CN1757722A - 条斑紫菜功能基因构成的基因芯片 - Google Patents

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CN1757722A CNA2005100442775A CN200510044277A CN1757722A CN 1757722 A CN1757722 A CN 1757722A CN A2005100442775 A CNA2005100442775 A CN A2005100442775A CN 200510044277 A CN200510044277 A CN 200510044277A CN 1757722 A CN1757722 A CN 1757722A
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周晓君
隋正红
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Abstract

本发明是一种条斑紫菜功能基因构成的基因芯片，是在适合的载体面上点制组合有如附表所示的471个序列点，诸序列点所对应代表的EST在国际基因序列库(GeneBank)中的接收号及其对应的矩阵号：1—4；列号：1—11；行号：1—11；EST编号；在平行的四个矩阵单元中，诸矩阵间有四次重复；该芯片诸矩阵右侧或左侧的两个矩阵为起始矩阵；该芯片中的每序列点是以100—3000bp连续的核苷酸为探针的序列或同源序列或其互补序列。该芯片具备高通量的优势，它正被应用于基因表达检测，通过定量监测大量基因表达水平，阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶，从整体水平研究功能基因的表达谱；总之该芯片广泛应用于工农业生产当中。

Description

条斑紫菜功能基因构成的基因芯片
技术领域
本发明涉及海洋生物基因技术的改进，尤其是涉及条斑紫菜功能基因构成的基因芯片，其是将许多特定的cDNA基因片段有规律地排列固定于载体上的技术，从而获得所需基因序列及其表达的大量信息。
背景技术
本技术领域的技术人员众所周知，一个基因组的所有碱基对中一般只有很少一部分基因编码蛋白质，绝大部分为非编码区，因此，对基因组直接测序不是经济有效的途径。尽管在高等真核生物中基因组分析的基本策略是对全基因组和cDNA进行测序，大量的实验证明以cDNA的形式进行基因转录产物的大规模测序生成表达序列标签(EST)是了解基因组，收集基因组信息以及发现新基因的有效途径。采用生物信息学方法延伸表达序列标签(ESTs)序列，获得基因部分乃至全长cDNA序列，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的发展提供广阔的空间。随着生物实验技术的不断革新和发展，生物数据日益膨胀。传统的以杂交或电泳为基础的基因表达、测序、突变检测和多态性分析等研究方法效率太低，无法适应现代研究的要求。近年来，随着实验技术和设备水平的提高，基因芯片便应用而生。基因芯片技术正逐渐的被广泛应用于动植物的基因组学和功能基因组学研究中。ESTs序列代表了某种特定时空和生理条件下基因的表达情况，但基因表达是动态变化的，在生物体不同时相、不同发育时期或不同生理状态下基因表达的差异对于生物体的生长发育、抗病抗逆、适应环境等具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是完善基因芯片技术应用于海洋生物基因组学和功能基因组学的研究，尤其提供条斑紫菜功能基因序列构成的基因芯片。
本发明的任务是由以下技术方案完成的研制了一种条斑紫菜功能基因构成的基因芯片。该芯片是在适合的载体面上点制组合有如附表所示的471个序列点，诸序列点所对应代表的EST在国际基因序列库(GeneBank)中的接收号及其对应的矩阵号：1——4；列号：1——11；行号：1——11；EST编号；即，该471个序列点排布在平行的四个矩阵单元中，诸矩阵间有四次重复；该芯片诸矩阵右侧或左侧的两个矩阵为起始矩阵；该芯片中的每序列点是以100——3000bp连续的核苷酸为探针的序列或同源序列或其互补序列。
所述的起始矩阵，其第一排2——11个序列点为质控对照点，前1——10个是质控阳性对照序列点，后1——2个是质控阴性对照序列点。
所述的质控阳性对照序列点，其是七个质控阳性对照序列点，即：3C8，3C9，3E3，3E11，3F3，3H3，py661。
所述的质控阴性对照序列点，其是两个质控阴性对照序列点，即：DMSO，POLY A。
所述的适合的载体是固相载体，其或为玻片，或为硅片，或为尼龙膜，或为硝酸纤维膜，或为凝胶。
所述的核苷酸，其是脱氧核糖核酸，和/或核糖核酸，和/或多聚寡核苷酸。
上述EST编号(序列标签)所组成的基因芯片就是在载体上结合有如附表中所示的序列或同源序列或其互补序列的核酸分子。
本发明的优点在于：由于本发明的基因cDNA芯片具备高通量的优势，它正被越来越多的研究人员应用于基因表达检测，通过定量监测大量基因表达水平，阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶。采用本发明的基因芯片技术从整体水平研究功能基因的表达谱等技术是一种高通量的进行功能基因表达分析的研究手段。具体讲本发明的基因芯片具有(1)可同时检测除去9个对照点以外的包括条斑紫菜功能基因在内的462条基因的表达情况；(2)可用于克隆植物的重要功能基因，如抗病、抗逆、生长发育相关基因的克隆；(3)该基因芯片还可用于动植物的育种和植物新品种的产生；(4)该基因芯片还可用于从整体上研究整个信使核糖核酸(mRNA)的表达，这对生物体基因调节的整体性研究具有重要的科研和实践指导价值；(5)应用该基因芯片还可以运用突变体研究植物，为发现植物中的基因功能和生理代谢途径提供重要的理论依据；总之本发明的基因芯片可以作为一种商品，广泛应用于工农业生产当中。当然，目前，条斑紫菜基因组学研究尚处于起步阶段，某些功能基因仍旧处于单基因研究阶段等。但是，将cDNA芯片技术应用于条斑紫菜功能基因的研究将打破传统的对单个基因的研究，使得从整体水平高通量的研究条斑紫菜基因表达分析成为可能，大大缩小了与模式生物研究的差距，为下一步的遗传育种研究提供条件。
