CN1723232B - 巯基选择性水溶性聚合物衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了带有适合于选择性偶联诸如那些包含在蛋白质半胱氨酸残基中的巯基的巯基选择性末端的水溶性聚合物衍生物。

Description

巯基选择性水溶性聚合物衍生物

                    发明领域

本发明涉及制备诸如聚乙二醇这类水溶性聚合物的巯基选择性衍生物的方法。本发明特别涉及：(i)制备在至少一个末端上带有适合于与蛋白质或其它活性剂的巯基偶联的巯基、被保护的巯基或其它基团的聚合物的方法；(ii)巯基选择性聚合物自身；(iii)其轭合物；和(iv)这类聚合物的使用方法。

                    发明背景

由于近来生物技术的进展，目前可以大规模制备治疗蛋白和其它生物分子，例如抗体和抗体片段，使得这类生物分子得到更广泛的利用。令人遗憾的是，有潜力的治疗生物分子的临床应用通常因其快速蛋白水解降解、制备、储存或给药时的不稳定性或因其免疫原性而受到阻碍。由于持续关注为治疗应用而给药蛋白质和其它生物分子，所以已经研究了克服这些缺陷的各种手段。

已经广泛研究的一种这类手段为通过共价连接诸如聚乙二醇或″PEG″这类水溶性聚合物修饰蛋白质和其它有潜力的治疗生物分子(Abuchowski，A.等人，J.Biol.Chem.252(11)，3579(1977)；Davis，S.等人，Clin.Exp Immunol.，46，649-652(1981)。在许多情况中，已经证实PEG-修饰的蛋白质、也称作PEG-轭合物或聚乙二醇化蛋白质的生物特性与其未聚乙二醇化对应物得到明显改善(Herman等人，Macromol.Chem.Phys.，195，203-209(1994)。已经证实聚乙二醇-修饰的蛋白质因对蛋白水解降解的耐受性增加而在体内具有较长的循环时间且还具有增加的热稳定性(Abuchowski，A.等人，J.Biol.Chem.，252，3582-3586(1977)。使用其它生物分子、例如抗体和抗体片段也观察到了类似的生物功效提高(Chapman，A.，Adv.Drug Del.Rev.54，531-545(2002))。

一般来说，使用活化的PEG衍生物、即带有至少一个适合于与生物分子亲核中心(例如赖氨酸、半胱氨酸和类似的蛋白质残基)反应的活化末端的PEG使聚乙二醇与药物或其它表面连接。最常用的是基于PEG与诸如那些存在于蛋白质赖氨酸侧链上的活化蛋白质氨基反应的方法。带有适合于与蛋白质氨基反应的活化端基的聚乙二醇包括PEG-醛类(Harris，J.M.，Herati，R.S.，Polym Prepr.(Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem)，32(1)，154-155(1991)、混合的酸酐类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类、羰基咪唑类(carbonylimadazolides)和氯氰脲酸酯类(Herman，S.等人，Macromol.Chem.Phys.195，203-209(1994))。尽管已经证实许多蛋白质在PEG修饰过程中保持了活性，但是在某些情况中，诸如当特定的赖氨酸残基的衍生使蛋白质失活时，聚合物通过蛋白质氨基的连接可能并不理想(Suzuki，T.等人，Biochimica et Biophysica Acta788，248-255(1984))。因此，有利的是拥有使用另一种诸如半胱氨酸这类连接用靶氨基酸、通过PEG修饰蛋白质的其它方法。与半胱氨酸上的蛋白质巯基连接可以提供的优点在于半胱氨酸在蛋白质中一般不如赖氨酸丰富，由此减少蛋白质在与这些含有巯基的氨基酸轭合时失活的可能性。

带有巯基-选择性活性端基的聚乙二醇衍生物包括马来酰亚胺类、乙烯基砜类、碘乙酰胺类、硫醇类和二硫化物。这些衍生物均用于与蛋白质的半胱氨酸侧链偶联(Zalipsky，S.，Bioconjug.Chem.6，150-165(1995)；Greenwald，R.B.等人，Crit.Rev.Ther.DrugCarrier Syst.17，101-161(2000)；Herman，S.等人，Macromol.Chem.Phys.195，203-209(1994))。然而，这些试剂中的许多因其难以合成和纯化而未得到广泛利用。例如，Woghiren等的方法(Woghiren，C.等人，Biocojugate Chem.4，314-318(1993))要求一系列合成转化和纯化步骤以形成特定的被巯基-保护的PEG试剂。首先，使甲氧基-PEG与甲苯磺酰氯反应，随后纯化反应产物以回收相应的甲苯磺酰基-PEG。然后通过与硫代乙酸盐反应、随后再进行一次纯化步骤而将甲苯磺酰基-PEG转化成相应的PEG-硫代乙酸盐。然后使用甲醇对PEG-硫代乙酸盐进行醇解，随后进行柱色谱法而得到纯化的硫醇盐，然后将其用二硫苏糖醇还原成相应的PEG-巯基。随后通过柱色谱法纯化所得的PEG巯基。然后通过使PEG-巯基与4，4′-二吡啶基二硫化物反应、随后通过柱色谱法纯化制备硫醇的被保护形式。概括的说，Woghiren的将EG转化成其巯基-被保护形式的方法需要5个不同的反应步骤和另外5个独立的纯化步骤，使得它以及其它类似的合成手段不理想且极其费时。

尽管进行了多个纯化步骤，但是在许多现存的获得单官能巯基特异性PEG衍生物途经中的另一个明显的缺陷在于没有能力除去由存在于单官能PEG原料上的二醇产生的双官能化PEG。

因此，存在对制备高纯度、活化的PEG-巯基和其它巯基-选择性PEG衍生物的方法的需求，该方法既是直接的又是简单的，即需要最少数量的反应和纯化步骤，同时可以维持PEG链段的完整性(即在适度反应条件下进行)，且该方法可以进一步以高产率提供高纯度的巯基-选择性PEG衍生物。本申请人已经研发了这类方法，在下文中更详细地描述。

                    发明概述

本发明在一个方面中提供了制备水溶性聚合物的巯基选择性衍生物(即带有至少一个为巯基选择性基团的末端的聚合物，即所述的巯基选择性基团为优选与诸如巯基、硫醇盐或被保护的巯基这类巯基反应的基团)的方法。更具体地说，该方法包括下列步骤：(i)提供包括本文命名为″POLY″的水溶性聚合物链段的水溶性聚合物，所述的″POLY″带有用亲电体(-E)活化的末端，本文一般命名为″POLY-E″；随后(ii)使这类聚合物与包括亲核体(-NU)和巯基选择性结构部分的反应剂分子在有效促进亲电体与亲核体之间反应的条件下反应而形成带有巯基选择性末端的水溶性聚合物，本文命名为″POLY-S″，其中在该用语中″S″指的是巯基选择性结构部分。可以包含在反应剂分子中的巯基-选择性结构部分包括巯基、被保护的巯基、二硫化物、马来酰亚胺、乙烯基砜、碘乙酰胺和邻吡啶基二硫化物。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述的巯基选择性结构部分选自巯基、被保护的巯基和二硫化物组成的组。

在反应剂分子中包含的巯基选择性结构部分为二硫键的情况中，所述的方法可以进一步包括还原POLY-S上的二硫键而形成带有末端巯基的水溶性聚合物(本文命名为″POLY-SH″)的步骤。

在本发明的一个实施方案中，例如，当步骤(i)中提供的聚合物为封端的线性高聚物或仅带有一个反应性亲电末端的单官能活化的聚合物时，来自步骤(ii)的POLY-S产物组成中包括大于约95％摩尔百分比的所需单官能取代的POLY-S。在该实施方案中，以总聚合物成分为基准，优选步骤(i)中提供的聚合物为含有小于约5％聚环氧烷二醇和/或双官能亲电体活化的聚环氧烷二醇衍生物的组合的聚环氧烷。

在另一个相关的实施方案中，例如，当起始聚合物为封端的或仅带有一个反应性亲电子末端单官能活化的聚合物时，来自步骤(ii)的POLY-S产物包括小于约5％的双功能-取代的POLY-S。

在另一个实施方案中，步骤(i)中的聚合物包括为羧酸或活化的羧酸衍生物的亲电体(-E)。这类亲电体包括羧酸、酰胺、羧酸酯、碳酸酯、碳酸、酰基卤和酸酐。在本发明一个具体的实施方案中，步骤(i)中的聚合物为聚乙二醇的N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯或N-羟基羟基琥珀酰亚胺基丁酸酯衍生物。

在另一个实施方案中，所述的亲电体E为羧酸或活化的羧酸衍生物，且在反应步骤前纯化POLY-E或其前体。优选的纯化方法包括化学和色谱法。在该方法的优选实施方案中，在反应步骤前通过柱色谱法纯化POLY-E。在更具体的实施方案中，通过离子交换色谱法或IEC纯化POLY-E。

所述的反应剂分子包括亲核体(-NU)。如果适用，合适的亲核体包括伯胺基、仲胺基、羟基、亚氨基、巯基、硫代酸酯及其阴离子型对应物。在特定的实施方案中，所述的反应剂分子包括为伯胺基或仲胺基的亲核体。

在另一个实施方案中，所述的反应剂分子为包括相同亲核体(-NU)、一般为端基的对称二硫化物试剂，其中反应步骤导致形成带有中心二硫键的对称聚合物。在具体的实施方案中，与亲电活化聚合物反应的分子为胱胺或半胱胺。另一方面，所述的反应剂分子为任选被保护为胺盐的N-(2-氨基-乙基)3-马来酰亚氨基-丙酰胺。

在该方法的另一个实施方案中，巯基选择性结构部分为巯基，该方法可以进一步包括使POLY-S巯基与蛋白质的巯基或被保护的巯基反应的步骤以形成二硫化物-连接的聚合物-蛋白质轭合物，本文一般命名为POLY-S-S-蛋白质。

本发明提供了通过这类方法生产的二硫化物-连接的聚合物。

本发明在另一个方面中包括通过上述方法生产的带有巯基-选择性末端的水溶性聚合物，本文一般命名为POLY-S。示例性的巯基-选择性基团包括：巯基；被保护的巯基；二硫化物；马来酰亚胺；乙烯基砜；α-卤代乙酰基化合物，诸如碘乙酰胺和碘乙酸酯；汞制剂；芳基卤；重氮基乙酸盐；和邻吡啶基二硫化物。

适用于本发明的水溶性聚合物链段包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰吗啉、聚噁唑啉和聚氧乙基化多元醇类。

在本发明优选的实施方案中，所述的聚合物为聚环氧烷，诸如聚乙二醇(PEG)。

本发明的聚合物可以进一步包括封端基，诸如C₁-C₂₀烷氧基，优选甲氧基、乙氧基或苄氧基。

在本发明的另一个实施方案中，聚合物、例如聚乙二醇聚合物具有约200-约100,000道尔顿或约200-约60,000道尔顿或约500-约40,000道尔顿的标称平均分子量。在优选的实施方案中，所述的聚合物具有约20,000-约40,000道尔顿的分子量。一种优选的聚乙二醇聚合物具有约20,000道尔顿的分子量。

适用于本发明方法和组合物的聚合物可以具有许多不同的几何结构，包括线性、支化、分岔(forked)和多臂。带有线性结构的聚合物包括单官能、同双官能和异双官能聚合物。

在另一个实施方案中，用于本发明的聚合物链段可以包括可水解的键。

本发明在另一个方面中提供了制备水溶性聚合物的巯基衍生物的方法，包括下列步骤。步骤(i)包括提供亲电活化的聚合物，本文特别命名为POLY-L_0，1-E(I)。在上述结构中，POLY为水溶性聚合物链段，L为任选的连接基，其中L₀表示不存在连接基且L₁表示存在这类连接基，且E为亲电体。步骤(ii)包括使POLY-L_0，1-E与本文更具体地命名为(NU-Y-S-)₂的对称二硫化物试剂反应，其中NU为亲核体，Y为″NU″与巯基-选择性基团之间插入的基团，在此情况中为二硫化物，且S为硫原子，反应条件为有效促进E与NU之间的反应而因此形成POLY-L_0，1-X-Y-S-S-Y-X-L_0，1-POLY((POLY-L_0，1-X-Y-S-)₂)(II)，其中X为E与NU之间反应产生的基团。优选的基团Y选自含有约2-约10个碳原子的亚烷基、取代的亚烷基、环亚烷基、取代的环亚烷基、芳基和取代的芳基组成的组。

在另一个实施方案中，所述的方法可以进一步包括还原(POLY-L_0，1-X-Y-S-)₂上的二硫键而形成POLY-L_0，1-X-Y-SH(III)的步骤(iii)，其中″-SH″为巯基。

聚合物中包含的特定L′s包括C₁-C₁₀烷基和C₁-C₁₀取代的烷基。在一个实施方案中，所述的连接基选自(CH₂)_{1、2、3、4和5}组成的组。

有代表性的E′s包括羧酸或活化的羧酸衍生物，诸如羧酸、羧酸酯、酰胺、碳酸酯、碳酸，酰基卤和酸酐。在一个特定的实施方案中，E为琥珀酰亚胺基酯。

对称二硫化物试剂中的NU′s包括氨基、羟基、亚氨基和巯基。在一个具体的实施方案中，NU为-NH₂。

POLY-L_0，1-X-Y-S-S-Y-X-L_0，1-POLY((POLY-L_0，1-X-Y-S-)₂)中包含的产生基团X包括酰胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、醚和硫代酸酯。

在一个实施方案中，POLY含有结构-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-，其中n为10-约4,000，优选约20-约1,000。

在另一个实施方案中，POLY为封端的聚环氧烷，诸如聚乙二醇，L为L₀或-CH₂-，且E为N-羟基琥珀酰亚胺基酯。

在另一个实施方案中，所述的对称二硫化物试剂为胱胺，其中NU为伯胺基且Y为-(CH₂)₂-。

本发明在另一个方面中提供了制备聚合物-蛋白质轭合物的方法，所述的方法包括下列步骤：(i)提供亲电活化的聚合物POLY-L_0，1-E，其中POLY、L和E如上述所定义；(ii)使POLY-L_0，1-E与对称二硫化物试剂(NU-Y-S-)₂反应，其中NU、Y和S如上述所定义，反应条件为有效促进E与NU之间的反应，从而形成POLY-L_0，1-X-Y-S-S-Y-X-L_0，1-POLY((POLY-L_0，1-X-Y-S-)₂)，其中X为E与NU之间反应产生的基团；(iii)还原(POLY-L_0，1-X-Y-S-)₂上的二硫键而形成POLY-L_0，2-X-Y-SH；和(iv)使POLY-L_0，1-X-Y-SH与蛋白质的巯基或被保护的巯基反应而形成蛋白质轭合物POLY-L_0，1-X-Y-S-S-蛋白质(V)。

