 10μl，pcDNA3-5μl，内切酶buffer M 2μl，XbaI 2μl，HindIII 2μl，加ddH₂O至20μl，37℃消化4h。将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用上海生物工程公司回收试剂盒回收酶切后0.85kb的CVB2 VP1酶切产物和5.4kb的线形化的pcDNA3。取CVB2 VP1 20μl和线形化的pcDNA3 5μl加至1.5ml微量离心管中，加入10×T4连接酶反应buffer 3μl、T4 DNA连接酶1μl、补加ddH₂O至30μl。16℃反应过夜。

(5)pcDNA3-CVB2 VP1转化：将连接产物取30μl加至100μl感受态E.coliJM83，冰浴60s，冰浴2min，加入800μlSOC培养基，37℃振摇60min，接种至含Amp的LB琼脂平板，37℃培养8小时。

(6)鉴定：用前述方法小量提取质粒DNA，进行初步琼脂糖凝胶电泳分析，选择出较大的可疑阳性重组质粒进一步精提，进行PCR和酶切鉴定。取5μl该质粒分别用BgL II、XbaI+Hind III酶切，判断其大小及目的基因插入的正确性。

5、pcDNA3-CVB2 VP1的体外真核表达：

(1)纯化重组质粒：重组质粒纯化采用聚乙二醇沉淀法，具体操作如下：挑含有目的质粒的单菌落接种于5ml含Amp的LB培养基中，37℃过夜培养，提质粒鉴定正确后将上述培养液1/10稀释，接种于45ml含Amp(100μg/ml)的LB培养基中，37℃摇振4小时培养。收获菌液于4℃7000g离心10min，弃上清，加入3.6ml预冷的溶液I(同前)重悬细胞，然后加入8ml新配制的溶液II(同前)，颠倒数次，静置7分钟至沉淀消失，再加4ml冰预冷的溶液III(同前)，颠倒混匀，冰浴10min。5000g 4℃离心15min，将溶液过滤于4层灭菌纱布，上清加入另一25ml离心管中，加0.6倍体积的异丙醇，-20℃静置10min，9500g4℃离心10min弃上清，倒置吹干，在室温下用70％的乙醇刷洗管底及管壁，倒掉乙醇，并使剩余的乙醇挥发掉，用TE(pH8.0)300μl溶解湿润的核酸沉淀。加入300μl预冷的5M LiCl,混匀，4℃12000g离心10min，将上清移入1.5ml微量离心管中，在室温下用70％的乙醇刷洗管底及管壁，倒掉乙醇，并使剩余的乙醇挥发掉，用50μl含RNase A的TE(pH8.0)溶解湿润的核酸沉淀。室温放置30min。加入50μl含13％(W/V)聚乙二醇(PEG-8000)的1.6M NaCl溶液充分混合，12000g 4℃离心5min，以回收沉淀的质粒，用酚∶氯仿抽提一次，然后用氯仿抽提一次。用标准的乙醇沉淀发法回收DNA，湿润的质粒沉淀用35μl灭菌的TE(pH 8.0)溶解。以1∶100用TE(pH 8.0)稀释后测OD₂₆₀，并计算质粒DNA的浓度。按1OD₂₆₀＝50μg质粒DNA/ml计算，用于细胞转染。

(2)转染HeLa细胞：按Lipofect AMINE^TM产品说明书进行转染，设空载体和病毒感染细胞对照。具体操作如下：取对数生长期的HeLa细胞移种到灭菌6孔板中，轻轻晃动以分散细胞，使之均匀分布到平皿的底部，放入37℃含5％CO₂的温箱中孵育，在倒置显微镜下观察细胞覆盖平皿面积达60％～70％时进行转染。将20μg重组质粒加入不含抗生素和小牛血清的92μl MEM中混匀，将6μl脂质体加入不含抗生素和小牛血清的94μl MEM中混匀，再将上述两种液体混匀室温静置20min。此时将6孔板中接种的HeLa细胞在不冲散其单层的情况下，吸弃细胞上的培养液，并将转染混合物加入800μl不含抗生素和小牛血清的MEM，沿孔壁缓慢地加入，在37℃含5％CO₂的孵箱中孵育5h。孵育后再向平皿中加入2.0ml含10％的胎牛血清和青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml的MEM，用封口膜密封6孔板，在37℃含5％CO₂的细胞孵箱中继续孵育，分别于48h、72h、96h取出作RT-PCR及间接免疫荧光检测。

(3)转染细胞的RT-PCR检测：分别将48h、72h、96h的HeLa细胞弃上清，用TRIzol提取试剂盒提取总RNA，在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA，用于PCR扩增，以检测CVB2 VP1 mRNA的转录。PCR反应条件同CVB2 VP1的RT-PCR。扩增CVB2的特异性引物为P1、P2。

(4)转染细胞的免疫荧光检测：将转染后48h、72h、96h的细胞用冷丙酮固定干燥在载玻片上，用0.05M PBS(pH7.2)1∶250稀释CVB2 VP1 IgG作为阳性血清、将其与阴性血清及羊抗鼠IgG荧光抗体(用1∶10000的Evan’s蓝1∶50稀释)感作后，50％甘油PBS封片，置于荧光显微镜下观察。

(二)pcDNA3-CVB2 VP1的动物免疫实验：

1、真核表达质粒的大量制备及纯化：免疫动物所用的真核表达质粒pcDNA3-CVB2 VP1、pcDNA3、按如下的步骤制备：(1)取菌液划线于含Amp的LB琼脂平板上37℃培养过夜。(2)挑取单个菌落于10mlLB培养液中37℃振荡培养、鉴定。(3)取1ml上述菌液加入到100ml LB培养液中37℃3h后加0.3ml氯霉素(0.34mg/ml)过夜培养。(4)8000g离心20min，弃上清加3.2ml的溶液I及0.9ml新配制的溶菌酶(5mg/ml)混匀，冰浴30min；加溶液II6.4ml，冰浴5min；加入溶液III4.8ml，冰浴60min。然后以15000g离心15min，取上清加入2倍体积乙醇，-20℃过夜。(5)12000g离心20min，沉淀以1ml TE悬浮，加入0.129g醋酸铵(终浓度为0.25M)混匀，冰浴20min。(6)12000g离心20min，取上清加2倍体积无水乙醇-20℃过夜。(7)12000g离心20min，弃上清，沉淀吹干，以0.4ml含RNA酶(20μg/ml)的TE悬浮，37℃作用30min。(8)以等体积饱和酚、等体积饱和酚/氯仿、氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提取一次。(9)收集水相，加2倍体积的冷乙醇和1/10体积的NaAc(3M，pH4.8)，混匀，于-70℃沉淀1h后，4℃12000g离心15min，弃上清。(10)沉淀用70％乙醇洗涤，真空抽干，TE溶解。(11)取适量样品进行酶切分析、验证，取该质粒溶液作适量稀释后用紫外分光光度测其含量。(12)应用0.01M PBS溶液稀释重组质粒和空载体，终浓度为1μg/μl，-20℃保存待用。

