CN1763195A - 一个人源的Nanog基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents
一个人源的Nanog基因及其编码蛋白与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1763195A CN1763195A CN 200510098452 CN200510098452A CN1763195A CN 1763195 A CN1763195 A CN 1763195A CN 200510098452 CN200510098452 CN 200510098452 CN 200510098452 A CN200510098452 A CN 200510098452A CN 1763195 A CN1763195 A CN 1763195A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- dna
- gene
- nanog gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 101150012532 NANOG gene Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 2
- 229940021171 curative drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 2
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 22
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 102220023256 rs387907547 Human genes 0.000 description 5
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 3
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 3
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910020700 Na3VO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 102220369447 c.1352G>A Human genes 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- YDTFRJLNMPSCFM-YDALLXLXSA-M levothyroxine sodium anhydrous Chemical compound [Na+].IC1=CC(C[C@H](N)C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 YDTFRJLNMPSCFM-YDALLXLXSA-M 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005084 Multigene Family Proteins 0.000 description 1
- 108020005093 RNA Precursors Proteins 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 102220369446 c.1274G>A Human genes 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 102220004457 rs11567847 Human genes 0.000 description 1
- 102220023257 rs387907546 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一个人源的Nanog基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一个人源的Nanog基因及其编码蛋白与其在肿瘤的检测、治疗中的应用。该基因是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明为肿瘤的快速检测及治疗提供了一条新的途径，将在肿瘤的检测及其治疗性药物的制备中发挥重大作用。
Description
技术领域
本发明涉及基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个来源于人的Nanog基因及其编码蛋白与其在肿瘤的检测及治疗性药物制备中的应用。
背景技术
Nanog是2003年刚发现的核转录因子，它具有homeodomain结构域，在胚胎干细胞的自我更新和多能性维持中起到十分重要的作用(Mitsui et al.，Cell，2003：113，631-642)。Nanog基因仅在鼠和人的ES、EG和EC中表达，在分化细胞和正常组织中不表达，而且该基因在鼠和人中具有较高的同源性。Nanog基因在上述全能性细胞中起到自我更新的作用，并且实验证实它对细胞的生长周期具有影响。
在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因。假基因与有功能的基因同源，原来可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或点突变等原因，使这些基因失去活性，成为没有功能的基因。造成假基因的原因之一，可能是基因经过转录后生成的RNA前体通过剪接失去内含子形成mRNA，mRNA经反复转录产生cDNA，再整合到染色体DNA中，便成为假基因，因此假基因是没有内含子的，在这个过程中，可能同时会发生缺失，倒位或点突变等变化，从而使假基因不能表达。
人的Nanog基因具有11个假基因，它们分布在不同的染色体上。假基因1具有内含子和外显子，其它几个假基因没有内含子，而且除了假基因8外别的假基因都具有内部终止子。理论上认为假基因8不能称为假基因而应该称之为逆转录基因，因为它具有完整的编码框，而且具有Alu序列。但是迄今为止，还未发现假基因8的任何EST序列。
发明内容
本发明的目的是提供一个人源的Nanog基因及其编码蛋白。
本发明所提供的Nanog基因，名称为NANOGP8(简称NgP8)，来源于人属人(Homosapiens)，是下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №：1由918个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至918位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第300至479位碱基编码homeodomain结构域。