附图及其具体实施方式
本发明的实施例结合附图说明如下：
图1为条斑紫菜cDNA芯片杂交前的矩阵扫描图。
图2为条斑紫菜cDNA芯片的起始矩阵放大扫描图。
图3为条斑紫菜cDNA芯片应用于基因表达检测中杂交后的扫描图。
参见图1，2制成的一种条斑紫菜功能基因构成的基因芯片。该芯片是在美国FullMoon公司出品的cDNA基片的载体面上点制组合有如附表所示的471个序列点，诸序列点所对应代表的EST在国际基因序列库(GeneBank)中的接收号及其对应的矩阵号：1——4；列号：1——11；行号：1——11；EST编号；即，该471个序列点排布在平行的四个矩阵单元中，诸矩阵间有四次重复；该芯片诸矩阵右侧或左侧的两个矩阵为起始矩阵；如图1所示：图中的矩阵排布形式为：2×2，以平行的4个矩阵(A、B、C、D矩阵)为单位，矩阵间4次重复，图1中的A、B、C、D矩阵为矩阵间的重复。前两个A、D矩阵，如图1中的大括号所示的最右一排9个点为质控对照点。在A矩阵中从右至左分别有第一、二、三、四单个矩阵。在B、C、D矩阵中也同样区分。每个矩阵(A、B、C、D)中的单个矩阵形式：11×11。
该芯片中的每序列点是以100——3000bp连续的核苷酸为探针的序列或同源序列或其互补序列。
所述的起始矩阵，其第一排2，或9，或11个序列点为质控对照点，前1，或7，或10个是质控阳性对照序列点，后1，或2个是质控阴性对照序列点。
如图2所示：所述的质控阳性对照序列点，其是七个质控阳性对照序列点1，即：3C8，3C9，3E3，3E11，3F3，3H3，py661；或者是一个质控阳性对照序列点，即：py661(图中未画出)；或者是十个质控阳性对照序列点，即：3C8，3C9，3E3，3E11，3F3，3H3，py661，myx0208，3H6，3B9(图中未画出)。
如图2所示：所述的质控阴性对照序列点2，其是两个质控阴性对照序列点，即：DMSO，POLY A；或者是一个阴性对照：POLY A(图中未画出)。
本发明的基因芯片所对应的每个点代表的EST在国际基因序列库(GeneBank)中的接收号如下附表：
  矩阵号   列号   行号   EST编号   GeneBank号   矩阵号   列号   行号   EST编号   GeneBank号
  111111111111111111111111111111111   111111222223333334444455555566666   135791124681013579112468101357911246810   py066py110py129py231py249py262py306py312py328py376py390py407py479py498py505py535py542py556py600py623py651py717py756py774pyD11pyE5pyG7myx0092myx0109myx0144myx0400myx0123myx0357   CX873925CX873949CX873961CX874039CX874054CX874064CX874104CX874110CX874123CX874162CX874174CX874189CX874251CX874266CX874273CX874301CX874307CX874319CX874599CX874375CX874399CX874456CX874602CX874499CX874562CX874573CX874584DR907381DR907322DR907387DR907382DR907562DR907338   111111111111111111111111111111111   111112222223333344444455555666666   246810135791124681013579112468101357911   py087py123py163py244py258py268py308py323py335py379py400py429py490py501py507py537py548py565py612py640py661py747py764py799pyE10pyF10pyH9myx0106myx0130myx0156myx0091myx01311A2   CX873938CX873957CX873988CX874596CX874061CX874069CX874106CX874120CX874129CX874164CX874182CX874207CX874260CX874269CX874275CX874303CX874312CX874327CX874365CX874388CX874407CX874479CX874492CX874520CX874569CX874576CX874590DR907502DR907556DR907487DR907442DR907400AU186639
  1   7   1   1B11   AU186975   1  7  2   1C1   AU186993
  具阵号   列号   行号   EST编号   GeneBank号   矩阵号   列号   行号   EST编号   GeneBank号
  11111111111111111111111111122222222222   7777788888999999101010101011111111111111111122222   357911246810135791124681013579111357911246810   1C31C71E21E71E111H21H112A62C112D52D112G62H32H103B73C33C83E84A123F83H43H104A2py011py052py058py182py204py219py273py289py298py337py344   AU187050AU187260AU188114AU188333AU188557AU191312AU191852AU192513AU194885AU195443AU196057AV430204AV430522AV430754AV432359AV432796AV433069AV434863AV437944AV435511AV436692AV437662AV438071CX873887CX873914CX873919CX874002CX874020CX874030CX874073CX874089CX874099CX874131CX874135   