2、动物免疫实验：

(1)动物分组和免疫：将66只BALB/c小鼠随机分成3组，即空载体对照组、pcDNA3-CVB2 VP1基因免疫组及PBS组，每组22只。每只鼠腹腔注射盐酸氯胺酮1mg，数分钟后小鼠四肢松弛，接种3次，每次间隔一周，分别于免疫后2周、4周、6周、8周断尾采血，分离血清，-20℃保存用于特异性抗体测定(10只/次)，于免疫后2周、4周、6周每组随机取小鼠雌雄各半4只，摘眼球采血约500μl/只，加入含有EDTA抗凝剂的试管中于4小时以内测定CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，即刻取脾分离淋巴细胞用于淋巴细胞增殖试验，第8周每组随机取小鼠雌雄各半4只，摘眼球采血用于中和抗体效价测定并分离这些及剩余的空载体组和疫苗组小鼠脾淋巴细胞用于CTL活性测定。

(2)接种后体液免疫应答检测：

①CVB2特异性抗体IgG的ELISA检测：参照试剂盒说明书，取标本稀释液100μl加入反应板内，将待检血清用生理盐水按1∶10稀释后取10μl加入反应孔内，置37℃反应20min，用洗涤液洗板5次，每孔加100μl酶结合物(羊抗鼠IgG酶标抗体1∶1000稀释)，置37℃反应20min，洗板5次，将底物A、B液各取50μl加到反应孔内避光显色10min，每孔加终止液终止反应。用酶标仪于波长450nm处测定OD值，用空白对照孔调零，计算P/N值，P/N≥2.1时判为阳性，P/N＜2.1判为阴性。

②中和抗体效价测定：

病毒液制备：将CVB2病毒接种于HeLa。每瓶加病毒液1ml，生长液9ml(含10％灭活胎牛血清的MEM)，37℃培养1～3天，病变达++++时收获。2000r/min，15min离心沉淀，去除细胞碎屑。将混匀的病毒分装于小管，供病毒滴定用。

TCID₅₀滴定：将CVB2病毒悬液分别用维持液作连续10倍稀释，由10^-3～10^-10。首先在96孔微量滴定板每孔内加入细胞悬液200μl(5000/μl)，待细胞长成单层后，吸弃上清，每孔加病毒液100μl，每个稀释度病毒加4孔，37℃5％CO₂温箱孵育吸附2小时，吸弃上清，每孔加维持液(含2％灭活胎牛血清的MEM)200μl，37℃5％CO₂温箱孵育，逐日在普通显微镜下观察细胞病变(CPE)情况至第7天，细胞病变50％或以上作为病变阳性孔，无细胞病变或细胞病变50％以下作为阴性孔。按Reed和Muench法计算距离比例∶距离比例＝大于50％的百分数-50％/大于50％的百分数-小于50％的百分数；1g TCID₅₀＝大于50％的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数。

固定病毒稀释血清法测定中和抗体效价：于灭菌96孔板上接种100μl HeLa细胞，将待检血清用MEM作1∶5，1∶10，1∶20，1∶40连续2倍稀释，置56℃水浴灭活30分钟，1.5ml微量离心管中每管100μl稀释血清，病毒液按每100μl含100TCID₅₀病毒量(即10^-7/100μl)，将其分别加入上述每个Ep管中，37℃水浴中和2小时，将各稀释度的血清-病毒混合液，按100μl/孔接种于HeLa细胞，每个稀释度做3个孔，另设病毒对照(100TCID₅₀/100μl)、血清对照(1∶5)、正常细胞对照各两孔，37℃5％CO₂温箱孵育，逐日在普通显微镜下观察细胞情况，观察7天，以第7天的结果作为最后结果，待检血清的各稀释度能抑制50％细胞病变出现者即为50％保护，表明该稀释度血清中有中和抗体存在。按Reed和Muench法计算距离比例∶距离比例＝50％-低于50％的病变率/大于50％的病变率-小于50％的病变率；效价＝(低于50％病变率血清稀释度的对数+距离比例×血清稀释系数的对数)的反对数。

(3)接种后的细胞免疫应答：

①淋巴细胞增殖实验：断颈处死小鼠，无菌取出脾脏，洗去血液，将脾组织研磨碎，纱网过滤，离心后加入0.83％NH4Cl放置15min，破坏红细胞，1000r/min离心收集淋巴细胞，用10％小牛血清的RPMI1640培养液悬浮脾淋巴细胞，调整细胞浓度为5×10⁵/ml，加入96孔板，每孔约200μl，每只动物脾细胞重复10孔，其中5孔为对照组，不加刀豆蛋白A(ConA)，另5孔加ConA(100μg/μl)，终浓度为10μg/μl，混匀后置37℃，5％CO₂培养66小时，取出培养板，显微镜下观察淋巴细胞增殖情况，MTT法测定细胞增殖率：于终止培养前4小时每孔加入10％SDS的0.01M HCl 100μl，震荡溶解15min后，540nm波长测定各孔的吸光度值(A)，根据各组细胞A值计算其平均值。增殖指数(proliferation index，PI)：PI＝实验组平均A值/对照组平均A值。

②CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞测定：将采集的肝素(250U/ml)抗凝血用PBS稀释后，小心的加到淋巴细胞分离液的上层，室温2000rpm离心25分钟，抽取中间白细胞层，用PBS洗一次，离心重悬后加入FITC标记的大鼠抗小鼠的CD4抗体(200倍稀释，由预实验确定)与R-PE标记的大鼠抗小鼠的CD8抗体(200倍稀释，由预实验确定)暗盒冰浴30min，用含有4％胎牛血清的PBS洗3次，流式细胞仪检测外周血淋巴细胞中CD4⁺、CD8⁺细胞的百分含量，用CellQuest软件进行数据的获取与分析。

③CTL活性测定：效应细胞的制备：参照Vignuzzi方法，无菌取小鼠脾制备单细胞悬液。0.83％NH₄Cl放置15min低渗裂解红细胞，10％FCS的RPMI 1640洗两次，用含10％FCS的RPMI 1640培养，37℃孵育1.5小时，去除贴壁细胞，收集脾细胞悬液，2000r/min，离心5min，以2％FCS的RPMI 1640调整细胞浓度为4×10⁷/ml。