所述Nanog基因NANOGP8编码的蛋白(NANOGP8)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1)序列表中的SEQ ID №：2；
2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对肿瘤细胞的自我更新和生长周期具有调控作用的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №：2由305个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第100至159位氨基酸残基为homeodomain结构域。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增NANOGP8中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明提供了一个人源的Nanog基因NANOGP8，实验证明，该基因与细胞增殖关系密切，它的发现，为肿瘤的快速检测及治疗提供了一条新的途径，将在肿瘤的检测及其治疗性药物的制备中发挥重大作用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为PCR检测Nanog基因及其假基因8在不同细胞系中表达情况的结果
图2为PCR检测Nanog基因及其假基因8在人正常组织和肿瘤组织中表达情况的结果
图3为NANOGP8与人Nanog基因的核苷酸序列比对结果
图4为Western blot检测NANOGP8在OS732、HepG2中表达情况的结果
图5为分别转染pQCXIN-NANOGP8和pQCXIN空载体的NIH3T3细胞的生长曲线
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及探针均由上海生工合成。
实施例1、人源Nanog基因NANOGP8全长序列的获得
根据已公开的Nanog基因的核苷酸序列(GenBank号：AB093576)，设计两对引物：引物对1(引物1和引物2)可特异性扩增Nanog基因，扩增片段的大小为439bp；根据假基因8和Nanog基因具有较高的同源性而设计的引物对2(引物3和引物4)，可同时扩增出两者的大小为292bp的片段，引物序列如下：
引物1(上游引物)：5’-TAGAGACTCCAGGATTTTAACG-3’
引物2(下游引物)：5’-GTGGGTTGTTTGCCTTTGGGAC-3’；
引物3(上游引物)：5’-ATCCGACTGTAAAGAATCTTCAC-3’
引物4(下游引物)：5’-TCTATCATTGAGTACACACAGC-3’
首先以正常的人成纤维细胞和不同人源肿瘤细胞的总RNA为模板，分别在引物对1和引物对2的引导下，进行RT-PCR扩增，以Actin基因为参照(上游引物：5’-TCACCACCACGGCCGAGCG-3’和下游引物：5’-TCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’)，20ulPCR反应体系为：模板2ul；上、下游引物各2ul；dNTP 2ul；rTaq酶缓冲液(试剂盒自带)2ul；水11.9ul；rTaq酶(Takara公司)0.1ul；PCR反应条件为：先94℃5分钟；然后94℃40秒，55℃40秒，72℃1分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道1-8分别为以下述细胞的RT-PCR扩增产物：正常的人成纤维细胞、OS732细胞、HepG2细胞、MCF-7细胞、THP-1细胞、Hela细胞、畸胎瘤PA-1和NTERA-2细胞)，表明439bp的Nanog基因片段只在畸胎瘤PA-1和NTERA细胞中表达，在其余的细胞中不表达，在肿瘤细胞OS732、HepG2、MCF-7、PA-1和NTERA-2中均检测到了292bp的片段，综合两对引物的PCR扩增结果，推测在OS732、HepG2和MCF-7肿瘤细胞表达的是假基因8。
再利用上述两对引物，在人正常皮肤组织和不同的人源肿瘤组织中用同样方法进行PCR检测，检测结果如图2所示(泳道1-11分别为以下述组织和肿瘤细胞的RT-PCR扩增产物：人正常皮肤组织；人肾、乳腺、宫颈、膀胱、甲状腺、食道、胃、结肠、肺来源的肿瘤组织；畸胎瘤PA-1细胞)，表明439bp的Nanog基因片段仅在畸胎瘤细胞PA-1中表达，在人正常皮肤组织和各种肿瘤组织中不表达，292bp的片段在上述各种肿瘤组织和畸胎瘤细胞PA-1都有表达，综合两对引物的PCR扩增结果，推测在人肾、乳腺、宫颈、膀胱、甲状腺、食道、胃、结肠和肺来源的肿瘤组织中表达的是假基因8。回收并纯化从上述肿瘤组织中扩增出的292bp的片段，将其克隆入T载体pGEM-T(Promega公司)中，进行测序，测序结果表明所表达的确实是与Nanog基因具有较高同源性的假基因8，与预期结果相符。
根据假基因8 292bp片段的序列设计引物，RT-PCR扩增其全长序列，引物序列如下：
引物5(上游引物)：5’-ACCGAATTCATGAGTGTGGATCCAGCTTGTC-3’
引物6(下游引物)：5’ATTGTCGACTCACACGTCTTCAGGTTGCATG-3’
以人膀胱肿瘤组织的总RNA为模板，在引物5和引物6的引导下，进行PCR扩增，50ul PCR反应体系为：模板5ul；上、下游引物各5ul；dNTP 5ul；ExTaq酶缓冲液5ul；水29.8ul；ExTaq酶(Takara公司)0.2ul；PCR反应条件为：先94℃5分钟；然后94℃40秒，55℃40秒，72℃1分钟30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约918bp的目的片段，将该目的基因命名为NANOGP8(简称NgP8)，将其克隆到载体pGEM-T(Promega公司)中，筛选阳性克隆，将含有NANOGP8的重组质粒载体命名为NANOGP8-pGEM-T，进行测序，测序结果表明NANOGP8具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：1由918个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至918位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第300至479位碱基编码homeodomain结构域。将NANOGP8与人Nanog基因进行核苷酸序列比对，序列比对结果如图3所示，NANOGP8与人Nanog基因只有6个碱基的差别，两者编码的氨基酸残基序列仅有一个氨基酸残基的差别，相似性较高。
