CN1736977B - 结晶形态的(+)-(1s,2s,3s,4r,5r)-1-氨基-5-羟甲基-n-2-(1,3-二羟丙基)-2,3,4-环己三醇及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新结晶形态的化合物(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇，其具有稳定的形态和确定的熔点，具备了大规模合成或配制药物所需要的性能。本发明的新形态的化合物具有良好的α-糖苷酶抑制剂活性。

Description

结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇及其制备方法
技术领域
本发明涉及新结晶形态的化合物(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇(下称结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇)。
本发明还涉及含有本发明结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇的药物组合物。
本发明还涉及制备结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇的方法。
背景技术
化合物((+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇(又称维力波糖(valibose))是一种α-糖苷酶抑制剂，口服后能竞争拮抗性地抑制肠道内双糖类水解酶(α-葡萄糖苷酶)，从而延缓了糖类的消化和吸收，以改善餐后高血糖。餐后高血糖会使胰岛素的分泌和胰岛素的作用出现障碍，使糖代谢进一步恶化，因此纠正餐后高血糖对于防止糖尿病及并发症的发展是非常重要的。同时，α-糖苷酶抑制剂是口服降糖药中耐受性最好的一类药，具有降糖作用温和、不易发生低血糖反应及毒副作用少等特点，比较适合老年人服用。其制备方法的相关的信息披露有：美国专利US 4,701,559；US 4,777,294；US 4,803,303。
在美国专利US 4,803,303中具体涉及了上述化合物的制备方法，该方法采用Validamine与二羟基丙酮、氰基硼氢化钠，用盐酸做促进剂，在二甲基亚砜中反应，产品冷冻干燥，得到无定形的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇粉末，收率17％。具体的方法为在50ml二甲亚砜中加入2.0gValidamine、3.4g二羟基丙酮、1.5ml 2N盐酸和2.6g氰基硼氢化钠，在60～65℃搅拌16小时，减压蒸除二甲亚砜，将残余物溶于100ml水，将溶液经过Amberlite H+型CG-50柱，水/0.5N氨水洗脱，将洗脱液减压浓缩，然后将浓缩物经过Dowex 1×2OH-型色谱柱，水洗，洗脱液减压浓缩，冻干得0.5g白色粉末。式(I)和式(II)分别为Validamine和Valibose的结构式：
在大规模的工业化生产中，上述无定形的化合物作为制药工业的原料因收率低、分离纯化的成本高，加之其制备条件十分苛刻，需要冻干等工艺条件，而导致成本十分昂贵。而且该无定形粉末的吸湿性极强，无固定的熔点，使其在工业化大规模制药的应用上受到了限制。
发明内容
本发明的一个目的在于提供结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇，其具有大规模合成或配制治疗用药剂所需的性能。
本发明的另一个目的在于提供含有本发明结晶形态的维力波糖的药物组合物。
本发明的再一个目的在于提供结晶形态的维力波糖的制备方法，该方法可以较高的收率制得维力波糖晶体，并且纯化效果良好，适于大规模生产。
根据本发明的一方面，本发明提供结晶形态的维力波糖化合物，其具有以下物理特性：(1)其以度2θ表示的，使用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射光谱至少在19.5～19.9和/或在21.8～22.2有特征峰，进一步包括在约13.24～13.26、约14.54～14.64、约15.50～15.62、约17.04～17.12、约23.42～23.5、约23.94～24.00、约25.92～25.98、约26.80～26.86和约29.16～29.18有明显的峰；(2)其DSC吸热转变在约89℃；(3)比旋度为[α]D 25+(77-79)°。
