CN1721525A - 诱发神经分化的方法及组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于诱发神经分化的方法，包括以神经营养因子及/或二丁基环磷酸腺苷(dbcAMP)处理骨髓干细胞，其中该神经营养因子包含衍生自神经胶细胞株的神经营养因子(GDNF)或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)。本发明提供一种用于诱发神经分化的组合物。

Description

诱发神经分化的方法及组合物
技术领域
本发明主要涉及一种无毒性诱发神经分化的方法及组合物。
背景技术
中枢神经系统(CNS)损伤后的神经细胞丧失使得CNS修复十分困难。许多研究显示，分离自各种啮齿类及人类CNS区域的神经干细胞(NSCs)在环境及/或外源生长因子的影响下，可在成年啮齿类CNS中分化为神经细胞(F.H.Gage，Mammalian neural stem cells.Science 287(2000)1433-1438；J.Price及B.P.Williams，Neural stem cells.Curr.Opin.Neurobiol.11(2001)564-567)。因此，补充NSCs被认为是人类CNS治疗的潜在策略(D.A.Peterson，Stem cells in brain plasticity andrepair.Curr.Opin.Pharmacol.2(2002)34-42)。
衍生自人类骨髓的干细胞(hBMSCs)在形态学上属于异源性。它们多相等势地分化为骨母细胞、脂肪细胞、软骨细胞及肌肉，且亦可产生神经细胞(E.Mezey，K.J.Chandross，G.Harta，R.A.Maki及S.R.McKercher，Turning Blood into Brain：Cells Bearing Neuronal AntigensGenerated in vivo from Bone Marrow.Science 290(2000)1779-1782；E.Mezey，S.Key，G.Vogelsang，I.Szalayova，G.D.Lange及B.Crain，Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(2003)1364-1369；Sanchez-Ramos等人(2000)；D.Woodbury，E.J.Schwarz，D.J.Prockop及I.B.Black，Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate intoneurons.J.Neurosci.Res.61(2000)364-370)。近来已有报导指出，人类及小鼠的BMSCs经视网酸及表皮生长因子(EGF)或衍生自大脑的神经营养因子(BDNF)刺激后，会表现神经祖细胞标记物(巢蛋白(nestin))、神经细胞专一性核蛋白(NeuN)及神经胶纤维酸性蛋白(GFAP)(Sanchez-Ramos等人(2000))。亦已证明移植的BMSCs可在损伤的CNS中分化为神经或神经胶世系(J.R.Sanchez-Ramos，Neural cellsderived from adult bone marrow and umbilical cord blood.J.NeurosciRes.69(2002)880-893)。此外，Chopp等人发现移植BMSCs可促进患有局灶性脑缺血的大鼠(J.Chen，Y.Li及M.Chopp，Intracerebraltransplantation of bone marrow with BDNF after MCAo in rat.Neuropharmacology 39(2000)711-716)、患有外伤性脑损伤的大鼠(D.Lu，Y.Li，L.Wang，J.Chen，A.Mahmood及M.Chopp，Intraarterialadministration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic braininjury.J.Neurotrauma 18(2001)813-819)及患有帕金森氏症的小鼠(Y.Li，J.Chen，L.Wang，L.Zhang，M.Lu及M.Chopp，Intracerebraltransplantation of bone marrow stromal cells in a1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine mouse model ofParkinson′s disease.Neurosci.Lett.316(2001)67-70)功能恢复。上述研究结果指出作为人类CNS细胞治疗的有用细胞来源的潜在角色。