实施例2、用Nanog的抗体检测NANOGP8在OS732、HepG2中的表达情况
因为Nanog和NANOGP8只有一个氨基酸残基的差别，故用Nanog的抗体检测NANOGP8在OS732、HepG2中的表达情况，具体方法如下：
1、核蛋白的抽提
1)将细胞用冷的PBS洗两次，其中一次是用PBS+1mM Na3VO4+5mM NaF，另外一次是用低渗溶液(PBS+20mM Hepes+20mM NaF+1mM Na3VO4+1mM Na4P2O7+1mM EDTA+1mMEGTA+1mM DTT+0.5mM PMSF+1ug/mL leupeptin+1ug/mL Aprotunin+1ug/mL Pepstain)；
2)将冷的低渗溶液+0.2％NP40(总共0.5mL)加到10cm培养皿中裂解细胞；
3)将裂解的细胞收集到1.5mL离心管中，混匀，16000g离心20s，得到的上清为胞质溶胶，沉淀为细胞核；
4)用150ul的高盐缓冲液(低渗溶液+420uM NaCl+20％甘油)重悬细胞核，缓慢摇动30min
5)16000g、4℃离心20min，上清即为核蛋白。
2、表达蛋白的Western blot检测
1)将步骤1获得的蛋白样品跑10％SDS-PAGE，按胶的大小裁剪NC膜(购自AmershamBiosciences公司)一张，3mm Watmman滤纸四张。将胶和NC膜及滤纸在电转液中浸泡10min；
2)依次放上：海绵垫片、两层滤纸、胶、NC膜、两层滤纸、海绵垫片，安装完毕后在Amersham Biosciences电转系统恒压下100V转膜50minutes；
3)将NC膜置封闭液中封闭12-24小时；
4)将一抗(Nanog的抗体，购自R&D公司，货号AF1997，以Actin的抗体为参照)用TBST以1∶1000稀释，NC膜浸于其中轻摇1小时，再用TBST洗膜三次，每次10min；
5)将碱磷酶标记的anti-mouse IgG(购自Sigma公司)用TBST以1∶20000稀释，NC膜浸于其中轻摇1小时，再用TBST洗膜三次，每次10min；
6)准备10mL碱磷酶显色溶液，先后加入66μl NBT和33μl BCIP底物储液并混匀；
7)将NC膜在滤纸上轻轻吸干，转移至显色液中。当显色合适后，将膜置于去离子水中终止反应。
检测结果如图4所示(泳道1-4分别为：正常的成纤维细胞(阴性对照)、HepG2、PA-1(阳性对照)、OS732)，表明检测到的应该是NANOGP8的全蛋白，证明NAMOGP8不是一个假基因，而是一个真基因。推测该基因可能与Nanog基因在细胞的自我更新中具有相似的作用，只是NANOGP8在肿瘤细胞中发挥作用，而Nanog基因在胚胎干细胞中发挥作用。
实施例3、NANOGP8的转细胞实验
首先，将全长918bp的NANOGP8克隆入载体pQCXIN(Clontech公司)中，得到含NANOGP8全长基因的重组载体，命名为pQCXIN-NANOGP8，对其进行测序，测序结果表明插入的NANOGP8序列正确；然后将pQCXIN-NANOGP8转染NIH3T3细胞，以转染pQCXIN空载体的NIH3T3细胞为对照；最后通过流式细胞检测仪检测分别转染pQCXIN-NANOGP8和pQCXIN空载体的NIH3T3细胞的细胞周期的差异，结果：转染NANOGP8后，NIH/3T3的S期比例明显增加，从正常培养的30.49％±0.9增加到46.52％±1.8，再对结果数据进行t-检验分析，分析结果表明NANOGP和pQCXIN空载体转染组间有显著差异，P小于0.05，表明NANOGP对细胞的生长周期具有调控作用。绘制两种转染细胞的生长曲线，检测S期的增加对细胞生长是否有影响，结果如图5所示，NANOGP和pQCXIN空载体转染组间有显著差异，P小于0.05，转NANOGP的细胞数量较pQCXIN空载体转染组明显提高，表明S期的增加对细胞生长是有显著影响的。
序列表
<160>2
<210>1
<211>918
<212>DNA
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>1
atgagtgtgg atccagcttg tccccaaagc ttgccttgct ttgaagcatc cgactgtaaa 60
gaatcttcac ctatgcctgt gatttgtggg cctgaagaaa actatccatc cttgcaaatg 120
tcttctgctg agatgcctca cacagagact gtctctcctc ttccttcctc catggatctg 180
cttattcagg acagccctga ttcttccacc agtcccaaag gcaaacaacc cacttctgca 240
gagaatagtg tcgcaaaaaa ggaagacaag gtcccggtca agaaacagaa gaccagaact 300
gtgttctctt ccacccagct gtgtgtactc aatgatagat ttcagagaca gaaatacctc 360
agcctccagc agatgcaaga actctccaac atcctgaacc tcagctacaa acaggtgaag 420
acctggttcc agaaccagag aatgaaatct aagaggtggc agaaaaacaa ctggccgaag 480
aatagcaatg gtgtgacgca gaaggcctca gcacctacct accccagcct ctactcttcc 540
taccaccagg ggtgcctggt gaacccgact gggaaccttc caatgtggag caaccagacc 600
tggaacaatt caacctggag caaccagacc cagaacatcc agtcctggag caaccactcc 660
tggaacactc agacctggtg cacccaatcc tggaacaatc aggcctggaa cagtcccttc 720
tataactgtg gagaggaatc tctgcagtcc tgcatgcact tccagccaaa ttctcctgcc 780
agtgacttgg aggctgcctt ggaagctgct ggggaaggcc ttaatgtaat acagcagacc 840
actaggtatt ttagtactcc acaaaccatg gatttattcc taaactactc catgaacatg 900
caacctgaag acgtgtga 918
<210>2
<211>305
<212>PRT
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>2
Met Ser Val Asp Pro Ala Cys Pro Gln Ser Leu Pro Cys Phe Glu Ala
1 5 10 15