在上述方法的一个实施方案中，所述的蛋白质为治疗蛋白。

本发明在另一个方面中提供了含有如下结构的活化的聚合物：

          POLY-L_0，1-C(O)G-Y-S-W

                 (VI)

在结构VI中，G为选自下列基团组成的组的杂原子：O，-NH，-NR²，其中R²为低级烷基，和S，和W为H或保护基。其余变化形式如上所述。在结构VI中，-C(O)G-为″X″的特定实施方案。

用于活化的聚合物的连接基L₁包括1-10个碳原子的脂族连接基。具体的连接基包括(CH₂)_{1、2、3、4和5}。

在本发明该方面的一个具体实施方案中，POLY为封端的聚乙二醇，L不存在或为-CH₂-，G为-NH，且Y为(CH₂)₂。

本文还提供了包括上述聚合物及其轭合物的组合物。

本发明在另一个方面中提供了含有如下结构的聚合物-轭合物：

          POLY-L_0，1-C(O)G-Y-S-S-A

                  (VII)

其中″A″表示活性剂，且″S-A″表示带有巯基的活性剂残基。

在本发明该方面的一个实施方案中，所述的活性剂选自蛋白质、肽类和小分子组成的组。

本文还提供了对需要的受试者递送生物活性剂的方法，通过给药本发明的轭合物来进行。

当结合如下详细描述阅读时，显然可以更完整地得出本发明的这些和其它目的和特征。

发明详述

定义

本文所用的下列术语具有指定的含义。作为本说明书和所附权利要求中所用的，除非上下文中另有清楚地说明，否则单数形式″一种(a)″、″一种(an)″、″该(the)″包括复数指代物。

在本发明有关聚合物的上下文中，″巯基选择性衍生物″指的是带有至少一个为巯基-反应性基团的末端的聚合物。优选巯基-选择性基团为优选与巯基反应的一种基团。本发明的巯基-选择性聚合物在一定反应条件下优先选择巯基。典型的巯基-选择性基团包括马来酰亚胺、乙烯基砜、邻吡啶基二硫化物、碘乙酰胺、巯基(-SH)、硫醇盐(-S-)或被保护的巯基、即被保护形式的巯基。典型的巯基保护基包括硫醚、硫代酸酯或二硫化物。典型的巯基保护基可以在Greene，T.和Wuts，Peter G.M.的″PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，第6章，3rd Edition，John Wiley和Sons，Inc.，New York，1999(p.454-493)中找到。

″活化的羧酸″或″活化的羧酸衍生物″指的是比母体羧酸更具反应性的羧酸的官能衍生物，特别是就亲核酰基取代而言。活化的羧酸包括、但不限于酰基卤(诸如酰基氯类)、酸酐类、酰胺类和酯类。

本文所用的″PEG″或″聚(乙二醇)″指的是包括任意水溶液聚(乙二醇)。一般来说，用于本发明的PEG含有如下两种结构之一：″-(CH₂CH₂O)_n-″或″-(CH₂CH₂O)_n-1CH₂CH₂-″，这取决于例如在合成转化过程中末端氧是否已经被取代。变量(n)在3-4000的范围且端基和PEG的整体的结构均可以改变。当PEG进一步含有连接基结构部分(下文中更具体地描述)，含有连接基的原子在与PEG链段共价连接时不会导致形成：(i)氧-氧键(-O-O-，过氧化物键)；或(ii)氮-氧键(N-O、O-N)。″PEG″指的是含有大部分、即大于50％的为-CH₂CH₂O-的子单元的聚合物。用于本发明的PEG包括具有将更具体描述的不同分子量、结构或几何结构的PEG(例如支化、线性、支链PEG、树枝状等)。

也称作α-、ω-二羟基聚(乙二醇)的″PEG二醇″可以以简单形式表示为HO-PEG-OH，其中PEG如上述所定义。

在本发明有关聚合物的上下文中的″水溶性″或″水溶性聚合物链段″为任意链段或在室温下溶于水的聚合物。一般来说，水溶性聚合物或链段可以透过至少约75％、更优选至少约95％的由过滤后相同溶液透过的光。以重量为基准，水溶性聚合物或其链段优选至少约35％(按重量计)溶于水、更优选至少约50％(按重量计)溶于水、更优选约70％(按重量计)溶于水且更优选约85％(按重量计)溶于水。然而，最优选所述的水溶性聚合物或链段约95％(按重量计)溶于水或完全溶于水。

″封端″或″封端的″基团为存在于诸如PEG这类聚合物末端上的惰性或非反应性基团。封端基是一种在一般合成反应条件下不易于进行化学转化的基团。封端基团一般为烷氧基-OR，其中R为由1-20个碳组成的有机基团且优选低级烷基(例如甲基、乙基)或苄基。″R″可以是饱和或不饱和的且包括芳基、杂芳基、任意上述基团的环、杂环和取代形式。例如，封端的PEG一般含有如下结构：″RO-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-″，其中R如上述所定义。另一方面，封端基还可以有利地包括可检测标记。当聚合物带有包括可检测标记的封端基时，可以通过使用合适的检测器测定聚合物和/或聚合物与之偶联的部分(例如活性剂)的量或位置。这类标记包括、但不限于荧光剂、化学发光剂、用于酶标记的结构部分、比色剂(例如染料)、金属离子、放射性结构部分等。封端基还可以有利地为磷脂。当聚合物带有封端基、诸如磷脂时，该聚合物可以被赋予独特特性(诸如形成具有相似封端的聚合物形成组织化结构的能力)。典型的磷脂类包括、但不限于那些选自称作磷脂酰胆碱类的磷脂类型的磷脂。具体的磷脂类包括、但不限于那些选自二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱(disteroylphosphatidylcholine)、山萮炔酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱(arachidoylphosphatidylcholine)和卵磷脂组成的组的磷脂。

涉及本发明聚合物的″非天然存在的″指的是聚合物作为整体形式在天然中未被发现。然而，非天然存在的本发明聚合物含有天然存在的一个或多个子单元或子单元链段，条件是该聚合物的整体结构在天然中未被发现。

在本发明上下文中诸如PEG这类水溶性聚合物的″分子量″指的是一般通过尺寸排阻色谱法、光散射技术或在1，2，4-三氯苯中的特性速度测定测定的聚合物的标称平均分子量。本发明的聚合物一般为多元分散系，具有小于约1.20且更优选小于约1.10的多分散值。

术语″反应性″或″活化的″指的是在常规有机合成条件下易于或以实用速率反应的官能基。这一结果与不反应或需要强催化剂或不切实际的反应条件才能反应的那些基团(即″非反应性″或″惰性″基团)相反。

涉及存在于反应混合物中分子上的官能基的″不易于反应″或″惰性″表示在有效产生反应混合物中的所需反应的条件下仍然大部分保持完整的基团。

″保护基″是防止或阻止在分子上的特定化学反应官能基在一定反应条件下反应的部分。保护基可以随被保护的化学反应基团类型以及所用反应条件和分子上存在的其它反应性基团或保护基的不同而改变。可以被保护的官能基作为实例包括羧酸基、氨基、羟基、巯基、羰基等。羧酸的有代表性的保护基包括：酯类(诸如对甲氧基苄酯)、酰胺类和肼类；就氨基而言，为氨基甲酸酯类(诸如叔丁氧羰基)和酰胺类，就羟基而言，为醚类和酯类；就巯基而言，为硫醚类和硫代酸酯类；就羰基而言，为缩醛类酮缩醇类等。这类保护基是本领域技术人员众所周知的且例如描述在T.W.Greene和G.M.Wuts的Protecting Groups in Organic Synthesis，Third Edition，Wiley，New York，1999及其中引述的参考文献中。

″被保护形式的″官能基指的是带有保护基的官能基。本文所用的术语″官能基″或其任意同义词指的是包括其被保护形式。

本文所用的术语″连接基″指的是任选用于连接互连结构部分、诸如聚合物链段与亲电体的原子或原子团。本发明的连接基一般为水解稳定的。

″生理上可裂解的″或″可水解的″或″可降解的″键是在生理条件下与水反应(即水解)的相当弱的键。键在水中水解的倾向不仅取决于连接两个中心原子的键的一般类型，而且取决于与这些这些原子连接的取代基。合适的水解不稳定的或弱的键包括、但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐类、缩醛类、酮缩醇类、酰氧基烷基醚、亚胺类、原酸酯类、肽类和寡核苷酸、硫代酸酯类、硫羟酸酯类和碳酸酯类。

″酶可降解的键″指的是可以用一种或多种酶进行降解的键。

用于本发明目的且特别涉及本发明聚合物的″水解稳定的″键或连接基指的是在正常生理条件下水解稳定的原子或原子团。即水解稳定的键在生理条件下和延长时间期限内不会发生任何可感觉的程度水解。水解稳定的键的实例包括、但不限于如下键或基团：碳-碳键(例如在脂族链上)、醚类、酰胺类、尿烷类、胺类等。有代表性的化学键的水解率可以在最标准的化学教科书中找到。

涉及聚合物的几何结构或整体结构的″支链″指的是带有2个或多个聚合物″臂″的聚合物。支链聚合物可以带有2个聚合物臂、3个聚合物臂、4个聚合物臂、6个聚合物臂、8个聚合物臂或多个聚合物臂。认为用于本发明目的的一种特定类型的高度支链化聚合物为枝状聚合物或树枝状聚合物具有不同于支链聚合物的结构。

″支化点″指的是含有一个或多个原子的分枝点，聚合物在该点上从直链结构分开或支化成一个或多个其它聚合物臂。

″树枝状聚合物″是球形、尺寸单分散性聚合物，其中所有键从具有规则支化模式并带有各自提供支化点的重复单元的中心焦点或核心以放射状出现。树枝状聚合物表现出一定的树枝状态特性，诸如核心包封，使得它们与其它类型聚合物相比具有独特性。

″基本上″或″主要″指的是接近完全或完全、例如95％或95％以上的一定的指定量。

″烷基″或″亚烷基″根据其在分子上位置和基团与非氢的原子连接基团的连接点的数量，指的是一般约为1-20个原子长度的烃链或结构部分。这类烃链优选、但不一定是饱和的，除非如此指定，且这类烃链可以为直链或支链，不过一般优选直链。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等。

″低级烷基″或″低级亚烷基″指的是如上述所定义的含有1-6个碳原子的烷基或亚烷基且可以为直链或支链，如可以列举甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基。

″环烷基″或″环亚烷基″根据其在分子上位置和基团与非氢的原子连接点的数量，指的是饱和或不饱和环状烃链，包括多环，诸如桥连、稠合或螺环化合物，优选由3-约12个碳原子、更优选3-约8个碳原子构成。

″低级环烷基″或″低级环亚烷基″指的是含有1-6个碳原子的环烷基。

″脂环″指的是含有碳原子环的任意脂族化合物。脂环基是一种含有如上述所定义的被一个或多个烷基或亚烷基取代的″环烷基″或″环亚烷基″的基团。

″非干扰取代基″是那些在存在于分子上时一般不与该分子内包含的其它官能基反应的基团。

术语″取代的″例如在″取代的烷基″上时指的是被一个或多个非干扰取代基取代的结构部分(例如烷基)，所述的非干扰取代基诸如、但不限于：C₃-C₈环烷基，例如环丙基、环丁基等；卤素，例如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基；低级苯基；取代的苯基等。就在苯基环上的取代而言，取代基可以为任意方向(例如邻位、间位或对位)。

″烷氧基″指的是-O-R基团，其中R为烷基或取代的烷基，优选C₁-C₂₀烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、苄基等)，优选C₁-C₇。

本文所用的″链烯基″指的是1-15个原子长度的含有至少一个双键的支链或非支链烃基，诸如乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四烯基等。

本文所用的″炔基″指的是2-15个原子长度的含有至少一个三键的支链或非支链烃基，诸如乙炔基、正丙炔基、异丙炔基、正丁炔基、异丁炔基、辛炔基、癸炔基等。

″芳基″指的是各自为5或6个核心碳原子的一个或多个芳族环。芳基包括可以稠合的、如萘基或非稠合的、如联苯基的多芳基环。芳基环还可以与一个或多个环状烃、杂芳基或杂环纯化或不与它们稠合。本文所用的″芳基″包括杂芳基。

″杂芳基″是含有1-4个杂原子、优选N、O或S或其组合的芳基。杂芳基环还可以与一个或多个环状烃、杂环、芳基或杂芳基环稠合。

″杂环″或″杂环的″指的是5-12个原子、优选5-7个原子的一个或多个环，它们具有或不具有不饱和或芳香性且带有至少一个不为碳的环原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。

″取代的杂芳基″是带有一个或多个非干扰基团作为取代基的杂芳基。

″取代的杂环″是带有一个或多个由非干扰取代基形成的侧链的杂环。

″亲电体″指的是离子、原子或可以为离子的原子团，它带有能够与亲核体反应的亲电子中心，即为得电子的中心。

″亲核体″指的是离子或原子或可以为离子的原子团，它带有亲核中心、即为得亲电子中心的中心且能够与亲电体反应。

本文所用的″活性剂″包括提供可以在体内或体外证实的一定药理作用、通常为有益作用的任意试剂、药物、化合物、物质的组合物或混合物。它包括食品、食品补充剂、营养物、营养药、药物、疫苗、抗体、维生素和其它有益试剂。本文所用的这些术语进一步包括给患者提供局部或全身作用的任意生理或药理活性物质。

″药物上可接受的赋形剂″或″药物上可接受的载体″指的是可以包括在本发明组合物中且不会对患者产生明显不良毒理作用的赋形剂。

″药理有效量″、″生理有效量″和″治疗有效量″在本文中可以互换使用以指存在于需要在血流或靶组织内提供所需水平的活性剂和/或轭合物的药物制剂中的PEG-活性剂轭合物用量。精确的用量取决于许多因素，例如特定的活性剂、药物制剂中的成分和物理特性、所针对的患者群体、患者的考虑等，且本领域技术人员易于基于本文提供和相关文献中获得的信息测定精确用量。

