CN1717417B - 用于治疗和预防毒性及病原体介导的疾病的新的免疫粘附素 - Google Patents

Abstract

本发明通过例示抗炭疽病和常见感冒之类病原体的免疫粘附素，描述了对毒素和病原体有抵抗活性的免疫粘附素。事实上，可以采用免疫粘附素受体配体原理来对抗病原体、毒物或毒素，包括例如天然和合成的代谢毒物。

Description

用于治疗和预防毒性及病原体介导的疾病的新的免疫粘附素

相关申请

本申请要求作为Larrick和Wycoff于2001年4月28日提交、题目为“用于预防鼻病毒感染的新的免疫粘附素(immunoadhesin)”的国际专利申请Ser No.PCT/US01/13932的部分继续申请的优先权。而Larrick和Wycoff的上述申请又要求2000年4月28日提交、题目相同的美国临时申请Ser No.60/200,298。将包括所有图片、绘图和序列表的各申请完整地在此引入以作参考。

有关联邦政府发起的研究或开发的申明

联邦研究资助以SBIR I期资金(R43 AI43122)和SBIR II期资金(2R44AI43122-02)的形式提供。

发明领域

本发明涉及免疫粘附素，它们从植物中的制备以及它们在治疗和预防毒性(toxicity)与病原体介导的疾病(ailments)，如炭疽病和常见感冒中的用途。

发明背景

常见感冒通常是相当轻的疾病。但是，严重的感冒并发症，如中耳炎、鼻窦炎和哮喘的恶化都是常见的。人鼻病毒(HRV)导致50％的成人感冒和25％的儿童感冒(Bella and Rossmann，J Struct Biol.128：69-74，1999和Sperber and Hayden，Antimicrob Agents Chemother.32：409-19，1988)。每年社会上的开支达数十亿元。这些小的无包膜RNA病毒是小核糖核酸病毒的一个亚型(Rueckert，Virology，pp.507-548，eds.Fields，et al.，Raven Press，Ltd.New York，1990)。对小核糖核酸病毒进行X-光衍射晶体分析，鉴定到了直径为300nm)、二十面体对称的衣壳，该衣壳由各60个拷贝的病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3构成(Rossmann，Nature 317：145-153，1985)。HRV上的表面凹陷或“峡谷(canyon)”认为是受体结合位点(Colonno，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.85：5449-5443，1985；Rossmann，et al.Nature317：145-153，1985)。在鉴定到的102个HRV血清亚型中，有91个(已知为主要的类型)以称作细胞间粘附分子(ICAM-1)(Greve，etal.，Cell56：839-847，1989；Staunton，et al.，Cell56：849-853，1989)的细胞表面糖蛋白作为受体。其结合位点位于第一个N-端结构域(Greve，etal.，J Virol.65：6015-6023，1991；Staunton，et al.，Cell 61：243-254，1990)中。

ICAM-1是具有5个细胞外结构域、1个疏水性跨膜结构域和一个短的细胞质结构域的膜蛋白。免疫和炎症应答中重要的许多细胞都表达ICAM-1，其他细胞也可诱导表达ICAM-1(Casasnovas，et al.，ProcNatl Acad Sci USA.95：4134-9，1998)。ICAM-1是白细胞整合素LFA-1和Mac-1的配体(Springer，Cell.76：301-14，1994；Staunton et al.，Cell61：243-254，1990)。在细胞表面上，跨膜结构域的缔合使ICAM-1主要以二聚体形式存在(Miller，et al.，J Exp Med.182：1231-41，1995；Reilly，et al，JImmunol.155：529-32，1995)。

由5个细胞外结构域组成的重组可溶形式的ICAM-1(sICAM-1)能够在体外有效阻断鼻病毒对人细胞的感染(Greve，et al.，J Virol.65：6015-6023，1991；Marlin，et al.，Nature.344：70-2，1990)。评价sICAM-1对各种实验室病毒株和野生分离物的活性，结果表明主要的HRV株都对sICAM-1敏感。不使用ICAM作为受体的次要病毒株不受sICAM-1的影响(Crump et al.，Antiviral Chem Chemother.4：323-327，1993；Ohlin，et al.，Antimicrob Agents Chemother)。

可溶性ICAM-1的体外抗病毒活性似乎由多种机制介导。这些机制包括和细胞表面ICAM-1竞争结合位点、干扰病毒侵入或脱衣壳以及通过成熟前释放病毒RNA、形成空的衣壳而直接灭活(Arruda et al.，Antimicrob Agents Chemother.36：1186-1191，1192；Greve et al.，J Virol.65：6015-6023，1991；Marlin et al.，Nature 344：70-2，1990；Martin et al.，JVirol.67：3561-8，1993)。

HRV的宿主范围仅限于灵长类动物。最近研究表明可溶性ICAM-1能够有效预防鼻病毒感染黑猩猩(Huguenel，et al.，Am J RespirCrit Care Med.155：1206-10，1997)。虽然黑猩猩不表现出临床症状，但通过测定血清转化和病毒释放可以证实感染的发生。鼻内喷单剂量10mg的可溶性ICAM-1，和HRV同时施用或施用病毒10分钟后施用，能够有效预防HRV-16的感染，

利用可溶性ICAM-1对人进行临床治疗，结果表明可溶性ICAM-1能够降低实验性HRV感冒的严重程度(Turner et al.，JAMA281：1797-804，1999)。在该临床试验中，共有196个病人接受了各种制剂形式的可溶性ICAM-1或安慰剂。一些病人在接种HRV39之前7个小时开始接受可溶性ICAM-1或安慰剂，其他病人在病毒接种后12小时开始接受可溶性ICAM-1或安慰剂。药物以鼻内吸入溶液或粉末形式施用，持续7天，每天6个剂量(共4.4mg/天)。在该项研究中，通过病毒分离或血清转化进行测定，发现可溶性ICAM-1不能预防感染(安慰剂治疗组感染率92％，可溶性ICAM-1治疗组感染率85％)。但是，可溶性ICAM-1对疾病的所有指标有影响。总的症状评分降低了45％，患有临床感冒的病人比例降低了23％，鼻黏膜重量减轻了56％。粉末或溶液制剂施用组间、接种前或接种后施用组间没有显著差异。可溶性ICAM-1的治疗不具有任何副作用，也不经鼻黏膜吸收。并且，对抗-HRV型-特异性抗体的形成也没有抑制作用。

如上文讨论，ICAM-1在细胞膜上是二聚体。在J Virol67：3561-8中Martin等首次提出：多聚可溶性ICAM和HRV的多价结合会导致更高的有效亲和性，又称作亲和力，进而促进病毒的脱衣壳。它们构成多价的ICAM-1/免疫球蛋白分子。和单价可溶性ICAM-1相比，多价的ICAM-1/免疫球蛋白分子能够更有效地中和HRV，从而提高治疗上的可用性。这些ICAM-1/免疫球蛋白分子包括和IgAl(IC1-2D/IgA)、IgM(IC1-2D/IgM)和IgGl(IC1-2D/IgG)重链铰链区和恒定区相融合的第1个和第2个ICAM-1氨基端结构域。另外，5个细胞外结构域和IgA1(IC1-5D/IgA)相融合。在HRV结合、感染性和构象分析中，将这些ICAM-1/免疫球蛋白分子和具有2个(sIC1-2D)和5个(sIC1-5D)结构域的可溶性ICAM-1相比较。ICAM-1/IgA免疫球蛋白(IC1-5/IgA)比可溶性ICAM-1有效200倍，ICAM-1/IgM免疫球蛋白(IC1-2D/IgM)和ICAM-1/IgG免疫球蛋白分子(IC1-2D/IgG)比可溶性ICAM-1有效25和10倍。这些分子能够非常有效地抑制鼻病毒和细胞的结合，破坏病毒衣壳的构象。ICAM-1/IgA免疫球蛋白分子在纳摩尔级的浓度范围内有效。将IC-1-2D/IgA和IC1-2/IgG相比较，结果表明Ig恒定区的类别对效应有很大的影响。

随后的研究比较了可溶性ICAM-1和IC1-5D/IgA对9个主要HRV血清亚型和一个对可溶性ICAM-1有中度抗性的HRV-39变体的抑制活性(Crump，et al.，Antimicrob Agents Chemother.38：1425-7，1993)。对标准的血清亚型而言，相同重量的IC1-5D/IgA比可溶性ICAM-1强50至143倍，相同摩尔数的IC1-5D/IgA比可溶性ICAM-1强60至170倍。HRV-39变体对可溶性ICAM-1的抗性比野生型强38倍，对IC1-5D/IgA的抗性比对野生型仅强5倍。这和以下假设相一致，即病毒逃逸多价分子抑制作用的几率比病毒逃逸单价可溶性受体的几率低(Martin，et al.，J Virol.67：3561-8，1993)。分析测定病毒的失活，结果表明可溶性ICAM-1不能使HRV-39和HRV-13显著失活(<0.5log₁₀感染性的下降)。但是，和IC1-5D/IgA一起孵育，这些病毒的感染性降低约1.0log₁₀(Crump，et al.，Antimicrob Agents Chemother.38：1425-7，1994)。Martin et al.(J Virol.67：3561-8，1993)的结果表明价位越高，分子的效力越大。通过蔗糖梯度沉浆法可以分离二聚体和十聚体形式的IC1-2/IgM。在阻断HRV和HeLa细胞的结合方面，十聚体比二聚体有效5倍。

有报道说明ICAM-1/免疫球蛋白分子具有几个缺点，包括烦琐的生产技术以及与生产方法相关的高成本。另外，以前有报道说明ICAM-1/免疫球蛋白分子在分子必须能够灭活鼻病毒的苛刻环境下，其多聚体稳定性有限。

本申请人以前共同拥有的申请、国际申请Ser.No.PCT/US01/13932描述了嵌合免疫粘附素分子的构建、纯化以及用途，并列出了指导治疗或预防病毒感染和疾病，如常见感冒的示例和权利要求。需要有类似的试剂来治疗并预防毒性和其病原体介导的疾病及失调，如炭疽病之类的病毒感染和疾病。2001年9月11日的生物恐怖袭击就强调了这一需要。

炭疽病的致病性因子-炭疽杆菌分泌的三分(tripartite)毒素有助于细菌逃避免疫系统，在系统性感染中杀伤宿主。毒素的两个组分对哺乳动物细胞质中的底物进行酶学修饰：水肿因子(OF)是一种腺苷酸环化酶，它能够通过多种机制，包括抑制吞噬作用来削弱宿主防御；致死因子(LF)是一种锌依赖的蛋白酶，它能够切割丝裂原活化的蛋白激酶的激酶，导致巨噬细胞的裂解。第三个组分，即保护性抗原(PA)能够和细胞受体相结合，介导酶组分向细胞质的转移。和细胞表面受体结合后，PA被弗林样蛋白酶切割成两个片段。氨基端片段PA₂₀解离至培养基中，使得羧基端片段PA₆₃七聚体化，并与LF及OF结合。[PA6₃]₇与OF和/或LF形成的复合物通过受体介导的内吞作用进入细胞，并移向低pH的内体区室。在那里，酸环境诱导[PA6₃]₇发生构象改变，使其插入到细胞膜中形成一个孔。这一改变促进结合态OF和LF跨内体膜向细胞质的转位。

