CN1318556A - 人核转录因子－2基因编码蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明属于人类基因组技术领域,所述的人核转录因子－2蛋白(Nuclear transcription factor2,NFX2)基因全长cDNA序列为3613bp,其开放阅读框序列为3075bp,其编码1024个氨基酸,该基因在基因库(Genbank)中的编号为AF332009。本发明利用NFX2基因克隆制备融合蛋白,并可用该蛋白免疫动物制备单克隆和多克隆抗体,同时可将基因克隆用于睾丸特异功能基因表达芯片的制备,表达蛋白也可能成为治疗相关疾病的基因药物。

Description

人核转录因子-2基因编码蛋白

本发明属于人类基因组技术领域。

本发明所述人核转录因子-2基因(Nuclear transcription factor2,NFX2)是发明人在南京医科大学生殖医学江苏省重点实验室用基因芯片方法筛选获得，首先制备人睾丸功能基因表达芯片，通过比较胚胎和成年人睾丸功能基因的表达，获得差异表达克隆，经序列测定证明为全长cDNA，为3613p；其开放阅读框架为3075bp，其编码1024个氨基酸。查阅基因库，该基因与小鼠核转录基因同源。由于该基因是成人睾丸低表达，而胚胎与成人睾丸的主要差别是后者有精子发生，因此发现的人核转录因子-2基因可能与促进精细胞中组织相容性抗原的表达有关，用该基因克隆可制备成融合蛋白，用该蛋白免疫家兔，可获得单克隆和多克隆抗体，该基因也可用于制备睾丸功能基因表达芯片。融合蛋白也可能成为治疗相关疾病的基因药物。