然而，通过培养平盘附着方式分离hBMSCs产生的主要是异源族群(A.J.Friedenstein，J.E.Gorskaja及N.N.Kulagina，Fibroblast precursorsin normal and irradiated mouse hematopoietic organs.Exp.Hematol.4(1976)267-274)。因此，已基于其相异尺寸及特定表面标记物而发展出数种方法，使用细胞分类产生同源族群(S.C.Hung，N.J.Chen，S.L.Hsieh，H.Li，H.L.Ma及W.H.Lo，Isolation and characterization ofsize-sieved stem cells from human bone marrow.Stem Cells 20(2002)249-258；R.Zohar，J.Sodek及C.A.McCulloch，Characterization ofstromal progenitor cells enriched by flow cytometry.Blood 90(1997)3471-3481)。据此，最近Hung等人(2002)已发展出一种由人类骨髓有效分离同源族群的方法，其基于细胞尺寸及附着能力，使用Percoll梯度分离及3-μm孔筛去除较小的细胞。经纯化而产生的hBMSC族群称为尺寸筛选细胞(SSCs)，其较hBMSC异源族群具有更强的更新能力(Hung等人(2002))。SSCs在转种2至3缺乏早期造血干细胞的表面标记物CD34及AC133，且不表现成骨MSCs及成熟成骨前驱体的标记物(Hung等人(2002))。然而，上述细胞表现Thy-1、基质受体(CD44及CD105)及整合素(CD29及CD51)。SSCs是多相等势的，在环境信号的影响下可生成成骨、成脂肪及成软骨世系(Hung等人(2002))。亦己发现以β-巯基乙醇及视网酸等抗氧化剂(其常用于在体外诱发干细胞的神经分化)刺激SSCs可电化产生神经细胞(S.C.Hung，H.Cheng，C.Y.Pan，M.J.Tsai，L.S.Kao及H.L.Ma，In vitro differentiation of size-sieved stemcells into electrically active neural cells.Stem Cells 20(2002)522-529)。虽然β-巯基乙醇及视网酸对于SSCs分化为功能性神经细胞具有潜在效果，该二因子在CNS组织修复的角色仍需界定。
然而，以β-巯基乙醇及视网酸等抗氧化剂刺激SSCs而产生神经细胞仅能在体外施行。β-巯基乙醇是一种有毒试剂。此外，视网酸是一种致癌物。该两种抗氧化剂均会对动物造成伤害，且移植经刺激的神经细胞会导致接受者死亡。
发明内容
本发明提供一种将SSCs由纤维母细胞外形在形态上转变为具突起的外形的新颖方法，其利用安全且可有效刺激神经细胞形态变化的神经营养因子。此外，依据本发明所得到的神经细胞适用于修复动物的神经缺损。
本发明的目的之一是提供一种用于诱发神经分化的方法，包括以神经营养因子及/或二丁醯cAMP(dbcAMP)处理骨髓干细胞，其中该神经营养因子包含衍生自神经胶细胞株的神经营养因子(GDNF)或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)。
本发明的目的之一是提供一种用于诱发神经分化的组合物，包括神经营养因子及/或二丁醯cAMP(dbcAMP)，其中该神经营养因子包含衍生自神经胶细胞株的神经营养因子(GDNF)或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)。
附图说明
图1显示SSCs似神经细胞转形的相位差影像。其指出在单独的ITS培养基(0)中以及在含50ng/ml GDNF或20ng/ml PACAP的ITS培养基中，SSCs成为具突起的细胞(放大倍率＝200X)。
图2显示SSCs通过GDNF、PACAP及dbcAMP的似神经细胞转形的相位差影像。其指出含血清培养基中的SSCs外形类似纤维母细胞，并在撤回血清的培养基(单独的ITS培养基；0)中成为具突起的形式。再者，于ITS培养基中以GDNF(50ng/ml)、PACAP(20ng/ml)、dbcAMP(0.1mM)、GDNF(50ng/ml)+PACAP(20ng/ml)或GDNF(50ng/ml)+dbcAMP(0.1mM)处理7天的SSCs的突起为延长且高度分支者(放大倍率＝200X)。