1111111111111111111111111122222222222   777788888899999101010101010111111111111111222222   46810135791124681013579112468102468101357911   1C51C101E51E91F11H62A22A102D12D72E42G102H63A13B103C63C113E103F63F103H63H124A4py026py054py064py189py215py226py276py295py303py341py356   AU187188AU187408AU188262AU188542AU188628AU191407AU192081AU192908AU195257AU195500AU196905AV430375AV430654AV430822AV432404AV433013AV433253AV435210AV435462AV435663AV437245AV437848AV438205CX873897CX873916CX873923CX874007CX874028CX874035CX874077CX874096CX874101CX874133CX874145
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  33333333333333333333   66666777778888889999   35791124681013579112468   myx0121myx0146myx0420myx0128myx03751B121C41C91E31E81E121H31H122A82C122D62E12G72H52H12   DR907426DR907522DR907491DR907507DR907340AU186985AU187127AU187329AU188147AU188477AU188598AU191328AU191982AU192715AU195085AU195484AU196433AV430292AV430639AV430819   33333333333333333333   66667777778888899999   46810135791124681013579   myx0136myx0390myx0119myx01661B101C21C61E11E61E101G101H72A42C72D22D102G32H12H83B6   DR907453DR907364DR907498DR907545AU186921AU187003AU187241AU188112AU188308AU188550AU191173AU191441AU192313AU194709AU195284AU195980AV430158AV430483AV430706AV432313
  矩阵号   列号   行号   EST编号   GeneBank号   矩阵号   列号   行号   EST编号   GeneBank号
  333333333333444444   91010101010101111111111111111   1013579112468101357911   3B93C44A113E93F53F93H53H114A3py010py032py056py168py197py217   AV432389AV432869AV439345AV435129AV435414AV435619AV437112AV437687AV438100CX873886CX873903CX873918CX873992CX874013CX874029   333333333333444444   91010101010111111111111111112   1124681013579112468101   3C13C73E73E113F73H33H84A1py021py053py063py187py212py223   AV432674AV433030AV434854AV435228AV435469AV436577AV437472AV437944CX873892CX873915CX874595CX874006CX874026CX874032
    4444444444444444444444444     2222233333344444555555666     24681013579112468101357911246  py269py278py296py336py342py360py430py442py462py508py515py526py569py581py586py662py682py701py802pyA5pyB9myx0005myx0018myx0068myx0168  CX874070CX874079CX874097CX874130CX874134CX874147CX874208CX874218CX874235CX874276CX874283CX874294CX874331CX874342CX874347CX874408CX874427CX874442CX874523CX874541CX874551DR907342DR907492DR907325DR907535     4444444444444444444444444     2222233333444444555556666     35791124681013579112468101357     py275py294py300py340py355py364py435py454py468py511py517py530py572py584py588py673py689py707py807pyB3pyC12myx0008myx0038mvx0078myx0192   CX874076CX874095CX874100CX874597CX874144CX874150CX874213CX874229CX874241CX874279CX874285CX874297CX874334CX874345CX874349CX874419CX874433CX874448CX874527CX874548CX874554DR907422DRg07374DR907397DR907328