靶细胞的制备：P-815细胞培养于10％FCS的RPMI 1640液，感染CVB2云南株，37℃吸附1.5小时，继续培养两天收集细胞，用PBS洗两次，然后以2％FCS的RPMI 1640调整细胞浓度为2×10⁶/ml。

特异性T细胞杀伤试验：将不同比例的效/靶细胞(E/T)混合孵育，⁵¹Cr释放法测定CTL杀伤效应。效应细胞∶靶细胞分别为12.5∶1，25∶1及50∶1，结果以γ液体闪烁计数器每分钟记录的脉冲数cpm表示。CTL杀伤率＝[(实验组cpm值-自然释放cpm值)/最大释放cpm值-自然释放cpm值]。

3、统计学处理：应用SPSS10.0统计软件进行实验数据的统计学分析。计量资料以x±s表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，并以LSD法进行组间，组内两两比较，以P＜0.05作为结果存在统计学意义的标准，以P＜0.01作为结果存在显著统计学意义的标准

结果：

一、CVB2云南分离株VP1基因的扩增：CVB2 VP1的RT-PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳可见0.85kb处有一条明亮的核酸区带，与预期值一致(图3)。

二、pMD18-T-CVB2VP1重组质粒的鉴定：重组质粒PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳可见0.85kb处有一条明亮的核酸区带，与预期值一致，经EcoR I单酶切较空载体pMD18-T大，被切成3.6kb的单一片段，初步说明VP1基因插入pMD18-T(见图4、图5)

三、CVB2云南分离株的核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析、BC环蛋白质二级结构预测：被克隆的CVB2云南分离株VP1全基因序列含846个碱基，编码282个氨基酸，如序列表CVB2云南分离株全长VP1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列所示(框内为CVB共同抗原表位；下划线为βB-βC环)，与PCR扩增片段核苷酸数目相符，无起始密码子与终止密码子。相对分子质量(M_r)为31558.74。本株CVB2 VP1含有的氨基酸中苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸所占的比例较高，分别占10.28％，9.22％，7.45％，7.45％。等电点的理论值为8.43。72～96位氨基酸构成BC环，240～252位氨基酸RIYFKPKHVKAWI为CVB可能的共同抗原表位(如序列表中CVB2VP1基因核苷酸推导的氨基酸序列与参考毒株的对应区域的联配比对所示，其中：阴影部分表示变异的氨基酸，氨基酸序列的方框内表示可能存在抗原表位的区域，-表示未测部分；预测的蛋白二级结构中H为螺旋结构，E为伸展结构，T为转角结构，C为无规卷曲))。BC环预测的蛋白质二级结构中螺旋结构(H)占35％，转角结构(T)占9％，无规卷曲(C)占17％和伸展结构(E)占39％。

四、CVB2云南分离株与Ohio-1株等VP1核苷酸及推导的氨基酸序列同源性及其变异分析：GenBank中参考毒株序列联配比对(推导的氨基酸序列联配比对见序列表)，CVB2VP1云南株与登录号为AF081312的CVB2Ohio-1株VP1基因核苷酸序列同源性最高为98％，与之比较，云南分离株存在5处错义突变，即第30、82、140、159、270位氨基酸分别由A→V，G→S，V→A，T→A，E→K；2处缺失突变，即因核苷酸序列252位-257位缺失6个A造成的推导的氨基酸序列中84位和85位各缺少1个赖氨酸，正处于βB、βC区之间，蛋白质二级结构预测表明该处为无规卷曲结构。CVB2云南分离株VP1基因与Ohio-1，jo/Roma98，fr/Roma98，sp/Roma88，816/84，China-2，China-1，MD84-5914，HON84-6016，NC95-2135，FL92-1512等11株国内外参考毒株VP1基因相应核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性分别为49％-98％，52-98％(见表2)。预测的环蛋白质二级结构中除sp/Roma88株变化较大，其余四株βB、βC区内结构完全相同。比对CVB的共同抗原表位RIYFKPKHVKAYV，RIYFKPKHVKA高度保守，为云南株及其它参考毒株的共同序列，氨基酸的变异主要在CVB2的251-252位，W→Y，V→I。

五、CVB2的进化树分析：除sp/Roma88，816/84株(因这两株165位-263位氨基酸序列无报道)，建立其余10株CVB2VP1对应氨基酸序列进化树，CVB2云南分离株与Ohio-1株同在一组，亲缘关系最近，与China-1较近，与MD84-5914、NC95-2135亲缘关系较远(见图6)。

表2  CVB2云南分离株VP1基因与参考毒株对应区核苷酸及其推导的氨基酸同源性比较

参考毒株	核苷酸同源性(％)	氨基酸同源性(％)
			Ohio-1China-1China-2NC95-2135HON84-6016816/84fr/Roma98FL92-1512MD84-5914jo/Roma98sp/Roma88	9884858284848286858349	9897979797979696969452

六、依据已测定的CVB2云南株VP1设计引物构建的pMD18-T CVB2 VP1的初步鉴定：CVB2 VP1与pMD18-T连接产物转化E.coli JM83后平板有菌落生长，粗提质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳初步筛选，获得大小约为0.85kb的PCR片段，且经EcoRI酶切获得0.85kb和2.7kb两个片段质粒初步认定为VP1基因是正向插入到pMD18-T，为目的克隆(如图7所示)。

七、pcDNA3-CVB2 VP1的PCR及酶切鉴定：CVB2 VP1与pcDNA3-连接产物转化E.coli JM83后平板有菌落生长，粗提质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳初步筛选，PCR后获得一大小约为0.85kb的产物，且经HindIII+XbaI酶切获得0.85kb和5.6kb两个片段的质粒初步认定为VP1基因是正向插入到pcDNA3，为重组阳性质粒(如图8所示)。

八、pcDNA3-CVB2 VP1测序结果：插入的CVB2 VP1采用T7和SP6通用引物测序，CVB2 VP1基因序列与pMD18-T CVB2 VP1的测序结果无差异，CVB2 VP1正确插入到pcDNA3/HindIII+XbaI酶切位点。

九、pcDNA3-CVB2VP1的体外瞬时表达：

(一)转染细胞的RT-PCR检测：取扩增产物4μl经1％琼脂糖凝胶电泳可见0.85kb处有一条明亮的核酸区带，与预期值一致(见图9)。

(二)转染细胞的间接免疫荧光检测：如图10～12所示，pcDNA3-CVB2VP1转染的50～60％HeLa细胞于48h胞内可见亮绿色的荧光，而对照细胞内无荧光。病毒感染的细胞圆缩，胞内可见颗粒样亮绿色的荧光。