图3显示神经细胞专一性标记物NF-L及NF-H表现的结果，其中西方墨点分析显示与在单独的ITS培养基(0)中所观察到的相比较，于ITS培养基中以GDNF(50ng/ml)或PACAP(10及20ng/ml)处理7天的SSCs中神经细胞专一性标记物NF-L系经向上调节。
图4显示NF-L及α-微管蛋白表现的结果，其中西方墨点分析显示在如上述处理7天后的SSCs中，神经细胞专一性标记物NF-L系经向上调节。此外，通过上述各种处理，SSCs中的神经细胞专一性细胞骨架蛋白质α-微管蛋白有所增加。单独的ITS培养基处理以0表示。
图5显示SSCs中α-中间粘连蛋白的免疫萤光染色结果，其中SSCs在单独的ITS培养基(0)中或以GDNF(50ng/ml)、PACAP(20ng/ml)及dbcAMP(0.1mM)处理7天。然后对培养物进行α-中间粘连蛋白的免疫萤光染色。以GDNF及dbcAMP处理的SSCs，其突起的分支(箭号)及延长(箭头)较单独的ITS培养基(0)更为广泛。比例尺＝50μm。
图6显示SSCs似神经细胞转形的影像。其指出当SSCs培养于单独的ITS培养基(0)中7天时已经表现出液泡蛋白质突触素-1。此外，于ITS培养基中以GDNF(50ng/ml)或PACAP(20ng/ml)处理7天可诱发进一步延长(箭头)及增加突起的分支(箭号)。比例尺＝50μm。
具体实施方式
本发明提供一种用于诱发神经分化的方法，包括以神经营养因子及/或二丁基环磷酸腺苷(dbcAMP)处理骨髓干细胞，其中该神经营养因子包含衍生自神经胶细胞株的神经营养因子(GDNF)或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)。本发明也提供一种用于诱发神经分化的组合物，包括神经营养因子及/或二丁基环磷酸腺苷(dbcAMP)，其中该神经营养因子包含衍生自神经胶细胞株的神经营养因子(GDNF)或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)
依据本发明，取用骨髓干细胞以制备功能性神经细胞。源自人类骨髓的干细胞具有分化为神经细胞的潜力，被认为是再生神经细胞的最佳材料。较佳者，该骨髓干细胞为源自人类骨髓的尺寸筛选干细胞。尺寸筛选干细胞的开发是基于其相异尺寸及特定表面标记物以产生同源族群，使用细胞分类以避免骨髓干细胞初代培养物产生异源族群。此外，尺寸筛选干细胞较异源族群具有更强的更新能力。较佳以3-μm孔筛筛选源自人类骨髓的尺寸筛选干细胞。使用Percoll梯度分离及孔筛去除较小的细胞，即可基于细胞尺寸及附着能力有效地由人类骨髓分离出尺寸筛选干细胞的同源族群。
依据本发明，以神经营养因子作为诱发神经分化的刺激物。鉴于神经营养因子是存在于正常生理环境下的微环境因子，较之化学试剂具有较小伤害性，其被认为是一种处理用于移植至动物的骨髓干细胞的安全试剂。依据本发明，该神经营养因子包含衍生自神经胶细胞株的神经营养因子或垂体腺苷酸环化酶激活肽。
衍生自神经胶细胞株的神经营养因子(GDNF)对许多CNS神经细胞族群而言是有力的存活因子，其对各种CNS疾病具有治疗潜力。最近Airaksinen及Saarma评论了GDNF的治疗价值(M.S.Airaksinen及M.Saarma，The GDNF family：signaling，biological functions andtherapeutic value.Nat.Rev.Neurosci.3(2002)383-394)。亦有报告指出将GDNF以脊椎内注射至受伤的脊髓，可促进脊髓损伤(SCI)大鼠的后肢恢复(H.Cheng，J.P.Wu及S.F.Tzeng，Neuroprotection of glial cellline-derived neurotrophic factor in damaged spinal cords followingcontusive injury.J.Neurosci.Res.69(2002)397-405)。依据本发明，GDNF处理可促进轴突及分支延伸突起的伸展。在神经细胞专一性标记物方面，GDNF对神经纤维轻蛋白质(NF-L)、液泡蛋白质-突触素-1(synapsin-1)及神经祖细胞标记物-中间粘连蛋白(internexin)的表现皆具刺激作用。GDNF亦可在SSCs中诱发非专一性神经细胞骨架蛋白质α-微管蛋白(α-tubulin)表现。较佳者，衍生自神经胶细胞株的神经营养因子的剂量为20ng/mL至50ng/mL。
垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是一种cAMP诱发的神经肽，其在活体内及活体外的CNS神经分化均扮演关键的角色(E.Dicicco-Bloom，N.Lu，J.E.Pintar及J.Zhang，The PACAPligand/receptor system regulates cerebral cortical neurogenesis.Ann.N.Y.Acad.Sci.11(1998)274-289；J.A.Waschek，Multiple actions ofpituitaty adenylyl cyclase activating peptide in nervous systemdevelopment and regeneration.Dev.Neurosci.24(2002)14-23)。此外，细胞内cAMP的提高对轴突再生具决定性(W.D.Snider，F.Q.Zhou，J.Zhong及A.Markus，Signaling the pathway to regeneration.Neuron 35(2002)13-16)。Gattei等人已发现GDNF受体-α及其附加酪胺酸激酶-RET在hBMSCs中表现(V.Gattei，A.Celetti，A.Cerrato，M.Degan，A.De luliis，F.M.Rossi，G.Chiappetta，C.Consales，S.Improta，V.Zagonel，D.Aidinucci，V.Agosti，M.Santoro，G.Vecchio，A.Pinto及M.Grieco，Expression of the RET receptor tyrosine kinase andGDNFR-alpha in normal and leukemic human hematopoietic cells andstromal cells of the bone marrow microenvironment.Blood 89(1997)2925-2937)。依据本发明，PACAP用于在SSCs形态上转变为神经细胞时刺激神经细胞分化。PACAP通过与PAC1受体作用提高细胞内cAMP而刺激神经生成(Dicicco-Bloom等人(1998))。依据本发明，PACAP处理可促进轴突及分支延伸突起的伸展。在神经细胞专一性标记物方面，PACAP对NF-L、液泡蛋白质-突触素-1及神经祖细胞标记物-中间粘连蛋白的表现皆具刺激作用。PACAP亦可在SSCs中诱发α-微管蛋白表现。较佳者，垂体腺苷酸环化酶激活肽的剂量为10ng/mL至20ng/mL。
二丁基环磷酸腺苷(dbcAMP)是一种细胞可穿透性的cAMP类似物，其可在SSCs中诱发高度分支、延长且纤细的突起。依据本发明，dbcAMP处理可增加NF-L、液泡蛋白质-突触素-1及神经祖细胞标记物-中间粘连蛋白的表现。dbcAMP亦可在SSCs中诱发α-微管蛋白表现。再者，较之以GDNF及PACAP处理的SSC培养物，dbcAMP处理可造成更广泛地分支及延长的突起。较佳者，二丁基环磷酸腺苷的剂量为100μM。
在许多神经疾病中，神经营养因子对神经细胞存活及修复具有效果。因此，细胞移植与神经营养因子的结合被认为是神经疾病的有效治疗策略。已证明神经营养因子可诱发神经干细胞分化(N.Y.Ip，Theneurotrophins and neuropoietic cytokines：two families of growth factorsactingon neural and hematopoietic cells.Ann.N.Y.Acad.Sci.840(1998)97-106；A.Markus，T.D.Patel及W.D.Snider，Neurotrophic factors andaxonal growth.Curr.Opin.Neurobiol.12(2002)523-531；H.Thoenen，Neurotrophins and neuronal plasticity.Science 270(1995)593-598)。然而神经营养因子对SSCs转分化为神经细胞的效果仍属未知。本发明首先显示GDNF及PACAP可刺激SSC朝向成熟神经细胞外型分化。已知这两种神经营养因子具神经保护效果，且可通过活化cAMP/PKA、MAP激酶、P13激酶及PLC-γ信号途径而刺激轴突再生(Airaksinen等人(2002)及Waschek等人(2002))。此外，细胞内cAMP的提高可在SSCs中促进轴突形成。本发明显示培养于ITS培养基中的SSCs为具有突起的外形，且对神经突触液泡蛋白质-突触素-1为阳性。在ITS培养基中的GDNF或PACAP处理可进一步诱发SSCs转变为具纤细突起的似神经细胞。已知表现于大多数CNS成熟神经细胞中的NF蛋白质在神经细胞成长、组织、形状及可塑性各方面均扮演关键角色。因此，在SSCs中由含GDNF或PACAP的ITS培养基所诱发的NF-L额外表现，表明该两种分子在SSCs分化为神经细胞上的调控角色。在dbcAMP处理的SSCs中所观察到的延长突起广泛分支以及NF-L水平增加，暗示细胞内cAMP可能涉及促进PACAP处理的SSCs分化为神经细胞。注意GDNF与PACAP或dbcAMP并用对SSCs中NF-L及α-微管蛋白的产生并无加乘作用。