矩阵号 列号 行号 EST编号  GeneBank号 矩阵号 列号 行号 EST编号 GeneBank号
44444444444444 66777777888889 81013579112468101 myx0208myx03471A31A111851C111D41D81F21F71F122812862C1  DR907332DR907372AU186640AU186734AU186815AU187432AU187575AU187814AU188695AU189557AU190373AU193431AU194195AU194392 44444444444444 66777778888889 91124681013579112 mvx0029myx03561A61B11B81D11D61D111F51F101G728428102C3 DR907407DR907503AU186694AU186748AU186853AU187504AU187675AU187981AU189025AU189728AU190726AU193733AU194259AU194434
4444444444444444 999991010101010111111111111 3579112468101357911 2E52F22F83A33A73B23D33D83E23F113G53G94A54A9 AU196949AV429507AV429768AV431013AV431511AV431832AV433613AV434077AV434481AV435717AV435972AV436116AV438237AV439276 444444444444444 99991010101010101111111111 468101357911246810 2E102F42F123A53A93B43D53D113E43G23G73G114A7 AU197164AV429562AV430057AV431245AV431695AV431874AV433800AV434375AV434594AV435795AV436001AV436191AV438389
本发明的基因芯片在国际基因序列库的接收号所对应的功能分类与注释表如下：
  功能分类   GeneBank号   功能注释
  抗氧化活性(antioxidantactivity)   AV435619AU188005AU187408   氢离子运输ATP酶β亚基烟酰胺核苷酸转氢酶蛋白质二硫异构酶
  粘连性能(binding)催化活性(catalyticactivity)   AV436146AV432674CX874482AU192513AU195500AU192908AU195284CX874208AV429507CX874216AV429828AV430375AU188598AU186853AU194423AU194195AV435663AV433013AV433800   CbbX蛋白同族体CG9553-PB第六号染色体115号阅读框[Homo sapiens]DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)盒39多肽[Danio rerio]70KD热休克蛋白脂氧合酶原卟啉IX镁离子螫合酶ADF3_MAIZE肌动蛋白解聚因子(ZmADF3)细胞分裂蛋白染色体区分蛋白(chromosome partitioning protein)A环化酶关联蛋白(cyclase associated protein)2Δ9脂肪酸去饱和酶鸟嘌呤核苷酸粘联蛋白β亚基[Lentinula edodes]70KD热休克蛋白[Guillardia theta]假定蛋白CNBA3860[Cryptococcus neoformans var.neoformans B-3501A]蛋白酶调整亚基7threonyl-tRNA合成酶天冬酰胺酸合成酶细胞分裂周期蛋白48同族体
  CX874299AV434375AU194263AV434481CX874457AV431669AV439442AU186827AV435210AV431853AV431955AU195484AV435129AU186716AU187981AV434594AU194204AU191312AV435783AU187050AU188902AU187528AV438100AU186639CX874286AU188333AU187504AU187188AU195443AU191852AU191070AV429555AU189323AU188628AV433613AU191407AU196905AV436116AV430158AU192715CX873938AU196433AU195980AU187935AV433030   亲环素蛋白A[Chlamys farreri]谷氨酸盐合成酶(Glutamine synthetase)Glutamyl-tRNA还原酶假定蛋白UM01728.1KIAA0116[Homo sapiens]长链酰基辅酶A合成酶光解酶蓝光受体PHR2可能的氨基肽酶N(ALPHA-AMINOACYLPEPTIDE水解酶)金属蛋白酶蛋白丝氨酸蛋白酶相关蛋白磷酸丙糖异构酶假定的尿苷二磷酸葡萄糖6脱氢酶未知蛋白(protein for MGC：68851)1-脱氧-5-磷酸-D-核酮醣合酶1乌头酸水合酶，线粒体前体(柠檬酸盐水合裂解酶)(顺乌头酸酶)AMP-依赖的合成酶和连接酶家族蛋白天门冬氨酸盐转氨酶ATP柠檬酸盐裂解酶几丁质合酶3半胱氨酸合成酶细胞质3磷酸甘油醛脱氢酶[Porphyra yezoensis]DNA修复蛋白/转录因子蛋白(UVH6)[Arabidopsis thaliana]烯醇酶专使蛋白(expressed protein)谷胱甘肽-S-转移酶class M5[Mus musculus]假定的谷胱甘肽-s-转移酶假定蛋白[Macaca fascicularis]假定蛋白[Neurospora crassa]假定蛋白MG01819.4[Magnaporthe grisea 70-15]假定蛋白UM04233.1亚硝酸盐还原酶磷酸烯醇式丙酮酸碳酸酵素[Chlamydomonas reinhardtii]磷乙醇胺二胞苷酰基转移酶磷酸甘油酸激酶[Chondrus crispus]假定的ATP硫酸化酶假定的monodehydroascorbate还原酶假定的果糖-6-磷酸焦磷酸盐-1-磷酸转移酶RepB[Dictyostelium discoideum]S-腺苷甲硫氨酸合成酶丝氨酸蛋白酶相似蛋白胰岛素降解酶类似蛋白(Insulysin)SODM_CHLRE锰过氧化物歧化酶[Mn]，线粒体前体琥珀酸盐脱氢酶黄素蛋白亚基α亚基海藻糖磷酸酯酶家族蛋白泛素激活酶E[Schistosoma japonicum]未知蛋白