本发明有关聚合物的上下文中的″多官能″指的是带有其中含有的3个或3个以上官能基的聚合物骨架，其中所述的官能基可以相同或不同且一般存在于聚合物末端上。本发明的多官能聚合物在该聚合物骨架内一般含有约3-100个官能基或3-50个官能基或3-25个官能基或3-15个官能基或3-10个官能基或含有3、4、5、6、7、8、9或10个官能基。

″双官能″聚合物指的是其中含有的一般在末端上的两个官能基的聚合物。当所述的官能基相同时，认为该聚合物为同双官能型。当所述的官能基不同时，认为该聚合物为异双官能型。

本文所述的碱性或酸性反应剂包括中性、带电荷及其任意相应的盐形式。

″聚烯醇″指的是含有烯烃聚合物骨架的聚合物，诸如带有与聚合物骨架连接的多个侧羟基的聚乙烯。典型的聚烯醇为聚乙烯醇。

本文所用的″非肽″指的是基本上不含肽键的聚合物骨架。然而，该聚合物可以包括沿重复单体子单元间隔的少量的肽键，诸如：例如每约50个单体单元不超过约1个肽键。

术语″患者″指的是患有或易患可以通过给予本发明聚合物、但不一定是聚合物-活性剂轭合物形式来预防或治疗疾病的活生物体且包括人和动物。

″任选″或″任选地″指的是随后所述的情况可以发生，也可以不发生，使得该描述包括情况发生和情况不发生的例子。

所谓″残基″指的是与一种或多种分子反应后剩余的分子部分。例如，本发明聚合物轭合物上的生物活性分子残基一般至多相当于生物化学分子的部分，但不包括因生物活性分子上的反应基与聚合物试剂上的反应基反应而形成的共价键。术语″轭合物″用以指分子、例如分子与生物活性分子或任意反应性表面与反应性聚合物分子、优选反应性聚(乙二醇)共价连接结果而形成的本体。

″半胱胺″指的是2-氨基乙硫醇或H₂N-(CH₂)₂-SH。

″胱胺″指的是2，2′-二硫代双(乙胺)或(H₂N-(CH₂)₂-S-)₂。制备水溶性聚合物的巯基选择性衍生物的方法

方法综述

本发明提供了制备适合于与蛋白质或其它活性剂上的巯基反应反应的水溶性聚合物衍生物的方法。在该方法中，带有至少一个反应性亲电子末端的水溶性聚合物链段与含有亲核体(用于与聚合物的亲电子末端反应)和巯基选择性结构部分的双官能反应剂分子(即带有至少两个如下所述的官能基的反应剂分子)反应。有代表性的巯基选择性结构部分包括：巯基；被保护的巯基；二硫化物；马来酰亚胺；有机汞；α-卤代乙酰基化合物，诸如碘乙酰胺；乙烯基砜类；芳基卤类；重氮乙酸盐；和邻吡啶基二硫化物。该反应在有效促进聚合物的亲电子末端与反应剂分子的亲核基团之间反应的条件下进行，从而在聚合物与反应剂分子之间形成共价连接。该反应导致形成带有选择与巯基(例如巯基、被保护的巯基、二硫化物、马来酰亚胺、乙烯基砜、碘乙酰胺或邻吡啶基二硫化物)反应的末端的活化的聚合物，这取决于所用的特定反应剂分子。下面提供了一般反应方案。

1.一般反应方案：

 POLY-L_0，1-E+NU-Y-S→POLY-L_0，1-X-Y-S

“POLY-E”                    “POLY-S”

                 分子反应剂

            其中S为巯基选择性基团

2.示例的具体实施方案

POLY-L_0，1-E+(NU-Y-S-)₂→POLY-L_0，1-X-Y-S-S-Y-X-L_0，1-POLY

                             (POLY-L_0，1-X-Y-S-)₂，

(I)                                (II)

(II)                               (III)

其中R.A.为还原剂且Z、POLY、L、Y、X、NU如本文所定义。

POLY-L_0，1-X-Y-SH+HS-A→POLY-L_0，1-X-Y-S-S-A

(III)                             (IV)

其中A为活性剂。

该方法在其最简化的形式中可以在一个反应步骤中提供带有巯基-选择性末端(例如巯基、被保护的巯基或马来酰亚胺)的活性聚乙二醇衍生物。在反应剂分子带有和巯基选择性结构部分竞争性与聚合物的亲电子末端反应的亲核体，此时，亲核体为氨基且含硫的结构部分为诸如在典型的反应剂半胱胺上的巯基或硫醇盐，保护该反应剂分子上的巯基必须防止反应剂巯基中心上的聚合物反应。另一方面，如果两种竞争性结构部分的反应率明显不同，那么该反应可以在反应剂分子的亲电子中心选择性或优选与聚合物的亲电体反应的条件下进行。然后可以通过附加的纯化/分离步骤除去巯基或硫醇盐与指定亲电体之间反应产生的不需要的反应产物。

下面的部分中提供了有关合适的亲电体活化的聚合物和分子反应剂的详细描述。

在一个优选的实施方案中，所述的反应剂分子为带有两个相同的与聚合物亲电子基团反应的亲核基团的对称二硫化物。该手段是有利的，因为在反应剂分子上可能的不同亲核体之间不存在竞争。因此，在合适的反应条件(例如，当使用至少2倍摩尔过量的亲电活化的聚合物时-足以与对称二硫化物上的所有亲核基团反应)下，仅形成一种活化的聚合物产物。

示例的对称反应剂分子带有中心二硫(-S-S-)键，其中硫原子各自与相同的Y基团连接，诸如亚烷基、取代的亚烷基、环亚烷基、取代的环亚烷基、芳基或取代的芳基，这些基团带有与之共价连接的亲核体(NU)，诸如氨基、羟基、巯基、亚氨基、硫代酸酯等″(NU-Y-S)₂″。一种这类优选的对称反应剂分子为胱胺。亲电活化的聚合物与对称二硫化物试剂、诸如胱胺的反应导致形成带有从中心二硫键的各硫原子伸展的相同聚合物链段的对称二硫化物聚合物。实施例(实施例1-3)中提供了与不同亲电体活化的聚合物和反应剂胱胺进行的示例性反应。亲电活化的聚合物一般与双官能反应剂分子在非常温和的反应条件(例如室温)下反应，从而为该手段提供了另一种优势。此外，一般产率大于70％，优选大于80％，更优选大于90％，且通常甚至大于95％。

由于产生的二硫化物聚合物的对称性，所以通过诸如二硫苏糖醇这类还原剂的作用的裂解导致形成2摩尔的相应巯基-选择性聚合物衍生物(″POLY-S″)。

用于本发明的优选聚合物(POLY-E′s)包括甲氧基-PEG丙酸和甲氧基-PEG丁酸及其活化形式。本文所述的结构(11)、(13)和(18)中提供了带有巯基选择性末端的特别优选的聚合物衍生物。

在另一个优选的实施方案中，由聚合物酸或聚合物酸-等同原料制备本发明的聚合物衍生物，其中在与亲核体反应前纯化所述的聚合物酸。聚合物酸或聚合物酸等同物为本发明的水溶性聚合物，它带有至少一个为羧酸或羧酸等同物、诸如羧酸的活化衍生物的官能基或末端。聚合物酸的应用或制备提供的另一个优点在于用于除去可能存在于聚合物原料中的PEG二醇或PEG二醇-衍生的杂质，这取决于其来源。

通常作为本发明许多实施方案中使用的聚乙二醇原料、诸如亲电活化的PEG含有可检测量的PEG二醇杂质，通常在0.5％-超过30％重量。任何量的二醇杂质均是一个难题，因为二醇(及其反应产物)可能极其难以除去/分离。另外，PEG-二醇(且具体地说为其转化产物)因其反应性而可以在偶联反应中与生物活性剂反应，导致形成轭合物产物的混合物。所得的轭合物混合物可能难以分析，即难以测定二醇衍生的杂质的存在程度。此外，从二醇衍生的轭合物产物中分离所需的轭合物产物可能极其困难且在某些情况中可能无法实现。特别地，高分子量水溶性聚合物、诸如甲氧基-PEG-OH(例如具有大于约30,000道尔顿的分子量)可以至多含有30％重量或30％以上重量的二醇，这取决于PEG原料的来源和/或制备方法。如上所述，这类二醇和二醇衍生的杂质在被携带通过一系列转化和/或轭合反应时尤其可能成为难题。诸如在本发明的方法中应用聚合物酸要求例如通过色谱法对POLY-E原料(或其等同前体)进行纯化且最终形成主要不含反应性PEG-二醇或反应性PEG-二醇衍生的杂质的巯基-选择性聚合物制品。

申请人认为在反应或系列反应前端分离与PEG-二醇-相关的杂质导致形成反应性聚合物衍生物或最终聚合物轭合物是有利的，因为当与分离各种聚合物轭合物种类比较时，在该阶段分离/纯化更易于进行。

另一方面，作为除去或使mPEG-二醇衍生的杂质隋性的手段，可以由不含二醇的PEG-OH制备步骤(i)中提供的水溶性聚合物POLY-E，其中不含二醇的PEG-OH如共同拥有的美国专利US6,448,369中所述由苄氧基-PEG制备。在该手段中，优选通过在苄醚离子Bz-O^-上聚合环氧乙烷制备苄氧基-PEG-OH原料，产生高纯度的含有PEG-二醇的单官能苄氧基PEG。在将所有PEG-OH转化成惰性的甲基醚类并在随后步骤中除去苄氧基后，该方法提供了不含二醇的纯甲氧基-PEG-OH。在使用该方法的过程中，将PEG-二醇转化成其非反应性的醚形式，从而使其变成了所得组成中的惰性成分。

概括的说，本文提供的方法：(i)避免了多个烦琐的反应步骤；(ii)不必需要多个保护/脱保护步骤；(iii)在适度条件下进行，使得聚合物链段不易特别受到破坏；(iv)产生高产率的产物，一般大于90％；和(v)提供了一类新的带有巯基-选择性末端的聚合物衍生物。下文更完整地描述了本发明的总体合成方法、试剂、聚合物衍生物、组合物和轭合物。

聚合物反应剂POLY-L_0，1-E

聚合物链段POLY

下文描述了本文命名为POLY的应用于所述方法的亲电活化的聚合物的聚合物链段以及本发明的巯基-选择性聚合物。用于本发明的亲电活化的聚合物衍生物一般包括至少一种与水溶性聚合物链段偶联的亲电体。亲电体可以直接与聚合物链段共价结合或可以选择通过连接基L与聚合物骨架偶联。

有代表性的POLYs包括：聚(亚烷基二醇)，诸如聚(乙二醇)、聚(丙二醇)(″PPG″)；乙二醇与丙二醇的共聚物；聚(烯醇)；聚(乙烯基吡咯烷酮)；聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)；聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)；聚(糖)；聚(α-羟基酸)；聚(乙烯醇)；聚磷腈；聚噁唑啉；和聚(N-丙烯酰吗啉)。POLY可以为任意上述物质的均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三元共聚物、无规三元共聚物或嵌段三元共聚物。水溶性聚合物链段优选为聚(乙二醇)″PEG″或其衍生物，但不一定是它们。

所述的聚合物链段可以具有任意大量不同的几何结构，例如POLY可以为线形、支化或分岔的。最一般的情况是，POLY为线形或支化的，例如，带有2个聚合物臂。尽管作为示例性POLY，本文的多数讨论集中在PEG，但是有关讨论和本文提供的结构易于扩展至包括上述任意的水溶性聚合物链段。

可以按照本发明方法将带有至少一个亲电体活化的末端的任意水溶性聚合物用于制备巯基-选择性聚合物。尽管通常使用并且本文解释了仅带有单一反应性亲电体活化末端的水溶性聚合物，但是也可以使用带有适合于转化成如本文所述的巯基选择性聚合物的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或12个以上反应末端的聚合物。有利的是当水-聚合物链段上的羟基或其它反应性结构部分的数量增加时，用于引入亲电子基团的可利用的位置的数量也增加。与水溶性聚合物链段连接的羟基和/或亲电子结构部分数量的上限的非现限制性实例包括约1-约500、1-约100、约1-约80、约1-约40、约1-约20和约1-约10。

现在转到优选的POLY，PEG包括任意线形、支化或多臂形式的聚(乙二醇)，包括封端的PEG、分岔的PEG、支化的PEG、带侧基的PEG和含有一个或多个隔离单体子单元的可降解键的PEG，在下文中更完整地描述。

PEG聚合物链段含有如下结构：-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-，其中(n)一般在约3-约4,000或约3-约3,000或更优选在约20-约1,000的范围。

POLY可以是封端的，其中PEG在末端上被惰性封端基封端。优选的封端的PEG带有如下基团作为封端部分：诸如烷氧基、取代的烷氧基、链烯氧基、取代的链烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基、取代的芳氧基。优选的封端基为C₁-C₂₀烷氧基，诸如甲氧基、乙氧基和苄氧基。封端基还可以有利地包括磷脂。典型的磷脂类包括：磷脂酰胆碱，诸如二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱(disteroylphosphatidylcholine)、山萮炔酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱(arachidoylphosphatidylcholine)和卵磷脂。

现在涉及包括聚合物链段POLY的任意结构，POLY可以相对于或含有如下结构：

″Z-(CH₂CH₂O)_n-″或″Z-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-″，其中n在约3-约4000或约10-约4000的范围且Z为或包括可以为反应基或封端基的官能基。Z的实例包括羟基、氨基、酯、碳酸酯、醛、缩醛、醛水合物、酮、酮缩醇、酮水合物、链烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、巯基、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰肼、脲、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、碘乙酰胺、烷氧基、苄氧基、硅烷、脂质、磷脂、生物素和荧光素，包括它们适用的活化和被保护形式。优选这类官能基，诸如N-羟基琥珀酰亚胺基酯、1-羟基苯并三唑基碳酸酯、胺、乙烯基砜、马来酰亚胺、N-琥珀酰亚胺基碳酸酯、酰肼、丙酸琥珀酰亚胺酯、丁酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基酯、缩水甘油醚、氧基羰基咪唑、碳酸对硝基苯酯、醛、邻吡啶基-二硫化物和丙烯酰(acrylol)。