十、pcDNA3 CVB2 VP1真核表达质粒免疫小鼠后CVB2特异性抗体的测定：如表2示，单纯pcDNA3质粒接种未见CVB2特异性抗体产生。pcDNA3-CVB2 VP1真核表达质粒免疫小鼠后2周时，P/N＜2.1，未检测到免疫小鼠的CVB2特异性抗体(数据未列出)；免疫后4周A₄₅₀吸光度值高于空载体组和PBS组(P＜0.001)且P/N＞2.1，即此时产生了CVB2特异性抗体，免疫后6周CVB2IgG水平高于免疫后4周(P＜0.01)，于第8周观察时CVB2特异性抗体仍存在，且与第6周无差别(P＞0.05)。从图13可以看出随着应用pcDNA3 CVB2VP1真核表达质粒的加强免疫，小鼠的CVB2 IgG有增高的趋势。

表3  小鼠基因免疫后CVB2IgG水平( x±s)ELISA检测(血清1∶100倍稀释)

组别	免疫后4周		免疫后6周		免疫后8周
							A450	P/N	A450	P/N	A450	P/N
	pcDNA3-VP1(n＝10)pcDNA3(n＝10)PBS(n＝10)	0.142±0.007*0.120±0.0070.119±0.009	＞2.1＜2.1＜2.1	0.153±0.0110.116±0.0150.118±0.005	＞2.1＜2.1＜2.1	0.150±0.0090.121±0.0100.116±0.012							＞2.1＜2.1＜2.1

^*与pcDNA3和PBS对照组进行比较P＜0.001；^与pcDNA3-VP1免疫4周比较P＜0.01，与其免疫8周比较P＞0.05；^与pcDNA3-VP1免疫后4周比较P＜0.05。

十一、TCID₅₀测定结果：依据公式及表2实验结果计算CVB2的TCID₅₀∶距离比例＝(80-50)/(80-20)＝0.5，lgTCID50＝lg(10^-8)+0.5×lg(10^-1)＝8.50，TCID₅₀＝10^-8.50，100μl，即10^-8.50的CVB2病毒悬液100μl表示1个TCD₅₀。这一稀释度可以使50％接种病毒的细胞发生病变。

表4  CVB2的TCID₅₀测定

病毒稀释度	CPE孔/总孔	CPE分布		累计		比数	百分比(％)
								(+)孔	(-)孔	(+)↓	(-)↑
		10-310-410-510-610-710-810-910-10	4/44/44/44/44/43/41/40/4	44444310	00000134							242016128410	00000148	24/2420/2016/1612/128/84/51/50/8	10010010010010080200

十二、pcDNA3CVB2 VP1真核表达质粒免疫小鼠CVB2中和抗体效价测定：经计算，第8周CVB2病毒中和抗体效价在1∶22，即1∶22稀释的血清可保护50％的细胞不产生病变(如表5所示)。

表5  小鼠CVB2DNA免疫8周50％血清中和终点

血清稀释度	CPE孔/总孔	CPE分布		累计		比数	百分比(％)
								(+)孔	(-)孔	(+)↓	(-)↑
		1∶4(10-0.6)1∶8(10-0.9)1∶16(10-1.2)1∶32(10-1.5)1∶64(10-1.8)	0/40/41/43/44/4	00134	44310							00148	128410	0/120/81/54/58/8	002080100

十三、pcDNA3 CVB2 VP1真核表达质粒免疫小鼠淋巴细胞增殖的动态变化：从图14可以观察到小鼠免疫后4周、6周T淋巴细胞较免疫后2周有所增殖(P＜0.01)，免疫后6周较4周略有增高(P＜0.05)。

十四、pcDNA3 CVB2 VP1真核表达质粒免疫小鼠CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的动态变化：小鼠经pcDNA3 CVB2 VP1真核表达质粒免疫后第4周，CD4⁺T细胞计数已较免疫后第2周增高(P＜0.05)，且高于空载体和PBS组(P＜0.05)，免疫后6周CD4⁺T细胞计数略高于重组质粒免疫后第4周(P＜0.05)，但显著高于免疫后第2周(P＜0.01)，CD4⁺T细胞计数呈增高趋势(表6，图15)。小鼠经pcDNA3 CVB2 VP1真核表达质粒免疫后第4周，第6周CD8⁺T细胞计数较免疫后第2周明显增高(P＜0.01)，且高于第二次免疫后的空载体和PBS组(P＜0.01)，免疫后第6周CD8⁺T细胞计数与免疫后第4周无差别(P＞0.05)(表7，图16)。

表6  pcDNA3-CVB2 VP1免疫后小鼠CD4⁺T细胞的变化

组别	CD4+T细胞计数(％)
				免疫后2周	免疫后4周	免疫后6周
	pcDNA3-VP1(n＝4)pcDNA3(n＝4)PBS(n＝4)	29.48±4.2929.91±3.5729.13±3.20	34.06上3.0929.63±2.3729.94±3.89				38.02±4.77*28.87±2.1527.71±3.69

^*与pcDNA3-VP1免疫2周比较P＜0.01，与pcDNA3-VP1免疫4周比较P＜0.05；^与pcDNA3-VP1免疫2周比较P＜0.05。

表7  pcDNA3 CVB2 VP1免疫后小鼠CD8⁺T细胞的变化

组别	CD8+T细胞计数(％)
				免疫后2周	免疫后4周	免疫后6周
	pcDNA3-VP1(n＝4)pcDNA3(n＝4)PBS(n＝4)	10.45±1.429.83±2.3110.04±2.90	15.93±2.54*10.25±1.3811.56±2.17				17.43±3.9012.14±2.9311.08±1.62

^*与pcDNA3-VP1免疫2周比较P＜0.01，与pcDNA3-VP1免疫6周比较P＞0.05；^与pcDNA3-VP1免疫2周比较P＜0.01。

十五、CTL活性测定：小鼠pcDNA3-CVB2 VP1免疫后CVB2 VP1特异性CTL活性如表8所示，以100μg/鼠重组质粒免疫小鼠，第8周时不同E/T比例，pcDNA3-VP1接种组CTL特异杀伤百分率均高于pcDNA3组(P＜0.01)，随着E/T比例升高，CTL特异性杀伤百分率也逐渐上升，当E/T为50∶1时pcDNA3-VP1免疫后特异性CTL杀伤百分率最高，为(31.2±6.8)％(P＜0.05)(见表8)。