下列实例的目的仅供举例说明，并无意限制本发明的范围。
实例1：源自人类骨髓的尺寸筛选干细胞
SSCs如先前所描述般分离自人类骨髓(Hung等人(2002))。简言之，将人类骨髓由正常捐赠者的骼嵴吸出，然后以磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)清洗两次。将细胞放进1.073g/ml Percoll溶液(Sigma)，然后于900g下离心30分钟。由交界面收集单核细胞(MNCs)，以1×106MNCs/cm2的密度置盘于10公分的塑料培养皿，该培养皿包含插入的3-μm孔筛(Transwell System，Corning)。将细胞培养于低葡萄糖的Dulbecco’s修改Eagle’s培养基(DMFM-LG)中，该培养基包含10％胎牛血清(FBS)、100U/ml盘尼西林、100mg/ml链霉素及0.25μg/ml两性霉素B(amphotericin B)(含血清培养基)。七天后，附着于插入筛上半部的细胞具有较大的似纤维母细胞外形，将其命名为SSCs。然而，通过筛的细胞呈小多角形，且较少更新。接着以0.25％胰蛋白酶及1mMEDTA收取SSCs，并重新置盘于10公分的培养皿上。当生长于含血清培养基的SSCs达到80％密度时，将细胞以1×105细胞/皿的密度重新置盘于35毫米的培养皿上以供西方墨点分析，或以1×104细胞/井的密度置于8井室中以供免疫萤光分析。
实例2：刺激源自人类骨髓的尺寸筛选干细胞
于含血清培养基中经48小时后，以单独的血清培养基(ITS培养基)及含GDNF(20及50ng/ml；R&D)、PACAP(10及20ng/ml；Sigma)或dbcAMP(20μM；Sigma)的ITS培养基处理SSCs。ITS培养基由56％DMEM-LG(Life Biotech)、40％MCDB-201培养基(Sigma)及含1mg/ml胰岛素、0.55mg/ml人类转铁蛋白(transferrin)、0.5μg/ml亚硒酸钠、10nM地塞米松(dexamethasone；Sigma)及10μM抗坏血酸(Sigma)的1× ITS培养基补充物(Sigma)所组成。我们发现不含血清的DMEM-LG培养基中的SSCs对GDNF及PACAP反应不佳。然而，当SSCs培养于具ITS补充物的不含血清培养基时，上述细胞良好地附着于培养皿上并伸展其突起。因此，于ITS培养基中进行处理。
SSCs的外形显示于图1及2。如图2所示，当SSCs培养于含10％FBS的培养基中时，上述细胞具有扁平而类似纤维母细胞的外形。然而，发现当SSCs培养于单独的ITS培养基时会产生伸展的轴突(图1及2)。此外，以含GDNF或PACAP的ITS培养基处理SSCs进一步促进了轴突的伸展。SSCs于单独的ITS培养基培养7天后即可观察到液泡蛋白质突触素-1。综上所述，单独的ITS培养基亦可诱发SSCs在某种程度上分化为神经细胞。
实例3.GDNF、PACAP及dbcAMP对神经细胞专一性标记物的效果
本研究是关于GDNF、PACAP及dbcAMP对ITS培养基中的SSCs分化为神经细胞的效果。以西方墨点法检验SSCs中神经细胞专一性标记物(NF-L及NF-H)的水平。将细胞以每30毫米培养皿1×105个细胞的密度重新置盘，并于含不同浓度GDNF、PACAP或dbcAMP的ITS培养基中培养7天。收取细胞并使用含1％SDS、1mM苯基甲基磺基氟化物(PMSF)、1mM EDTA、1.5mM胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)、2mMleupeptin及0.7mM抑肽酶(aprotinin)的PBS于冰上轻微同质化。使用Bio-RadDC套组测定蛋白质浓度。将10μg总蛋白质装载至7.5％SDS-PAGE并转移至硝基纤维素膜上。于4℃下将该膜浸泡于抗NF抗体(Chemicon)中过夜，接着浸泡于辣根过氧化酶共轭二级抗体及化学冷光增强溶液(NEN LifeScience)中，即可辨识NF-L(70kDa)及NF-H(200kDa)。
结果显示于图3及4。参照图3，西方墨点分析显示以GDNF或PACAP处理对SSCs中的NF-L蛋白质表现具有刺激效果，虽然对SSCs中的NF-H水平效果较差。