本发明的免疫粘附素可以被定制(be tailored)，以对抗病原因子或毒物，和本领域中以前描述的免疫粘附素相比具有显著的优越性。本发明中在植物中表达的免疫粘附素可以是四聚体，而不仅仅是二聚体。具有多个结合位点的免疫粘附素对病原体/毒物具有更有效的亲和力，从而增加免疫粘附素的效力。另外，分泌组分和免疫球蛋白J链与本发明免疫粘附素的缔合能够增加黏膜环境中免疫粘附素的稳定性(Corthesy，Biochem Sec Trans.25：471-475，1997)。和分泌型组分相缔合的分泌型IgA是在黏膜分泌中，包括奶和初乳的分泌中正常存在的抗体同型。和其他抗体同型不同，SigA能够几乎不发生降解地通过胃。其在室温下的粗提植物制备物中也是非常稳定的。分泌型组分的功能似乎是保护抗体免受黏膜苛刻环境的损伤(Paul，Fundamental Immunology，Raven Press，NY，Third Edition，pp.303-304，1993)。另外，从植物中生产本发明的免疫粘附素比从动物细胞培养物中生产要廉价，从植物中生产使其在应用于人时更安全，这是因为植物不携带有任意动物病毒。

前面讨论的以及下面列出的资料可能会有助于理解本发明，但并不是承认它们是本发明的现有技术。

Bumlein H，Wobus U，Pustell J，Kafatos FC(1986)蚕豆中豆球蛋白基因家族：B型基因的结构及可能的豆球蛋白基因特异性调节元件。Nucl.Acids Res.14：2707-2713

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Crump et al.(1994)可溶性细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和嵌合型ICAM-1免疫球蛋白A分子抗鼻病毒活性的比较.AntimicrobialAgents and Chemotherapy，38：6，p.1425-1427

Depicker A，Stachel S，Dhaese P，Zambryski P，Goodman HM(1992)胭脂碱合成：转录物图谱的绘制和DNA测序.J.Mol.Genet.1：561-573

Gielen J，De Beuckeleer M，Seurinck J，Deboeck F，De Greve H，Lemmers M，Van Montagu M，Schell J(1984)根癌农杆菌质粒pTiAch5中TL-DNA的完整核苷酸序列.Embo J 3：835-46

Greve et al.(1991)EP 0468257，多聚体形式的人鼻病毒受体蛋白.

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Ingelbrecht I，Breyne P，Vancompernolle K，Jacobs A，Van MontaguM，Depicker A(1991)转基因植物中的转录干扰。Gene 109：239-242

MacDonald MH，Mogen BD，Hunt AG(1991)Nucleic Acids Res 19：5575-81

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发明概述

本发明涉及免疫粘附素，该免疫粘附素包含毒素受体蛋白和至少一部分免疫球蛋白重链相连的嵌合分子，其中J链及分泌组分和嵌合分子相缔合。这里所用的毒素受体是一种受体分子或受体分子的一部分，至少其中的一部分是宿主有机体的细胞表面或细胞内部存在的蛋白质或肽。毒物(toxicant)，例如有毒物质(poisons)或诸如病毒、细菌、真菌、寄生物等的病原有机体(或这些病原有机体所产生的分子)与之的接触是疾病发生过程的一部分。在优选的实施方案中，毒素受体是受体分子的细胞外结构域。毒素受体可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。还可以对受体蛋白或其部分加以改变和修饰，前提是这些修饰不破坏受体与毒素、毒物、病原体或病原体组分相结合的能力。

在受体蛋白是病毒受体蛋白的一些实施方案中，本发明的免疫粘附素包含鼻病毒受体蛋白，这种鼻病毒受体蛋白由鼻病毒受体蛋白的细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合和连接有免疫球蛋白重链的ICAM-1构成。本发明还涉及本发明的免疫粘附素中免疫球蛋白是由不同免疫球蛋白同型(isotype)的结构域或片段组成的IgA、IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE或嵌合免疫球蛋白重链。

在本发明的其他优选实施方案中，免疫粘附素包含和J链及分泌组分相缔合的多个(multiple)嵌合ICAM-1分子。效价的增加导致对鼻病毒的更高亲和力，进而增加免疫粘附素的效力。

在本发明的优选实施方案中，所有用于制造本发明中免疫粘附素的蛋白质都是人类蛋白质。除了在植物或植物细胞中生成外，本发明还涉及在哺乳动物细胞、发根(hairy root)培养物、组织培养的植物细胞和来源于植物、脊椎动物或无脊椎动物的异源细胞中表达的免疫粘附素。

在本发明的优选实施方案中，免疫粘附素在植物，包括单子叶植物和双子叶植物中作为植物基因组的一部分表达。和培养细胞中的表达相对的是，在植物中的表达能够显著降低生产免疫粘附素的成本。

本发明涉及具有植物特异性糖基化的免疫粘附素。基因在植物细胞中表达时，其所编码的多肽氨基酸序列中具有糖基化信号天冬氨酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸，其中X可以是任意氨基酸残基。该多肽通过和序列中的天冬酰胺残基相连的寡糖链得以糖基化。用作糖基化信号的多肽序列的一般评论参见Marshall，Ann.Rev.Biochem.，41：673(1972)和Marshall，Biochem.Soc.Symp.，40：17(1974)。这些信号能够在哺乳动物和植物细胞中得以识别。在多肽成熟的最后，和其他类型细胞，包括哺乳动物细胞和昆虫细胞中表达的蛋白质相比，植物或植物细胞中表达的蛋白质具有更多不同方式的糖基化。举例来说，分析植物特异性糖基化及将之和其他类型细胞中进行的糖基化相比较的具体研究参见Cabanes-Macheteau et al.，Glycobiology 9(4)：365-372(1999)和Altmann，Glycoconjugate J.14：643-646(1997)。这些研究组和其他研究组都已经说明植物特异性糖基化产生木糖通过β(1，2)方式和甘露糖相连的葡聚糖，而哺乳动物和昆虫细胞中的糖基化结果表明木糖不通过β(1，2)方式和甘露糖相连。植物特异性糖基化导致果糖通过α(1，3)方式和邻近的GlcNAc相连，而哺乳动物和昆虫细胞中的糖基化结果表明果糖通过α(1，6)方式和邻近的GlcNAc相连。另外，植物特异性糖基化不导致向蛋白葡聚糖的末端添加唾液酸，而哺乳动物的糖基化添加唾液酸。

在其他的实施方案中，本发明的免疫粘附素是组合物的一部分，其中组合物包含植物物质和与J链及分泌组分相缔合的免疫粘附素。存在的植物物质可以是植物细胞壁、植物细胞器、植物胞浆、完整植物细胞、活的植物等。可能会存在的具体植物物质或植物大分子包括核酮糖二磷酸羧化酶、集光复合物、色素、次级代谢物或叶绿体。本发明的组合物可以含有占不含水物质0.001％至99.9％之间的免疫粘附素。在其他的实施方案中，免疫粘附素的存在占不含水物质的0.01％至99％。在其他的实施方案中，本发明的组合物具有植物物质或植物大分子，其存在占不含水物质的0.01％至99％。

本发明还涉及治疗或预防患者中人鼻病毒感染的方法，包括通过一种方法来降低鼻病毒对病毒敏感性宿主细胞的感染性，或降低人鼻细胞所导致的常见感冒的启动或蔓延，该方法包括将病毒和本发明的免疫粘附素相接触，其中免疫粘附素和人鼻病毒相结合，降低其感染性。免疫粘附素可以通过和细胞表面的ICAM-1竞争结合位点，干扰病毒侵入或脱衣壳和/或成熟前释放病毒RNA、形成空衣壳而直接灭活来介导感染(Arruda，et al.，Antimicrob.Agents Chemother.36：1186-1191，1992；Greve，et al.，J.Virol.65：6015-6023，1991；Martin，et al.，Nature 344：70-2，1990；Martin，et al.，J.Virol.67：3561-8)。在其他的实施方案中，通过一种方法来患者中抑制人鼻病毒的感染，该方法包括给患者鼻内施用有效量的本发明免疫粘附素，其中免疫粘附素降低人鼻病毒的感染力。

本发明的其他方面涉及免疫粘附素、组合物和使用免疫粘附素及组合物的方法，其中免疫粘附素对一种细菌或多种细菌有活性。在这些方面中，免疫粘附素含有能够与感兴趣细菌，如炭疽杆菌或其病原体组分，如保护性抗原(PA)相结合的受体蛋白。在治疗或预防炭疽病的一些优选实施方案中，受体蛋白是炭疽毒素受体蛋白或其中一部分。该部分可以是细胞外结构域或细胞外结构域的一部分。其他的或可替代的实施方案可以参考上文关于ICAM免疫粘附素的报道。举例来说，某些优选的实施方案中还包括上文所述的至少一部分免疫球蛋白重链，即J链和分泌组分。

在本发明的另一个不同方面中，描述了一种降低或防止毒素或病原体[如炭疽杆菌的保护性抗原(PA)]与对所述毒素或病原体损伤敏感的宿主细胞的结合的方法，该方法通过将毒素或病原体和能够与之结合的免疫粘附素相接触，进而诱骗(decoy)毒素或病原体，掩盖和/或改善其致病作用。其他的方面描述了根据该概念降低死亡率和发病率的方法。

在毒物方面，本发明还描述了毒物解毒药，该解毒药包括与免疫粘附素相连的毒物受体或其中的一部分。

虽然炭疽病和常见感冒是本发明的各方面中列举的两个目标，本发明涉及的免疫粘附素可利用能够与任意病原体或毒物的组分相结合的任意已知受体蛋白或其中一部分，其中病原体或毒物的组分是病原体发挥致病或毒性作用所必需的。除了天然病原体之外，毒物包括但并不局限于对细胞、组织、器官或有机体具有负性效应的动物毒素、致癌物、致突变物或其他代谢抑制剂或促进剂。这里所述的原理可以用于预防、治疗、改善、或调节任意类型的毒性或病原体介导的疾病或其导致的症状。

附图简述

图1所示为pSSPHuA2载体，其中将编码包含5个人ICAM-1结构域和人IgA2m(2)Fc区的嵌合ICAM-1分子的DNAs相融合[SEQ IDNO：9，48]。该载体包含驱动信号肽和人IgA2m(2)重链恒定区表达的SuperMas启动子。通过PCR扩增编码ICAM结构域1～5的序列，使之包含便于操作的限制性位点(5′SpeI和3′SpeI)，以便插入到信号肽和Cα1结构域之间。编码ER滞留信号(RSEKDEL)的DNA[SEQID NO：5]附加在重链的3′末端，以增强构建体的表达水平。

图2所示为嵌合ICAM分子。2A所示为产生ICAM-1分子的DNA表达序列盒。2B所示为信号肽切割后，成熟形式融合蛋白的氨基酸序列[SEQ ID NO：8]。通过克隆步骤引入的氨基酸带有下划线，并标出了ICAM-1中5个细胞外结构域和IgA2m(2)重链的Cα1～Cα3结构域的连接部位。粗体表示的N’s所示为15个潜在的糖基化位点。