本发明还提供结晶形态的维力波糖的药学上可接受的盐，这些盐包括但不限于例如，盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐等。在本发明的一个实施方案中，提供了结晶形态的维力波糖的盐酸盐，其具有以下物理化学特性：(1)其以度2θ表示的，使用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射光谱至少在20.01～20.5和/或在23.8～24.2有特征峰，此外其在约10.94～10.98、约13.22～13.28、约16.14～16.16、约23.28～23.32和约25.02～25.08有明显的峰；(2)其DSC吸热转变在约144.3℃；(3)比旋度为[α]D 25+53°。
本发明还提供含有结晶形态的维力波糖或其药学上可接受的盐的药物组合物，可以将本发明的结晶形态的维力波糖或其药学上可接受的盐添加药学上可接受的载体和/或赋形剂而制备成治疗糖尿病的药物组合物。
根据本发明的又一方面，提供制备结晶形态的维力波糖的方法，其以validamine(化学名：(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-2，3，4-环己三醇，式I)与二羟基丙酮反应生成席夫碱(Schiff)，再与氰基硼氢化钠进行还原反应得到本发明的维力波糖(式II)，反应式如下：
Figure G2004100585045D00031
在本发明方法中，原料Validamine的制备是通过由井岗霉素A经水解得到validoxylamine A，再由validoxylamineA与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)反应，得到validamine，反应式如下：
Figure G2004100585045D00041
将上述反应所得的产物经分离分别得到纯的Validamine(式I化合物)和Valienamine。
本发明的制备结晶形态的维力波糖的方法包括下述步骤：
1)以冰醋酸作为促进剂，无水甲醇为溶剂，将(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-2，3，4-环己三醇与二羟基丙酮及氰基硼氢化钠反应得到((+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇；
2)将上述步骤1)中得到的产物去除溶剂后，以水溶解并酸化，再以碱中和至约pH6.0；
3)依次用以下树脂柱分离，并以TLC跟踪检测；
PUROLITE C100E H+型强酸性阳离子树脂柱，水和0.5N氨水洗脱；
YD CG-50NH4 +型弱酸性阳离子树脂柱，0.1N氨水洗脱；
HZ-202OH-强碱性阴离子树脂柱，H2O洗脱；
4)收集产品并浓缩至干；
5)以甲醇、乙醇或其混合物溶解步骤4)中获得的产品，向其中加入晶种(维力波糖)析晶制得结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇。
本发明的方法中，优选使用的冰醋酸量为8～25％(冰醋酸体积/原料(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-2，3，4-环己三醇重量，下同)，更优选为冰醋酸的用量为20％。步骤1)的反应在无水条件下进行，有效提高了产物的收率，无水甲醇的使用一方面避免了产物在高热下长时间加热而导致的产物分解、收率降低和分离困难，另一方面简化了后处理操作，使得浓缩操作简单易行。
本发明的结晶形态的维力波糖，具有稳定的形态和确定的熔点，这种新形态的维力波糖具备了大规模合成或配制药物所需要的性能，使得在工业上大规模制备含有维力波糖的药物时原料成本大大降低，原料方便贮存，生产操作更为简便，质量更易控制。
通过体外和体内实验证明，本发明的新形态的维力波糖化合物具有良好的α-糖苷酶抑制剂活性，通过抑制肠道双糖酶，即α-葡萄糖苷酶，使碳水化合物消化过程中最后阶段即双糖水解为单糖延迟，从而延缓了葡萄糖吸收入血液的速度，因此本发明的结晶形态的维力波糖具有作为治疗或预防糖尿病药物的良好前景。
本发明的方法可获得高收率的结晶形态的维力波糖，而且制备步骤和分离纯化步骤充分考虑大规模产业化的需要，操作简单易行，成本低，分离效果好。
下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
附图说明
图1为本发明的结晶形态的维力波糖1H-NMR核磁共振图谱；