Ser Asp Cys Lys Glu Ser Ser Pro Met Pro Val Ile Cys Gly Pro Glu
20 25 30
Glu Asn Tyr Pro Ser Leu Gln Met Ser Ser Ala Glu Met Pro His Thr
35 40 45
Glu Thr Val Ser Pro Leu Pro Ser Ser Met Asp Leu Leu Ile Gln Asp
50 55 60
Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ser Pro Lys Gly Lys Gln Pro Thr Ser Ala
65 70 75 80
Glu Asn Ser Val Ala Lys Lys Glu Asp Lys Val Pro Val Lys Lys Gln
85 90 95
Lys Thr Arg Thr Val Phe Ser Ser Thr Gln Leu Cys Val Leu Asn Asp
100 105 110
Arg Phe Gln Arg Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Gln Gln Met Gln Glu Leu
115 120 125
Ser Asn Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Lys Gln Val Lys Thr Trp Phe Gln
130 135 140
Asn Gln Arg Mer Lys Ser Lys Arg Trp Gln Lys Asn Asn Trp Pro Lys
145 150 155 160
Asn Ser Asn Gly Val Thr Gln Lys Ala Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Ser
165 170 175
Leu Tyr Ser Ser Tyr His Gln Gly Cys Leu Val Asn Pro Thr Gly Asn
180 185 190
Leu Pro Met Trp Ser Asn Gln Thr Trp Asn Asn Ser Thr Trp Ser Asn
195 200 205
Gln Thr Gln Asn Ile Gln Ser Trp Ser Asn His Ser Trp Asn Thr Gln
210 215 220
Thr Trp Cys Thr Gln Ser Trp Asn Asn Gln Ala Trp Asn Ser Pro Phe
225 230 235 240
Tyr Asn Cys Gly Glu Glu Ser Leu Gln Ser Cys Met His Phe Gln Pro
245 250 255
Asn Ser Pro Ala Ser Asp Leu Glu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Glu
260 265 270
Gly Leu Asn Val Ile Gln Gln Thr Thr Arg Tyr Phe Ser Thr Pro Gln
275 280 285
Thr Met Asp Leu Phe Leu Asn Tyr Ser Met Asn Met Gln Pro Glu Asp
290 295 300
Val
305
Claims (9)
1、人源Nanog基因，是下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2、根据权利要求1所述的人源Nanog基因，其特征在于：所述基因具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列。
3、权利要求1所述的人源Nanog基因的编码蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：2；
2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对肿瘤细胞的自我更新和生长周期具有调控作用的蛋白质。
4、根据权利要求3所述的人源Nanog基因的编码蛋白，其特征在于：所述蛋白具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。
5、含有权利要求1所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
6、权利要求1所述的人源Nanog基因在体外进行细胞增殖及肿瘤检测中的应用。
7、权利要求1所述的人源Nanog基因在制备肿瘤治疗性药物中的应用。
8、权利要求3所述的人源Nanog基因的编码蛋白在肿瘤检测中的应用。
9、权利要求3所述的人源Nanog基因的编码蛋白在制备肿瘤治疗性药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100984529A CN100402648C (zh) | 2005-09-08 | 2005-09-08 | 一个人源的Nanog基因及其编码蛋白与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100984529A CN100402648C (zh) | 2005-09-08 | 2005-09-08 | 一个人源的Nanog基因及其编码蛋白与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1763195A true CN1763195A (zh) | 2006-04-26 |
| CN100402648C CN100402648C (zh) | 2008-07-16 |
Family
ID=36747516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2005100984529A Active CN100402648C (zh) | 2005-09-08 | 2005-09-08 | 一个人源的Nanog基因及其编码蛋白与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100402648C (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105929001A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-09-07 | 南京大学 | 特异性dna假结结构修饰的金电极及制备方法和应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1163613C (zh) * | 1998-11-20 | 2004-08-25 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 人白介素6核转录因子表达质粒系列及其在肿瘤治疗中的应用 |