由于人核转录因子-2基因在Genbank数据库中尚无人的同源基因，本发明人对于该基因的结构和功能研究成果全都是开创性的。美国国家生物技术情报中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)已正式接受该基因为Genbank的新成员，接受号为AF332009。1 acgtgacctg gtgacagtgc tggcttggct gtacagctcg atctaggttc tgcggcacgg61 gatggcggag gcgcctcctg tctcaggtac ttttaaattc aatacagatg ctgctgaatt121 cattcctcag gagaaaaaaa attctggtct aaattgtggg actcaaagga gactagactc181 taataggatt ggtagaagaa attacagttc accacctccc tgtcaccttt ccaggcaggt241 cccttatgat gaaatctctg ctgttcatca gcatagttat catccgtcag gaagcaaacc301 taagagtcag cagacgtctt tccagtcctc tccttgtaat aaatcgccca agagccatgg361 ccttcagaat caaccttggc agaaattgag gaatgagaag caccatatca gagtcaagaa421 agcacagagt cttgctgagc agacctcaga tacagctgga ttagagagct cgaccagatc481 agagagtggg acagacctca gagagcatag tccttctgag agtgagaagg aagttgtggg541 tgcagatccc aggggagcaa aacccaaaaa agcaacacag tttgtataca gctatggtag601 aggaccaaaa gtcaagggga aactcaaatg tgaatggagt aaccgaacaa ctccaaaacc661 ggaggatgct ggacccgaaa gtaccaaacc tgtgggggtt ttccaccctg actcttcaga721 ggcatcctct agaaaaggag tattggatgg gtatggagcc agacgaaatg agcagagaag781 atacccacag aaaaggcctc cctgggaagt ggagggggcc aggccacgac caggcagaaa841 tccaccaaaa caggagggcc accgacatac aaacgcagga cacagaaaca acatgggccc901 cattccaaag gatgacctca atgaaagacc agcaaaatct acctgtgaca gtgagaactt961 ggcagtcatc aacaagtctt ccaggagggt tgaccaagag aaatgcactg tacggaggca1021 ggatcctcaa gtagtatctc ctttctcccg aggcaaacag aaccatgtgc taaagaatgt1081 ggaaacgcac acaggttctc taattgaaca actaacaaca gaaaaatacg agtgcatggt1141 gtgctgtgaa ttggttcgtg tcacggcccc agtgtggagt tgtcagagct gttaccatgt1201 gtttcatttg aactgcataa agaaatgggc aaggtctcca gcatctcaag cagatggcca1261 gagtggttgg aggtgccctg cctgtcagaa tgtttctgca catgttccta atacctacac1321 ttgtttctgt ggcaaggtaa agaatcctga gtggagcaga aatgaaattc cacatagctg1381 tggtgaggtt tgtagaaaga aacagcctgg ccaggactgc ccacattcct gtaaccttct1441 ctgccatcca ggaccctgcc caccctgccc tgcctttatg acaaaaacat gtgaatgtgg1501 acgaaccagg cacacagttc gctgtggtca ggctgtctca gtccactgtt ctaacccatg1561 tgagaatatt ttgaactgtg gtcagcacca gtgtgctgag ctgtgccatg ggggtcagtg1621 ccagccttgc cagatcattt tgaaccaggt atgctattgc ggcagcacct cccgagatgt1681 gttatgtgga accgatgtag gaaagtctga tggatttggg gatttcagct gtttaaagat1741 atgtggcaag gacttgaaat gcggtaacca tacatgttcg caagtgtgcc accctcagcc1801 ctgccagcaa tgcccacggc tcccccagct ggtgcgctgt tgcccctgtg gccaaactcc1861 tctcagccaa ttgctagaac ttggaagtag tagtcggaaa acatgcatgg accctgtgcc1921 ttcatgtgga aaagtgtgcg gcaagcctct gccttgtggt tccttagatt tcattcatac1981 ctgtgaaaag ctctgccatg aaggagactg tggaccatgc tctcgcacat cagttatttc2041 ctgcagatgc tctttcagaa caaaggagct tccatgtacc agtctcaaaa gtgaagatgc2101 tacatttatg tgtgacaagc ggtgtaacaa gaaacggttg tgtggacggc ataaatgtaa2161 tgagatatgc tgtgtggata aggagcacaa gtgtcctttg atttgtggga ggaaactccg2221 ttgtggcctt cataggtgtg aagaaccttg tcatcgtgga aactgccaga catgctggca2281 agccagtttt gatgaattaa cctgccattg tggtgcatca gtgatttacc ctccagttcc2341 ctgtggtact aggccccctg aatgtaccca aacctgcgct agagtccatg agtgtgacca2401 tccagtatat cattcttgtc atagtgaggagaagtgtccc ccttgcactt tcctaactca2461 gaagtggtgc atgggcaagc atgagtttcg gagcaacatc ccctgtcacc tggttgatat2521 ctcttgcgga ttaccctgca gtgccacgct accatgtggg atgcacaaat gtcagagact2581 ctgtcacaaa ggggagtgtc ttgtggatga gccctgcaag cagccctgca ccacccccag2641 agctgactgt ggtcacccgt gtatggcacc ctgccatacc agctcaccct gccctgtgac2701 tgcttgtaaa gctaaggtag agctacagtg tgaatgtgga cgaagaaaag agatggtgat2761 ttgctctgaa gcatctagta cttatcaaag aatagctgca atctccatgg cctctaagat2821 aacagacatg cagcttggag gttcagtgga gatcagcaag ttaattacca aaaaggaagt2881 tcatcaagcc aggctggagt gtgatgagga gtgttcagcc ttggaaagga aaaagagatt2941 agcagaagca tttcatatca gtgaggattc tgatcctttc aatatacgtt cttcagggtc3001 aaaattcagt gatagtttga aagaagatgc caggaaggac ttaaagtttg tcagtgacgt3061 tgagaaggaa atggaaaccc tcgtggaggc cgtgaataag gttgaagtcg aaacatccca3121 ctggacattt ctctaaggcc agcttgatga aaaaaaaaaa aagcaatcaa gtcctggaaa3181 cactttcaac ctagagtagt tgtaggaaaa agtcacaact tctttgagga tccttatctt3241 tctcaaaaca cagccattat aacatctgtg gaagcctgtc ctggttcagg acagttgact3301 gcagaaaaga tctacagtcg gctgggcaca gtgtctcatg cctgtaatgc cagcactttg3361 ggaggccaag gcaggcagat cacttgaggt caggagttct agatcagctt ggccaacatg3421 acgaaaccct gtctctacta aaaatataaa aattagctgg gtgtggtggc gggcacctgt3481 tattccagct acttgcaagg cttaggcagg agaattcctt gaacccggga ggcagaggtt3541 gctgtgagct gagattctgc cactgcactc cagcctgggc aacaagagtg aaactctgtc3601 ttaaaaaaaa aaa