图2为本发明的结晶形态的维力波糖13C-NMR核磁共振图谱；
图3为本发明的结晶形态的维力波糖的X射线衍射图谱；
图4为本发明的另一批次的结晶形态的维力波糖的X射线衍射图谱；
图5为本发明的又一批次的结晶形态的维力波糖的X射线衍射图谱；
图6为本发明的结晶形态的维力波糖的DSC图谱；
图7为本发明的结晶形态的维力波糖盐酸盐的1H-NMR核磁共振图谱；
图8为本发明的结晶形态的维力波糖盐酸盐的13C-NMR核磁共振图谱；
图9为本发明的结晶形态的维力波糖盐酸盐的X射线衍射图谱；
图10为本发明的另一批次结晶形态的维力波糖盐酸盐的X射线衍射图谱；
图11为本发明的又一批次结晶形态的维力波糖盐酸盐的X射线衍射图谱；
图12为本发明的结晶形态的维力波糖盐酸盐的DSC图谱；
图13为本发明的结晶形态的维力波糖对正常小鼠蔗糖负荷后血糖曲线的影响；
图中：Nor为正常小鼠对照组，Acar为阳性对照药拜唐苹组(10mg/kg)，TD-01(0.2mg)、TD-01(1mg)、TD-01(5mg)为维力波糖(TD-01)给药组，剂量分别为0.2mg/kg、1mg/kg、5mg/kg；n＝10
图14为本发明的结晶形态的维力波糖对正常小鼠蔗糖负荷后血糖曲线下面积(AUC)的影响；
图中：Nor为对照组，Acar为阳性药拜唐苹组(10mg/kg)，TD-01(0.2mg)、TD-01(1mg)、TD-01(5mg)为维力波糖(TD-01)给药组，剂量分别为0.2mg/kg、1mg/kg和5mg/kg；与Nor比较，***p＜0.001；n＝10
图15为本发明的结晶形态的维力波糖对四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖负荷后血糖曲线的影响；
图中：Con为对照组，Acar为阳性药拜唐苹组(10mg/kg)，TD-01(0.2mg)、TD-01(1mg)、TD-01(5mg)为维力波糖(TD-01)给药组，剂量分别为0.2mg/kg、1mg/kg和5mg/kg；n＝10
图16为本发明的结晶形态的维力波糖对四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖负荷后血糖曲线下面积(AUC)的影响；
图中：Con为对照组，Acar为阳性药拜唐苹组(10mg/kg)，TD-01(0.2mg)、TD-01(1mg)、TD-01(5mg)为维力波糖(TD-01)给药组，剂量分别为0.2mg/kg、1mg/kg和5mg/kg；与对照组Con比较，***p＜0.001；n＝10
具体实施方式
制备结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3- 二羟丙基)-2，3，4-环己三醇
【实施例1】原料Validamine的制备
原料Validamine可以由现有技术文献中公开的方法制备，例如：J.Antibiotics 24：57-58，1971和Chem.Lctt.，1989，725-728(Harii，s.j.T.Iwasa&Y.Kameda)中描述的方法，本发明的制备工艺中，原料Validamine的制备是通过由井岗霉素A(购自浙江钱江生物化学有限公司，含量60％)经水解得到validoxylamine A，再由validoxylamineA与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)(上海五联化工厂，化学纯)反应，得到validamine。反应式如下：
将反应产物用CG-50NH4 +弱酸性阳离子树脂柱，0.1N氨水洗脱分离得到纯的Validamine和Valienamine。
【实施例2】结晶形态的维力波糖的制备
反应式如下：
在2600毫升无水甲醇(分析纯)中，加入Validamine 104克(587毫摩尔)、1，3二羟基丙酮82.3克(FRUKA 97％，886毫摩尔)、冰醋酸10.4毫升、氰基硼氢化钠76.5克(营口三征化工有限公司97％，1.18摩尔)，回流反应6小时。反应结束后，蒸除甲醇，加水500毫升，用2N HCl酸化至pH1.5，再用NaOH中和至pH6。分别经过PUROLITE C100E H+型强酸性阳离子树脂柱(水和0.5N氨水)、YD CG-50NH4 +弱酸性阳离子树脂柱(0.1N氨水)、HZ-202OH-强碱性阴离子树脂柱(H2O)，TLC跟踪检测(展开剂：正丁醇∶甲醇∶氯仿∶氨水＝5∶4∶2∶5；显色剂：0.2％茚三酮乙醇溶液；Rf＝0.46(validamine)；Rf＝0.52(valibose)).合并茚三酮呈阳性与Valibose对照品Rf值相同的组分，减压浓缩至干，用乙醇溶解，加晶种析晶，得93克.收率：63.1％，mp：88-89℃.收率计算：