  AU189025   UPL1_ARATH E3泛素蛋白连接酶UPL1
  伴护活性(chaperoneactivity)   CX874349AV438071AV430639AU186694AU191982AU186892   17.5kd热休克蛋白Gmhsp17.6L热休克蛋白60(hsp60)70kDa热休克蛋白[Phaseolus vulgaris]dnaK-type分子伴侣前体91kD热休克蛋白90热休克蛋白假定的热休克蛋白
  防御/免疫蛋白活性(defense/immunity proteinactivity)   AV432313   ATP/ADP传送器(translocator)
  酶调控活性(Enzymeregulatoractivity)   AU187470AU193733   蛋白磷酸酶1，α催化亚基四环素抗性蛋白
  运动活性(motor   AU190051AU186815   发育蛋白(developmental protein)DG1118[Dictyostelium discoideum]假定蛋白FG08956.1[Gibberella zeae PH-1]
  activity)陈旧的分子作用(obsoletemolecular CX874491AV431832AV435511 细胞色素c氧化酶亚基1[Porphyra purpurea]假定的纤维素合酶催化亚基假定的多药耐性蛋白[Geodia cydonium]
  function)蛋白标签活性(protein CX874523 未命名的蛋白产物[Candida glabrata CBS138]
  taggingactivity)信号传感器活性(signaltransduceractivity) AV430706AU 194434AV437687AV434444AV432796AV434199AV434077AU188112AU187241AU191173 假定蛋白色氨酸富含感受蛋白(tryptophan-rich sensory procein)腺苷酰磷硫化激酶假定蛋白MAP激酶MAPKOSJNBb0067G11.14磷蛋白脂磷酸酶2A 65K regulatory chain homologpDF1-Arabidopsis thaliana丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶催化亚基PP2A未名蛋白产物
  结构分子活性(structuralmoleculeactivity)   AV436692DR907332AV437245AV436577AV439345CX874407   假定的酸性核糖核蛋白P1a核糖核蛋白L9类似蛋白核糖核蛋白L24核糖核蛋白L30核糖核蛋白S29类似蛋白40S核糖核蛋白S16
  AV435972AV432389CX874454AV433069AV431245AU187127AU187003AV438205AV436479AV435228AV431386AV435385AV434515CX874131AV433090AV435414   40S 核糖核蛋白S20类似蛋白40S 核糖核蛋白；包含C-末端区域60S ribosomal protein L24[Cryptosporidium parvum]60S ribosome protein红藻肌动蛋白α微管蛋白β微管蛋白细胞质核糖体蛋白S13假定的60S核糖体蛋白核糖体蛋白L10，QM蛋白[Danio rerio]核糖体蛋白L18a核糖体蛋白L19核糖体蛋白L22核糖体蛋白S19，红藻叶绿体(Porphyra purpurea)核糖体蛋白S8S6核糖体蛋白
  转录调控活性(transcription regulatoractivity)   AV437944AU191328AU188550CX874177AV436191DR907545AV435717CX874499AU186993AU189728AU187690AV437662   预测蛋白DNA拓扑异构酶(EC 5.99.1.2)-粘液菌(Physarum polycephalum)DNA拓扑异构酶I组蛋白H2A protein组蛋白H2B protein组蛋白Histlh2aa[Mus musculus]可能的长链脂肪酸辅酶A连接酶可能的CCAAT-连接转录因子亚基[Arabidopsis thaliana]假定的pirin-like蛋白假定的泛素接合酶[Arabidopsis thaliana]叶绿体膜相关类似蛋白30kD普遍的压力蛋白UspA和相关的核苷粘连蛋白
  翻译调控活性(translationregulatoractivity)   AV435462AU187658AU190373AU194469AU197164CX874375AV429768AV430654AU186640AV436018   假定的RNA连接蛋白(putative RNA binding protein)延伸因子1a[Porphyra yezoensis]延伸因子-2[Cyanidioschyzon merolae]真核缩氨酸链释放因子亚基1-3多肽释放因子(polypeptide release factor)3蛋白翻译因子[Griffithsia japonica]假定的AG01类似蛋白假定的GTP连接蛋白typA[Oryza sativa(japonica cultivar-group)]翻译延伸因子eEF-3同族体YPL228w-酵母(Saccharomyces cerevisiae)翻译起始因子2γ亚基