人核转录因子-2基因cDNA序列MAEAPPVSGTFKFNTDAAEFIPQEKKNSGLNCGTQRRLDSNRIGRRNYSSPPPCHLSRQVPYDEISAVHQHSYHPSGSKPKSQQTSFQSSPCNKSPKSHGLQNQPWQKLRNEKHHIRVKKAQSLAEQTSDTAGLESSTRSESGTDLREHSPSESEKEVVGADPRGAKPKKATQFVYSYGRGPKVKGKLKCEWSNRTTPKPEDAGPESTKPVGVFHPDSSEASSRKGVLDGYGARRNEQRRYPQKRPPWEVEGARPRPGRNPPKQEGHRHTNAGHRNNMGPIPKDDLNERPAKSTCDSENLAVINKSSRRVDQEKCTVRRQDPQVVSPFSRGKQNHVLKNVETHTGSLIEQLTTEKYECMVCCELVRVTAPVWSCQSCYHVFHLNCIKKWARSPASQADGQSGWRCPACQNVSAHVPNTYTCFCGKVKNPEWSRNEIPHSCGEVCRKKQPGQDCPHSCNLLCHPGPCPPCPAFMTKTCECGRTRHTVRCGQAVSVHCSNPCENILNCGQHQCAELCHGGQCQPCQIILNQVCYCGSTSRDVLCGTDVGKSDGFGDFSCLKICGKDLKCGNHTCSQVCHPQPCQQCPRLPQLVRCCPCGQTPLSQLLELGSSSRKTCMDPVPSCGKVCGKPLPCGSLDFIHTCEKLCHEGDCGPCSRTSVISCRCSFRTKELPCTSLKSEDATFMCDKRCNKKRLCGRHKCNEICCVDKEHKCPLICGRKLRCGLHRCEEPCHRGNCQTCWQASFDELTCHCGASVIYPPVPCGTRPPECTQTCARVHECDHPVYHSCHSEEKCPPCTFLTQKWCMGKHEFRSNIPCHLVDISCGLPCSATLPCGMHKCQRLCHKGECLVDEPCKQPCTTPRADCGHPCMAPCHTSSPCPVTACKAKVELQCECGRRKEMVICSEASSTYQRIAAISMASKITDMQLGGSVEISKLITKKEVHQARLECDEECSALERKKRLAEAFHISEDSDPFNIRSSGSKFSDSLKEDARKDLKFVSDVEKEMETLVEAVNKVEVETSHWTFL

人核转录因子-2基因开放阅读框架氨基酸序列

本发明的目的是：鉴于人核转录因子-2基因是本发明人发现的全新基因，目前人类对此基因的认识和了解仅限于本发明人所做的科学研究工作。由于该基因是与睾丸特异功能相关的基因，而且是胚胎高表达，成人低表达，因此该基因很可能与睾丸内的精子发生有关，其异常表达可能影响男性的生殖功能，因此该基因的研究可用于：

①通过制备该基因的融合蛋白，用于研究该基因与睾丸功能的关系，还可能成为一种治疗男性睾丸相关疾病的生物药品。

②制备特异性抗体：基因编码蛋白的特异性抗体是研究基因结构和功能的不可缺少的重要工具，人核转录因子-2基因编码蛋白的多克隆和单克隆抗体，可用作免疫组织化学染色、ELISA、免疫电镜、免疫共沉淀等多种根据免疫学原理设计的检测方法，可用于该基因编码蛋白在组织细胞中的定位和定量研究，也可用于各种生物样本(如血液、精液、尿液等)中的含量变化研究以及蛋白质-蛋白质相互作用研究等。因此，该抗体有可能用于制备与人核转录因子-2基因表达异常相关疾病诊断试剂盒，并有可能用于制备抗生育药物。

③制备基因诊断芯片：将功能基因用于制备基因诊断芯片是基因开发研究的一个重要方面，在疾病诊断(如男性不育、性功能低下)和药物筛选等方面均具有重要意义。本发明技术方案

1．人核转录因子-2基因融合蛋白的制备

以人核转录因子-2基因开放阅读框的核苷酸序列与质粒pDEST^TM15制备成GST-SP2-pDEST15表达质粒，在无NaCl的LB中30℃培养到0.5OD600，经0.3MNaCl诱导后，超声粉碎后经GST亲和层析柱纯化，得到纯化的融合蛋白。

2．人核转录因子-2基因编码蛋白特异性多克隆抗体

取融合蛋白与载体蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)结合，经透析后再与完全/不完全佐剂(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)等量混合，免疫新西兰兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激发注射一次，共三次，于三个月后取血分离血清。以免疫前动物血清作为对照做ELISA，测定各免疫兔血清中抗体滴度。筛选高滴度血清，进一步用抗原作竞争抑制免疫试验确定抗体的特异性。根据ELISA结果确定其用于免疫组织化学染色的稀释倍增数为1∶200～500。

3．人核转录因子-2基因编码蛋白特异性单克隆抗体

取融合蛋白与载体蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)结合，经透析后再与完全/不完全佐剂(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹腔内注射)，隔周一次，连续2-3次，融合前静脉加强一次，用ELISA方法证实抗体的产生后，取脾脏分离脾细胞，然后与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞。阳性克隆经多次亚克隆，直至获得分泌抗人核转录因子-2抗体的单克隆杂交瘤细胞株。