聚合物反应剂(和相应的产物)可以具有哑铃样或双官能直链结构，例如，其中两个亲电体通过中心POLY、例如PEG互联。更具体的说，这类POLY可以由结构E1-PEG-E2表示，其中E1和E2为独立选择的如本文所述的亲电体。优选E1和E2相同。实施例3中提供了属于该类的典型PEG，例如(15)和(16)。美国专利US5,900,461中提供了其它实例，特别将该文献引入本文作为参考。在优选的实施方案中，特别就本发明的巯基-选择性聚合物或其前体而言，官能基Z可以相当于″L_0，1-X-Y-S″以便提供在聚合物链段的侧链上带有相同基团的同双官能巯基-选择性聚合物，例如S-Y-X-L_0，1-POLY-L_0，1-X-Y-S，VIII。

这些和其它官能基Z描述在下列参考文献中，将所有这些文献引入本文作为参考：N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(例如，参见美国专利US5,281,698；US5,468,478)；胺(例如，参见Buckmann等人，Makromol.Chem.182：1379(1981)；Zalipsky等人，Eur.Polym.J.19：1177(1983))；酰肼(例如，参见Andresz等人，Makromol.Chem.179：301(1978))；丙酸琥珀酰亚胺酯和丁酸琥珀酰亚胺酯(例如，参见Olson等人，Poly(ethylene glycol)Chemistry&Biological Applicationspp170-181；Harris&Zalipsky Eds.，ACS，Washington，DC，1997；另外参见美国专利US 5,672,662)；琥珀酸琥珀酰亚胺酯(例如，参见Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)和Joppich等人，Makromol.Chem.180：1381(1979)；琥珀酰亚胺基酯(例如，参见美国专利US 4,670,417)；碳酸苯并三唑酯(例如，参见美国专利US 5,650,234)；缩水甘油醚(例如，参见Pitha等人，Eur.J.Biochem.94：11(1979)；Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991)；氧基羰基咪唑(例如，参见Beauchamp，等人，Anal.Biochem.131：25(1983)；Tondelli等人，J.ControlledRelease 1：251(1985))；碳酸对硝基苯酯(例如，参见Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.11：141(1985)；和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))；醛(例如，参见Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)，美国专利US 5,824,784，美国专利US 5,252,714)；马来酰亚胺(例如，参见Goodson等人，Bio/Technology 8：343(1990)；Romani等人，Chemistry ofPeptides and Proteins 2：29(1984))；和Kogan Synthetic Comm.22：2417(1992))；邻吡啶基-二硫化物(例如，参见Woghiren等人，Bioconj.Chem.4：314(1993))；丙烯酰(例如，参见Sawhney等人，Macromolecules 26：581(1993))；乙烯基砜(例如，参见美国专利US 5,900,461)。

此外，所述类型的POLY指的是包括线形聚合物链段且还指支化或分岔聚合物链段。在聚合物链段支化的情况中，例如，POLY结构相当于形成POLY总体结构组成部分的聚合物臂。另一方面，在POLY具有支链结构的情况中，例如，POLY可以相当于支化点前聚合物链段的线形部分。

POLY还包括带有2个臂、3个臂、4个臂、5个臂、6个臂、7个臂、8个臂或8个臂以上的支化PEG分子。用于制备本发明巯基-选择性聚合物的支化聚合物可以具有2-300之间的任意值或这类反应末端。优选带有2或3个聚合物臂的支化聚合物链段。如美国专利US5,932,462中所述的示例性支化POLY相当于如下结构：

在该通式中，R″为非反应性结构部分，诸如H、甲基或PEG，且P和Q为非反应性键。在优选的实施方案中，支化PEG聚合物链段为甲氧基聚(乙二醇)二取代的赖氨酸。

在上述特定的支化构型中，支化聚合物链段带有从″C″支化点延伸的单一反应活性部位以便聚合物反应剂的亲电子基团或巯基-选择性聚合物产物的X基团定位。诸如用于本发明的这些支化PEG一般带有少于4个PEG臂且更优选带有2或3个PEG臂。这类支化PEG与线形PEG对应物相比提供了带有单一反应活性部位的优点，所述的单一反应活性部位与较大、密度较高的聚合物云状物偶联。带有亲电子基团的示例性支化聚合物、诸如它们商购自Nektar(Huntsville，Alabama)，且包括mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺。

本发明的示例性支化聚合物反应剂和相应的巯基-选择性聚合物分别具有如下所示的结构：

其中X、Y和S如本文所述。在结构IX-B中，X可以相当于-C(O)-G，其中G为-NH。

用于制备本发明聚合物的支化聚合物还包括更一般地由通式R(POLY)_n表示的那些聚合物，其中R为中心或核心分子，从其中可以延伸2或2个以上POLY臂，诸如PEG。变量n表示POLY臂数，其中聚合物臂可以各自独立为封端的或换之在其末端上带有反应性官能基。一般来说，至少一个聚合物臂带有末端官能基。在本发明的这类多臂实施方案中，每个PEG臂一般在其末端带有亲电体(或亲电体与如上所述的亲核体之间的相应反应产物)。上述诸如那些一般由通式R(PEG)_n表示的支化PEG带有2个聚合物臂-约300个聚合物臂(即n在2-约300的范围)。优选这类支化PEG带有2-约25个聚合物臂、更优选2-约20个聚合物臂且甚至更优选2-约15个或15个以下聚合物臂。最优选带有3、4、5、6、7或8个聚合物臂的多臂聚合物。

如上所述优选的支化PEG上的核心分子为多元醇类。这类多元醇包括带有1-10个碳原子和1-10个羟基的脂族多元醇，包括乙二醇、烷二醇类、烷基二醇类、烷叉基烷基二醇类、烷基环烷二醇类、1，5-萘烷二醇、4，8-双(羟甲基)三环癸烷、环亚烷基二醇类、二羟基烷类、三羟基烷类等。还可以使用脂环族多元醇类，包括直链或闭环糖类和糖醇类，诸如甘露糖醇、山梨醇、肌醇、木糖醇、白雀木醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、赤藓醇、侧金盏糖醇、卫矛醇(ducitol)、facose、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、阿卓糖、塔罗糖、tagitose、吡喃糖苷类、蔗糖、乳糖、麦芽糖等。其它脂族多元醇类包括甘油醛、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖和相关立体异构体的衍生物。可以使用的其它核心多元醇类包括冠醚、环糊精、糊精和其它碳水化合物，诸如淀粉和直链淀粉。优选的多元醇类包括甘油、季戊四醇、山梨醇和三羟甲基丙烷。

对应于不发明巯基-选择性聚合物的有代表性的多臂结构如下所示，其中n优选在约3-约8的范围。

用于制备本发明的其它多臂聚合物包括购自Nektar(Huntsville，Alabama)的多臂PEG。用于本发明方法的优选多臂化亲电活化的聚合物对应于如下结构，其中E表示亲电子基团：

PEG为-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-且m选自3、4、5、6、7和8组成的组。当然，相应的巯基-选择性聚合物产物具有如上所示的结构，但亲电体E被″-X-Y-S″取代(XI-B)。

另一方面，所述的聚合物链段可以具有完全分岔的结构。支链PEG的实例对应于如下一般结构，其中第一个结构表示亲电活化的分岔PEG且第二个结构表示分岔的巯基-选择性聚合物产物：

其中PEG是本文所述的任意形式的PEG，A为连接基，优选水解稳定的键，诸如氧、硫或-C(O)-NH-，F和F′为任选存在的水解稳定的间隔基，且其它变量对应于如上述所定义的E、X、Y和S。对X、Y和S可能的值的一般和具体描述适合于上述结构。对应于A、F和F′的典型连接基和间隔基描述在国际申请号PCT/US99/05333中用于形成用于本发明的这类聚合物链段。F和F′为可以相同或不同的间隔基。在上述一个特定实施方案中，PEG为mPEG，A对应于-C(O)-NH-且F和F′均为亚甲基或-CH₂-。这类聚合物链段用于与两种活性剂反应，其中所述的两种活性剂以精确或预定的间距定位，这取决于对F和F′的选择。

在本文提供的任意有代表性的结构中，一个或多个可降解的键可以包含在聚合物链段中以便在体内生成带有小于初始给药的轭合物上的PEG链的PEG-二硫化物连接的轭合物。合适的生理学上可裂解的键包括、但不限于酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基醚、缩醛和酮缩醇。这类键在包含在指定聚合物链段上时优选在储存和初始给药时保持稳定。更具体的说，如上述一般所述，通过可水解键连接的两个或多个聚合物链段可以由下列结构表示：PEG1-W-PEG2(其中PEG1和PEG2可以相同或不同)且W表示弱的可水解键。这些聚合物结构含有可在体内被除去(即可裂解的)PEG臂或PEG臂部分。

用于制备本发明轭合物的带有线形或支化结构的其它有代表性的PEG可以购自Nektar Therapeutics(上述Shearwater Corporation，Huntsville，Alabama)。解释性结构描述在Shearwater′s 2001目录中的标题为″Polyethylene Glycol and Derivatives for BiomedicalApplications″中，特别将该文献引入本文作为参考。

一般来说，水溶性聚合物链段POLY的标称平均分子量是可变的。POLY的标称平均分子量一般在如下范围中的一个或多个值：约100道尔顿-约100,000道尔顿；约500道尔顿-约80,000道尔顿；约1,000道尔顿-约50,000道尔顿；约2,000道尔顿-约25,000道尔顿；约5,000道尔顿-约20,000道尔顿。示例性的水溶性聚合物链段POLY的标称平均分子量包括：约1,000道尔顿；约5,000道尔顿；约10,000道尔顿；约15,000道尔顿；约20,000道尔顿；约25,000道尔顿；约30,000道尔顿；和约40,000道尔顿。低分子量POLYs具有约250、500、750、1000、2000或5000道尔顿的分子量。示例性的巯基选择性衍生物包括如实施例1-3中提供的具有选自5,000道尔顿、20,000道尔顿和40,000道尔顿组成的组的分子量的PEG。

在本发明的一个特定实施方案中，如本文提供的活化的巯基选择性衍生物带有具有如下标称平均分子量之一的PEG链段：500、1000、2000、3000、5000、10,000、15,000、20,000、30,000和40,000道尔顿。

就子单元的数量而言，用于本发明的PEG一般包括属于如下范围中的一个或多个的大量(-OCH₂CH₂-)子单元：10-约4000个子单元；约20-约1000个子单元；约25-约750个子单元；约30-约个500子单元。

在一个实施方案中，尽管可以使用任意数量的聚合物(POLY)，但是聚合物包括亲水性聚合物，即含有少于约25个子单元的聚氧化丙烯或其它类似疏水性聚合物链段的聚合物。在可选的实施方案中，聚合物可以不含聚氧化丙烯或类似的疏水性子单元。在一个实例中，聚合物优选不为pluronic-型聚合物。

在另一个特定的实施方案中，所述的聚合物优选不与固相支持体结合。在另一个具体的实例中，本发明的聚合物是一种虽然可以、但不必是基本上不含脂肪酸部分或其它亲脂性部分的聚合物。

聚合物亲电子基团(″E″)

用于所述方法的聚合物含有至少一个适合于与亲核体反应的亲电体或亲电子基团(-E)，所述的亲核体诸如包含在巯基-选择性反应剂分子中。典型的亲电体包括活化的酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯或1-羟基苯并三唑基酯)、活性碳酸酯类(例如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、对硝基苯基碳酸酯和1-羟基苯并三唑基碳酸酯)、缩醛、醛、醛水合物、活性酸酐类、诸如酸酐类、酰基卤、芳基卤、酮、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰氨基酯等。特别优选活化的酯类，诸如NHS酯类。概括的说，具有一般结构POLY-L_0，1-E的聚合物链段可以在至少一个末端上带有任意的亲电子基团，其中典型的亲电体包括如上所述的那些亲电体。

聚合物连接基L

在大部分情况中，聚合物链段直接与亲电体连接。另一方面，聚合物链段提供插入的连接基L与亲电体连接。当使用这类连接基时，本文一般将其表示为L₁，其含义是存在这类连接基。当这类连接基不存在时，本文一般将其表示为L₀。用于本发明的连接基一般为C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀取代的烷基。例如，在聚合物链段为PEG、例如-(CH₂CH₂-O)_n-CH₂CH₂-的情况中，一种特别优选的连接基为亚甲基-CH₂-，不过，可以类似地使用任何直链低级烷基或支链低级烷基或其嵌段的对应物。

纯化的亲电体活化的聚合物

特别适用于本发明方法的是亲电活化的PEG试剂，诸如色谱法纯化的羧酸或其功能等价物，诸如购自Nektar，Huntsville，Alabama的mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯、mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸酯、mPEG-CM-HBA-NHS、mPEG2-NHS等。根据酸的官能度，这类亲电活化的PEG更易于在与双官能反应剂分子NU-Y-S反应前而不是之后纯化，从而使PEG-二醇或二醇-衍生的杂质得到分离。可以通过本领域中常用的任意大量的纯化方法纯化POLY-E，不过，优选基于化学的分离和色谱法。一种这类优选的色谱法为离子交换色谱法或IEC。IEC用于分离任意带电荷的分子，诸如PEG-酸。典型的离子交换色谱法的条件易于由本领域技术人员测定，诸如具体的柱、所用pH范围、离子强度、缓冲剂的选择、梯度等。

在某些情况中，将凝胶渗透色谱法或GPC用于测定含有PEG-的反应剂和衍生物的纯度。因此，在一个实例中，GPC可以用于测定指定PEG-原料或PEG反应剂中PEG-二醇或二醇-衍生的杂质的程度。一旦例如通过GPC证实存在一定量的PEG-二醇，则通过离子交换色谱法纯化PEG-原料或衍生物、诸如PEG-酸以除去任何PEG-二醇或与PEG-二醇相关的杂质，使得所得的PEG组合物基本上不含这类双官能PEG杂质。

这类亲电活化的PEG试剂优选基本上是纯的，即不存在PEG-二醇或反应性双官能PEG-二醇衍生的杂质。优选原料POLY-L_0，1-E含有低于约10％的任何这类杂质、优选低于约5％的任何这类杂质且更优选低于约2％或不可检测到量的任何这类杂质。它相应地指的是所得巯基-特异性-官能化聚合物POLY-S优选包括至少90％或至少95％或至少98％或98％以上的基于所需聚合物的产物，其中不含显著量来源于PEG-二醇的双官能化的聚乙二醇杂质。某些这类双官能化的聚合物杂质、特别是在实施本发明方法时因携带这类杂质产生的相应二硫醇类或被保护的二硫醇类可能极难以除去。如果携带这类反应性杂质从反应方案进入最终活化的聚合物衍生物，那么这类反应性杂质可以与靶偶联结构部分、诸如蛋白质或其它活性剂上含有巯基的基团反应而得到除所述产物以外的聚合物轭合物。