  运输活性(transporteractivity)   AU194164AU194709AU186975CX874552   ABC运送体，ATP-连接蛋白保守的假定蛋白假定蛋白UM01341.1[Ustilago maydis 521]NAD+-精确的异柠檬酸脱氢酶b-亚基[Rattus norvegicus]
  AV438389AU194259AU187814AV438237AU190726CX874097AV430754CX874540AU186748AU195257AU188477AU187575CX874396AU186756AV430292AV434854CX874297AU194885AU186985CX874106AU188114AU188147AV431511   PfSec61假定的ABC转运体AbcG11433_CANAL 14-3-3蛋白同族体3-氧代酰基-(酰基运送蛋白)还原酶A30816 band 3阴离子转运蛋白(clone pBIIIC1)-chicken网格蛋白连接复合体AP-1小链ε1细胞色素p450羟化酶Δ5脂肪酸去饱和酶[Pythium irregulare]谷氨酸盐脱氢酶[Porphyra yezoensis]假定蛋白假定蛋白H28016.1a汞还原酶线粒体F0 ATP合成酶β链[Plantago major]NADH脱氢酶亚基7质体ATP/ADP转运体假定的硝酸盐跨膜运输体假定的泛素类似蛋白P-型ATP酶类似蛋白，潜在的磷脂转位酶；Drs2p溶质运送家族35，member B1未名蛋白(protein for MGC：78094)尿素主动运输类似蛋白液泡ATP合成酶催化亚基A液泡ATP酶亚基B
本发明的基因芯片上的462个克隆序列点的具体实施方式与实验数据如下：
实施例1：
cDNA文库的构建：
用Oligo-capping方法构建cDNA文库(Maruyama等，1994)。
一、总RNA的提取：
总RNA提取为UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒，购自上海生物工程有限公司。材料取自本实验室藻种库的条斑紫菜丝状体，采用改进的一步法提取总RNA。具体步骤如下：
●无菌水清洗并经滤纸吸干后称藻体70mg，于液氮中速冻20分钟；
●液氮充分研磨后藻粉转移到预冷的1.5ml EP管中，加入450μl Trizol，剧烈涡旋30s，充分混合；
●26-G#针头剪切2次以形成匀浆液；
●匀浆液转移至一个新的1.5ml RNase-free EP管，加入100μl氯仿/异戊醇，剧烈涡旋30s；
●12000转离心5分钟，将水相与有机相分开，此时蛋白质及部分酚被抽提至有机相；
●将水相转移至一个新的1.5ml RNase-free EP管，加入1/3体积无水乙醇，颠倒混匀，此时可见明显的多糖及DNA絮状沉淀；
●将溶液转移至UNIQ-10柱中，22℃保温2分钟后8000rpm离心1min。此时RNA结合到silica gel膜上；
●弃滤过液，将UNIQ-10柱放回收集管中。向UNIQ-10柱加入500μl缓冲液RPE，10000rpm室温离心30s，以洗涤RNA；
●弃滤过液，将UNIQ-10柱放回收集管中，重复上述操作一次。此时多糖及大部分DNA被去除；
●向上述UNIQ-10柱中加入RNase-free DNase，22℃保温15分钟；
●重复洗涤一次，弃收集管，将UNIQ-10柱放到一个新的1.5ml RNase-free EP管，室温离心15s，去除残留的RPE缓冲液；
●将UNIQ-10柱放到一新的1.5ml RNase-free EP管，加入40μl RNase-free H2O到UNIQ-10柱的中央，12000rpm离心1.5min；
●离心液即总RNA水溶液。分装置于-70℃保存备用。
二、去磷酸化：
1)去磷酸化流程：
①在1.5ml离心管里按照下表配制10μl去磷酸化反应体系。RNA用量为1-5μg；
  Reagent   Sample RNA   Control RNA
  RNA   xμl   2μl
  1OX CIP Buffer   1μl   1μl
  RNaseOutTM(40U/μl)   1μl   1μl
  CIP(10U/μl)   1μl   1μl
  DEPC water   yμl   5μl
  Total Volume   10μl   10μl
②用枪头混匀，短暂涡旋30s，3000rpm离心30s；
③50℃温育1h；
④温育后，短暂离心30s，放在冰上。
2)去磷酸化步骤中的RNA沉淀(都用1.5ml Rnase-free EP管)；
①加90μl DEPC水和100μl酚：氯仿，剧烈涡旋30s以沉降RNA；
②12000转离心5min，室温；
③将上清转移至一新的离心管中(~100μl)；
④加2μl 10mg/ml mussel glycogen，10μl 3M sodium acetate，pH 5.2，混匀后再加220μl 95％ ethanol，涡旋30s；
⑤干冰冷冻10minutes；
⑥12000转离心20min，4℃；
⑦去除上清；
⑧加500μl 70％ ethanol洗涤；
⑨12000转离心2minutes at+4℃；
⑩去除上清后再3000转离心30s；去除乙醇，室温干燥2min；用8μl DEPC水重溶RNA，取1μl；电泳检测完整性。
三、去帽(Removing the mRNA Cap Structure)：
1)去帽流程：
①在1.5ml离心管里按照下表配制10μl去帽反应体系：
Dephosphorylated RNA                       7μl
10X TAP Buffer                             1μl
RNaseOutTM(40U/μl)                       1μl
TAP(0.5U/μl)                              1μl
Total Volume                               10μl