4．人核转录因子-2基因用于制备睾丸功能基因表达芯片

(1)以获取的人核转录因子-2基因的核苷酸序列设计引物，扩增全长的人核转录因子-2基因序列，用作点膜的样品。

(2)用英国BioRobotics自动点膜仪将标本点在8×12cm尼龙膜上，每一标本点2个点，每点的DNA量约几ng。；阳性对照8个housekeeping genes (a.ribosomal protein S9；b.Actin gamma；c.glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；d.hypoxanthinephosphoribosyltransferase 1；e.H.sapiens mRNA for 23KD highly basicprotein；f.ubiqnitin C；g.Phospholipase A2；h.ubiquitin carboxy Ⅰ-ferminal esteraseLⅠ)。阴性对照加λ噬菌体DNA和P-blue质粒。

(3)将含有该基因的芯片用于人核转录因子-2基因缺失的诊断和药物筛选

³³P标记：

抽提待检标本mRNA或DNA，用Random Primer标记法标记待检标本mRNA或DNA，作为杂交的探针。

杂交：

将点制好的尼龙膜标记探针杂交后，杂交炉(68℃)内烘干，用磷屏压片。

信号扫描和分析：

用记录仪分析杂交信号。根据杂交信号的强弱分析影响人核转录因子-2基因蛋白表达水平或人核转录因子-2基因的缺失。

Claims (5)

1．人核转录因子-2基因(NFX2)克隆制备的融合蛋白，其特征是NFX2基因全部开放阅读框氨基酸，序列为：MAEAPPVSGTFKFNTDAAEFIPQEKKNSGLNCGTQRRLDSNRIGRRNYSSPPPCHLSRQVPYDEISAVHQHSYHPSGSKPKSQQTSFQSSPCNKSPKSHGLQNQPWQKLRNEKHHIRVKKAQSLAEQTSDTAGLESSTRSESGTDLREHSPSESEKEVVGADPRGAKPKKATQFVYSYGRGPKVKGKLKCEWSNRTTPKPEDAGPESTKPVGVFHPDSSEASSRKGVLDGYGARRNEQRRYPQKRPPWEVEGARPRPGRNPPKQEGHRHTNAGHRNNMGPIPKDDLNERPAKSTCDSENLAVINKSSRRVDQEKCTVRRQDPQVVSPFSRGKQNHVLKNVETHTGSLIEQLTTEKYECMVCCELVRVTAPVWSCQSCYHVFHLNCIKKWARSPASQADGQSGWRCPACQNVSAHVPNTYTCFCGKVKNPEWSRNEIPHSCGEVCRKKQPGQDCPHSCNLLCHPGPCPPCPAFMTKTCECGRTRHTVRCGQAVSVHCSNPCENILNCGQHQCAELCHGGQCQPCQIILNQVCYCGSTSRDVLCGTDVGKSDGFGDFSCLKICGKDLKCGNHTCSQVCHPQPCQQCPRLPQLVRCCPCGQTPLSQLLELGSSSRKTCMDPVPSCGKVCGKPLPCGSLDFIHTCEKLCHEGDCGPCSRTSVISCRCSFRTKELPCTSLKSEDATFMCDKRCNKKRLCGRHKCNEICCVDKEHKCPLICGRKLRCGLHRCEEPCHRGNCQTCWQASFDELTCHCGASVIYPPVPCGTRPPECTQTCARVHECDHPVYHSCHSEEKCPPCTFLTQKWCMGKHEFRSNIPCHLVDISCGLPCSATLPCGMHKCQRLCHKGECLVDEPCKQPCTTPRADCGHPCMAPCHTSSPCPVTACKAKVELQCECGRRKEMVICSEASSTYQRIAAISMASKITDMQLGGSVEISKLITKKEVHQARLECDEECSALERKKRLAEAFHISEDSDPFNIRSSGSKFSDSLKEDARKDLKFVSDVEKFEMETLVEAVNKVEVETSHWTFL

2．根据权利要求1所述针对NFX2基因开放阅读框氨基酸序列制备的多克隆抗体，其特征是融合蛋白与完全和不完全佐剂混合后，免疫新西兰兔制备多克隆抗体。

3．根据权利要求1所述针对NFX2基因开放读框氨基酸序列制备的单克隆抗体，其特征是融合蛋白与完全和不完全佐剂混合，免疫Balb/C小鼠，分离脾脏B淋巴细胞并和骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，进一步用亚克隆方法、ELISA和抗体分型方法筛选分泌IgG抗体的单克隆，制备单克隆抗体。

4．根据权利要求1所述针对将NFX2基因开放读框氨基酸序列用于制备睾丸功能基因表达芯片，其特征是PCR扩增NFX2基因cDNA，点于芯片用于芯片制备。

5．根据权利要求1所述，针对NFX2基因开放读框氨基酸序列制备融合蛋白，其特征是融合蛋白可作为制备治疗相关疾病的药物。