巯基-选择性反应剂分子

按照本发明的方法，使POLY-L_0，1-E与反应剂分子反应，所述的反应剂分子含有与如上所述的活化聚合物的亲电基团反应的亲核体(-NU)和巯基-选择性基团。一般来说，用于本发明的分子反应剂具有结构NU-Y-S，其中NU为亲核体，Y为NU与S之间插入的基团，且S为巯基-选择性基团。

“Y”

Y在性质上典型地、但不必是直链的。Y基团的总长度一般在1-约20个原子或约2-15个原子的范围，其中该长度指的是单链上不计算取代基的原子的数量。例如，就连接基总长度而言，-CH₂-计为一个原子，-CH₂CH₂O-在长度上计为3个原子。优选Y具有约1-约20个原子或约2-约15个原子或约1-约6个原子的长度且为水解稳定的。

有代表性的Y基团可以为任意如下的基团：-CH₂-；-CH₂-CH₂-；-CH₂-CH₂-CH₂-；-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-；-O-CH₂-；-CH₂-O-；-O-CH₂-CH₂-；-CH₂-O-CH₂-；-CH₂-CH₂-O-；-O-CH₂-CH₂-CH₂-；-CH₂-O-CH₂-CH₂-；-CH₂-CH₂-O-CH₂-；-CH₂-CH₂-CH₂-O-；-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-；-CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-；-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-；-CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-；-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-；-C(O)-NH-CH₂-；-C(O)-NH-CH₂-CH₂-；-CH₂-C(O)-NH-CH₂-；-CH₂-CH₂-C(O)-NH-；-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-；-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-；-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-；-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-；-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-；-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-；-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-；-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-；-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)NH-CH₂-CH₂-；-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-；-C(O)-O-CH₂-；-CH₂-C(O)-O-CH₂-；-CH₂-CH₂-C(O)-O-CH₂-；-C(O)-O-CH₂-CH₂-；-NH-C(O)-CH₂-；-CH₂-NH-C(O)-CH₂-；-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-；-NH-C(O)-CH₂-CH₂-；-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂；-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂；-C(O)-NH-CH₂-；-C(O)-NH-CH₂-CH₂-；-O-C(O)-NH-CH₂-；-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-；-NH-CH₂-；-NH-CH₂-CH₂-；-CH₂-NH-CH₂-；-CH₂-CH₂-NH-CH₂-；-C(O)-CH₂-；-C(O)-CH₂-CH₂-；-CH₂-C(O)-CH₂-；-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-；-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-；-CH₂-CH₂-C(O)-；-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-；-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-；-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-；环亚烷基；或取代的环亚烷基；-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-；和任意上述基团中的两个或多个的组合。

例如，用于本发明的优选Y基团包括亚烷基、取代的亚烷基、环亚烷基、取代的环亚烷基、芳基和取代的芳基。Y一般含有约2-约10个碳原子且可以如下含有其它非干扰原子。示例性Y基团具有如下结构：

其中R¹和R²在每次出现时均独立为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、环亚烷基、取代的环亚烷基和取代的亚烷基环烷基组成的组的有机基团。优选Y由2-约10个碳原子组成。典型的Y基团包括亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂CH₂-)、亚丙基(-CH₂CH₂CH₂)、亚丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂-)、亚戊基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-)、2-甲基丙基、取代的对应物等。在上述结构的特定实施方案中，R¹和R²均为H。

另一种优选的Y基团具有如下结构：-(CH₂)_{1，2，3，4，5}-NH-C(O)-CH₂CH₂-。

巯基-选择性基团″S″

典型的巯基-选择性基团包括巯基、被保护的巯基、二硫化物、马来酰亚胺、乙烯基砜、碘乙酰胺和邻吡啶基二硫化物。本文所述的″S″表示任意的巯基-选择性基团。特别地，″S″可以表示巯基、硫醇盐、二硫化物或其它被保护的巯基。巯基结构部分的保护基除二硫化物外还包括：三苯甲基；硫醚类，诸如烷基和苄基硫醚类，包括一硫代、二硫代和氨基硫代缩醛类、硫代酸酯类、硫代碳酸酯类、硫代氨基甲酸酯类和亚氧硫基衍生物。下面提供了对应于这些典型″S″基团的结构，其中虚线表示与分子的Y部分的连接点。A-SH表示带有巯基的活性剂。

巯基-选择性基团            相应的A-SH轭合物

亲核体

反应剂分子的亲核体部分为本领域中公知常用的任意亲核体。优选的亲核体包括伯胺基、仲胺基、羟基、亚氨基、巯基、硫代酸酯等。仲胺基一般带有诸如甲基、乙基这类低级烷基作为取代基。

因此，用于本发明的分子反应剂分子带有本文提供的NU、Y和S的任意组合。优选的分子反应剂包括胱胺—一种示例性的对称氨基二硫化物化合物和半胱胺—一种氨基硫醇以及N-(2-氨基-乙基)-3-马来酰亚氨基-丙酰胺。实施例1-3中提供了使用典型分子反应剂胱胺进行的反应且下文提供了使用分子反应剂N-(2-氨基-乙基)-3-马来酰亚氨基-丙酰胺的典型反应方案。

由POLY-E制备马来酰亚胺，其中E为酸或酸的等价物

反应条件

分子反应剂上聚合物的亲电子基团与亲核体之间典型地，但不必在温和反应条件下进行，这当然取决于进行反应的特定亲电体和亲核体。一般来说，这类反应在约100℃或100℃以下或在65℃或65℃以下或在40℃或40℃以下或在约25℃或25℃以下的温度下进行。反应步骤典型在有机溶剂中进行，诸如：丙酮；乙腈；氯化烃类，诸如氯仿和二氯甲烷；芳族烃类，诸如苯、甲苯或二甲苯、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亚砜。

特定的反应条件(溶剂、反应剂的摩尔比、温度、压力、反应时间)易于由本领域技术人员根据选择的特定反应剂和所需产物来决定。可以通过任意大量常用的分析技术监测反应过程或进程，诸如薄层色谱法或¹H NMR。

在巯基选择性结构部分为被保护的巯基的情况中，可能还需要脱保护步骤。用于脱保护的条件取决于保护基的性质且这类条件易于由本领域技术人员决定，如Greene，T.，和Wuts，Peter G.M.在″PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，Chapter 6，3rd Edition，John Wiley和Sons，Inc.，New York，1999(p.454-493)。

当将对称的二硫化物试剂、诸如胱胺用作分子反应剂时，所得聚合物产物为带有中心二硫键的对称聚合物。带有中心二硫键的有代表性的对称水溶性聚合物作为结构(10)和(12)提供，不过，基于对本文提供的反应和POLY、L₁、E、NU、Y和S基团的描述易于预计到许多具有这些特征的可选结构。然后可以通过用诸如二硫苏糖醇、Sn/HCl、Na/二甲苯、氨、氢化铝锂、硼氢化钠这类合适的还原剂或本领域中各种的任意其它还原剂将对称聚合物二硫化物转化成相应的巯基-封端的聚合物，例如(11)和(13)等。

巯基-选择性聚合物

本发明在另一个方面中还提供了具有上述特征和成分的巯基-选择性聚合物。一般来说，本发明的巯基-选择性聚合物具有如下结构：POLY-L_0，1-X-Y-S，其中变量L、X、Y和S如上所述。用于上述本发明巯基-选择性聚合物的一般性结构中包括所有上述惰性的POLYs、连接基、Y基团和S基团。优选聚合物试剂的亲电体与分子反应剂上的亲核体反应产生的官能基X为酰胺(-C(O)-NH-或尿烷-O-C(O)-NH-。在某些情况中，将官能基X在本文中命名为″-G₁-C(O)-G₂-″，其中G₁和G₂各自独立为杂原子，诸如O、NH或S。在一个实施方案中，G₁不存在且Y相当于C(O)-G。优选G₂为-NH。本发明的对称聚合物二硫化物具有如下一般结构：(POLY-L_0，1-X-Y-S-)₂，II，它包括本文所有对POLYs、连接基和Y基团所述的内容。

聚合物反应剂的储存

优选将本发明的巯基-选择性聚合物储存在惰性环境中，诸如氩气或氮气环境中。还优选使本发明的聚合物与湿气的接触最少。因此，优选的储存条件是在氩气或其它干燥惰性气体环境中和低于约-15℃的温度下。优选在低温下储存，因为在低温下可以减缓不需要的副反应速率。在聚合物产物的聚合物链段为PEG时，PEG部分可以与氧发生缓慢反应而沿分子的PEG部分形成过氧化物。过氧化物的形成可能最终导致链裂解，由此增加本文提供的PEG试剂的多分散性。鉴于上述内容，还优选将本发明的聚合物储存在黑暗中。

巯基-活化的聚合物轭合物

本发明还包括通过使本文所述的任意巯基-选择性聚合物反应形成的轭合物。本发明的巯基-选择性聚合物特别用于与带有至少一个用于反应的巯基或氨基的活性剂或表面轭合。轭合物具有对应于通过使本文所述的任意巯基-选择性基团、例如巯基、马来酰亚胺、乙烯基砜、邻吡啶二硫化物与活性剂中包含的易接近的巯基反应而形成的官能基的结构。

例如，本发明的轭合物可以具有如下结构：POLY-L_0，1-X-Y-S-S-活性剂，IV，其中S-S-为二硫键。

另一方面，本发明的轭合物可以具有如下结构：

其中″-S-活性剂″表示含有巯基(-SH)的活性剂，优选生物活性剂，且其它变量如上所述。在活性剂为生物活性剂或仅含有一个反应性巯基的小分子的情况中，所得组合物可以有利地仅含有单一聚合物轭合物种类，这是因蛋白质中包含的较低硫氢基数量且易于轭合所致。在某些情况中，将蛋白质或小分子或其它活性剂改造成在公知的位置上带有巯基且类似地产生仅包括单一聚合物轭合物种类的组合物。这种手段一般称作位点特异性修饰。

另一方面，本发明的轭合物可以具有如下结构：

在上述结构中，″-NH-活性剂″表示含有氨基的活性剂或表面，优选生物活性剂，且其它变量如上所述。在某些反应条件下，马来酰亚胺基可以与诸如那些存在于诸如蛋白质这类活性剂上的氨基反应。

与本发明活化的聚合物偶联的半胱氨酸残基可以天然存在(即以其天然形式在蛋白质中出现)或可以使用标准遗传工程技术将其插入天然序列以取代天然存在的氨基酸。由于巯基在蛋白质中的数量少于它们在其它典型的聚合物连接位置、诸如氨基上的数量，所以聚合物衍生物的共价连接可以导致对靶蛋白的更具选择性的聚乙二醇化。即本发明的聚合物衍生物可以更大程度地控制所得聚合物轭合物-在与母体蛋白连接的聚合物衍生物数量(单-与二-与三-取代的轭合物等相比)上和聚合物连接的位置上。

上文以详细形式描述了本发明轭合物的一般性特征。与巯基-选择性聚合物共价连接的活性剂包括任意大量类型的分子、实体、表面等，正如可以从下文中显而易见的。

靶分子和表面

本发明的巯基-选择性聚合物可以通过共价或非共价方式与大量实体连接，包括：薄膜；化学分离和纯化表面；固相支持体；金属/金属氧化物表面，诸如金、钛、钽、铌、铝、钢及其氧化物、氧化硅；大分子和小分子。另外，本发明的聚合物和方法还可以用于生物化学传感器、生物电子开关和闸门。本发明的聚合物和方法还可以用于制备肽合成的载体、用于制备聚合物-涂敷的表面和聚合物接枝、用于制备用于亲和分配的聚合物-配体轭合物、用于制备交联或非交联水凝胶和用于制备用于生物反应器的聚合物-辅因子加合物。

用于提供本发明轭合物的生物活性剂可以为如下中的一种或多种。合适的活性剂选自：例如催眠药和镇静药；精神兴奋剂；安定药；呼吸药；抗惊厥药；肌肉驰缓药；抗震颤麻痹药(多巴胺拮抗剂)；止痛药；抗炎药；抗焦虑药(抗焦虑剂)；食欲抑制剂；抗偏头痛药；肌肉收缩药；抗感染药(抗生素、抗病毒药、抗真菌药、疫苗)；抗关节炎药；抗疟药；止吐药；anepileptics；支气管扩张药；细胞因子；生长因子；抗癌药；抗血栓形成药；抗高血压药；心血管药物；抗心律失常药；抗氧化剂；抗哮喘药；激素药，包括避孕药；拟交感神经药；利尿药；脂质调节剂；抗雄激素药；抗寄生物药；抗凝剂；neoplastics；抗肿瘤药；降血糖药；营养剂和补充剂；生长补充剂；抗肠炎药(antienteritis)；疫苗；抗体；诊断用药；和造影剂。

更具体地说，所述的活性剂属于许多结构类型之一，包括、但不限于小分子(优选不溶性小分子)、肽类、多肽类、蛋白质、抗体、多糖类、类固醇、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、脂肪、电解质等。优选用于与本发明聚合物偶联的活性剂带有天然硫氢基或较少优选天然氨基，或另一方面，所述的活性剂被修饰成含有至少一个适合于偶联的反应性硫氢基或氨基。