Figure G2004100585045D00082
式中：W：投料量或得量    M：分子量
【实施例3】结晶形态的维力波糖的制备
在2500毫升无水甲醇(分析纯)中，加入Validamine100克(565毫摩尔)，升温至50℃加入1，3二羟基丙酮63克(FRUKA 97％，678毫摩尔)、冰醋酸20毫升、氰基硼氢化钠56克(营口三征化工有限公司97％，865毫摩尔)，回流反应6小时。结束反应后，蒸除甲醇，加水500毫升，用2N HCl酸化至pH1.5，再用NaOH中和至pH6.0，分别经过(PUROLITE C100E)H+型强酸性阳离子树脂柱(水/0.5N氨水)，YD CG-50NH4 +弱酸性阳离子树脂柱(0.1N氨水)、HZ-202OH-强碱性阴离子树脂柱(H2O)，TLC跟踪检测(展开剂：正丁醇∶甲醇∶氯仿∶氨水＝5∶4∶2∶5；显色剂：0.2％茚三酮乙醇溶液；Rf＝0.46(validamine)；Rf＝0.52(valibose))。合并茚三酮呈阳性与Valibose对照品Rf值相同的组分，减压浓缩至干，用甲醇和乙醇的混合溶液(体积比甲醇∶乙醇＝1∶2)溶解，加晶种析晶，得121克。收率：85％，mp：88-89℃。
结晶形态的维力波糖的物理性质
【实施例4】结晶形态的维力波糖物理性质测定
首先对获得的结晶形态的化合物进行了核磁共振分析和元素分析，确定了本发明获得的化合物为(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇，然后进行X射线粉末衍射分析和差示扫描量热测定，使用X射线衍射(XRD)图谱和DSC差示热分析图谱来表征本发明的化合物晶体，此外对获得的化合物晶体进行了熔点和比旋度的测定，以获得有关本发明化合物晶体的更多资料。
1、核磁共振分析
仪器：Varian 500
结果：见图1和图2
1H-NMR(D2O，500MHZ)δ
1.32(1H，ddt，J＝3，1.5，15)，1.80-1.87(1H，m)，1.92(1H，dt，J＝3，15)，2.78(1H，m，J＝5.5)，3.15(1H，dd，J＝3.5)，3.25(1H，dd，J＝10.5).3.50-3.55(2H，m)，3.57(2H，t，J＝4.5)，3.62(2H，t，J＝5.5)，3.65(1H，dd，J＝5，11.5)，3.72(1H，dd，J＝3.5，11)；
13C-NMR(D2O，75MHZ)δ
28.61，38.97，55.63，59.28，61.31，62.70，63.19，73.91，74.21，75.34
2、元素分析(C10H21NO6)
仪器：德国ELEMENTAR公司vario EL元素分析仪
计算值：(％)C，47.80；H，8.42；N，5.57
实测值(两次)：(％)C，47.90/47.84；H，8.56/8.57；N，5.41/5.45
核磁共振分析和元素分析中，本发明获得的结晶形态的维力波糖与无定形维力波糖粉末得到了完全相同的结果，表明它们具有完全相同的化学结构。
3、X射线粉末衍射分析
仪器：日本理学电机D/MAX-IIIA X射线粉末衍射仪
靶：Cu-Kα辐射(λ＝1.5405)，2θ＝2-60℃
管压：35KV
管流：25mA
步径扫描：0.02℃/步
滤片：石墨单色器
本发明制备的三个批次的结晶形态的维力波糖具有基本如图3～图5所示的XRD图谱，由图谱可见结晶形态的维力波糖以度2θ表示的，使用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射光谱基本上在19.5～19.9和在21.8～22.2有特征峰，其相对强度分别达到了74～100和77～100，此外其在约13.24～13.26、约14.54～14.64、约15.50～15.62、约17.04～17.12、约23.42～23.5、约23.94～24.00、约25.92～25.98、约26.80～26.86和约29.16～29.18有明显的峰，三个批次样品的XRD图谱基本重合，结果见下表1：
表1结晶形态的维力波糖的X射线衍射图谱峰值
Figure G2004100585045D00102
4、差示扫描量热测定(DSC)
仪器：德国NETZSCH DSC2004
范围：40-140℃
升温速度：10℃/分钟
本发明的结晶形态的维力波糖在约89℃有DSC吸热转变，其DSC图谱如图6所示。
5、熔点测定