图3所示为免疫粘附素在单独转化的烟草愈伤组织中的表达。3A所示为含有不同转化的烟草愈伤组织(C)和水提物(Aq)的样品在非还原性SD-聚丙烯酰胺凝胶上电泳、并探测人ICAM存在与否的免疫印迹图。指出了分子量标记物，参照标准品(R)是人ICAM(～75kD)和人SIgA(>>250kD)的混合物。3B所示为含有从愈伤组织Rhi107-11中部分纯化的免疫粘附素各级分的非还原性SD-聚丙烯酰胺凝胶的免疫印迹图。加以分析的纯化级分可以是汁液(J)、G-100级分(G)、除菌过滤的G-100级分(SG)和人SigA(75ng)及人ICAM-1(75ng)(RS)的参照标准品混合物。

用抗人ICAM(～ICAM)、人IgA重链(～α)、人分泌组分(～SC)和人J链(～J)的抗体探测，进行印迹分析。为了使用碱性磷酸酶来标记免疫阳性带，使用二级酶联抗体是必要的。

图4所示为酶联免疫吸附分析(ELISA)的结果，该结果说明了植物提取物和可溶性ICAM-1之间与抗ICAM-1抗体的竞争结合。对于分析来说，使用0.25μg可溶性ICAM-1/mL包被96-孔板。方框表示sICAM增加的浓度，圆圈表示用于和吸附ICAM竞争与恒定量小鼠(抗人ICAM)抗体的结合的愈伤组织增加量。

图5所示为分析结果，该分析结果说明了免疫粘附素抑制人鼻病毒杀伤HeLa细胞(细胞病变效应，或CPE分析)的能力。5A所示为包含ICAM-Fc融合体(IC1-5D/IgA)中免疫粘附素或抗阿霉素抗体的多个部分纯化提取物存在的条件下，比较人鼻病毒对HeLa细胞的CPE的分析结果(右测上方和左测下方的三角表示来源于包含免疫粘附素的Rhi107-11的两个提取物)。5B所示为可溶性人ICAM-1或来源于ICAM-Fc融合体(IC1-5D/IgA)中免疫粘附素的提取物存在的条件下，比较人鼻病毒对HeLa细胞的CPE的分析结果。图中的插图所示为可溶性ICAM(1.35μg/mL)或IC1-5D/IgA(0.12μg/mL；小11.3倍)的IC50范围的比例尺放大图。

图6所示为对生产1克免疫粘附素成品所需的必需物进行评价的图。在该图中，列出了产率为20％、达到预期表达水平的条件下所需的植物数和植物重量。在不同免疫粘附素表达水平(mg/kg鲜重)和总回收率(定在20％)条件下，为了获得特定的生产目标(1g/收获)，可以在一个具有合理可能性的窗口(点所围起的面积)中确定各植物重量以及植物总数。随着生长期和再生长期数目的增加，所需的植物数减少。预期的生物量的产生、起作用时间和生长条件影响收获时间和收获间时间。可以通过错开种植和收获时间将这些生长期和纯化计划相协调。

图7所示为表2中所列各免疫球基因和蛋白质的编码序列与氨基酸序列[SEQ ID NO：15至47和SEQ ID NO：52至62]。

图8所示为按照实施例2所述用来转化植物的质粒序列，可以研究本发明中免疫粘附素的表达。

图8A所示为质粒PSSpICAMHuA2的核苷酸序列[SEQ ID NO：9]和蛋白质序列[SEQ ID NO：48]。

图8B所示菜豆(bean)豆球蛋白信号肽的核苷酸和蛋白质序列[SEQID NO：10]。

图8C所示为编码pSHuJ中蛋白质编码区的核苷酸序列[SEQ IDNO：11]和氨基酸序列[SEQ ID NO：50]。

图8D所示为编码pSHuSC中蛋白质编码区的核苷酸序列[SEQ IDNO：12]和氨基酸序列[SEQ ID NO：51]。

图8E所示为编码质粒pBMSP-1的核苷酸序列[SEQ ID NO：13]。

图8F所示为编码质粒pBMSP-1spJSC的核苷酸序列[SEQ IDNO：14]。

图9包含ICAM-1和人IgA2的核苷酸和蛋白质序列SEQ IDNO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8及其他核苷酸序列。

图10所示为ATR-IgA2融合体(免疫粘附素)的全长核苷酸序列[SEQ ID NO：98]和氨基酸序列[SEQ ID NO：99]。

图11所示为质粒pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2的T-DNA边界之间的序列[SEQ ID NO：100]。

图11所示为质粒pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC的T-DNA边界之间的序列[SEQ ID NO：101]。

发明详述

A.定义

这里所用的下列缩略词和术语包括但不必要局限于下列定义。

如非指明，本发明的实施将采用属于本领域技术范围的常规免疫学、分子生物学技术、微生物学技术、细胞生物学技术和重组DNA技术。参见Sambrook，et al.，分子克隆：实验室指南，第二版(1989)；分子生物学最新方案[F.M.Ausubel，et al.eds.，(1987)]；酶学中的系列方法(Academic Press，Inc)；M.J.MacPherson，et al.，eds.Psc2：一种使用方法(1995)；Harlow and lane，eds，抗体：实验室指南(1988)，和H.Jones，分子生物学方法，vol.49，“植物基因转移和表达方案”(1995)。

免疫球蛋白分子或抗体。包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的免疫活性部分，并共价偶联在一起从而能够特异性地与抗原相结合的多肽或多聚蛋白。免疫球蛋白或抗体分子是一个大的分子家族，包括多种类型的分子，诸如IgD、IgG、IgA，分泌型IgA(SIgA)、IgM和IgE。

构建体或载体。往靶植物组织或细胞中转移的人工组装的DNA片段。典型地说，构建体包括感兴趣的特定一个基因或多个基因、标记基因和适当的调控序列。术语“质粒”指自主的、能够自我复制的染色体外DNA分子。在一个优选的实施方案中，本发明的质粒构建体包含编码抗体重链和轻链的序列。含有适当调控元件的质粒构建体还称为“表达序列盒”。在一个优选的实施方案中，质粒构建体还可以包含一个筛选或选择标记，例如一种抗生素抗性基因。

选择标记。编码产物能够使转基因组织在选择培养基中生长的基因。不具有限制作用的选择标记示例包括编码抗生素，如氨苄霉素、卡那霉素等抗性的基因。其他选择标记是本领域的熟练技术人员都知道的。

转基因植物。遗传改造的植物或遗传改造的植物子代。转基因植物通常包含来源于至少一种非相关有机体，如病毒、其他植物或动物的物质。

嵌合ICAM-1分子：ICAM-1细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合与免疫球蛋白重链蛋白的至少一部分形成的融合体，该融合体通过将ICAM-1序列连接在免疫球蛋白重链基因序列的上游，并使该构建体表达所编码的蛋白质而制成。在抗菌的实施方案中，能够有效和一种目标细菌或多种目标细菌或其亚组分相结合的一种或多种受体蛋白取代ICAM-1使用，或和ICAM-1联用。许多这种受体蛋白都是已知的，本领域的普通技术人员可以不进行太多的实验将之用在本发明的适当方面中。下面列举了利用这样一种蛋白质的一个例子，该蛋白质能够与导致人炭疽病的细菌所导致的发病机制中涉及的蛋白质相结合。通过使用免疫粘附素形式的适当受体蛋白，该概念还用于靶向鼻病毒之外的病毒。

嵌合免疫球蛋白重链：具有来源于不同同型或亚型或其他一些肽、多肽或蛋白质的免疫球蛋白重链之氨基酸序列至少一部分的免疫球蛋白重链。典型地说，嵌合免疫球蛋白重链具有来源于至少两个不同免疫球蛋白重链同型或亚型的的氨基酸残基。

双子叶植物(dicots)：胚具有两个种瓣或子叶的开花植物。双子叶植物的例子是：烟草；西红柿；包括苜蓿的豆科植物；栎属植物；槭树；玫瑰；薄荷；南瓜；雉菊属植物；胡桃属植物；仙人掌；堇菜属植物和毛茛属植物。

有效量：足以使对病毒或细菌感染(看情况而定)、毒性或复制的抑制作用能够检测得到，或足以降低感染严重性或感染时间的本发明免疫粘附素的有效量。

人鼻病毒(HRV)：为小核糖核酸病毒一个亚型的无包膜RNA病毒，是人常见感冒的主要致病因素。在鼻病毒、呼肠孤病毒和细小病毒，pp.1057-1059，Zinsser Microbiology，Joklik et al.，eds.Appletonand Lange(1992)中对鼻病毒作了描述。

免疫粘附素：包含嵌合受体蛋白分子，并可任选地包含分泌组分和J链的复合物。

免疫球蛋白重链：包含免疫球蛋白中至少一部分抗原结合结构域和免疫球蛋白重链中至少一部分可变区或免疫球蛋白重链中至少一部分恒定区的多肽。因而，来源于免疫球蛋白的重链具有和多个免疫球蛋白基因家族同源的重要氨基酸序列区。例如，Fag片段中的重链就是来源于免疫球蛋白的重链。

免疫球蛋白轻链：包含免疫球蛋白中至少一部分抗原结合结构域和免疫球蛋白轻链中至少一部分可变区或免疫球蛋白轻链中至少一部分恒定区的多肽。因而，来源于免疫球蛋白的轻链具有和多个免疫球蛋白基因家族同源的重要氨基酸序列区。

免疫球蛋白分子：包含共价偶联在一起的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链中免疫活性部分，并能够与抗原特异性相结合的蛋白质。

ICAM-1：细胞间粘附分子-1。在人体内，ICAM-1作为人鼻病毒的受体发挥作用。

J链：参与免疫球蛋白的多聚化过程及多聚化免疫球蛋白通过上皮细胞转运的多肽。参见免疫球蛋白辅助分子：免疫球蛋白基因中的J链，pg.345，Academic Press(1989)。在五聚化IgM和二聚化IgA中存在有J链，它通过二硫键相结合。在小鼠和人体内都对J链进行了研究。

单子叶植物(monocots)：胚具有一个子叶或一个种瓣的开花植物。单子叶植物的例子是：百合属植物；草；玉米；包括燕麦、小麦和大麦的谷类作物；兰花；鸢尾属植物；葱属植物和棕榈树。

糖基化：寡糖对蛋白质的修饰作用。对用作糖基化信号的多肽序列的综述参见Marshall，Ann.Rev.Biochem.，41：673(1972)和Marshall，Biochem.Soc.Symp.，40：17(1974)。这些信号可以在哺乳动物和植物细胞中得以识别。

植物特异性糖基化：在植物表达的蛋白质中发现的糖基化模式，该模式和在哺乳动物或昆虫细胞中制成的蛋白质中的糖基化模式不同。和在其他类型的细胞，包括哺乳动物细胞和昆虫细胞中表达的蛋白质相比，在植物或植物细胞中表达的蛋白质具有更多不同的糖基化模式。分析植物特异性糖基化及将它和其他类型细胞中进行的糖基化相比较的具体研究参见Cabanes-Macheteau et al.，Glycobiology9(4)：365-372(1999)、Lerouge et al.，Plant Molecular Biology 38：31-48(1998)和Altmann，Glycoconjugate J.14：643-646(1997)。植物特异性糖基化产生木糖通过β(1，2)方式和甘露糖相连的葡聚糖。而哺乳动物和昆虫的糖基化均不产生木糖通过β(1，2)方式和甘露糖相连的葡聚糖。植物葡聚糖的末端不具有唾液酸，而哺乳动物细胞则添加唾液酸。另外，植物特异性糖基化导致果糖通过α(1，3)方式和邻近的GlcNAc相连，而哺乳动物和昆虫细胞中的糖基化结果表明果糖通过α(1，6)方式和邻近的GlcNAc相连。