活性剂的具体实例包括、但不限于天冬酰胺酶；amdoxovir(DAPD)；安肽；贝卡普勒明；降钙素；cyanovirin；地尼白介素-毒素连接物；红细胞生成素(EPO)；EPO激动剂(例如如WO 96/40749中所述的约10-40个氨基酸长度且包括特定的核心序列的肽类)；阿法链道酶；红细胞生成刺激蛋白(NESP)；凝血因子，诸如V因子、VII因子、VIIa因子、VIII因子、IX因子、X因子、XII因子、XIII因子、von Willebrand因子；西利酶；伊米苷酶；α-葡糖苷酶；胶原蛋白；环胞菌素；α防卫素；β防卫素；exedin-4；粒细胞集落刺激因子(GCSF)；血小板生成素(TPO)；α-1蛋白酶抑制剂；依降钙素；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)；血纤蛋白原；非格司亭；生长激素人生长激素(hGH)；生长激素释放激素(GHRH)；GRO-β；GRO-β抗体；骨形态发生蛋白，诸如骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-6、OP-1；酸性成纤维细胞生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；CD-40配体；肝素；人血清清蛋白；低分子量肝素(LMWH)；干扰素，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素ω、干扰素τ、共有干扰素；白细胞介素和白细胞介素受体，诸如白细胞介素-1受体、白细胞介素-2、白细胞介素-2融合蛋白、白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-4受体、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-12、白细胞介素-13受体、白细胞介素-17受体；乳铁蛋白和乳铁蛋白片段；促黄体激素释放激素(LHRH)；胰岛素；前胰岛素；胰岛素类似物(例如美国专US5,922,675中所述的单酰化胰岛素)；糊精；C-肽；促生长素抑制素；促生长素抑制素类似物，包括奥曲肽、加压素、促卵泡激素(FSH)；流感疫苗；胰岛素样生长因子(IGF)；insulintropin；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；血纤蛋白溶解酶原激活物，诸如阿替普酶、尿激酶、瑞替普酶、链激酶、帕米普酶、拉诺替普酶和teneteplase；神经生长因子(NGF)；骨桥蛋白(osteoprotegerin)；血小板衍生生长因子；组织生长因子；转化生长因子-1；血管内皮生长因子；白血病抑制因子；角质化细胞生长因子(KGF)；胶质生长因子(GGF)；T细胞受体；CD分子/抗原；肿瘤坏死因子(TNF)；单核细胞趋化蛋白-1；内皮生长因子；甲状旁腺素(PTH)；胰高血糖素样肽；促生长素；胸腺素α-1；胸腺素α-1 IIb/IIIa抑制剂；胸腺素β10、胸腺素β9、胸腺素β4；α1-抗胰蛋白酶；磷酸二酯酶(PDE)化合物；VLA-4(极迟抗原-4)；VLA-4抑制剂；二膦酸盐；呼吸道合胞病毒抗体；囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)基因；脱氧核糖核酸酶(deoxyreibonuclease)(Dnase)；杀菌/增加渗透性的蛋白(BPI)；和抗-CMV抗体。典型的单克隆抗体包括依那西普(由与IgG1的Fc部分连接的人75kD TNF受体的胞外配体结合部分组成的二聚化融合蛋白)、阿昔单抗、阿非莫单抗(afeliomomab)、巴利昔单抗、达珠单抗、英夫利昔单抗、替伊莫单抗(tiuexetan)、米妥莫单抗、莫罗单抗-CD3、碘131托西莫单抗轭合物、奥立珠单抗、利妥昔单抗和曲妥单抗(赫赛汀)。

适合于与聚合物共价连接的其它活性剂包括、但不限于氨磷汀；胺碘酮；氨基己酸；氨基马尿酸钠；氨鲁米特；氨基酮戊酸；氨基水杨酸；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；天冬酰胺酶；蒽环类抗生素；贝沙罗汀；比卡鲁胺；博来霉素；布舍瑞林；白消安；卡麦角林；卡培他滨；卡铂；卡氮芥；苯丁酸氮芥(chlorambucin)；西司他丁钠；顺铂；克拉屈滨；氯膦酸盐；环磷酰胺；环丙孕酮；阿糖胞苷；喜树碱；13-顺式维A酸；全反式维A酸；达卡巴嗪；更生霉素；柔红霉素；去铁敏；地塞米松；双氯芬酸；己烯雌酚；多西他赛；多柔比星；表柔比星；雌氮芥；依托泊苷；依西美坦；非索非那定；氟达拉滨；氟氢可的松；氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟他胺；吉西他滨；肾上腺素；左旋多巴；羟基脲；伊达比星；异环磷酰胺；伊马替尼；伊立替康；依地康唑；戈舍瑞林；来曲唑；亚叶酸；左旋咪唑；赖诺普利；lovothyroxine sodium；环己亚硝脲；氮芥；甲羟孕酮；甲地孕酮；美法仑；巯嘌呤；重酒石酸间羟胺；甲氨蝶呤；甲氧氯普胺；美西律；丝裂霉素；米托坦；米托蒽醌；纳洛酮；烟碱；尼鲁米特；奥曲肽；奥沙利铂；氨羟二磷酸二钠；喷司他丁；pilcamycin；卟菲尔钠；泼尼松；丙卡巴肼；丙氯拉嗪；奥丹西隆；雷替曲塞；西罗莫司；链脲素；他克莫司；他莫昔芬；替莫唑胺；鬼臼噻吩苷；睾酮；四氢大麻酚；沙利度胺；硫鸟嘌呤；塞替派；托泊替康；维A酸；戊柔比星；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春瑞滨；多拉司琼；格拉司琼；福莫特罗；氟替卡松；亮丙立德；咪达唑仑；阿普唑仑；两性霉素B；鬼臼毒素；核苷抗病毒药；芳酰腙；舒马曲坦；大环内酯类，诸如红霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、罗红霉素、克拉霉素、davercin、阿奇霉素、氟红霉素、地红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、白霉素、麦白霉素、罗他霉素和andazithromycin；和swinolide A；氟喹诺酮类，诸如环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲沙星、moxifloxicin、诺氟沙星、依诺沙星、格帕沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马氟沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、托氟沙星、普卢利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星和西他沙星；氨基糖甙类，诸如庆大霉素、奈替米星、草履虫素、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和链霉素、万古霉素、替考拉宁、雷冒拉宁(rampolanin)、麦地拉宁、粘菌素、达托霉素、短杆菌肽、磺粘菌素；多粘菌素(polymixin)，诸如多粘菌素B、卷曲霉素、杆菌肽、青霉烯类；青霉素类，包括青霉素酶敏感性药，如青霉素G、青霉素V；青霉素酶-抗性活性剂，如甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林；革兰氏阴性菌活性剂，如氨苄西林、阿莫西林和海他西林、cillin和galampicillin；抗假单胞菌属青霉素类，如羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林；头孢菌素类，如头孢泊肟、头孢丙烯、头孢布坦、头孢唑肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢吡硫、头孢氨苄、头孢拉定(cephradrine)、头孢西丁、头孢孟多、头孢唑林、头孢噻啶、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢来星、头孢呋辛、头孢雷特、头孢噻肟、头孢三嗪、头孢乙腈、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑、头孢他啶、氯碳头孢(loracarbef)和拉氧头孢、单酰胺菌素、如氨曲南；和碳青霉烯类，诸如亚胺培南、美罗培南、依西酸喷他脒、硫酸舒喘灵、利多卡因、硫酸异丙喘宁、双丙酸倍氯米松、醋酸曲安缩松、布地缩松、氟替卡松、异丙托溴铵、氟尼缩松、色甘酸钠和酒石酸麦角胺；紫杉烷类，诸如紫杉醇；SN-38；和tyrphostines。

用于偶联本发明巯基-选择性聚合物的优选肽类或蛋白质包括EPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、共有IFN、VII因子、VIII因子IX因子、IL-2、remicade(英夫利昔单抗)、Rituxan(利妥西单抗)、Enbrel(依那西普)、Synagis(帕利珠单抗)、Reopro(阿昔单抗)、Herceptin(曲妥单抗)、tPA、Cerizyme(伊米苷酶)、Hepatitus-B疫苗、rDNAse、α-1蛋白酶抑制剂、GCSF、GMCSF、hGH、胰岛素、FSH和PTH。

如果合适，上述典型生物活性剂用以包括其类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂、异构体和药物上可接受的盐形式。就肽类和蛋白质而言，本发明用以包括其合成、重组、天然、糖基化和非糖基化形式及其生物活性片段。上述生物活性蛋白还用以包括带有一种或多种氨基酸取代的(例如半胱氨酸)、缺失等的变体，条件是所得变体蛋白具有至少一定程度的母体(天然)蛋白的活性。

本文所述的轭合物或方法还可以扩展至水凝胶制剂。

轭合方法

合适的轭合条件是足以在聚合物试剂与活性剂之间进行轭合的时间、温度、pH、试剂浓度、溶剂等这些条件。正如本领域中公知的，具体条件尤其取决于活性剂、所需的轭合类型、反应混合物中存在的其它物质等。在任何情况下进行轭合的充分条件可以由本领域技术人员在阅读本文的公开内容、参照相关文献和/或常规实验来确定。

示例的轭合条件包括在约6-约10且例如在pH约6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10的pH下进行轭合反应。使该反应进行约5分钟-约72小时、优选约30分钟-约48小时且更优选约4小时-约24小时或24小时以下。用于轭合反应的温度一般在约0℃-约40℃，但并不一定；轭合通常在室温或低于室温下进行。轭合反应通常在诸如磷酸盐或乙酸盐缓冲液这类缓冲液或类似系统中进行。

就试剂浓度而言，一般将过量的聚合物试剂与活性剂合并。然而，在某些情况中，优选在聚合物试剂上具有化学计算量的反应基团数量与活性剂量。示例的聚合物试剂与活性剂的比例包括约1∶1(聚合物试剂∶活性剂)、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1或10∶1的摩尔比。使轭合反应进行至基本上不再有轭合反应发生，一般可以通过监测一定反应时间内的反应进程来测定。

可以通过在不同时间点从反应混合物中抽取等分部分并通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱法或任意其它合适分析方法进行分析来监测反应进程。一旦轭合物形成的量或未轭合的聚合物剩余量达到平值，则推定反应完成。一般来说，轭合反应可以进行几分钟-几小时之间的任意时间(例如5分钟-24小时或24小时以上)。优选从所得产物混合物中分离出过量的试剂、未轭合的反应剂(例如活性剂)、不需要的多轭合的种类和游离或未反应的聚合物，但不必进行纯化。任何可以使用的分析方法、诸如MALDI、毛细管电泳、凝胶电泳和/或色谱法进一步表征所得轭合物

更优选本发明的巯基-选择性聚合物与含有硫氢基的活性剂在约6-9(例如在6、6.5、7、7.5、8、8.5或9)的pH下、更优选在约7-9且甚至更优选在约7-8的pH下轭合。一般来说，使用略微摩尔过量的聚合物试剂，例如1.5-15-倍摩尔过量，优选2-倍-10倍摩尔过量。反应时间一般在室温下的约15分钟-几小时，例如8或8小时以上。对位阻的硫氢基而言，所需反应时间可能明显较长。由于本发明的聚合物为巯基-选择性的，所以巯基-选择性轭合优选在pH 7左右下进行。

分离

任选纯化通过使本发明的巯基-选择性聚合物与生物活性剂反应产生的轭合物以获得/分离不同的种类、例如PEG-类或除去不需要的反应副产物。

如果需要，可以使用凝胶过滤色谱法分离具有不同分子量的PEG轭合物。尽管可以使用这种手段分离具有不同分子量PEG轭合物，但是该手段一般无法分离在蛋白质中带有不同聚乙二醇化位点的位置异构体。例如，可以使用凝胶过滤色谱法使PEG 1-链节、2-链节、3-链节等的混合物彼此分离，不过回收的各PEG-链节组合物可能含有与蛋白质内不同反应基团连接的PEG。

适合于进行这类分离的凝胶过滤柱包括购自AmershamBiosciences的Superdex^TM和Sephadex^TM柱。对具体柱的选择取决于所需范围的理想分级分离。一般使用诸如磷酸盐、乙酸盐等这类基于非胺的缓冲液进行洗脱。可以通过许多不同的方法分析收集的级分，例如：(i)用于蛋白质含量的280nm处的OD；(ii)BSA蛋白质分析；(iii)用于PEG含量的碘试验(Sims G.E.C.等Anal.Biochem，107，60-63，1980)；或可以选择：(iv)通过进行SDS PAGE凝胶试验，随后用碘化钡染色。

可以通过例如使用RP-HPLC C18柱(Amersham Biosciences或Vydac)的反相色谱法或通过使用离子交换柱、例如购自AmershamBiosciences的Sepharose离子交换柱的离子交换色谱法对位置异构体进行分离。任一手段可以用于分离具有相同分子量的PEG-生物分子(位置异构体)。

根据轭合后所得PEG-轭合物的应用以及任选的其它分离步骤的不同，可以浓缩该轭合物混合物、进行无菌过滤并储存在约-20℃-约-80℃的低温下。另一方面，可以将轭合物冻干，其中带有或不带有缓冲剂，且将其作为冻干粉末储存。在某些情况中，优选交换用于轭合的缓冲液，诸如将乙酸钠交换成诸如碳酸铵或乙酸铵这类易于在冻干过程中除去的挥发性缓冲液，使得冻干的蛋白质轭合物粉末制品中不存在残余的缓冲液。另一方面，可以使用制剂缓冲液而应用缓冲液交换步骤，使得冻干的轭合物为适合于再溶解成制剂缓冲液且最终适合于对哺乳动物给药的形式。

药物组合物

本发明还包括药物制剂，它包括本文提供的轭合物与药物赋形剂。一般来说，轭合物自身为固体形式(例如沉淀)或溶液形式，可以将它与固体或液体形式的合适的药物赋形剂合并。

示例的赋形剂包括、但不限于那些选自下列物质组成的组的赋形剂：碳水化合物、无机盐、抗菌剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及其组合。

碳水化合物、诸如糖、衍生的糖，诸如糖醇、醛糖酸、酯化的糖和/或糖聚合物可以作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括：例如：单糖类，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖类，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖类，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇类，诸如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、木糖醇、山梨醇(山梨糖醇)、吡喃糖基山梨醇、肌醇等。

赋形剂还可以包括无机盐或缓冲剂，诸如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠及其组合。

制剂还可以包括用于预防或制止微生物生长的抗菌剂。适合于本发明的抗菌剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、氯化十六烷基吡啶鎓、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞及其组合。

制剂中还可以存在抗氧化剂。抗氧化剂用于防止氧化，由此防止制剂中的轭合物或其它成分变质。用于本发明的合适的抗氧化剂包括：例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、棓酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠及其组合。

表面活性剂可以作为赋形剂存在。示例的表面活性剂包括：聚山梨醇酯类，诸如″Tween 20″和″Tween 80″；和pluronic类，诸如F68和F88(均购自BASF，Mount Olive，New Jersey)；脱水山梨醇酯类；脂类，诸如磷脂类，诸如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙醇胺类(不过并不优选脂质体形式)、脂肪酸和脂肪酯类；类固醇，诸如胆固醇；和螯合剂，诸如EDTA、锌和其它这类合适的阳离子。