表8  小鼠pcDNA3-VP1免疫后CVB2 VP1特异性CTL活性

组别	不同效应细胞、靶细胞比例(E/T)CTL杀伤率(％)
				50∶1	25∶1	12.5∶1
	pcDNA3-VP1(n＝10)pcDNA3(n＝10)	31.2±6.81)，2)8.7±4.1	23.4±4.71)9.3±3.1				19.1±3.51)8.0±1.6

¹⁾与pcDNA3组比较P＜0.01，；²⁾与组内E/T比为25∶1，12.5∶1时比较P＜0.0。

                           序列表

一、CVB2VP1的DNA序列：

CCAAGCTGGC TAGCGTTTAA ACTTAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACGA TTGAATTCGT     60

CATGAGCCCA GTGGAGGAAT CCATTGAGAG AAGCATTGGC AGAGTTGCTG ACACCATTGG    120

TAGTGGACCA TCCAATTCGG AGGCAATACC GGTACTCACA GCAGTAGAAA CAGGACACAC    180

ATCACAGGTT ACACCTAGTG ACACGATGCA AACAAGACAT GTGCACAACT ACCATTCAAG    240

GTCCGAATCC AGCGTAGAGA ACTTCCTGGC ACGCTCGGCT TGTGTGTTTT ATACAACATA    300

CACCAACAGT AAAAATGCCG CCAAAGAGAA GAAGTTTGCA ACGTGGAAGG TGAGTGTTAG    360

ACAAGCCGCC CAACTAAGAA GAAAGCTAGA GCTATTCACA TACTTACGCT GTGACATCGA    420

ACTAACATTC GTCATCACCA GTGCACAAGA TCCATCGACC GCTACCAACT TGGATGCGCC    480

AGTGTTGACC CATCAAATAA TGTACGTCCC ACCTGGTGGT CCAGTCCCTG AAGCCGTGGA    540

CGATTACAAC TGGCAAACAT CTACAAATCC CAGCCTTTTT TGGACTGAAG GGAATGCACC    600

TCCACGCATG TCAATTCCAT TCATGAGCAT AGGCAATGCC TATAGTATGT TCTATGATGG    660

TTGGTCCGAG TTTAGGCATG ACGGTGTGTA CGGCCTGAAT ACCCTTAACA ATATGGGCAC    720

AATATATGCT AGGCACGTCA ACGCTGACAA CCCAGGTAGC ATCACCAGCA CAGTGAGAAT    780

ATACTTCAAA CCCAAACATG TCAAGGCATG GATTCCTCGC CCGCCTCGTT TGGCACAGTA    840

TCTTAAAGCC AATAATGTGA ATTTTAAGAT CACCGATGTG ACAGAAAAGA GAGATAGTCT    900

CACGACCACG AATCTCTAGA GGGCCCGTTT AAACCCGCTG                          940

二、质粒pcDNA3-CVB2VP1 DNA序列

GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTCGACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG     60

CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG    120

CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC    180

TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT    240

GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA    300

TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC    360

CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC    420

ATTGACGTCA ATGGGTGGAC TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT    480

ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT    540

ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA    600

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG    660

ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC    720

AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG    780

GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCT CTGGCTAACT AGAGAACCCA    840

CTGCTTACTG GCTTATCGAA ATTAATACGA CTCACTATAG GGAGACCCAA GCTTGCATGC    900

CTGCAGGTCG ACGATTGAAT TCGTCATGAG CCCAGTGGAG GAATCCATTG AGAGAAGCAT    960

TGGCAGAGTT GCTGACACCA TTGGTAGTGG ACCATCCAAT TCGGAGGCAA TACCGGTACT   1020

CACAGCAGTA GAAACAGGAC ACACATCACA GGTTACACCT AGTGACACGA TGCAAACAAG   1080

ACATGTGCAC AACTACCATT CAAGGTCCGA ATCCAGCGTA GAGAACTTCC TGGCACGCTC   1140

GGCTTGTGTG TTTTATACAA CATACACCAA CAGTAAAAAT GCCGCCAAAG AGAAGAAGTT   1200

TGCAACGTGG AAGGTGAGTG TTAGACAAGC CGCCCAACTA AGAAGAAAGC TAGAGCTATT   1260

CACATACTTA CGCTGTGACA TCGAACTAAC ATTCGTCATC ACCAGTGCAC AAGATCCATC   1320

GACCGCTACC AACTTGGATG CGCCAGTGTT GACCCATCAA ATAATGTACG TCCCACCTGG   1380

TGGTCCAGTC CCTGAAGCCG TGGACGATTA CAACTGGCAA ACATCTACAA ATCCCAGCCT   1440

TTTTTGGACT GAAGGGAATG CACCTCCACG CATGTCAATT CCATTCATGA GCATAGGCAA    1500

TGCCTATAGT ATGTTCTATG ATGGTTGGTC CGAGTTTAGG CATGACGGTG TGTACGGCCT    1560

GAATACCCTT AACAATATGG GCACAATATA TGCTAGGCAC GTCAACGCTG ACAACCCAGG    1620

TAGCATCACC AGCACAGTGA GAATATACTT CAAACCCAAA CATGTCAAGG CATGGATTCC    1680

TCGCCCGCCT CGTTTGGCAC AGTATCTTAA AGCCAATAAT GTGAATTTTA AGATCACCGA    1740

TGTGACAGAA AAGAGAGATA GTCTCACGAC CACGAATCTC TAGAGGGCCC TATTCTATAG    1800

TGTCACCTAA ATGCTAGAGC TCGCTGATCA GCCTCGACTG TGCCTTCTAG TTGCCAGCCA    1860

TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG AAGGTGCCAC TCCCACTGTC    1920

CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGA GTAGGTGTCA TTCTATTCTG    1980

GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGG AAGACAATAG CAGGCATGCT    2040

GGGGATGCGC TGGGCTCTAT GGCTTCTGAG GCGGAAAGAA CCAGCTGGGG CTCTAGGGGG    2100

TATCCCCACG CGCCCTGTAG CGGCGCATTA AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT TACGCGCAGC    2160

GTGACCGCTA CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCGCTTTCTT CCCTTCCTTT    2220

CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGCATCCC TTTAGGGTTC    2280

CGATTTAGTG CTTTACGGCA CCTCGACCCC AAAAAACTTG ATTAGGGTGA TGGTTCACGT    2340

AGTGGGCCAT CGCCCTGATA GACGGTTTTT CGCCCTTTGA CGTTGGAGTC CACGTTCTTT    2400

AATAGTGGAC TCTTGTTCCA AACTGGAACA ACACTCAACC CTATCTCGGT CTATTCTTTT    2460

GATTTATAAG GGATTTTGGG GATTTCGGCC TATTGGTTAA AAAATGAGCT GATTTAACAA    2520

AAATTTAACG CGAATTAATT CTGTGGAATG TGTGTCAGTT AGGGTGTGGA AAGTCCCCAG    2580

GCTCCCCAGG CAGGCAGAAG TATGCAAAGC ATGCATCTCA ATTAGTCAGC AACCAGGTGT    2640

GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA    2700

GCAACCATAG TCCCGCCCCT AACTCCGCCC ATCCCGCCCC TAACTCCGCC CAGTTCCGCC    2760

CATTCTCCGC CCCATGGCTG ACTAATTTTT TTTATTTATG CAGAGGCCGA GGCCGCCTCT    2820

GCCTCTGAGC TATTCCAGAA GTAGTGAGGA GGCTTTTTTG GAGGCCTAGG CTTTTGCAAA    2880

AAGCTCCCGG GAGCTTGTAT ATCCATTTTC GGATCTGATC AAGAGACAGG ATGAGGATCG    2940

TTTCGCATGA TTGAACAAGA TGGATTGCAC GCAGGTTCTC CGGCCGCTTG GGTGGAGAGG    3000

CTATTCGGCT ATGACTGGGC ACAACAGACA ATCGGCTGCT CTGATGCCGC CGTGTTCCGG    3060

CTGTCAGCGC AGGGGCGCCC GGTTCTTTTT GTCAAGACCG ACCTGTCCGG TGCCCTGAAT    3120

GAACTGCAGG ACGAGGCAGC GCGGCTATCG TGGCTGGCCA CGACGGGCGT TCCTTGCGCA    3180

GCTGTGCTCG ACGTTGTCAC TGAAGCGGGA AGGGACTGGC TGCTATTGGG CGAAGTGCCG    3240

GGGCAGGATC TCCTGTCATC TCACCTTGCT CCTGCCGAGA AAGTATCCAT CATGGCTGAT    3300

GCAATGCGGC GGCTGCATAC GCTTGATCCG GCTACCTGCC CATTCGACCA CCAAGCGAAA    3360

CATCGCATCG AGCGAGCACG TACTCGGATG GAAGCCGGTC TTGTCGATCA GGATGATCTG    3420

GACGAAGAGC ATCAGGGGCT CGCGCCAGCC GAACTGTTCG CCAGGCTCAA GGCGCGCATG    3480

CCCGACGGCG AGGATCTCGT CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG    3540

GAAAATGGCC GCTTTTCTGG ATTCATCGAC TGTGGCCGGC TGGGTGTGGC GGACCGCTAT    3600

CAGGACATAG CGTTGGCTAC CCGTGATATT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA ATGGGCTGAC    3660

CGCTTCCTCG TGCTTTACGG TATCGCCGCT CCCGATTCGC AGCGCATCGC CTTCTATCGC    3720

CTTCTTGACG AGTTCTTCTG AGCGGGACTC TGGGGTTCGA AATGACCGAC CAAGCGACGC    3780

CCAACCTGCC ATCACGAGAT TTCGATTCCA CCGCCGCCTT CTATGAAAGG TTGGGCTTCG    3840

GAATCGTTTT CCGGGACGCC GGCTGGATGA TCCTCCAGCG CGGGGATCTC ATGCTGGAGT    3900

TCTTCGCCCA CCCCAACTTG TTTATTGCAG CTTATAATGG TTACAAATAA AGCAATAGCA    3960

TCACAAATTT CACAAATAAA GCATTTTTTT CACTGCATTC TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC    4020

TCATCAATGT ATCTTATCAT GTCTGTATAC CGTCGACCTC TAGCTAGAGC TTGGCGTAAT    4080

CATGGTCATA GCTGTTTCCT GTGTGAAATT GTTATCCGCT CACAATTCCA CACAACATAC    4140

GAGCCGGAAG CATAAAGTGT AAAGCCTGGG GTGCCTAATG AGTGAGCTAA CTCACATTAA    4200

TTGCGTTGCG CTCACTGCCC GCTTTCCAGT CGGGAAACCT GTCGTGCCAG CTGCATTAAT    4260

GAATCGGCCA ACGCGCGGGG AGAGGCGGTT TGCGTATTGG GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC    4320

TCACTGACTC GCTGCGCTCG GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG    4380

CGGTAATACG GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG    4440

GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC    4500

GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA AACCCGACAG    4560

GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA    4620

CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC    4680

AATGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG    4740

TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT    4800

CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA    4860

GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA    4920

CTAGAAGGAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG    4980

TTGGTAGCTC TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA    5040

AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG    5100

GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG AGATTATCAA    5160

AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA    5220

TATATGAGTA AACTTGGTCT GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG    5280

CGATCTGTCT ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA    5340

TACGGGAGGG CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC    5400

CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC    5460

CTGCAACTTT ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA    5520

GTTCGCCAGT TAATAGTTTG CGCAACGTTG TTGCCATTGC TACAGGCATC GTGGTGTCAC    5580

GCTCGTCGTT TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT    5640

GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA    5700

GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT TCTCTTACTG    5760

TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG    5820

AATAGTGTAT GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AATACGGGAT AATACCGCGC    5880

CACATAGCAG AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT    5940

CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT    6000

CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA AGGCAAAATG    6060

CCGCAAAAAA GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC    6120

AATATTATTG AAGCATTTAT CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA    6180