分泌组分(SC)：有助于保护免疫球蛋白免受灭活性试剂作用，从而增强分泌型免疫球蛋白生物效力的分泌型免疫球蛋白组分。分泌组分可以来源于任意哺乳动物或啮齿类动物，包括小鼠和人类。

sICAM：缺失ICAM的疏水跨膜结构域和羧基段胞质结构域、天然存在的可溶性截短形式的ICAM-1。

本文中引用的文章、专利和专利申请在此引入，就象给出了完整引文一样。

虽然下面的许多讨论针对ICAM-1和免疫粘附素方面和实施方案，普通技术人员明白可以通过ICAM-1之外的受体蛋白分子，以类似的方法生产其他抗病毒或抗菌免疫粘附素。事实上，实施例10～12是抗菌实施例，这些实施例中使用炭疽毒素受体(ATR)取代ICAM-1。

B.含有嵌合ICAM分子的免疫粘附素

本发明提供了一种生产包含嵌合受体蛋白，如ICAM-1受体蛋白的免疫粘附素分子的新方法。举例来说，ICAM-1免疫粘附素含有嵌合ICAM-1分子，该分子由鼻病毒受体蛋白和缔合有J链及分泌组分的免疫球蛋白重链分子相连而成。本发明这一方面中的嵌合ICAM-1分子包含来源不同的两个分子：鼻病毒受体蛋白和免疫球蛋白链部分。鼻病毒受体蛋白来源于细胞间粘附分子1(ICAM-1)。Staunton，etal.，Cell 52：925-933(1988)；Greve，et al.Cell 56：839-847(1989)；Greve，et al.J.Virology 65：6015-6023(1991)；Staunton，et al.，Cell，61：243-254(1990)中测定并分析了人鼻病毒受体ICAM-1的核苷酸序列，序列IDNO.3和GenBank登记No.M24283中也描述了该序列。

ICAM-1分子是具有5个细胞外结构域、1个疏水性跨膜结构域和一个短的胞质结构域的膜蛋白(SEQ ID NOS：1和2)。Casasnovas，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95：4134-4139(1998)和Staunton etal.，Cell 52：925-933(1998)中描述了这些特征。本发明的适当方面中尤其有用的是位于N端结构域1和2、负责人鼻病毒结合的ICAM-1分子的结构域(Greve，et al.，J.Virol.，65：6015-6023 1991和Staunton，etal.，Cell，61：243-245 1990)。这些方面还涉及包括ICAM-1分子细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合的鼻病毒受体蛋白部分。在具体的优选实施方案中，鼻病毒受体蛋白部分包括ICAM-1分子的结构域1和2，在其他的优选实施方案中，鼻病毒受体蛋白部分中存在ICAM-1分子的结构域1、2、3、4和5。

ICAM-1中5个细胞外结构域的边界是本领域人员所熟知的，Staunton，et al．，Cell 52：925-933(1988)中也对其作了介绍。大致的结构域边界如下面的表1所示[SEQ ID NO：2]。

表1

如本发明的一些方面和实施方案中所用到的，ICAM-1结构域1从约第1个残基至约第88个残基；结构域2从约第89个残基至约第105个残基；结构域3从约第106个残基至约第284个残基；结构域4从约第285个残基至约第385个残基；结构域5从约第386个残基至第453个残基。这些结构域的确切边界可以变动，这一点是本领域的熟练技术人员所能够理解的。

嵌合ICAM-1分子优选含有至少一部分IgM或IgA重链，从而使得免疫球蛋白重链能够和免疫球蛋白J链结合，进而和分泌组分结合。预想来源于免疫球蛋白重链的部分嵌合ICAM-1分子包含选自IgA重链或IgM重链或其他同型重链的个别结构域。还预想对来源于IgA或IgM之外的免疫球蛋白重链或来源于免疫球蛋白轻链的免疫球蛋白结构域对进行分子改造，使之和免疫球蛋白J链相结合，从而用于生产本发明的免疫球蛋白和免疫粘附素。

本领域的熟练技术人员知道免疫球蛋白由大致100～110个氨基酸残基的结构域组成。这些不同的结构域是本领域人员所熟知的，具有已知的边界。通过现代分子生物学技术可以容易地去除一个结构域，置换成其他抗体分子的结构域。结构域是通过链内二硫键加以稳定的球形结构。这一点使结构域具有离散的形状，使之成为一个自含的单位，可以为其他类似形状的结构域置换或互换。免疫球蛋白的重链恒定区结构域具有多个特征，已知为对包含有该结构域的特定分子的抗体效应功能。举例来说，这些效应功能包括补体结合、胎盘转移、和葡萄球菌蛋白的结合、和链球菌G蛋白的结合、和单核细胞、中性粒细胞或肥大细胞及噬碱粒细胞的结合。特定结构域和特定免疫球蛋白同型和这些效应功能之间的联系是人们所熟知的，例如Immunology，Roitt et al.，Mosby St.Louis，Mo.(1993 3rd Ed.)中描述了这种联系。

本领域的熟练技术人员能够鉴定免疫球蛋白重链恒定区序列。举例来说，许多免疫球蛋白DNA和蛋白质序列可以通过GenBank查询来获得。表2所示为免疫球蛋白重链基因和这些基因所编码蛋白质的GenBank登记号。表2中列出的序列如表7所示。

表2

 

GenBank登记号	人免疫球蛋白序列名称	SEQ IDNO.
			J00220	Igα1重链恒定区编码序列	15、52
J00220	Igα1重链恒定区氨基酸序列	16
			J00221	IgA2重链恒定区编码序列	17、53
J00221	IgA2链恒定区氨基酸序列	18
			J00228	Igy1重链恒定区编码序列	19、54
J00228	Igy1重链恒定区氨基酸序列	20
			J00230V00554	IgG2重链恒定区编码序列	21、55
J00230V00554	IgG2重链恒定区氨基酸序列	22
			X03604M12958	IgG3重链恒定区编码序列	23、57
X03604M12958	IgG3重链恒定区氨基酸序列	24
			K01316	IgG4重链恒定区编码序列	25

 

K01316	IgG4重链恒定区氨基酸序列	26
			K02876	IgD重链恒定区编码序列	27
K02876	IgD重链恒定区氨基酸序列	28、30、32
			K02877	IgD重链恒定区编码序列	29
K02877	IgD重链恒定区氨基酸序列	28、30、32
			K02878	胚系IgD重链编码序列	31
K02878	胚系IgD重链氨基酸序列	28、30、32
			K02879	胚系IgD重链C-δ-3结构域编码序列	33
K02879	胚系IgD重链C-δ-3结构域氨基酸序列	28、30、32
			K01311	胚系IgD重链J-δ区：C-δCH1编码序列	58
K01311	胚系IgD重链J-δ区：C-δCH1氨基酸序列	28、30、32
			K02880	胚系IgD重链基因，C-区，分泌端编码序列	36
K02880	胚系IgD重链基因，C-区，分泌端氨基酸序列	28、30、32
			K02881	胚系IgD重链基因，C-区，膜端第一个结构域编码序列	38
K02881	胚系IgD重链基因，C-区，膜端第一个结构域氨基酸序列	28、30、32
			K02882	胚系IgD重链编码序列	40
K02882	胚系IgD重链氨基酸序列	28、30、32
			K02875	胚系IgD重链基因，C-区，C-δ-1结构域编码序列	42
K02875	胚系IgD重链基因，C-区，C-δ-1结构域氨基酸序列	28、30、32
			L00022J00227	IgE重链恒定区编码序列	59

 

V00555
			L00022J00227V00555	IgE重链恒定区氨基酸序列	60
X17115	IgE重链完整序列编码序列	61
			X17115	IgE重链完整序列氨基酸序列	62

本发明的免疫粘附分子除了包含嵌合ICAM-1分子外，还可包含与免疫球蛋白来源的重链相连的免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白J链。在优选的实施方案中，本发明的免疫粘附素包含两个或四个嵌合ICAM-1分子和一个与至少一个嵌合ICAM-1分子相连的免疫球蛋白J链。J链是本领域曾经描述和已知的。举例来说，参见M.Koshland，免疫球蛋白辅助分子：免疫球蛋白基因中的J链，Academic Press，London，pg.345，(1989)和Matsuuchi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83：456-460(1986)。免疫球蛋白J链的序列可以从美国的多个数据库中查询获得。

免疫粘附素可以具有和嵌合ICAM-1分子相缔合的分泌组分。通过氢键、二硫键、共价键、离子间相互作用或这些不同键的组合来完成缔合作用。典型地说，嵌合ICAM-1分子通过分子间的二硫键缔合在一起。嵌合ICAM-1分子的相互作用可以是非共价键结合或二硫键结合。

本发明还涉及来源于多个不同物种，包括人类、大鼠、兔、牛等的分泌组分。这些分子的核苷酸序列是本领域已知的。例如，美国专利6,046,037就包含了许多序列，该专利在此引入以作参考。本发明中包含分泌组分、嵌合ICAM-1分子和J链的免疫粘附素典型地通过以下方式相结合：氢键、二硫键、共价键、离子间相互作用或这些键的组合。

本发明还涉及包含多个受体蛋白分子，如ICAM-1的免疫粘附素。举例来说，ICAM-1免疫粘附素可以包含单体形式的、不通过二硫键和其他嵌合ICAM-1分子相结合的嵌合ICAM-1分子。在优选的实施方案中，免疫粘附素包含和其他嵌合ICAM-1分子缔合形成二聚体的嵌合ICAM-1分子及其他多价分子。典型地说，由于嵌合分子的免疫球蛋白部分的缔合，嵌合ICAM-1分子以二聚体形式存在。嵌合ICAM-1分子的免疫球蛋白部分使得两个嵌合ICAM-1分子形成具有两个活性结合部分的二聚体分子，其中活性结合部分由鼻病毒受体蛋白部分组成。在优选的实施方案中，二硫键介导这种缔合作用，其中二硫键正常情况下以天然存在的免疫球蛋白分子的一部分形式和天然免疫球蛋白的形式存在于免疫球蛋白结构域之间。

在其他的优选实施方案中，由于J链和嵌合ICAM-1分子的免疫球蛋白的缔合作用，免疫粘附素包含多聚体形式的嵌合ICAM-1分子。J链和两个嵌合ICAM-1分子形成的二聚体的缔合使得形成四聚体形式的免疫粘附素。在优选的实施方案中，嵌合ICAM-1分子的免疫球蛋白部分来源于IgA分子，J链的加入使得形成包含四个嵌合ICAM-1分子和四个结合位点的四聚复合物。在其他的优选实施方案中，嵌合分子的免疫球蛋白重链部分来源于IgM，可以形成包含10个或12个分子的多聚复合物。在嵌合ICAM-1分子使用嵌合免疫球蛋白重链的其他的优选实施方案中，嵌合ICAM-1分子通过IgA或IgM中负责J链结合的结构域形成二聚体或其他更为有序的多价复合物。在其他的嵌合免疫球蛋白分子中，负责两个免疫球蛋白重链和/或一个免疫球蛋白轻链和重链间二硫键结合的免疫球蛋白部分可以置于嵌合免疫球蛋白分子中，使形成二聚体或更为有序的多价复合物。