酸或碱可以作为赋形剂存在于制剂中。可以使用的酸的非限制性实例包括那些选自盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合组成的组的酸。合适的碱的实例包括、但不限于氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及其组合组成的组。

药物制剂包括所有类型的制剂且特别是那些适合于注射的制剂，例如可以再溶解的粉末以及悬浮液和溶液。当将组合物储存在单位剂量容器(例如小瓶)中时，组合物中轭合物(即本文所述的活性剂与聚合物之间形成的轭合物)的用量取决于许多因素，但最佳的是治疗有效剂量。此外，可以将药物制剂吸收在注射器内。可以通过反复给予增加量的轭合物以测定产生临床所需终点来确定治疗有效剂量。

组合物中任意各赋形剂的用量根据赋形剂的活性和组合物的具体要求的不同而改变。一般来说，通过常规实验、即通过制备含有不同用量的赋形剂(范围从低到高)的组合物、检验稳定性和其它参数且然后测定获得最佳性能而没有显著不良作用的范围来确定任何单独赋形剂的最佳用量。

然而，一般来说，赋形剂在组合物中的含量为约1％-约99％重量、优选约5％-98％重量、更优选约15-95％重量的赋形剂，其中最优选浓度低于30％重量。

上述这些药物赋形剂与其它赋形剂描述在下列文献中：Remington：The Science & Practice of Pharmacy″19ed.；Williams&Williams，(1995)″Physician′s Desk Reference″52nd ed.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)；和Kibbe，A.H.Handbookof Pharmaceutical Excipients，3rd Edition，AmericanPharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000。

一般、但不必通过注射给予本发明的药物制剂且由此它们一般为在给药前立即再溶解的液体溶液或悬浮液。该药物制剂还可以采用其它剂型，诸如糖浆剂、霜剂、软膏、片剂、粉剂等。还包括其它给药方式，诸如肺部、直肠、经皮、跨粘膜、口服、鞘内、皮下、动脉内等。

如上所述，可以通过静脉内注射或较少优选通过肌内注射或通过皮下注射而经非肠道注射给药所述的轭合物。用于非肠道给药的合适的制剂类型包括备用的注射溶液、使用前与溶剂合并的干粉、备用注射的悬浮液、使用前与载体合并的不溶性干组合物和给药前稀释的乳剂和液体浓缩物。

给药方法

本发明还提供了对患者给予本文提供的轭合物的方法，所述的患者患有对用轭合物治疗有响应的疾病。该方法包括一般经注射给予治疗有效量的所述轭合物(优选作为药物制剂的组成部分提供)的步骤。该给药方法可以用于治疗可以通过给药具体轭合物治疗或预防的任意疾病。本领域技术人员可以了解具体轭合物可以有效治疗的疾病。实际给药剂量随受试者年龄、体重和一般情况以及所治疗疾病的严重程度、健康保健专业人员的判断和所给予的轭合物的不同而改变。治疗有效量是本领域技术人员公知的和/或描述在有关参考教科书和文献中。一般来说，治疗有效量在约0.001mg-100mg、优选0.01mg/天-75mg/天的剂量且更优选0.10mg/天-50mg/天的剂量范围。

可以按照不同给药方案给药任意指定的轭合物(此外，优选作为药物制剂的组成部分提供)的单位剂量，这取决于临床医师的判断、患者的需求等。具体的给药方案是本领域技术人员公知的或可以使用常规方法经实验测定。示例的给药方案包括、但不限于每天给药5次、每天4次，每天3次、每天2次、每天1次、每周3次、每周2次、每周1次、每月2次、每月1次及其任意的组合。一旦达到了临床终点，则停止给药组合物。

给药本发明轭合物的一个优点在于可以裂解各水溶性聚合物部分。当因聚合物的大小而从体内清除成为一个难题时，这类结果是有利的。最好的情况是，通过使用生理上可裂解的和/或酶可降解的键、诸如尿烷、酰胺、碳酸酯或含酯的键裂解各水溶性聚合物部分。在这种方式中，可以通过选择聚合物的分子大小和可以提供所需清除特性的官能基来调节轭合物的清除(通过裂解各水溶性聚合物部分)。本领域技术人员可以测定聚合物的合适的分子大小以及可裂解的官能基。例如，本领域技术人员可以使用常规实验测定合适的分子大小和可裂解的官能基，通过下列步骤进行：首先制备具有不同聚合物重量和可裂解官能基的各种聚合物衍生物且然后通过对患者给药聚合物衍生物并定期取采集的血和/或尿样而获得清除分布曲线(例如通过定期采血或尿样)。一旦对每种测试轭合物获得了一系列清除分布曲线，则可以鉴定合适的轭合物。

将所有论文、书籍、专利、专利公开文献和本文参照的其它公开文献的全部内容引入作为参考。

下列实施例解释、但不用来限定本发明的范围。

                实施例

材料和方法

使用由Bruker生产的400MHz分光计获得¹H NMR数据。

所附实施例中涉及的PEG试剂购自Nektar Therapeutics，Huntsville，AL。

1.mPEG-5K丙酸，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的制备

如下合成PEG试剂mPEG-5K丙酸，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。

A.M-PEG(5,000)-腈(1)

将M-PEG-OH(甲氧基-PEG，MW＝5,000道尔顿，50g，含有4wt％的高分子量PEG-二醇，如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测定)溶于加入了氢氧化钾(1.0g)的蒸馏水(50.0ml)中。将该溶液在冰浴中冷却至0-5℃。缓慢加入乙腈(6.8g)并将该溶液在0-5℃下搅拌2.5小时。通过添加磷酸二氢钠将该溶液的pH调节至7。用二氯甲烷(250、100和50ml)将产物提取3次。用硫酸镁干燥合并的有机层、过滤、浓缩并通过在0-5℃下添加到乙醚中沉淀产物。通过过滤取出沉淀并在真空中干燥。

产量47.0g。NMR(d₆-DMSO)：2.74ppm(t，2H，-CH₂-CN)；3.21ppm，(s，3H，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)。

B.M-PEG(5,000)-酰胺(2)

将M-PEG(5,000)-腈(1)(47.0g)和浓盐酸(235g)的混合物在室温下搅拌48小时。用2升水稀释该溶液并用二氯甲烷(300、200和100ml)提取。用水洗涤合并的有机提取物二次、用硫酸钠干燥、过滤并通过旋转蒸发浓缩至干。

产量：43.0g。NMR(d₆-DMSO)：2.26ppm(t，2H，CH ₂ -CONH₂)；2.43ppm(t，2H，-CH ₂ -COOH)；3.21ppm(s，3H，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)。

C.M-PEG(5,000)-丙酸，(PEG的α-甲氧基，ω-丙酸)(3)

将M-PEG(5,000)-酰胺(2)(32.0g)溶于2300ml加入了200g氢氧化钾的蒸馏水并将该溶液在室温下搅拌22小时。加入氯化钠(300g)并用300ml二氯甲烷将该溶液各提取3次。用5％草酸，水洗涤合并的有机提取物(2次)并用硫酸钠干燥。浓缩该溶液并通过加入到乙醚中沉淀产物，通过过滤收集产物M-PEG(5,000)-丙酸(3)并真空干燥。

产量：28.0g。NMR(d₆-DMSO)：2.43ppm(t，2H，-CH₂-COOH)；3.21ppm(s，3H，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)。

双官能杂质的除去：

将含有4wt％PEG(10,000)-二丙酸(22g)(来源于原料中含有的PEG二醇杂质的反应)的M-PEG(5,000)-丙酸(3)溶于2200ml去离子水并使所得溶液施用于四硼酸盐形式的DEAE Sephadex A-25色谱柱。施用氯化钠的逐步离子梯度(在2-14mM中以递增方式)并开始级分收集(每次约60ml)。级分4-25中含有纯的M-PEG(5,000)-丙酸。随后的两种级分不含PEG，而级分28-36含有纯的PEG(10,000)-二丙酸。合并含有纯M-PEG(5,000)-丙酸的级分并浓缩(至约100ml)。加入氯化钠(10g)，将pH调节至3并用二氯甲烷提取产物。用MgSO₄干燥有机层并在减压条件下蒸馏出溶剂而得到18.4g产物。

HPLC分析显示产物为100％纯的M-PEG(5,000)-丙酸(不存在任何其它杂质)。

D.M-PEG(5,000)-丙酸，NHS酯(PEG的α-甲氧基ω-丙酸琥珀酰亚胺基 酯(″甲氧基-PEG-SPA″))，(4)

将M-PEG(5,000)-丙酸(14.4g)(3)溶于二氯甲烷(60ml)而形成溶液，向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.36g)。将该溶液冷却至0℃并滴加二环己基碳化二亚胺(0.72g)在10ml二氯甲烷中的溶液。将该溶液在室温下和氩气环境中搅拌过夜。过滤该反应混合物、浓缩并通过加入到乙醚中沉淀产物。

终产物(4)产量：14.0g。NMR(d₆-DMSO)：2.81ppm(s，4H，NHS)；2.92ppm(t，2H，-CH₂-COO-)；3.21ppm(s，3H，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)。

2.mPEG-20K丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯

如下合成PEG试剂、mPEG-20K丁酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。

A.M-PEG(20K)-甲磺酸酯(5)

将M-PEG-OH(MW＝20,000道尔顿，60g，含有6wt％的高分子量PEG-二醇(通过凝胶渗透色谱法(GPC)测定))溶于300ml甲苯并在氩气环境中共沸蒸发1小时。然后该溶液冷却至室温。向该溶液中加入24ml无水二氯甲烷和0.62ml三乙胺(0.0044moles)。滴加0.28ml甲磺酰氯(0.0036moles)。将该溶液在室温下和氮气环境中搅拌过夜。然后加入碳酸钠(30g)并将该混合物搅拌1小时。过滤该溶液并在减压条件下蒸馏出溶剂。产量27.5g。

¹H NNR(d₆-DMSO)：3.17ppm(s，3H，CH₃-甲磺酸酯)，3.24ppm(s，3H，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)，4.30ppm(m，-CH₂-甲磺酸酯)。

B.M-PEG(20,000)-丁酸(8)

在氮气环境中将溶于200ml二噁烷的丙二酸乙酯(3.4ml，0.022当量)滴加到在圆底烧瓶中的氢化钠(0.536g，0.022当量)和甲苯(100ml)中。将溶于100ml甲苯的M-PEG(20K)-甲磺酸酯(5)(40g，0.0020moles)加入到上述混合物中。将所得混合物回流过夜。然后将该反应混合物浓缩至原始体积的一半、用50ml的10％NaCl水溶液提取、用50ml 1％盐酸水溶液提取并合并含水提取物。用二氯甲烷(150ml×3)提取收集的水层并用硫酸镁将有机层干燥3小时、过滤并蒸发至干。

产量：36g的M-PEG丙二酸二乙酯(6)。NMR(d₆-DMSO)：1.17ppm(t，6H，-CH₃)；1.99ppm(四重峰，2H，-CH ₂ -CH)；3.21ppm，(s，3H，-OCH₃)；3.51ppm(s，PEG骨架)；4.10ppm(五重峰，4H，-OCH ₂ -CH₃)。

将M-PEG丙二酸二乙酯(6)(36g)溶于含有24g氯化钠的480ml1N氢氧化钠并将该混合物搅拌1小时。通过添加6N盐酸将该混合物的pH调节至3.0并用二氯甲烷(300ml和200ml)提取该混合物。用硫酸镁干燥有机层、过滤、浓缩并倾入冷乙醚。通过过滤取出产物M-PEG(20,000)-丙二酸(7)且在真空中干燥。

产量：32g.NMR(d₆-DMSO)；1.0ppm(q，2H，-CH ₂ CH₂CH-)；2.90ppm(t，2H，-CH₂CH-)；3.21ppm(s，3H，-OCH₃)；3.51ppm(s，PEG骨架)；12.1ppm(s，2H，-COOH)。

将M-PEG丙二酸(7)(30g)溶于240ml二噁烷并回流8小时，然后浓缩至干。将残余物溶于200ml水、用二氯甲烷(140ml和100ml)提取、用硫酸镁干燥并通过旋转蒸发浓缩该溶液。通过加入到冷乙醚中沉淀产物。

产量：22g的M-PEG(20,000)-丁酸(8)。¹NMR(d₆-DMSO)：1.72ppm(五重峰，2H，-CH₂ CH ₂ CH₂-COOH)；2.40ppm(t，4H，-CH₂ CH ₂ CH₂-COOH)；3.21ppm(s，3H，-OCH₃)；3.51ppm(s，PEG骨架)。HPLC分析显示产物含有94wt％的M-PEG(20,000)丁酸和来源于包含在原料中的高分子量PEG-二醇的6wt％的PEG-二丁酸。

为了除去高分子量反应性PEG种类，将含有6wt％PEG-二丁酸的M-PEG(20K)-丁酸(22g)溶于2200ml去离子水并施用于四硼酸盐形式的DEAE Sephadex A-50柱。施用逐步离子梯度的氯化钠(在1-4mM中递增)并收集级分。合并含有纯M-PEG(20,000)-丁酸的级分并收集。将含有纯PEG-二丁酸的后洗脱下的级分放在一边。浓缩含有纯M-PEG(20,000)-丁酸的合并级分(至约200ml)。加入氯化钠(20g)并将pH调节至3且用二氯甲烷提取产物。干燥提取物(MgSO₄)并在减压条件下蒸馏出溶剂而得到13.6g产物。

HPLC分析显示产物为100％纯的M-PEG(20,000)-丁酸(8)，不存在高分子量PEG种类。

C.M-PEG(20,000)-丁酸，NHS酯(9)

将M-PEG(20,000)-丁酸(8)(13.6g.)溶于二氯甲烷(40ml)并将N-羟基琥珀酰亚胺(0.094g)加入到该溶液中。将该溶液在0℃下冷却并滴加二环己基碳化二亚胺DCC(0.196g)在10ml二氯甲烷中的溶液。将该溶液在室温下搅拌过夜。过滤该反应混合物、浓缩并通过加入到乙醚中沉淀。

终产物产率：13.1g.NMR(d₆-DMSO)：1.83ppm(五重峰，2H，-CH₂ CH ₂ CH₂-COO-)；2.70ppm(t，2H，-CH ₂ -COO-)；2.81ppm(4H，NHS)；3.21ppm(s，3H，-OCH₃)；3.51ppm(s，PEG骨架)。