| CN1318556A (zh) * | 2001-04-11 | 2001-10-24 | 南京医科大学 | 人核转录因子－2基因编码蛋白 |
| JP2005110565A (ja) * | 2003-10-07 | 2005-04-28 | Nobuya Yamanaka | 分化多能性維持剤 |
-
2005
- 2005-09-08 CN CNB2005100984529A patent/CN100402648C/zh active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105929001A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-09-07 | 南京大学 | 特异性dna假结结构修饰的金电极及制备方法和应用 |
| CN105929001B (zh) * | 2016-04-19 | 2018-04-10 | 南京大学 | 特异性dna假结结构修饰的金电极及制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN100402648C (zh) | 2008-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Takeuchi et al. | Widespread expression of Agouti-related protein (AGRP) in the chicken: a possible involvement of AGRP in regulating peripheral melanocortin systems in the chicken | |
| CN1476478A (zh) | 人宫颈癌2原癌基因及其编码的蛋白质 | |
| CN1284083A (zh) | 肿瘤抗原肽衍生物 | |
| Katoh et al. | Evolutionary conservation of CCND1-ORAOV1-FGF19-FGF4 locus from zebrafish to human | |
| CN1259139A (zh) | 肝细胞癌的预防及治疗 | |
| CN1763195A (zh) | 一个人源的Nanog基因及其编码蛋白与应用 | |
| CN1908016A (zh) | 一类具有蛋白转导结构域tat－ptd的融合蛋白及其应用 | |
| Tsurumi et al. | cDNA cloning of p40, a regulatory subunit of the human 26S proteasome, and a homolog of the Mov-34 gene product | |
| CN1075148A (zh) | 新的巨核细胞扩增基因 | |
| Lemaire et al. | Giant catfish Pangasianodon gigas growth hormone-encoding cDNA: cloning and sequencing by one-sided polymerase chain reaction | |
| Watanabe et al. | Molecular cloning of UBE2G, encoding a human skeletal muscle-specific ubiquitin-conjugating enzyme homologous to UBC7 of C. elegans | |
| Karacay et al. | Expression and fine mapping of murine vasoactive intestinal peptide receptor 1 | |
| CN1208458C (zh) | 重组人血小板生成因子cDNA序列及其用途 | |
| CN1883703A (zh) | 无指盘臭蛙丝氨酸蛋白酶抑制剂及其基因和应用 | |
| CN1477117A (zh) | 新型人磷脂酰乙醇胺结合蛋白，其编码序列及用途 | |
| CN1247609C (zh) | 一种卵巢癌相关基因及其编码的蛋白质 | |
| Hata et al. | Analysis of carrot genes for proliferating cell nuclear antigen homologs with the aid of the polymerase chain reaction | |
| CN100350045C (zh) | 玉米酪氨酸蛋白磷酸酶基因及其编码蛋白与应用 | |
| Jiang et al. | Body color regulation of Leptobotia taeniops through tyrosinase gene expression | |
| CN101063132A (zh) | 花鲈白细胞介素8基因序列 | |
| CN1778814A (zh) | 一种高羊茅干旱应答元件结合蛋白及其编码基因与应用 | |
| Katoh et al. | Comparative genomics on Wnt16 orthologs | |
| CN1663603A (zh) | 一种肿瘤－胎盘抗原蛋白及其dna在肿瘤治疗中的应用 | |
| CN1560258A (zh) | 一种抗菌肽的制备方法 | |
| CN1208461C (zh) | 一个人类snx家族新基因snx21 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180613 Address after: 100190 170 1, block B, 1 building, 38 Zhongguancun Avenue, Haidian District, Beijing. Patentee after: Beijing Zhongke kunkang Biotechnology Co., Ltd. Address before: 100080 genetic Development Institute, 3 Chinese Academy of Sciences, Zhongguancun south, Haidian District, Beijing Patentee before: Inst. of Genetics & Development Biology, Chinese Academy of Sciences |
|
| TR01 | Transfer of patent right |