TTTAGAAAAA TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGACG    6240

三、CVB2云南分离株全长VP1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列

1    AGC CCA GTG GAG GAA TCC ATT GAG AGA AGC ATT GGC AGA GTT GCT GAC ACC ATT GGT AGT GGA CCA TCC AAT TCG GAG

1     S   P   V   E   E   S   I   E   R   S   I   G   R   V   A   D   T   I   G   S   G   P   S   N   S   E

79   GCA ATA CCG GTA CTC ACA GCA GTA GAA ACA GGA CAC ACA TCA CAG GTT ACA CCT AGT GAC ACG ATG CAA ACA AGA CAT

27    A   I   P   V   L   T   A   V   E   T   G   H   T   S   Q   V   T   P   S   D   T   M   Q   T   R   H

157  GTG CAC AAC TAC CAT TCA AGG TCC GAA TCC AGC GTA GAG AAC TTC CTG GCA CGC TCG GCT TGT GTG TTT TAT ACA ACA

53    V   H   N   Y   H   S   R   S   E   S   S   V   E   N   F   L   A   R   S    A   C   V   F   Y   T   T

                                                                                    -——————βB—————

235    TAC ACC AAC AGT AAA AA— —— —T GCC GCC AAA GAG AAG AAG TTT GCA ACG TGG AAG GTG AGT GTT AGA CAA GCC GCC

79      Y   T   N   S   K  (K  K)    N    A   A   K   E   K   K   F   A   T   W   K   V   S   V   R   Q   A   A

       ——————|                                |—————βC—————

313    CAA CTA AGA AGA AAG CTA GAG CTA TTC ACA TAC TTA CGC TGT GAC ATC GAA CTA ACA TTC GTC ATC ACC AGT GCA CAA

105     Q   L   R   R   K   L   E   L   F   T   Y   L   R   C   D   I   E   L   T   F   V   I    T  S   A   Q

391    GAT CCA TCG ACC GCT ACC AAC TTG GAT SCS CCA GTG TTG ACC CAT CAA ATA ATG TAC GTC CCA CCT GGT SST CCA GTC

131     D   P   S   T   A   T   N   L   D   A   P   V   L   T   H   Q   I   M   Y   V   P   P   G   G   P   V

469    CCT GAA GCC GTG GAC GAT TAC AAC TGG CAA ACA TCT ACA AAT CCC AGC CTT TTT TGG ACT GAA GGG AAT GCA CCT CCA

157     P   E   A   V   D   D   Y   N   W   Q   T   S   T   N   P   S   L   F   W   T   E   G   N   A   P   P

547    CGC ATG TCA ATT CCA TTC ATG AGC ATA GGC AAT GCC TAT AGT ATG TTC TAT GAT GGT TGG TCC GAG TTT AGG CAT GAC

183     R   M   S   I   P   F   M   S   I   G   N   A   Y   S   M   F   Y   D   G   W   S   E   F   R   H   D

627    GGT GTG TAC GGC CTS AAT ACC CTT AAC AAT ATG GGC ACA ATA TAT GCT AGG CAC GTC AAC GCT GAC AAC CCA GGT AGC

209     G   V   Y   G   L   N   T   L   N   N   M   G   T   I   Y   A   R   H   V   N   A   D   N   P   G   S

705    ATC ACC AGC ACA GTG AGA ATA TAC TTC AAA CCC AAA CAT GTC AAG GCA TGG ATT CCT CGC CCG CCT CGT TTG GCA CAG

235     I   S   T   V

P   R   P   P   R   L   A   Q

783    TAT CTT AAA GCC AAT AAT GTG AAT TTT AAG ATC ACC GAT GTG ACA GAA AAG AGA GAT AGT CTC ACG ACC ACG

261     Y   L   K   A   N   N   V   N   F   K   I   T   D   V   T   E   K   R   D   S   L   T   T   T

四、CVB2VP1基因核苷酸推导的氨基酸序列与参考毒株的对应区域的联配比对

1                                                               100

Yunnan    SPVEESIERSIGRVADTISSSPSNSEAIPVLTAVETGHTSQVTPSDTMQTRHVHNYHSRSESSVENFLARS KVSV

Secondary structure                                                              HEEEEEECCTTC—CHHHHHHHEEE

Ohi-1    SPVEESIERSIGRVADTIGSGPSNSEAIPALTAVETGHTSQVTPSDTMQTRHVHNYHSRSESSVENFLARS KVSV

Secondary structure                                                              HEEEEEECCTTCCCCHHHHHHHHEE

jo/RoMA98 ————————————————————————————————————————————————

fr/Rona98 ————————————————————————————————————————————————

sp/Roma  ———————————————————————————KHVRSESTIENFLARS

VITT

Secondary structure                                                              HEEEEEECCCCCC—CCCCCCCCE

816/84  SPVEESIERSIGRVADTIGSGPSNSEAIPALTAVETGHTSQVTPSDTMQTRHVRNYHSRSESSVENFLARS KVSV

Secondary structure                                                              HEEEEEECCTTC—CHHHHHHHHEE

China-2 SPVEESIERSIGRVADTIGSGPSNSEAIPALTAVETGHTSQVTPSDTMQTRHVHNYHSRSESSVENFLARS

KVSV

Secondary structure                                                              HEEEEEECCTTC—CHHHHHHHHEE

China-1  —————————————————————————————————————————————————

MD84     —————————————————————————————————————————————————

HON84    —————————————————————————————————————————————————

NC95     —————————————————————————————————————————————————

FL92     —————————————————————————————————————————————————

101                                                                                                      200

Yunnan  RQAAQLRRKLELFTYLRCDIELTFVITSAQDPSTATNLDAPVLTHQIMYVPPGGPVPEAVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYD

Ohi-1   RQAAQLRRKLELFTYLRCDIELTFVITSAQDPSTATNLDVPVLTHQIMYVPPGGPVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYD

jo/Roma98———————————————————————MYVPXGGPVPESVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYD

fr/Roma98———————————————————————————VPESVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYD

sp/Roma RKVAQLRRKLEMFTYLRFDMEITVVITSSQDQSTSQNQNAPVLTHQIM——————————————————————————

816/84  RQAAQLRRKLELFTYLRCDIELTFVITSAQDPSTATNLDVPVLTHQIMYVPPGGPVPETVDDYNWQTSTNQSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIG————

China-2 RQAAQLRRKLELFTYLRCDIELTFVITSAQDPSTAKNLDVPVLTHQIMYVPPGGPVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMEYD

China-1 ————————————————————————————————WQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYD

MD84    ———————————————————————————PVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYD

HON84   ———————————————————————————PVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYD

NC95    ———————————————————————————PVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYD

FL92    ———————————————————————————PVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYD

201     —————————————————————————————————————————————————300

Yunnan  GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV

PRPPRLAQYLKANNVNFKITDVTEKRDSLTTT—.............................................................................

OhiO-1  GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV

PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRDSLTTT—....

jo/Roma98GwSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNFEITDVTEKRESL——...........

fr/Roma98GwSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRESLVTT—........

sp/Roma88———————————————————————————————————————————............

816/84   ———————————————————————————————————————————............

China-2  GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRESLTTT—........

China-1  GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV

PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRESLTTT—........

MD84     GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRDSLVTTGA.........

HON84    GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV

PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRDSLTTTGA.........

NC95     GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV

PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRDSLTTT—.........

FL92    GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRDSLVTT—.........