                实施例1

mPEG(5K)-巯基，MPEG(5K)-CH₂CH₂CONHCH₂CH₂SH(11)的制备

由购自Shearwater Corporation，现在的Nektar Therapeutics，(Shearwater Catalog 2001，Polyethelne Glycol and Derivativesfor Biomedical Applications)，Huntsville，Alabama的示例亲电活化的PEG，mPEG-5K丙酸，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯(也称作mPEG-5K琥珀酰亚胺基丙酸酯)制备高纯度和高产率的甲氧基-PEG-5K-巯基。

mPEG-5K琥珀酰亚胺基丙酸酯的制备一般如美国专利US5,672,662(Shearwater Polymers)和上述″材料和方法″部分中所述。

M-PEG(5,000)-巯基(11)的合成

反应方案：

将M-PEG丙酸，NHS酯(4)，(MW＝5,268，10.0g，1.898mmol)溶于二氯甲烷(100ml)，向其中加入胱胺二盐酸盐(0.2278g，1.012mmol)和三乙胺(0.66ml)。将该溶液在室温下和氩气环境中搅拌过夜。凝胶渗透色谱(GPC)分析显示该反应混合物中含有所需产物(10)(具有约10,000分子量的对称二硫化物)，产率为97.53％且M-PEG(5,000)-丙酸产率为2.14％。

然后加入二硫苏糖醇(DTT)(0.88g，0.005705moles)和三乙胺(0.5ml)并将该反应混合物在室温下和氩气环境中搅拌3小时。接下来加入2，6-二-叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)(0.05g)并在减压条件下蒸馏出溶剂。将粗巯基产物(11)溶于二氯甲烷(20ml)并在0-5℃下用异丙醇沉淀。干燥后的产量为8.80g。

GPC分析：所需产物：M-PEG(5,000)-巯基，(11)，96.05％产率；MPEG(5,000)-丙酸，0.57％产率；非还原的二聚体，(10)，3.07％。NMR(d₆-DMSO)：1.52ppm(t，1H，-SH)；2.31ppm(t，2H，-CH₂-CO-)；2.66ppm(dt，2H，-CH₂-S-)；3.21ppm，(s，3H，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)；8.05ppm(t，1H，-NH-)。

使用仅需要两步的简单反应方案制备高产率和高纯度的示例性的二硫化物中间体(10)和还原的PEG-巯基产物(11)。示例性的试剂胱胺是商购的且其中的氨基易于被羰基产物上的琥珀酰亚胺基取代。带有两个末端反应氨基的化学计算量的对称试剂的示例性的应用因仅形成一种未被过量试剂污染的取代产物而使得反应″更清洁″。所得PEG-巯基产物适合于偶联例如药物或蛋白质的半胱氨酸残基上含有的反应性巯基而形成相应的PEG轭合物。本文所述的PEG键(即连接PEG链或骨架于药物或其它物质种类上的巯基的分子的连接部分)是稳定的并提供了一类新的水溶性非天然存在的聚合物，该聚合物适合便利地合成且可以用于选择性修饰蛋白质或其它分子或使其聚乙二醇化而不需要多个合成步骤、保护-脱保护步骤和多次纯化。

                    实施例2

mPEG(20K)-巯基，CH₃O(CH₂CH₂O)_n(20K)-CH₂CH₂CH₂CONHCH₂CH₂SH(13)的

                    制备

由购自Shearwater Corporation，现在的Nektar Therapeutics，(Shearwater Catalog 2001，Polyethelne Glycol and Derivativesfor Biomedical Applications)，Huntsville，Alabama的典型亲电体活化的PEG，mPEG-20K丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯(也称作mPEG-20K琥珀酰亚胺基丁酸酯)制备高纯度和高产率的甲氧基-PEG-20K-巯基。

mPEG-5K琥珀酰亚胺基丁酸酯的制备一般如美国专利US5,672,662(Shearwater Polymers)和上述″材料和方法″部分中所述。

m-PEG(20,000)-巯基(13)的合成

反应方案

将M-PEG(20K)-丁酸，NHS酯(9)，(MW＝20,000道尔顿，10.0g，0.500mmol)溶于二氯甲烷(100ml)并加入胱胺二盐酸盐(0.0564g，0.251mmoles)和三乙胺(0.167ml)。将该溶液在室温下和氩气环境中搅拌过夜。GPC分析显示该反应混合物中含有98.5％纯的所需产物(具有约40,000分子量的二聚体(12))和1.5％M-PEG(20,000)-丁酸。

然后加入二硫苏糖醇(DTT)(0.23g，1.500mmoles)和三乙胺(0.5ml)并将该反应混合物在室温下和氩气环境中搅拌3小时。接下来加入BHT(0.05g)并在减压条件下蒸馏溶剂。将粗产物溶于二氯甲烷(20ml)并在0-5℃下用异丙醇沉淀。

干燥后产量9.20g。HPLC分析：M-PEG(20K)-巯基(13)96.0％，M-PEG(20,000)-丁酸1.5％，非还原的二聚体2.5％。

与上述实施例1类似，本实施例表示制备了另一种有代表性的PEG-巯基(及其相应的二硫化物前体)。该合成是直接的，仅需要两个反应步骤：取代示例性PEG试剂(9)上亲电子羰基碳上的胱胺上的有代表性的亲核氨基，随后将二硫化物还原成相应的PEG-巯基。对称二硫化物试剂的应用简化了合成，使得不必纯化PEG-巯基产物。形成高产率的PEG-巯基(大于90％，实际上大于95％)且适合于与例如治疗蛋白的半胱氨酸残基上包含或通过化学方式引入蛋白或多肽或存在于小分子或其它活性剂上的巯基偶联。

                    实施例3

PEG(40K)-二-巯基，HSCH₂CH₂NH(O)CCH₂O-PEG-40K-CH₂C(O)HNCH₂CH₂SH

                (18)的制备

如下所述由双官能PEG试剂，PEG-40K二羧酸制备PEG-40K-二-巯基(18)。

A.PEG(40,000)-二-羧酸，乙酯(14)

将HO-PEG-OH(MW＝40,000道尔顿，50g，2.50羟基毫当量)溶于750ml甲苯且在氩气环境中共沸蒸馏1小时。从该反应混合物中蒸馏出150ml甲苯。接下来将该溶液冷却至40℃并加入1.0M叔丁醇钾在叔丁醇(4.0ml，4mmoles)中的溶液，随后加入溴乙酸乙酯(1.4g，8.4mmoles)。将该反应混合物在室温下和氮气环境中搅拌过夜。在减压条件下蒸馏出溶剂并将粗产物溶于二氯甲烷且加入到乙醚中。通过过滤分离沉淀的产物并在减压条件下干燥。产量42.3g。

B.PEG(40,000)-二-羧酸(15)

将40.0克(1.0mmoles)PEG(40,000)-二羧酸乙酯(14)在400ml1M NaOH中的溶液在室温下搅拌3小时。接下来将该混合物的pH调节至2并用二氯甲烷提取产物。然后在减压条件下蒸馏出溶剂。将粗产物溶于二氯甲烷(100ml)并加入到乙醚(900ml)中。通过过滤分离沉淀的产物并在减压条件下干燥。HPLC分析：PEG(40,000)-二-羧酸86.5％，PEG(40,000)-一-羧酸13.0％，HO-PEG(40,000)-OH 0.5％。

产量33.1g。¹H NMR(d₆-DMSO)：3.51ppm(s，PEG骨架)；4.02ppm(4H，-OCH₂COO-)。

将获得的产物(30g)溶于3000ml去离子水并施用于四硼酸盐形式的DEAE Sephadex A-50色谱柱。施用逐步离子梯度的氯化钠(在2-10mM中递增)并收集级分。合并对PAA试验阳性、即含有PEG(40,000)-二-羧酸的级分并浓缩(至约300ml)。加入氯化钠(30g)，将pH调节至3并用二氯甲烷提取产物。干燥提取物(MgSO₄)并在减压条件下蒸馏出溶剂而得到21.6g产物(15)。通过HPLC证实产物(15)为纯的二-酸，即100％PEG(40,000)-二-羧酸。

C.PEG(40,000)-二-羧酸，NHS酯，(16)

将PEG(40,000)-二-羧酸(15)(20g)溶于二氯甲烷(200ml)，向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.138g)。将该溶液冷却至0℃，滴加二环己基碳化二亚胺(0.290g)在5ml二氯甲烷中的溶液并将该溶液在室温下搅拌过夜。过滤该反应混合物、浓缩并通过加入到乙醚中沉淀。终产物(16)产量：18.3g。

¹H NMR(d₆-DMSO)：2.83ppm(8H，NHS)；3.51ppm(s，PEG骨架)；4.61ppm(4H，-OCH₂COO-)。

D.PEG(40,000)-二-巯基(18)

反应方案

将PEG(40,000)-二-羧酸，NHS酯(16)(MW＝40,000道尔顿，18.0g，0.900毫当量)溶于二氯甲烷(150ml)并加入胱胺二盐酸盐(1.01g，4.5moles)和三乙胺(1.70ml)。将该溶液在室温下和氩气环境中搅拌过夜。在室温下浓缩该溶液并加入到900ml异丙醇中。通过过滤分离沉淀的产物并在减压条件下干燥。

NMR分析显示所有NHS酯均耗尽且形成所需的二硫化物产物(17)。将该产物溶于二氯甲烷(150ml)，加入二硫苏糖醇(DTT)(0.84g，5.446mmoles)和三乙胺(2.0ml)并将该反应混合物在室温下和氩气环境中搅拌3小时。接下来加入BHT(0.09g)并在减压条件下蒸馏出溶剂。将残余物-粗二巯基产物(18)溶于二氯甲烷(40ml)并在室温下用异丙醇沉淀。干燥后的产量为14.3g。

¹H NMR(d₆-DMSO)：1.07ppm(t，2H，-SH)；2.66ppm(dt，4H，-CH₂-S-)；3.51ppm(s，PEG骨架)；3.90ppm(s，4H，-OCH₂CO-，8.05ppm(t，2H，-NH-)。

Claims (27)

1.制备水溶性聚合物的巯基选择性衍生物的方法，所述的方法包括下列步骤：

(i)提供包括水溶性聚合物链段″POLY″的水溶性聚合物，所述的水溶性聚合物链段带有被亲电体″-E″活化的一个末端；和

(ii)使所述聚合物与包括亲核体″-NU″和巯基选择性结构部分“S”的结构为NU-Y-S的分子反应，所述的巯基选择性结构部分选自巯基、被保护的巯基、二硫化物、马来酰亚胺、和碘乙酰胺组成的组，Y为NU与S之间插入的直链基团，反应条件为有效促进所述的亲电体与所述的亲核体之间的反应，从而形成包括选自巯基、被保护的巯基、二硫化物、马来酰亚胺、和碘乙酰胺组成的组的巯基选择性末端的聚合物产物″POLY-S″，其中所述水溶性聚合物链段具有1,000-50,000道尔顿的标称平均分子量。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的巯基选择性结构部分为二硫化物且所述的方法进一步包括还原所述的POLY-S上的二硫键的步骤以形成带有末端巯基的聚合物POLY-SH。

3.权利要求1所述的方法，其中所述的水溶性聚合物链段选自聚(环氧烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚

唑啉、聚(丙烯酰吗啉)和聚(氧乙烯化多元醇)组成的组。

4.权利要求1所述的方法，其中来自步骤(ii)的POLY-S产物包括大于95％重量的单官能取代的POLY-S。

5.权利要求1所述的方法，其中来自步骤(ii)的POLY-S产物包括小于5％的双官能取代的POLY-S。

6.权利要求3所述的方法，其中所述的水溶性聚合物链段为聚环氧烷。

7.权利要求6所述的方法，其中所述的水溶性聚合物链段为聚乙二醇PEG。

8.权利要求7所述的方法，其中所述的聚乙二醇为封端的。

9.权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述的亲电体为羧酸或羧酸衍生物。

10.权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述的亲电体选自羧酸酯、碳酸酯、碳酸、酰基卤和酸酐组成的组。

11.权利要求1所述的方法，进一步包括在所述的反应步骤前纯化来自步骤(i)的所述水溶性聚合物的步骤。

12.权利要求9所述的方法，进一步包括在所述的反应前纯化来自步骤(i)的所述水溶性聚合物的步骤。

13.权利要求11所述的方法，其中所述的纯化步骤包括色谱或化学分离。

14.权利要求12所述的方法，其中所述的所述的纯化步骤包括离子交换色谱。

15.权利要求6所述的方法，其中步骤(i)中提供的所述聚合物含有小于5％的聚环氧烷二醇。

16.权利要求1所述的方法，其中所述的亲核体选自伯胺基、仲胺基、羟基、亚氨基、巯基和硫代酸酯组成的组。

17.权利要求16所述的方法，其中所述的亲核体为伯胺基或仲胺基。

18.权利要求7所述的方法，其中所述的聚合物包括选自烷氧基、取代的烷氧基、链烯氧基、取代的链烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基组成的组的封端基。

19.权利要求7所述的方法，其中步骤(i)中所述的聚合物为聚乙二醇的N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺基丁酸酯。

20.权利要求1所述的方法，其中所述的分子为胱胺或半胱胺。

21.权利要求1所述的方法，其中所述的巯基选择性结构部分为巯基且所述的方法进一步包括使所述的POLY-S巯基与蛋白质的巯基或被保护的巯基反应的步骤而形成二硫化物连接的聚合物-蛋白质轭合物″POLY-S-S-蛋白质″。

22.权利要求2所述的方法，进一步包括使所述的POLY-SH与蛋白质的巯基或被保护的巯基反应的步骤而形成二硫化物连接的聚合物-蛋白质轭合物″POLY-S-S-蛋白质″。

23.权利要求7所述的方法，其中所述的聚乙二醇具有选自线形、支化、分岔和多臂组成的组的结构。

24.权利要求7所述的方法，其中所述的聚乙二醇包括可水解的键。

25.权利要求1所述的方法，其中所述的分子为包括亲核体(-NU)的对称二硫化物试剂且所述的反应步骤导致形成带有中心二硫键的对称水溶性聚合物。

26.通过权利要求1-25中任意一项所述方法产生的带有巯基-选择性末端的水溶性聚合物POLY-S。

27.通过权利要求21或权利要求22中所述方法产生的二硫化物连接的聚合物蛋白质轭合物。