多个方面和实施方案涉及嵌合ICAM-1分子，其中包含重链的免疫球蛋白结构域来源于不同同型的重链或轻链免疫球蛋白。本领域的熟练技术人员明白：可以使用分子技术，将这些结构域替换为类似的结构域，从而生成两个不同免疫球蛋白分子之间杂合的免疫球蛋白。这些嵌合免疫球蛋白使得包含分泌组分的免疫粘附素得以构建，这种免疫粘附素具有不同免疫球蛋白结构域所赋予的多个不同和所需特征。

还涉及嵌合ICAM-1分子，其中来源于免疫球蛋白、重链或轻链的嵌合分子部分可以包含和来源于不同免疫球蛋白分子的完整结构域相比更少的结构域。可以采用同样的分子技术来产生这种嵌合ICAM-1分子。

在优选的实施方案中，嵌合ICAM-1分子至少包含小鼠或人IgA1、IgA2或IgM中的CH1、CH2、CH3结构域。本发明的其他优选实施方案包含的免疫球蛋白结构域至少包括IgM的Cμ1、Cμ2、Cμ3或Cμ4结构域。

优选的嵌合ICAM-1分子包含来源于人免疫球蛋白不同同型的结构域。包括免疫球蛋白的优选嵌合ICAM-1分子包含的免疫球蛋白结构域至少包括人IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE或IgD。用作部分嵌合ICAM-1分子的其他免疫球蛋白包括所包含结构域至少来源于IgM或IgM中CH1、CH2、CH3或CH4的免疫球蛋白。本发明还涉及包含嵌合ICAM-1分子，该嵌合ICAM-1分子包含来源于哺乳动物免疫球蛋白中至少两个不同同型的免疫球蛋白结构域。一般说来，任意哺乳动物免疫球蛋白都可用在本发明的实施方案中，如下列同型(isotype)：IgG任意同型、IgA任意同型、IgE、IgD或IgM。还涉及来源于一个物种的嵌合ICAM-1分子，如来源于人类、小鼠或其他哺乳动物。在优选的实施方案中，嵌合ICAM-1分子包含负责J链与IgA和IgM相缔合的IgA部分或IgM部分。因此，通过使用嵌合ICAM-1分子中的嵌合免疫球蛋白，J链可以和不能结合J链的免疫球蛋白主要同型或分泌组分相缔合。

本发明还涉及嵌合分子，该嵌合分子包含来源于啮齿类动物或灵长类动物免疫球蛋白中两个不同同型的免疫球蛋白。啮齿类动物或灵长类动物免疫球蛋白是本领域人员所熟知的。本发明的嵌合分子可以包含免疫球蛋白来源的重链，该重链包括下列免疫球蛋白结构域的至少一个：小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgE或IgD的CH1、CH2或CH3结构域；小鼠IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4结构域；人IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的CH1结构域；人IgE或IgM的CH1、CH2、CH3、CH4结构域；哺乳动物IgG同型、IgA同型、IgE或IgD的CH1、CH2或CH3结构域；哺乳动物IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4结构域；啮齿类动物IgG、IgA、IgE或IgD同型的CH1、CH2或CH3结构域；啮齿类动物IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4结构域；动物IgG同型、IgA、IgE或IgD同型的CH1、CH2或CH3结构域；动物IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4结构域；本发明还涉及在嵌合分子，如ICAM-1分子中置换或添加来源于免疫球蛋白超家族成员分子的蛋白质结构域。属于免疫球蛋白超家族的分子具有和免疫球蛋白同源的氨基酸序列及核苷酸序列。可以根据氨基酸或核苷酸序列的同源性来鉴定属于免疫球蛋白超家族中一部分的分子。例如参见免疫球蛋白基因，p.361，Academic Press(1989)。

在本发明的优选实施方案中，通过能够产生具有植物特异性糖基化的免疫粘附素的方法表达免疫粘附素。糖基化是植物细胞中蛋白质的一种主要修饰，这是本领域人员所熟知的(Lerouge et al.，PlantMolecular Biology 38：31-48，1998)。蛋白质的糖基化也可发生在其他细胞类型中，包括哺乳动物细胞和昆虫细胞。糖基化过程起始于内质网中同时翻译的前体寡糖转移到新生多肽链的特定残基上。将寡糖加工为不同类型葡聚糖的过程发生在分泌途径中糖蛋白从内质网向最终目的地的转移中。其中葡聚糖中存在的残基类型不同，残基之间的连接性质不同。本技术领域的熟练技术人员能够理解：在蛋白质的成熟的最后，植物或植物细胞中表达的蛋白质和其他类型细胞，包括哺乳动物细胞和昆虫细胞中表达的蛋白质具有不同的糖基化模式。分析植物特异性糖基化及将之和其他类型细胞中进行的糖基化相比较的具体研究参见Cabanes-Macheteau et al.，Glycobiology 9(4)：365-372(1999)和Altmann，Glycoconjugate J.14：643-646(1997)。这些研究组和其他研究组都已经说明植物特异性糖基化产生木糖通过β(1，2)方式和甘露糖相连的葡聚糖，而哺乳动物和昆虫细胞中的糖基化结果表明木糖不通过β(1，2)方式和甘露糖相连。植物特异性糖基化导致果糖通过α(1，3)方式和邻近的GlcNAc相连，而哺乳动物和昆虫细胞中的糖基化结果表明果糖通过α(1，6)方式和邻近的GlcNAc相连。另外，植物特异性糖基化不导致向蛋白葡聚糖的末端添加唾液酸，而哺乳动物的糖基化添加唾液酸。

本发明中以植物特异性方式糖基化的免疫粘附素可以包括嵌合分子，如包括ICAM-1细胞外结构域任意组合，如结构域1、2、3、4和5任意组合的嵌合ICAM-1。图2B所示为本发明中嵌合ICAM-1/IgA2分子的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)，该嵌合分子包括个ICAM-1结构域。粗体N’s表示植物细胞以及哺乳动物细胞和昆虫细胞的糖基化过程中连接有寡糖基团的天冬酰胺残基。糖基化位点是三肽Asn-X-Ser/Thr，其中X可以是脯氨酸和天冬氨酸之外的任意氨基酸，这是本领域的熟练技术人员能够了解的(Kornfeld and Kornfeld，AnnuRev Biochem 54：631-664，1985)。因此，本领域的熟练技术人员清楚：蛋白质中的哪些氨基酸发生植物特异性糖基化取决于存在有哪些ICAM-1结构域。因为ICAM-1的序列和结构域边界是已知的(参见Staunton et al.，Cell 52：925-933，1988)，对于本领域的熟练技术人员来说，如何确定任意5个ICAM-1结构域任意可能组合上的植物特异性糖基化位点是显而易见的。

在本发明的其他优选ICAM-1方面和实施方案中，具有植物特异性糖基化并包含嵌合ICAM-1分子的免疫粘附素还包括和所述嵌合ICAM-1分子相缔合的J链和分泌组分，其中的嵌合ICAM-1分子具有ICAM-1细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合。由于对嵌合ICAM-1分子是可靠的，本领域的熟练技术人员将能够鉴定J链和分泌组分序列中的植物特异性糖基化位点。同样的原理适用于本发明中包含嵌合ICAM-1之外的嵌合受体分子的免疫粘附素。

本发明涉及具有植物特异性糖基化的免疫粘附素，这种免疫粘附素包含一个嵌合分子，如嵌合ICAM-1分子，其中免疫球蛋白重链选自IgA(SEQ ID NOS：15～18和52～53)、IgA1(SEQ ID NOS：15～16和52)、IgA2(SEQ ID NOS：17和53)、IgG1(SEQ ID NOS：19～20和54)、IgG2(SEQ ID NOS：21～22和55)、IgG3(SEQ ID NOS：23～24和56)、IgG4(SEQ ID NOS：25～26和57)、IgM(SEQ ID NOS：46～47和61～62)、IgD(SEQ ID NOS：27～33、35～36、38、40和42)、IgE(SEQ ID NOS：44～45和59～60)和一个免疫球蛋白重链。哪些免疫球蛋白重链序列，或免疫球蛋白重链序列的哪种组合和嵌合免疫球蛋白重链相组合对免疫粘附素的嵌合分子中的糖基化数目和位置具有影响，是本领域的熟练技术人员能够理解的。由于对嵌合分子是可靠的，本领域的熟练技术人员将能够鉴定免疫球蛋白重链序列中的植物特异性糖基化位点，包括构建的各种嵌合免疫球蛋白重链序列中的植物特异性糖基化位点。

这里还提供了免疫粘附素功能衍生物。“功能衍生物”指本发明中保留有至少一部分蛋白质功能的“化学衍生物”、“片段”或“变体”，举例来说，蛋白质功能可以是蛋白质对抗体特异的反应性、酶活性或结合活性，这些功能使蛋白质能够根据本发明使用。由于遗传编码的兼并性，多个不同的氨基酸序列可以编码相同的氨基酸序列，这是本领域人员所熟知的。可以进行氨基酸的保守替换而获得保留有原有功能的蛋白质或多肽，这也是本领域人员所熟知的。两种情况下的所有变换都属于本发明的内容。

还可以根据常规方法对衍生物加以基因工程改造，使之包括一个亲和纯化标签，从而使生产大量和/或相当纯或分离量的免疫粘附素成为可能。存在有能够掺入免疫粘附素一个或多个组分的多个不同版本的标签，在掺入时优选不破坏未掺入标签时免疫粘附素的所需结合活性。可以通过基因工程将这种标签改造成融合在编码本发明中免疫粘附素的核苷酸序列上的、编码可表达性标签的核酸序列。还可以通过基因工程将该标签改造成能够通过商业来源酶去除的形式。

另外，有可能删除一些密码子，或将一个或多个密码子替换成兼并密码子之外的密码子，生成结构上得以改造的多肽，但是该多肽具有和未改造核酸分子所产生多肽基本相同的可用活性。如本领域人员所意识到的，即使产生多肽的两个不同核酸分子之间不具有遗传密码的兼并性，两个多肽也可以功能上相同，

可以提供这种操作和产生后化学衍生化来提高稳定性、可溶性、吸收、生物或治疗效应和/或生物半衰期。例如，Remington’s药学，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)中公开了能够介导这种效应的基团。本发明范围内的功能衍生物是“变体”多肽，相对于天然多肽来说，该“变体”多肽或缺失一个或多个氨基酸，或包含额外的或替换的氨基酸。通过对蛋白质DNA编码序列进行适当修饰，在天然序列的C端、N端和/或内部的一个或多个位点添加、去除一个或多个氨基酸和/或改变一个或多个氨基酸的密码子，从天然存在的复合物组分获得变体。人们认为这种具有添加、替换和/或额外氨基酸的变体保留有天然蛋白质的上述一个或多个特征部分。

可以利用本领域的普通技术人员所熟知的常规技术来制备缺失、插入和/或替换了氨基酸残基的蛋白质功能衍生物。例如，利用定点诱变技术(Adelman et al.，1983，DNA 2：183中例举了该技术)可以生成功能衍生物的改造组分。该技术中，对DNA编码序列中的核苷酸进行修饰，使生成改造了的编码序列，然后利用上述的一些技术在原核或真核宿主细胞中表达该重组DNA。或者，利用本领域人员所熟知的方法，通过直接化学合成法制备具有氨基酸缺失、插入和/或替换的蛋白质。蛋白质的功能衍生物典型表现出和天然蛋白质同质的生物活性。