五、pcDNA3-CVB2VP1测序结果

                           HindIII

1    CCAAGCTGGC TAGCGTTTAAA CTT AAGCTTG CATGCCTGCA GGTCGACGA

      EcoRI

51   TT GAATTCGT CATGAGCCCAG TGGAGGAATC CATTGAGAGA AGCATTGGC

101  AGAGTTGCTG ACACCATTGGT AGTGGACCAT CCAATTCGGA GGCAATACC

151  GGTACTCACA GCAGTAGAAAC AGGACACACA TCACAGGTTA CACCTAGTG

201  ACACGATGCA AACAAGACATG TGCACAACTA CCATTCAAGG TCCGAATCC

251  AGCGTAGAGA ACTTCCTGGCA CGCTCGGCTT GTGTGTTTTA TACAACATA

301  CACCAACAGT AAAAATGCCGC CAAAGAGAAG AAGTTTGCAA CGTGGAAGG

351  TGAGTGTTAG ACAAGCCGCCC AACTAAGAAG AAAGCTAGAG CTATTCACA

401  TACTTACGCT GTGACATCGAA CTAACATTCG TCATCACCAG TGCACAAGA

451  TCCATCGACC GCTACCAACTT GGATGCGCCA GTGTTGACCC ATCAAATAA

501  TGTACGTCCC ACCTGGTGGTC CAGTCCCTGA AGCCGTGGAC GATTACAAC

551  TGGCAAACAT CTACAAATCCC AGCCTTTTTT GGACTGAAGG GAATGCACC

601  TCCACGCATG TCAATTCCATT CATGAGCATA GGCAATGCCT ATAGTATGT

651  TCTATGATGG TTGGTCCGAGT TTAGGCATGA CGGTGTGTAC GGCCTGAAT

701  ACCCTTAACA ATATGGGCACA ATATATGCTA GGCACGTCAA CGCTGACAA

751  CCCAGGTAGC ATCACCAGCAC AGTGAGAATA TACTTCAAAC CCAAACATG

801  TCAAGGCATG GATTCCTCGCC CGCCTCGTTT GGCACAGTAT CTTAAAGCC

851  AATAATGTGA ATTTTAAGATC ACCGATGTGA CAGAAAAGAG AGATAGTCT

901   CACGACCACG AATC TCTAGAG GGCCCGTTTA AACCCGCTG

                   Xba I  Apa I

Claims (3)

1、柯萨奇病毒B组2型基因疫苗，其特征在于所述柯萨奇病毒B组2型基因疫苗是一种由真核表达系统pcDNA3和CVB2VP1基因组成的pcDNA3-CVB2VP1真核表达质粒。

2、根据权利要求1所述的柯萨奇病毒B组2型基因疫苗，其特征在于CVB2VP1基因的基因序列为：

CCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGAATTCGTCATGAGCC

CAGTGGAGGAATCCATTGAGAGAAGCATTGGCAGAGTTGCTGACACCATTGGTAGTGGACCATCCAAT

TCGGAGGCAATACCGGTACTCACAGCAGTAGAAACAGGACACACATCACAGGTTACACCTAGTGACAC

GATGCAAACAAGACATGTGCACAACTACCATTCAAGGTCCGAATCCAGCGTAGAGAACTTCCTGGCAC

GCTCGGCTTGTGTGTTTTATACAACATACACCAACAGTAAAAATGCCGCCAAAGAGAAGAAGTTTGCA

ACGTGGAAGGTGAGTGTTAGACAAGCCGCCCAACTAAGAAGAAAGCTAGAGCTATTCACATACTTACG

CTGTGACATCGAACTAACATTCGTCATCACCAGTGCACAAGATCCATCGACCGCTACCAACTTGGATG

CGCCAGTGTTGACCCATCAAATAATGTACGTCCCACCTGGTGGTCCAGTCCCTGAAGCCGTGGACGAT

TACAACTGGCAAACATCTACAAATCCCAGCCTTTTTTGGACTGAAGGGAATGCACCTCCACGCATGTC

AATTCCATTCATGAGCATAGGCAATGCCTATAGTATGTTCTATGATGGTTGGTCCGAGTTTAGGCATG

ACGGTGTGTACGGCCTGAATACCCTTAACAATATGGGCACAATATATGCTAGGCACGTCAACGCTGAC

AACCCAGGTAGCATCACCAGCACAGTGAGAATATACTTCAAACCCAAACATGTCAAGGCATGGATTCC

TCGCCCGCCTCGTTTGGCACAGTATCTTAAAGCCAATAATGTGAATTTTAAGATCACCGATGTGACAG

AAAAGAGAGATAGTCTCACGACCACGAATCTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTG。

3、根据权利要求1所述的柯萨奇病毒B组2型基因疫苗，其特征在于质粒pcDNA3-CVB2VP1的DNA序列为：

GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAG

TTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGC

TACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGC

TTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATT

ACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCC

TGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAA

TAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAA

GTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGC

CCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA

TGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGT

CTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCG

TAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAG

CTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG

ACCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGAATTCGTCATGAGCCCAGTGGAGGAATCCATTGAG

AGAAGCATTGGCAGAGTTGCTGACACCATTGGTAGTGGACCATCCAATTCGGAGGCAATACCGGTACT

CACAGCAGTAGAAACAGGACACACATCACAGGTTACACCTAGTGACACGATGCAAACAAGACATGTGC

ACAACTACCATTCAAGGTCCGAATCCAGCGTAGAGAACTTCCTGGCACGCTCGGCTTGTGTGTTTTAT

ACAACATACACCAACAGTAAAAATGCCGCCAAAGAGAAGAAGTTTGCAACGTGGAAGGTGAGTGTTAG

ACAAGCCGCCCAACTAAGAAGAAAGCTAGAGCTATTCACATACTTACGCTGTGACATCGAACTAACAT

TCGTCATCACCAGTGCACAAGATCCATCGACCGCTACCAACTTGGATGCGCCAGTGTTGACCCATCAA

ATAATGTACGTCCCACCTGGTGGTCCAGTCCCTGAAGCCGTGGACGATTACAACTGGCAAACATCTAC

AAATCCCAGCCTTTTTTGGACTGAAGGGAATGCACCTCCACGCATGTCAATTCCATTCATGAGCATAG

GCAATGCCTATAGTATGTTCTATGATGGTTGGTCCGAGTTTAGGCATGACGGTGTGTACGGCCTGAAT

ACCCTTAACAATATGGGCACAATATATGCTAGGCACGTCAACGCTGACAACCCAGGTAGCATCACCAG

CACAGTGAGAATATACTTCAAACCCAAACATGTCAAGGCATGGATTCCTCGCCCGCCTCGTTTGGCAC

AGTATCTTAAAGCCAATAATGTGAATTTTAAGATCACCGATGTGACAGAAAAGAGAGATAGTCTCACG

ACCACGAATCTCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCG

ACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG

TGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATT

CTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCT

GGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCA

CGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTG

CCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCC

CGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAA

AAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGA

CGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCG

GTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTA

ACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTC

CCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCA

GGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCT

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TTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTC

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