②用枪头混匀，短暂涡旋30s，3000rpm离心30s；
③37℃温育1h；
④温育后，短暂离心30s，放在冰上。
2)去帽步骤中的RNA沉淀(Precipitating RNA)：
①加90μl DEPC水和100μl酚∶氯仿，剧烈涡旋30s以沉降RNA；
②12000转离心5min，室温；
③将上清转移至一新的离心管中(~100μl)；
④加2μl 10mg/ml mussel glycogen，10μl 3M sodium acetate，pH 5.2，混匀后再加220μl 95％ ethanol，涡旋30s；
⑤干冰冷冻10minutes；
⑥12000转离心20min，4℃；
⑦去除上清；
⑧加500μl 70％ ethanol洗涤；
⑨12000转离心2minutes at 4℃；
⑩去除上清后再3000转离心30s：去除乙醇，室温干燥2min。
四、与Oligo连接：
1)连接反应：
注意：0ligo为干粉形式，用前要离心使干粉集中于管底。开盖时小心防止粉末溅出减少引物的量。
①在盛有GeneRacer.RNA Oligo(0.25μg)的离心管中加7μl of脱磷酸化的，去帽的RNA用枪头吸打几次重悬RNA Oligo.短暂离心使液体沉到管底；
②65℃温育5mi；
③冰上冷却2minutes，短暂离心
④然后加入下列试剂，并用枪头轻轻混匀；
10X Ligase Buffer                  1μl
10mM ATP                           1μl
RNaseOutTM(40U/μl)               1μl
T4 RNA ligase(5U/μl)              1μl
Total Volume                       10μl
⑤37℃温育1h；
⑥温育后，短暂离心30s，放在冰上。
2)连接反应步骤中的RNA沉淀：
Note：本次RNA沉降后用10μl水溶解：
①加90μl DEPC水和100μl酚∶氯仿，剧烈涡旋30s以沉降RNA；
②12000转室温离心5min；
③将上清转移至一新的离心管中(~100μl)；
④加2μl 10mg/ml mussel glycogen，10μl 3M sodium acetate，pH 5.2，混匀后再加220μl 95％ ethanol，涡旋30s；
⑤干冰冷冻10minutes；
⑥12000转离心20min，4℃；
⑦去除上清；
⑧加500μl 70％ ethanol洗涤；
⑨12000转离心2minutes at +4℃；
⑩去除上清后再3000转离心30s；去除乙醇，室温干燥2min；用10μl DEPC水重溶RNA。
五、反转录(SuperScript.III RT Reaction)：
①将下列药品加入到上述10μl已经与Oligo进行连接的RNA；
Primers                        1μl
dNTP Mix                       1μl
Sterile，distilled water       1μl；
②65℃温育5minutes；
③冰上冷却2minutes，短暂离心；
④然后加入下列试剂：
5×First Strand Buffer         4μl
0.1M DTT                       1μl
RNaseOut.(40U/μl)             1μl
SuperScript.III RT(200U/μl)   1μl
Total Volume                   20μl
⑤用枪头轻轻混匀；
Note：如果使用随机引物则要在65℃温育之前，提前25℃温育5min，以使随机引物能充分与模板结合；
⑥短暂离心；50℃温育30-60min；
⑦70℃温育15 minutes灭活反转录酶。然后于冰上冷却2min；12000转离心3分钟；
⑧加入1μl of RNase H(2U)；
⑨37℃温育20min；
⑩3000转离心30s。生成的RNA可以立即使用或者在-20℃保存。用于RT-PCR的RNA量可以达到2μl。
六、PCR合成双链：
1)按照下列组分配制PCR反应液：
One Shot LA PCR Mix    25μl
模板DNA(2.5ng)         2μl
引物1(10μM)           2μl
引物2(10μM)           2μl
灭菌dddH 2 O            19μl
Total                  50μl
2)PCR反应条件：
95℃ 2min
72℃ 10min
总计时间：3.5h
七、cDNA片段大小分级以及与载体连接：
并通过低熔点凝胶电泳回收的办法分别收集不同分子大小片段(萨姆布鲁克等，1992)。按照500bp-1K，1-2K，2K以上三个范围分别进行了回收。并对每个回收范围分别与pMD-18T进行了连接，条件为16℃，连结过夜。以保证所构建文库的覆盖率。
八、转化：
转化操作流程：
①从-70℃取出2管感受态细胞(100μl/管)。握在手心融化细胞。细胞一经融化立即把EP管冰浴10min；
②取4μl连接反应物加至100μl感受态细胞中；
③轻轻旋转几次混匀，冰浴30min；
④42℃热激90s(恰好90s，不可摇动试管)；
⑤快速转移至冰浴中，2-3min；
⑥每管加入400μlLB液体培养基(无抗生素)，37℃，180rpm振荡45min-1h；
⑦每个90mm平板(LB+AMP+IPTG+X-Gal)加200μl上述混合物，用无菌玻棒涂均匀；
⑧将平板置于室温下直至液体被吸收；
⑨37℃倒置培养12-16h，选择阳性克隆，进行保存和培养。
实施例2：
数据库构建：
用0ilgo-capping方法构建的条斑紫菜cDNA文库作为测序EST的文库来源。所用通用引物为M13F(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)，自动测序仪为MegaBaceTM1000。