如图4所示，与在单独的ITS培养基所观察到者相比较，含细胞可穿透性cAMP类似物dbcAMP的ITS培养基在SSCs中诱发了高度分支、延长且纤细的突起。如同GDNF及PACAP，西方墨点分析亦显示dbcAMP处理增加了SSCs中的NF-L及α-微管蛋白水平。注意GDNF与PACAP或dbcAMP并用对SSCs中NF-L及α-微管蛋白的产生并无加乘作用。
对另一神经细胞中间丝蛋白质-α-中间粘连蛋白的免疫萤光染色(图5)使用抗α-中间粘连蛋白抗体(1∶200；Chemicon)进行。证据显示GDNF及PACAP在某个程度上可诱发SSCs的突起分支。然而，与在以GDNF及PACAP处理的SSC培养物及对照组培养物所观察到的相比较，以dbcAMP处理7天导致突起更广泛地分支及延长。
实例4：GDNF及PACAP对SSCs外形改变的效果
为了检测经50ng/ml GDNF或20nM PACAP于ITS培养基中处理7天后SSCs的外形改变，将SSCs于含PBS的4％多聚甲醛中固定10分钟。进行对突触素-1-一种突触液泡蛋白质的免疫萤光检验，是将SSCs与抗突触素-1抗体(1∶200；BD Biosciences)于4℃下浸泡于含0.1％Triton X-100及5％马血清的PBS中过夜，接着浸泡于生物素化二级抗体(1∶200；Vector)及FITC-亲和素(1∶200；Vector)中。结果指出，在有处理或未处理SSCs的突起及/或周边膜观察到对突触素-1的强烈免疫萤光染色。然而，证据指出在以GDNF及PACAP处理的培养物中，突触素-1阳性细胞显示伸展的具分支突起(如图6所示)。
虽然本发明的各种实施态样已经例示及说明，所属技术领域的技术人员可进行各种修改及改进。希望本发明并不限于所例示的特定形式，所有未偏离本发明精神及范围的修改均应包涵于权利要求的范围内。

Claims (14)

1.一种用于处理骨髓干细胞以诱发神经分化的方法，其特征是包括以神经营养因子及/或二丁醯cAMP(dbcAMP)处理骨髓干细胞，其中该神经营养因子包含衍生自神经胶细胞株的神经营养因子(GDNF)或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是该骨髓干细胞为源自人类骨髓的尺寸筛选干细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是该源自人类骨髓的尺寸筛选干细胞以3-μm孔筛筛选。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是衍生自神经胶细胞株的神经营养因子的含量为20ng/mL至50ng/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是垂体腺苷酸环化酶激活肽的含量为10ng/mL至20ng/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是二丁醯cAMP的含量为100μM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是该神经分化包括神经纤维轻蛋白质(NF-L)增加，α-微管蛋白(α-tubulin)增加，液泡蛋白质-突触素-1(synapsin-1)产生，神经祖细胞标记物-中间粘连蛋白(internexin)产生，细胞突起延长，以及突起分支增加。
8.一种用于处理骨髓干细胞以诱发神经分化的组合物，其特征是包含神经营养因子及/或二丁基环磷酸腺苷(dbcAMP)，其中该神经营养因子包含衍生自神经胶细胞株的神经营养因子(GDNF)或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征是该骨髓干细胞为源自人类骨髓的尺寸筛选干细胞。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征是该源自人类骨髓的尺寸筛选干细胞以3-μm孔筛筛选。
11.根据权利要求8所述的组合物，其特征是衍生自神经胶细胞株的神经营养因子的含量为20ng/mL至50ng/mL。
12.根据权利要求8所述的组合物，其特征是垂体腺苷酸环化酶激活肽的含量为10ng/mL至20ng/mL。
13.根据权利要求8所述的组合物，其特征是二丁醯cAMP的含量为100μM。
14.根据权利要求8所述的组合物，其特征是该神经分化包括神经纤维轻蛋白质(NF-L)增加，α-微管蛋白(α-tubulin)增加，液泡蛋白质-突触素-1(synapsin-1)产生，神经祖细胞标记物-中间粘连蛋白(internexin)产生，细胞突起延长，以及突起分支增加。
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