另外，本发明的免疫粘附素可以不仅是改造的受体蛋白/Ig免疫粘附素，还可以是其他的天然蛋白家族成员、同型和/或其他同源氨基酸序列，如人类、灵长类、啮齿类、犬、猫、牛、鸟等的同源氨基酸序列。并且，用于免疫粘附素的Ig类型可以变动，如可以在给定的物种之内或之外具有不同Ig家族成员的相同性。举例来说，ICAM和Igs是各种各样的，它们具有人们所熟知的序列，普通技术人员能够利用该序列产生不同的免疫粘附素，这些免疫粘附素在接受治疗的给定有机体中具有更多或更少的不同用途。具有ICAM-1同源性的分子的一个示例性的、不详尽的览表包括下表中所列的分子，这种ICAM-1同源性能够用于产生其他的免疫粘附素。

表3

 

登记号	ICAM名称	物种
			NP000192	细胞间粘附分子-1(CD54)[SEQ ID NO：63]	人类
AAH03097	细胞间粘附分子ICAM-2[SEQ ID NO：64]	人类
			NP 002153	细胞间粘附分子3前体[SEQ ID NO：65]	人类
BAB20325	TCAM-1[SEQ ID NO：66]	人类
			NP 003250	细胞间粘附分子5(Telencephalin)[SEQ ID NO：67]	人类

 

NM 007164	黏膜血管细胞粘附分子1(MADCAM1)[SEQ ID NO：68]	人类
			NM 001078	血管细胞粘附分子(VCAM1)[SEQ ID NO：69]	人类
AAA37875	MALA-2[SEQ ID NO：70]	小家鼠
			AAA37876	细胞间粘附分子1前体[SEQ ID NO：71]	小家鼠
AAG30280	细胞间粘附分子1[SEQ ID NO：72]	灰仓鼠
			AAB39264	细胞间粘附分子-3[SEQ ID NO：73]	牛
AAF80287	细胞间粘附分子-1前体[SEQ ID NO：74]	猪
			AAA18478	telencephalin[SEQ ID NO：75]	兔
NP 032345	细胞间粘附分子5，telencephalin[SEQ ID NO：76]	小家鼠
			BAB41106	细胞粘附分子TCAM-1[SEQ ID NO：77]	小家鼠
NP 067705	睾丸细胞粘附分子1[SEQ ID NO：78]	褐鼠
			AAG35584	Nectin样蛋白1[SEQ ID NO：79]	小家鼠
AAC18956	CD22蛋白[SEQ ID NO：80]	人类
			AAA35415	细胞间粘附分子1[SEQ ID NO：81]	猩猩

 

AAA83206	89kDa蛋白质[SEQ ID NO：82]	小家鼠
			AAA92551	细胞间粘附分子-1[SEQ ID NO：83]	犬
AAB06749	细胞间粘附分子-1[SEQ ID NO：84]	牛
			AAD13617	细胞间粘附分子-1前体[SEQ ID NO：85]	绵羊
NP 037099	细胞间粘附分子-1[SEQ ID NO：86]	褐鼠
			AAE22202	ICAM-4[SEQ ID NO：87]	褐鼠
AAA60392	细胞表面糖蛋白[SEQ ID NO：88]	人类
			AAF91086	Nephrin[SEQ ID NO：89]	褐鼠
AAF91087	Nephrin[SEQ ID NO：90]	小家鼠

同样的，人类和其他物种中不同Ig分子的许多重链恒定区都已知能够取代这里所述嵌合体的特异Ig区。

C.包含免疫粘附素的载体、细胞和植物

本发明还涉及包含本发明中免疫粘附素的表达和克隆载体、细胞和植物。分离编码免疫粘附素各个部分的基因的技术是本领域的熟练技术人员所熟知的，可使用这些技术将各种所需基因插入到表达和克隆载体中，其中这些载体是可以导入细胞和转基因植物的载体。

本发明涉及建立组装免疫粘附素的方法，该方法包括以下步骤：将编码嵌合受体蛋白分子(如ICAM-1分子)、免疫球蛋白J链的DNA片段导入生物有机体中，并且往同一生物有机体中导入编码分泌组分的DNA。优选的分泌组分至少包含人多聚免疫球蛋白受体(pIgR)氨基酸残基序列或其他物种同源氨基酸残基序列(Mostov，Ann Dev.Immu.12：63-84 1994)中氨基酸残基1至约606的片段。

本发明涉及包含本发明中免疫粘附素的真核细胞，包括植物细胞。本发明还涉及包含编码本发明中各组分的核苷酸序列的植物细胞。本领域的熟练技术人员理解：编码分泌组分保护蛋白、嵌合受体蛋白分子和J链的核苷酸序列将典型地、可操作性地和启动子相连接，以表达载体一部分或序列盒的形式存在。典型地说，如果所用的真核细胞是植物细胞，则使用的启动子是能够在植物细胞中发挥作用的启动子。嵌合受体蛋白基因、分泌组分基因和J链基因分离后，将它们典型地、可操作性地和表达载体中的启动子相连接。本发明还涉及包含编码嵌合受体蛋白分子之核苷酸序列的表达载体，其中的核苷酸序列和表达调控序列相连。在特定细胞中表达的核苷酸序列位于这些表达载体中启动子序列的3＇端。表达载体还可以包含能够提高转录效率的多个增强子序列。另外，诸如终止子、多聚腺苷酸化(PolyA)位点和其他3′端加工信号的序列也可以包括在表达载体中，以增加特定细胞中核苷酸序列的转录量。

组分在所选生物有机体中的表达可以来源于自主复制质粒，或染色体永久组分，或能够瞬时产生编码这些组分之转录物的DNA。适于转化的生物有机体可以是原核生物，也可以是真核生物。复合物组分的导入可以通过直接DNA转化，通过基因枪导入生物有机体，或通过其他生物有机体的介导，例如通过重组农杆菌对植物细胞的作用。蛋白质在转基因生物有机体中的表达通常需要同时导入适当的启动子元件和多聚腺苷酸化信号。在本发明的优选实施方案中，启动子元件导致组分在所有植物细胞中的组成性表达。在大多数或所有细胞中的组成性表达将确保前体物能够占据相同的细胞内膜系统，这一点是实现组装所必需的。

使用和宿主细胞相容的表达载体，优选那些和植物细胞相容的表达载体来表达本发明的基因。用于在植物中表达基因的典型表达载体是本领域人员所熟知的，包括来源于Rogers et al.，Meth.In Enzymol.，153：253-277(1987)中所述的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)肿瘤诱导性(Ti)质粒的载体。但是，其他几个表达载体系统也已知能在植物中发挥作用。例如参见Verma et al.，PCT申请No.WO87/00551；和Cocking and Davey，Science，236：1259-1262(1987)。

上述的表达载体包含表达控制元件，包括启动子。待表达的基因可操作性地和载体相连，使得启动子序列能够指导RNA聚合酶的结合以及基因编码的所需多肽的合成。在基因表达中有用的启动子可以是诱导型、病毒、合成的、组成型和受调控的启动子。本领域人员熟知：选择使用哪个表达载体，以及编码本发明中部分免疫粘附素的核苷酸序列最终和哪个启动子相连，都取决于所需的功能特征，如蛋白质表达的位置和时间，所要转化的宿主细胞，这些是重组DNA分子构建领域中的固有限制。但是，实施本发明时用到的表达载体至少能够指导复制，优选还能够指导包括在该载体所连接的DNA中的多肽编码基因的表达。

在优选的实施方案中，用于表达基因的表达载体包括在植物细胞中有效的选择标记，优选药物抗性选择标记。优选的药物抗性标记是表达产物能够赋予卡那霉素抗性的基因，即包含胭脂碱合酶启动子、Tn5新霉素磷酸转移酶II和胭脂碱合酶3′非翻译区的嵌合基因，Rogerset al.，植物分子生物学方法，Weissbach and H.Weissbach，eds.，Academic Press Inc.，San Diego，Calif.(1988)对其作了介绍。有用的植物表达载体可以从Pharmacia，Piscataway，N.J.购买。在植物中表达外源蛋白质的表达载体和启动子在U.S.Pat.Nos.5,188,642；5,349,124；5,352,605和5,034,322中作了介绍，在此引入以作参考。

已经建立了各种方法，通过互补粘末端将DNA和载体相连接。例如，可以往待插入载体DNA的DNA片段上添加互补的同聚物序列(tracks)。通过互补同聚物尾之间的氢键将载体和DNA片段相连接，形成重组DNA分子。或者，还可以使用包含一个或多个限制性内切酶位点的接头将DAN片段和表达载体相连接。通过在能够催化平末端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的作用下，将平末端的DNA片段和过量的合成接头分子孵育将合成的接头分子加到平末端DNA片段上。因而，反应产物是在两个末端具有合成接头的DNA片段。使用适当的限制性内切酶切割这些DNA片段，并将之连接到表达载体中，其中的表达载体已经用能够产生和合成接头相容的末端的酶切割。包含多个限制性内切酶位点的合成接头可以从多个途径购买，包括New England BioLabs，Beverly，Mass。

可以直接将编码本发明中分泌组分、J链和嵌合受体蛋白分子，如ICAM-1的核苷酸序列可以导入相同的植物细胞，也可以将各组分分别导入植物细胞，产生相应的植物，将产生各种组分的植物杂交来生成包含所有所需组分的最终植物细胞。

可以使用任意方法将编码本发明中各组分的核苷酸序列导入真核细胞。例如，将基因导入植物的方法包括农杆菌介导的植物转化、原生质体转化、向花粉中的基因转移、向生殖器官的基因注射及向未成熟胚中的基因注射。这些方法都各有优缺点。因此，将基因导入特定真核细胞或植物物种的特定方法并不是导入其他真核细胞或植物物种的最有效方法。

农杆菌介导的转移是将基因导入植物细胞的广泛应用的系统，这是因为该方法可以将DNA直接导入完整的植物组织中，绕过了从原生质体再生植物的需要。使用农杆菌介导的表达载体将DNA导入植物细胞是本领域人员所熟知的。例如，参见Fraley et al.，Biotechnology，3：629(1985)和Rogers et al.，Mothods in Enzymology，153：253-277(1987)中所介绍的方法。另外，Ti-DNA的整合是相当精确的过程，几乎不导致重排。通常如Spielmann et al.，Mol.Gen.Genet.，205：34(1986)和Jorgensen et al.，Mol.Gen.Genet.，207：471(1987)所述利用边界序列限定要转移的DNA区域，并将介入DNA插入到植物基因组中。如Kleeet al.，植物DNA感染试剂，T.Hohn and J.Schell，eds.，Springer-Verlag，New York，pp.179-203(1985)所述，如今的农杆菌转化载体能够在大肠杆菌中复制，也能够在农杆菌中复制，便于操作。在用于农杆菌介导的基因转移的载体领域，更近期发展起来的技术改进了载体中基因和限制位点的排列，便于构建表达多个多肽编码基因的载体。Rogers etal.，Method in Enzymology，153：253(1987)中介绍的载体具有便于插入多肽编码基因直接表达的多聚接头区。该多聚接头区旁侧有启动子和多聚腺苷酸化位点。该载体适用于本发明目的。