仪器：瑞士BRUKER BUCHI Melting Point B-545
测定结果：熔点为88～89℃
6、比旋度测定
仪器：Polartronic HHW5旋光仪
测试温度：25±0.5℃
试样管长：100mm
入射光波长：589.3nm
测试溶剂：水(C＝1)
测定结果：[α]D 25+(77-79)°
结晶形态的维力波糖盐酸盐
【实施例5】结晶形态的维力波糖的盐酸盐的制备及其物理性质测定
取2克结晶形态的维力波糖(按照前述实施例中的方法制备)，加水溶解，搅拌下滴加2N HCl溶液，至pH 3，继续搅拌2小时，经活性炭层析柱，H2O洗脱，收集洗脱液(TLC跟踪)，将获得的样品浓缩至干，用甲醇重结晶，过滤、干燥，得1克结晶形态的维力波糖盐酸盐。
物理性质测定：
1、核磁共振分析
仪器：Varian 500
结果：见图7和图8
1H-NMR(D2O，500MHZ)δ
1.58-1.68(2H，m)，2.03(1H，d，J＝14.4).3.21(1H，t，J＝9.3)，3.37-3.51(2H，m)，3.55-3.59(2H，m)，3.60-3.70(4H，m)，3.72-3.78(2H，m)；
13C-NMR(D2O，75MHZ)δ
26.78，40.69，59.68，60.25，60.38，63.97，64.03，72.63，74.26，76.43
2、元素分析(C10H21NO6·HCl)
仪器：德国ELEMENTAR公司vario EL元素分析仪
计算值：(％)C，41.74；H，7.70；N，4.89；Cl，12.30
实测值(两次)：(％)C，41.56/41.58；H，7.61/7.64；N，4.55/4.60；Cl，12.20
3、X射线粉末衍射分析
仪器：日本理学电机D/MAX-IIIA X射线粉末衍射仪
靶：Cu-Kα辐射(λ＝1.5405
Figure G2004100585045D00121
)，2θ＝2-60℃
管压：35KV
管流：25mA
步径扫描：0.02℃/步
滤片：石墨单色器
本发明制备的三个批次的结晶形态的维力波糖盐酸盐的具有基本如图9～图11所示的XRD图谱，由图谱可见结晶形态的维力波糖晶体盐酸盐以度2θ表示的，使用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射光谱基本上在20.10～20.5和在23.8～24.2有特征峰，其相对强度分别达到了97～100和58～65，此外其在约10.94～10.98、约13.22～13.28、约16.14～16.16、约23.28～23.32和约25.02～25.08有明显的峰，并且各批次测定的图谱基本重合，结果见表2：
表2结晶形态的维力波糖盐酸盐的X射线衍射图谱峰值
4、差示扫描量热测定(DSC)
仪器：德国NETZSCH DSC2004
范围：40-160℃
升温速度：10℃/分钟
本发明的结晶形态的维力波糖盐酸盐在约144.3℃有DSC吸热转变，其DSC图谱如图12所示。
5、熔点测定
仪器：瑞士BRUKER BUCHI Melting Point B-545
测定结果：熔点为145～146℃
6、比旋度测定
仪器：Polartronic HHW5旋光仪
测试温度：25±0.5℃
试样管长：100mm
入射光波长：589.3nm
测试溶剂：水(C＝1)
测定结果：[α]D 25+53°
结晶形态的维力波糖药效学实验
【实施例6】
以本发明前述实施例制备得到的结晶形态的维力波糖为实验药物，在体外实验比较了结晶形态的维力波糖和α-葡萄糖苷酶抑制剂拜唐苹(Acarbose)、倍欣(Voglibose)对α-葡萄糖苷酶(蔗糖酶、麦芽糖酶)和α-淀粉酶的抑制作用，发现结晶形态的维力波糖对蔗糖酶和麦芽糖酶活性有明显的抑制作用，IC50分别为1.28×10-8mol/L和3.18×10-7mol/L，对α-淀粉酶无抑制作用(104mol/L)，表明结晶形态的维力波糖是一种双糖酶抑制剂。体内实验选用正常ICR小鼠和四氧嘧啶高血糖小鼠，并以拜唐苹(Acarbose)作为阳性对照药，比较了维力波糖对蔗糖负荷后血糖升高的影响，证明结晶形态的维力波糖能明显降低蔗糖负荷后的血糖峰值和血糖曲线下面积，并使血糖峰值后移，说明结晶形态的维力波糖通过抑制肠道双糖酶，即α-葡萄糖苷酶，使碳水化合物消化过程中最后阶段即双糖水解为单糖延迟，从而延缓了葡萄糖吸收入血液的速度。
一、实验材料
1.受试药物
结晶形态的维力波糖是一化学合成的化合物，按照前述实施例方法制备。批号为20030801，分子量251，纯度为99.8％，实验时用去离子水配制成所需浓度。