去除序列中的载体序列并修正3`端测出的模糊碱基后，将片段长度小于100的序列视为无效序列，对其余的序列利用EST Analysis Pipeline SystemTM协助进行生物信息学分析，确定功能和降低冗余度。该程序组合了生物信息学分析的常用工具，包括BLAST，Phred，Pfam，Crossmatch，Phrap，Cap3等。得到469条代表不同基因的EST序列，通过相似性检索工具BLAST在NCBI中的非冗余蛋白质和核酸数据库以及SWISS-PROT蛋白质数据库对非冗余基因进行同源性检索。即将拼接好的叠连群和未能拼接的EST与NCBI非冗余蛋白质数据库比对，然后通过BLASTX对各非冗余基因进行蛋白质功能域分析或功能注释。
实施例3：
芯片的制备：
一、对目的克隆进行扩增及纯化处理：
对获得的代表不同基因的表达序列标签进行重新PCR扩增，采用的引物序列为，正向引物：5`CAGGAAACAGCTATGAC3`，反向为引物：5`GTTTTCCCAGTCACGAC3`。每100μl体系包括：10×Buffer 10μl，25mM MgCl2 10μl，10mM dNTP 2μl，50pmol/μl的正反向引物各0.4μl，质粒模板为50ng。PCR扩增流程：94℃预变性5min，每个循环94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸10分钟。
PCR产物处理。加入等量的异丙醇室温放置30min，4℃ 12000rpm/min离心20min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，干燥后溶解于20μl水中。
二、芯片制备：
将点样液溶于50％的DMSO中，使每个点样点终浓度为250ng/μl，用GeneMachine公司的OmniGrid 100点样仪点制芯片。片基是美国FullMoon公司的cDNA基片，样品点与片基结合的方式是多聚赖氨酸结合。点样后经过紫外交联处理。单个矩阵形式：11×11，矩阵排布形式：2×2，以平行的4个矩阵为单位，矩阵间4次重复，以验证试验的重复性。
实施例4：
检测不同世代条斑紫菜表达差异基因：
一、总RNA抽提(Trizol法)：
使用Trizol试剂(Gibco公司)分别提取条斑紫菜丝状体和叶状体组织总RNA，溶于无RNA酶的DEPC水中，用琼脂糖电泳检测总RNA较完整，测定A值后于-70℃保存。
二、荧光探针制备：
反转录cDNA第一链时掺入荧光素Cy32-dUTP或Cy5-dUTP制备荧光标记探针。反转录反应为：总RNA(10g/L)10μl，RNasin(40U/μl)0.5μl，70℃ 10min，加5×第一链缓冲液5μl，Cy3-dUTP或Cy5-dUTP(25nmol/L，Sigma公司)1μl，Oligo(dT)15(0.5g/L)4μl(大连宝生物公司)，4μl 10×低dTTP的dNTPs(dGTP、dATP、dCTP，各25μmol/L，10μmol/L dTTP)，DTT(0.1mol/L)1μl 42℃孵育2min，Superscript II reverse RNase H-reverse transcripase(200U/μl，GIBCO)1.5μl，42℃孵2h。反应结束后加1mol/L NaOH 5μl，65℃孵育1h以消化RNA。最后乙醇沉淀荧光标记探针，并进行紫外分光光度分析以确定合成的cDNA的量及掺入的荧光核苷酸的百分比。
三、杂交：
将荧光标记探针溶于8μl 1×UniHybTM杂交液(TeleChem公司)，96℃ 4min变性，与预处理的cDNA芯片在杂交盒(TeleChem公司)中65℃杂交16h。两种组织的荧光标记探针分别与cDNA芯片等量混合后与同一阵列同时杂交。杂交后用1×SSC/0.2％SDS洗5min，0.1×SSC/0.2％SDS洗5min，0.1×SSC漂洗，空气中干燥。
四、信号扫描与分析：
使用ScanArrayTM4000共聚焦荧光扫描仪。Cy3激发波长为532nm，Cy5激发波长633nm，激光强度设为95％，光管度值设为90％信号分析标准为：背景亮度值均设为0，同一克隆对照标本的亮度分别是待测标本对应点亮度的2倍以上方可确信此克隆代表的基因在这两种样本中有明显的表达差异。
本发明的实验结果表明：(见图3所示的基因芯片杂交后的扫描图)本发明的基因芯片上462个克隆中有384个克隆是在两个世代中共同表达，在76个差异表达的克降中，有9个克隆在叶状体中表达量明显下调，有23个克隆在叶状体中表达量明显上调，推测是与叶状体条斑紫菜生长发育相关的基因。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims (6)

1、一种条斑紫菜功能基因构成的基因芯片，其特征在于：该芯片是在适合的载体面上点制组合有如附表所示的471个序列点，诸序列点所对应代表的EST在国际基因序列库(GeneBank)中的接收号及其对应的矩阵号：1——4；列号：1——11；行号：1——11；EST编号；即，该471个序列点排布在平行的四个矩阵单元中，诸矩阵间有四次重复；该芯片诸矩阵右侧或左侧的两个矩阵为起始矩阵；该芯片中的每序列点是以100——3000个连续的核苷酸为探针的序列和/或同源序列和/或其互补序列。
2、根据权利要求1所述条斑紫菜功能基因构成的基因芯片，其特征在于：所述的起始矩阵，其第一排2——11个序列点为质控对照点，前1——10个是质控阳性对照序列点，后1——2个是质控阴性对照序列点。
3、根据权利要求2所述条斑紫菜功能基因构成的基因芯片，其特征在于：所述的质控阳性对照序列点，其是七个质控阳性对照序列点，即：3C8，3C9，3E3，3E11，3F3，3H3，py661。
4、根据权利要求2所述条斑紫菜功能基因构成的基因芯片，其特征在于：所述的质控阴性对照序列点，其是两个质控阴性对照序列点，即：DMSO，POLY A。
5、根据权利要求1所述条斑紫菜功能基因构成的基因芯片，其特征在于：所述的适合的载体是固相载体，其或为玻片，或为硅片，或为尼龙膜，或为硝酸纤维膜，或为凝胶。
6、根据权利要求1所述条斑紫菜功能基因构成的基因芯片，其特征在于：所述的核苷酸，其是脱氧核糖核酸，和/或核糖核酸，和/或多聚寡核苷酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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