在农杆菌介导的转化能够起效的植物物种中选用该方法，这种选择缘于该方法所导致基因转移的快速和明确特征。对叶片圆盘和其他组织进行农杆菌介导的转化似乎仅限于农杆菌天然状态下能够感染的植物物种。因此，农杆菌介导的转化是双子叶植物中最有效的方法。

几乎没有单子叶植物是农杆菌的天然宿主，虽然利用Bytebier etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5345(1987)所述的农杆菌载体生成了天门冬属的转基因植物。因此，重要的经济谷作物，如水稻、玉米和小麦的转化必须借助其他方法。利用以磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合可以实现这些植物原生质体的转化。例如参见Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.，199：183(1985)；Lorz et al.，Mol.Gen.Genet.，199：178(1985)；Fromm et al.，Nature，319：791(1986)；Uchimiya et al.，Mol.Gen.Genet.，204：204(1986)；Callis et al.，Genesand Development，1：1183(1987)；和Marcotte et al.，Nature，335：454(1988)。

这些方法在不同植物物种上的应用取决于从原生质体再生特定植物物种的能力。从原生质体再生谷类植物的示例性方法在Fujimura etal.，Plant Tissue Culture Letters，2：74：(1985)；Toriyama et al.，TheroAppl.Genet.73：16(1986)；Yamada et al.，Plant Cell Rep.，4：85(1986)；Abdullah et al.，Biotechnology，4：1087(1986)中作有介绍。

为了转化不能成功地从原生质体再生的植物物种，可以使用其他的方式将DNA导入完整细胞或组织。例如，可以如Vasil，Biotechnology，6：397(1988)所述方法实现谷类植物从未成熟胚胎或外植体的再生。另外，还可以使用“基因枪”或高速微注射技术。如Kleinet al.，Nature，327：70(1987)；Klein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8502(1988)和McCabe et al.，Biotechnology，6：923(1988)所述，利用这些技术，吸附在加速到每秒一百米至数百米的、小(0.525μm)金属颗粒表面的DNA透过细胞壁，进入细胞质。金属颗粒能够穿透数层细胞，使得组织外植体内部的细胞也能得以转化。金属颗粒已成功地用于转化玉米细胞，成功的产生可育的、稳定转化的烟草和大豆。这些组织外植体的转化不需要经过原生质体阶段，因此加速了转基因植物的生成。

还可以如Zhou et al.，Methods in Enzymology，101：433(1983)；A.Hess，Intern Rev.Cytol.，107：367(1987)；Luo et al.，Plant Mol.Biol.Reporter，6：165(1988)所述，通过直接将DNA转移至花粉中而将DNA导入植物。如Pena et al.，Nature，325：274(1987)所述通过将DNA注射到植物的生殖器官中获得多肽编码基因的表达。还可以如Neuhauset al.，Theor.Appl.Genet.，75：30(1987)；和Benbrook et al.，inProceedings Bio Expo 1986，Butterworth，Stoneham，Mass.，pp.27-54(1986)所述将DNA直接注射到未成熟胚和重新水化的冻干胚中。

从植物单个植物原生质体或各种外植体的再生是本领域人员所熟知的。例如参见植物分子生物学方法，A Weissbach and H.Weissbach，eds.，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(1988)。这种再生和生长过程包括的步骤有：选择转化的细胞和苗，使转化苗生根，并将小植株植入土壤。

可以如Horsch et al.，Science，227：1229-1231(1985)所述实现包含外源基因的植物从叶外植体的再生，其中外源基因通过农杆菌导入。在该过程中，如Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803(1983)所述，在选择性试剂存在的条件下，在诱导受转化植物苗再生的培养基中培养转化体。2至4周内，该过程典型地生成苗，将苗转移到适当的诱导生根的培养基中，后者含有选择性试剂和抑制细菌生长的抗生素。在选择性试剂存在的条件下能够形成小植株的转化苗移栽到土壤中，使之生根。这些过程根据所用的特定植物物种而变动，这些变动是本领域人员所熟知的。

本发明的免疫粘附素可以在任意植物细胞中生成，包括来源于双子叶植物或单子叶植物，如茄科植物、苜蓿、豆类植物或烟草的植物细胞。

可以从能够进行有性杂交的任意植物物种生成本发明的转基因植物，其中的植物物种可以利用本领域的熟练技术人员所掌握的任意方法进行转化。有用的植物物种是双子叶植物，包括烟草、西红柿、豆类植物、苜蓿、栎属植物和槭树；单子叶植物，包括草、玉米、谷类植物、燕麦、小麦和大麦；低等植物，包括裸子植物、球果植物、木贼、石松、苔类植物、金鱼藻、藓类植物、藻类植物、配子体、孢子体或蕨类植物。

本发明还涉及在包括哺乳动物细胞的真核细胞中表达免疫粘附素。本领域的熟练技术人员能够理解用于在哺乳动物细胞中表达免疫粘附素的各个系统，易于改进那些系统，从而在那些宿主细胞中表达免疫粘附素和嵌合蛋白质受体分子，如ICAM-1分子。在优选的ICAM实施方案中，本发明的嵌合ICAM-1、J链和分泌组分分子置于载体pCDM8中，该载体以前在Aruffo，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：8573-8577(1987)中有所描述。pCDM8构建体的使用并不是唯一的，还有许多其他的真核表达系统，这些系统不使用cog细胞表达系统，可以用于表达免疫粘附素的嵌合ICAM-1及其他分子。

D.包含免疫粘附素的组合物

本发明还涉及包含本发明中免疫粘附素以及植物大分子或物质的组合物。典型地说，这些植物大分子或植物物质来源于在本发明中有用的任意植物。在植物细胞、植物细胞提取物或植物中，植物大分子和本发明中的免疫粘附素共存。组合物中，和本发明中免疫粘附素相缔合的典型植物大分子是核糖二磷酸羧化酶、集光复合物色素(LHCP)、次级代谢物或叶绿素。本发明的组合物具有占不含水物质0.01％和99％之间的植物物质或植物大分子。其他组合物包括具有占不含水物质0.01％和99％之间的免疫粘附素的组合物。其他组合物包括占不含水物质50％至90％的免疫粘附素。

本发明的组合物可以含有占不含水物质0.1％和5％之间的植物大分子。典型地说，在组合物中存在的物质由植物大分子及本发明中的免疫粘附素组成。当本发明的免疫粘附素以更高或更低浓度存在时，组合物中植物大分子的浓度会以相反的趋势变动。在其他的实施方案中，植物大分子的组合物的存在占不含水物质的0.12％和1％之间。

本发明涉及包含下列所有或部分的组分：嵌合蛋白受体分子(如ICAM-1分子)、J链或分泌组分。这些组分如上所述形成复合物，并缔合在一起。典型地说，该组合物还包括植物来源的分子。还可以在提取加工产生功能性免疫粘附素和植物来源分子之后获得该组合物。

提取方法包括的步骤有：对包含复合物的植物施加一种力，通过这种作用力，植物的质外体区室破裂，释放所述的复合物。其中的作用力涉及使用简切这种原始方法释放质外体液体。

整株植物或植物提取物包含免疫粘附素及许多其他植物大分子的混合物。包含在混合物中的大分子有核糖二磷酸羧化酶(RuBisCo)或RuBisCo片段。另一种大分子是LHCP。另一种分子是叶绿素。

制备包含免疫粘附素的组合物的其他有用方法包括使用多种溶剂进行提取，使植物物质处于真空状态。本发明的组合物可以包含占不含水物质约0.1％和5％之间的植物大分子。

本发明还涉及用于患者或动物治疗的治疗性组合物。治疗性组合物的施用可以发生在从植物或其他转基因生物有机体中提取之前或之后。一旦提取，免疫粘附素可以通过大小排阻、离子交换或亲和层析之类的常规技术进一步纯化。植物分子可以和复合物一起施用。

本发明还涉及植物来源分子和动物来源分子的相对玻璃可以改变。特定植物蛋白，如RuBisCo或叶绿素的量可以占不含水的提取物物质的0.01％，或不包括水的提取物物质的99.9％之多。

本发明还涉及直接使用包含免疫粘附素的治疗性植物提取物，不进一步纯化特定的治疗性组分。施用可以是局部使用、口服、经鼻喷雾或其他适于将抗体运送到黏膜靶病原体的方法。

E.药用组合物、制剂和施用途径

这里介绍的免疫粘附素可以施用于患者，优选以合适药用组合物的形式施用。这种组合物可以包含除了上述组分之外的组分，或包含替代上述组分的组分。治疗时，组合物优选表现出治疗和预防特征中的其一或其二。可以根据本领域中的常规方法制备这种组合物，这种组合物可以呈现多种形式，如液态溶液、悬液或乳剂，以及使用在服用前加到液体中的固体形式。配制和施用多肽和蛋白质的技术可以在Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最终版中找到。利用这些方法，普通技术人员不需要使用本发明的免疫粘附素进行过多的实验就能获得成功。

1.施用途径

适于本发明的施用途径包括，如口服、经鼻施用、吸入、眼内施用、phanyngeal、支气管施用、经黏膜施用或肠道施用。或者，可以将复合物以局部方式施用，如在优选的作用部位注射或通过其他方式施用化合物。

2.制剂

可以以自身已知的方式生产本发明的药用组合物，如通过常规的混合、溶解、颗粒化、制作糖衣丸、研磨、乳化、装胶囊、捕获(entrapping)或冻干过程。可以使用一个或多个包含赋形剂和/或其他辅助物的、生理学上可接受的载体来促进活性化合物向药用制剂的加工。适当的制剂依赖于所选用的特定施用途径。

对于注射来说，本发明的试剂可以配制在水溶液中，优选配制在生理相容性缓冲液，如Hank’s溶液、林格注射液或生理盐缓冲液中。对于经黏膜施用来说，制剂中使用适于透过屏障的透过物。这种透过物在本领域中通常是已知的。

对于口服来说，可以通过将活性化合物和本领域人员所熟知的、药学上可接受的载体组合在一起来配制。这种载体使得本发明的化合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、口服液、凝胶、糖浆、浆料、悬液等等，用于受治疗患者的口服。适当的载体包括赋形剂，如糖之类的填充物，包括乳糖、蔗糖、甘露糖和/或山梨糖醇；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、土豆淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如果需要，可以加入促分解试剂，如交联的聚乙烯吡咯酮、琼脂或藻酸或其盐，如藻酸钠盐。

糖衣丸核心提供有适当的包衣。为了达到该目的，可以使用浓缩的糖溶液，该糖溶液可选性地含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯酮、卡波姆胶、聚乙二醇和/或二氧化钛；漆溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。可以往片剂或糖衣丸包衣中添加染剂或色素，鉴定或分析活性化合物剂量的不同组合。

能够口服的药用制剂包括由明胶制成的承插式胶囊，以及由明胶和塑形剂，如甘油或山梨糖醇组成的软的、密封的胶囊。承插式胶囊所含有的活性成分可以和填充物，如乳糖；结合物，如淀粉；和/或润滑剂，如滑石粉或硬脂酸镁；可选性的稳定剂相混合。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在适当的液体，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外还可以加入稳定剂。所有的口服制剂应该是适于这种施用方式的剂量。

对于经颊(buccal)施用来说，组合物可以是以传统方式配制的片剂或锭剂。

对于吸入施用来说，可以使用适当的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，方便地将根据本发明使用的化合物通过加压包装或喷雾器以气雾方式施用。使用加压气体的情况下，可以通过提供一个阀门来确定剂量单位，以便按规定量施用。吸入器(inhaller)或吹入器(insufflator)中胶囊和明胶软片的制剂中包含化合物的粉末混合物和适当的粉末主剂，如乳糖或淀粉。