2.阳性对照药
阿卡波糖(Acarbose，商品名拜唐苹)是90年代初由德国Bayer制药公司推出的世界上首个α-葡萄糖苷酶抑制剂，现为临床最常用的口服降血糖药之一，因此被选为阳性对照药物。拜唐苹为德国拜耳公司产品，批号101101，原料药(in vitro)为德国拜耳公司赠品，批号为264086D，实验时用去离子水配制成所需浓度。
伏格列波糖(voglibose，商品名倍欣)由日本武田药品有限公司出品的新一代α-葡萄糖苷酶抑制剂，批号20040304，实验时用去离子水配制成所需浓度。
二、实验动物
1、正常雄性ICR小鼠，22-24g；正常雄性SD大鼠，140-160g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK(京)2002-0003，饲养于中国医学科学院药物研究所二级动物房。
2.四氧嘧啶(Alloxan)高血糖小鼠
正常ICR小鼠尾静脉注射四氧嘧啶70mg/kg，72小时后预测血糖(葡萄糖氧化酶法，以下同)，选用血糖在250-500mg/dl的小鼠进行实验分组。
三、试验方法及结果(包括实验设计、主要实验过程及实验结果等)
1.维力波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用
蔗糖和麦芽糖在α-葡萄糖苷酶的作用下分解为葡萄糖。通过测定反应体系中葡萄糖生成量的多少，判定维力波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，根据药物不同浓度下对酶活性的抑制百分率计算出IC50，以衡量受试药物对酶活性的抑制强度。参考文献方法，从正常大鼠空肠上端肠粘膜分离提取蔗糖酶和麦芽糖酶，用于进行抑制剂研究。
表3结果表明，维力波糖对蔗糖酶活性抑制的IC50为1.28×10-8M，作用强于拜唐苹而弱于倍欣；对麦芽糖酶活性抑制的IC50为3.18×10-7M，作用较弱于拜唐苹和倍欣。
表3.维力波糖对α-葡萄糖苷酶(蔗糖酶、麦芽糖酶)的抑制作用
2.维力波糖对α-淀粉酶活性的抑制作用
淀粉在淀粉酶作用下分解，通过测定反应体系中淀粉的剩余量(碘-淀粉法)的多少，确定维力波糖是否对淀粉酶活性有抑制作用。
结果表明，在10-4mol/L浓度时，维力波糖和倍欣对淀粉酶活性均没有抑制作用；拜唐苹对淀粉酶活性抑制的IC50为3.74×10-6mol/L。提示维力波糖肠胀气的副作用可能远小于拜唐苹而类似于倍欣。
3.维力波糖对正常小鼠蔗糖负荷后血糖升高的影响
正常ICR小鼠5组，每组10只，实验前禁食过夜，一组口服蔗糖溶液(4.0g/kg)作为对照组(Nor)，一组口服蔗糖与拜唐苹(Acarbose 10mg/kg)作为阳性药对照组(Acar)，其余三组分别口服蔗糖与不同剂量的维力波糖(0.2mg/kg、1mg/kg、5mg/kg)作为给药组。测定给药前(0min)及给药后30min、60min、120min时的血糖值。
表4.维力波糖对正常小鼠蔗糖负荷后血糖的影响(X±SD)
与Nor比较，**p＜0.01，***p＜0.001；n＝10；Nor为对照组，Acar为阳性对照药拜唐苹组，维力波糖为给药组
结果见图13
表5.维力波糖对正常小鼠蔗糖负荷后血糖曲线下面积(AUC)及血糖峰值的影响
Figure G2004100585045D00161
与Nor比较，***p＜0.001；数据以X±SD表示，n＝10；Nor为对照组，Acar为阳性对照药拜唐苹组，维力波糖为给药组
结果见图14
结果表明(表4-5、图13-14)，维力波糖在0.2mg/kg～5mg/kg剂量范围内，能使正常小鼠口服蔗糖负荷后血糖峰值明显下降并右移，血糖曲线下面积减少，呈一定的量效关系。
4.维力波糖对四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖负荷后血糖升高的影响
四氧嘧啶高血糖小鼠5组，每组10只，禁食过夜，一组口服蔗糖溶液(4.0g/kg)作为对照组，一组口服蔗糖与拜唐苹(Acarbose 10mg/kg)作为阳性药对照组，其余三组分别口服蔗糖与不同剂量的维力波糖(0.2mg/kg、1mg/kg、5mg/kg)作为给药组。测定灌胃前及给药后30min、60min、120min时的血糖值。
表6.维力波糖对四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖负荷后血糖的影响(X±SD)
Figure G2004100585045D00171
与Con比较，*p＜0.05，***p＜0.001；n＝10；Con为四氧嘧啶高血糖小鼠对照组，Acar为阳性药拜唐苹组，维力波糖为给药组
结果见图15
表7.维力波糖对四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖负荷后血糖曲线下面积(AUC)及血糖峰值的影响(X±SD)
与Con比较，***p＜0.001；n＝10；Con为四氧嘧啶高血糖小鼠对照组，Acar为阳性药拜唐苹组，维力波糖为给药组
结果见图16
结果表明，维力波糖能明显降低四氧嘧啶高血糖小鼠口服蔗糖后血糖的升高，明显减少血糖曲线下面积(表6-7、图15-16)。
以上结果表明，本发明的结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇是一种较好的α-糖苷酶抑制剂，其可通过抑制体内碳水化合物的代谢而降低血糖。
以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (6)

1.一种结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇，其特征在于，所述结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇以度2θ表示的，使用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射光谱在13.24～13.26、14.54～14.64、15.50～15.62、17.04～17.12、19.5～19.9、21.8～22.2、23.42～23.5、23.94～24.00、25.92～25.98、26.80～26.86和29.16～29.18有特征峰；并且其DSC吸热转变在约89℃。
2.一种药物组合物，含有权利要求1所述的结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇或其盐酸盐，所述盐酸盐为结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇盐酸盐，其以度2θ表示的，使用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射光谱在10.94～10.98、13.22～13.28、16.14～16.16、20.01～20.5、23.8～24.2、23.28～23.32和25.02～25.08有特征峰；并且其DSC吸热转变在约144.3℃。
3.权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，其进一步含有药学上可接受的载体和/或赋形剂。
4.制备结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇的方法，包括下述步骤：
1)以冰醋酸作为促进剂，无水甲醇为溶剂，将(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-2，3，4-环己三醇与二羟基丙酮及氰基硼氢化钠反应得到(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇；
2)将上述步骤1)中得到的产物去除溶剂后，以水溶解并酸化，再以碱中和至约pH6.0；
3)依次以下述树脂柱吸附分离，并以TLC跟踪检测：
PUROLITE C100E H+型强酸性阳离子树脂柱，水和0.5N氨水洗脱；
YD CG-50NH4 +型弱酸性阳离子树脂柱，0.1N氨水洗脱；
HZ-202OH-强碱性阴离子树脂柱，水洗脱；
4)收集产品并浓缩至干；
5)以甲醇、乙醇或其混合溶液溶解步骤4)中获得的产品，向其中加入晶种析晶制得结晶形态的(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇。
5.权利要求4所述的制备方法，其中所述加入冰醋酸的量以冰醋酸体积/原料(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-2，3，4-环己三醇重量计，为8～25％。
6.权利要求5所述的制备方法，其中所述加入冰醋酸的量以冰醋酸体积/原料(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-环己-2，3，4-三醇重量计，为20％。
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