或者，活性成分以粉末的形式存在，在使用前用合适的赋形剂，如无菌无致热源的水配制。

另外，化合物还可以配制成储存制剂。可以通过包埋(例如皮下或肌肉包埋)或肌肉注射的方式施用这种长时间发挥作用的制剂。因此，例如，化合物可以与合适的多聚物或疏水物质(例如存在于可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制在一起，或者是少量可溶性衍生物的形式，例如少量可溶性盐的形式。

另外，可以使用缓释系统，如包含治疗性试剂的固态疏水性多聚物的半透性基质来施用化合物。已经确立了多种缓释物质，这些缓释物质是本领域的熟练技术人员所熟知的。缓释胶囊释放化合物的时间长达数周至100天以上，取决于其化学性质。根据治疗性试剂的化学性质和生物稳定性，还可以使用增加蛋白质稳定性的额外策略。

药用组合物还可以包含适当的固态或凝胶态的载体或赋形剂。这种载体或赋形剂的例子包括，但不局限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚乙二醇之类的多聚物。

使用许多酸，包括但不局限于盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等来形成药学上相容的盐。盐在水或对应于游离碱形式的其他质子化溶剂中更易于溶解。在溶液中，还采用常规调节pH的操作来优化所需特征。

3.测定有效剂量和剂量方案

本发明中适用的药用组合物包括含有有效量活性成分组合物，其中有效指能够达到预期目的，如治疗和/或预防目的。药用有效量指化合物能够有效防止、减轻或该上疾病症状，或延长受治疗者生存时间的量。药用有效量的确定在本领域的熟练技术人员的能力范围之内，典型为约0.5μg/kg/天和约500g/kg/天之间的量，个别剂量典型地包含约1纳克和数纳克之间的免疫粘附素。

对于用于本发明的任意化合物来说，可以首先从细胞培养物分析来估计治疗有效剂量。例如，将不同剂量施用于不同的动物或细胞培养物，对产生的效应进行比较。通过这种方式，人们可以鉴定到所需的浓度范围，相应地制备并施用这种量。对剂量进行优化对于本领域的普通技术人员来说是常规的技术。

除了考虑药效外，技术人员还应考虑细胞培养物或实验动物中与标准药学程序相应的毒性，如测定LD₅₀(使群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(对群体的50％治疗有效的量)。毒性和疗效之间的剂量比值是治疗指数，治疗指数可以表示为LD₅₀和ED₅₀之间的比值。从这些细胞培养物分析和动物研究中获得的数据可以用于系统地阐述用于人类的剂量范围。这种化合物的剂量优选位于包括ED₅₀在内的、很少有或没有毒性的浓度范围内。根据所采用的用药形式和施用途径，剂量可以在这一范围内变动。医师可以根据患者的病情来选择确切的制剂、施用方式和剂量(参见Fingl et al.，1975，“治疗中的药学基础”，第1章，p.1)。

可以调整用药量和用药频率，提供黏膜水平的免疫粘附素，使之能够维持或提供药效，如治疗和/或预防。对于各种免疫粘附素和免疫粘附素制剂来说，最小有效浓度(MEC)可以变动，但是可以从体外和/或体内数据加以估计。达到MEC所需的剂量依赖于个体特征和施用途径。然而，这里所述的分析方法可用语测定黏膜浓度，在用量和精确配方上可以将之进一步优化。

利用MEC还可以确定用药间隔。施用化合物所使用的方案能够将黏膜水平维持在MEC以上10％～90％的时间，30％～90％的时间，或最优选50％～90％的时间。

如果需要，组合物可以存在于包装袋或分配器装置中，它们可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂量。举例来说，包装袋包括金属或塑料箔，如发疱药包装袋。包装袋或分配器装置可以附有施用说明。包装袋或分配器还可以附有管理药剂或生物制品生产、使用或销售的政府机构出具的通告，该通告说明获得了负责人类或兽医施用的免疫粘附素生产、使用或销售的管理机构的批准。举例来说，这种通告可以是由美国食品与药品监督管理局认可为处方药的标记，或认可的产品插页。制备包含配制在相容性药用载体中的本发明化合物的组合物，将之盛在适当的容器中，标明用于治疗指定的病情，如治疗或预防由宿主有机体/患者蛋白质受体分子所介导的疾病。

F.治疗和预防ICAM-介导的疾病(afflictions)的方法

需要本发明中治疗性和/或预防性免疫粘附素嵌合体来对抗鼻病毒感染和/或症状，如感冒并发症状的患者，可以服用药用有效量的免疫粘附素，优选如上所述确定、生产及施用的药用组合物的一部分。这些制剂和施用方式可以大幅度变动。下面所述的是可以用于推测有效量和毒性的原始方法，可以方便地用于确定人类和其他哺乳动物中的治疗和预防参数以及方案。这些方法仅是示例性的，并不对本发明作出限制。另外，对于本领域的普通技术人员来说，这些方法都是常规方法。

1.免疫粘附素降低人类鼻病毒感染的能力：剂量上升耐受研究

可以利用随机对照试验来测定施用，如经鼻施用免疫粘附素对感染的影响，对本发明的免疫粘附素进行验证。也可以采用其他施用途径。现有多种用于监测影响效应的分析方法，如评价疾病症状，如由鼻病毒感染所导致的感冒症状的IL-8应答分析法。这些研究可以片家患者对象所服用的免疫粘附素能够预防或治疗鼻病毒感染的程度。例如，健康或不健康的研究对象都服用免疫粘附素，并在一段时间内加以观察，如在鼻病毒接种和/或疾病进程的前后时间内加以观察。可以根据之前用于评价重组可溶性ICAM-1分子对鼻病毒感染的影响的方案来制定临床方案，或对该方案进行改进(Turner，et.al.，JAMA 281：1797-804，1999)。

对任意物种、年龄、健康状况、或疾病状态的雄性和雌性研究对象进行评价。在研究之前，研究对象会给出一个血清中和抗体滴度，该滴度在感染和施用免疫粘附素的情况下波动。

本发明的免疫粘附素可以配制成含有不同量免疫粘附素的缓冲盐溶液，并以不同的时间间隔施用于患者。可以采用单一上升剂量和多个上升剂量研究来评价免疫粘附素的安全性。在各种情况下，每个剂量水平上对一个或多个研究对象加以评价，一些接受免疫粘附素，一个或多个可选性地接受安慰剂。在两项研究中，都对多个剂量水平进行评价。剂量水平可以有所变动，但是典型地说在纳克至克的范围内。

剂量可以在几秒、几分钟、几小时、几周和几个月的时间内施用，评价其毒性和/或药效。

可以通过观察鼻黏膜刺激或发生炎症的现象来评价安全性和毒性。还可以根据常规方法采用血液安全性评价，使用诸如ELISA之类的灵敏分析法测定各血液组分，包括血液循环中的免疫粘附素和鼻病毒的量。同样根据常规方法进行鼻灌洗试验。

可以采用常规的统计学分析和计算方法，确定对一个患者和/或患者-受试者群体长期以来预测到的作用和毒性。

本领域人员所熟知的激发研究可用于说明病毒激发后能够对临床感冒产生治疗保护作用和/或减轻感冒症状，使用商业来源的起始材料，如病毒、细胞和动物。参见Gwaltney，et al.，Prog.Med.Virol.39：256-263，1992。

下面的实施例说明本项公开发明的各方面和实施方案。这些实施例并不限制要求保护的发明范围。

实施例

1.构建ICAM-1免疫粘附素表达序列盒

通过PCR克隆法制备编码ICAM-1细胞外结构域D1至D5的序列盒。具体地说，从质粒pCDIC1-5D/IgA中扩增包含ICAM-1中5个细胞外Ig样结构域的片段(Martin，et al.，J.Virol.67：3561-8，1993)，扩增中使用下列寡核苷酸引物：

5′-

TCTGTTCCCAGGAACTAGTTTGGCACAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTC-3′(SEQ ID NO：6)；

5′-CATACCGGGGACTAGTCACATTCACGGTCACCTCGCGG-3′(SEQ ID NO：7)

两个引物的设计能够往PCR片段的5′和3′端引入Spe I位点(带有下划线的核苷酸)。使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行PCR，降低错误的积累。将PCR片段克隆到载体PCRScript(Stratagene)中，测序后和IgA2序列盒(羧基末端具有或不具有SEKDEL[SEQ ID NO：4])相融合。

建立能够在植物中表达人J链、分泌组分以及人IgA2重链的构建体。制备重链表达序列盒载体，命名为pSSpHuA2(参见图1)。该载体包含编码菜豆豆球蛋白信号肽的序列[Baumlein et al.，Nucleic Acids Res.14(6)，2707-2720，1986]。菜豆豆球蛋白的序列的GenBank登记号为X03677，菜豆豆球蛋白信号肽序列为SEQ ID NO：10(还参见图8)，和具有SpeI和SacI位点的IgA2m(2)恒定区，和驱动信号肽和人IgA2m(2)重链表达的SupperMas启动子。

将扩增的、编码人ICAM-1开始5个结构域和人IgAm(2)中Fc区的DNA融合在植物表达序列盒中，制备如图2A所示的嵌合ICAM-1分子表达构建体。通过将编码ICAM-1中5个细胞外结构域的片段克隆到载体pSSPHuA2中，产生pSSPICAMHuA2来实现构建体的构建。便于操作的限制性位点(5′SpeI和3′SpeI)使得扩增片段能够插入到信号肽和Cα1结构域之间。在产生的构建体中，嵌合ICAM-1分子的表达位于组成型启动子“superMAS”(Ni et al.，1995)和nos 3′末端区的控制下。

产生的嵌合ICAM-1分子构建体不包含可变区。mRNA翻译时，信号肽的切割可能将ICAM-1重链融合体储存到植物细胞的内质网(ER)中。编码ER滞留信号(RSEKDEL，SEQ IDNO：5)加到重链的3′端，以提高构建体的表达水平。氨基酸序列SEKDEL(SEQ ID NO：4)是蛋白质在植物细胞内质网中滞留的共有信号序列。有研究表明该序列能够增强抗体在植物中的积累水平(Schouten et al.，Plant Molecular Biology30：781-793，1996)。嵌合ICAM-1分子构建体的氨基酸序列如图2B所示。在用于基因枪转化之前验证构建体的DNA序列和翻译框架。

最近有研究表明J链和IgA的组装发生在高尔基体中(Yoo et al.，J.Biol.Chem.274：33771-33777，1999)，因此还构建了不含有SEKDEL(SEQID NO：4)的重链构建体。将ICAM-1片段克隆到包含不具有SEKDEL(SEQ ID NO：4)之IgA2m(2)恒定区的表达序列盒中。

2.在植物中表达组装的ICAM-1免疫粘附素

A.免疫粘附素表达载体

质粒pSSPICAMHuA2[SEQ ID NO：9和图8A]长度为6313bp。核苷酸49～1165为超启动子(Ni et al.，Plant Journal7：661～676，1995)。核苷酸1166～3662包含编码由接头序列相杂合的人ICAM-1/人 IgA2m(2)恒定区的序列。还包括增强翻译起始的共有Kozak序列(Kozak，Cell44(2)：283-92，1986)(nt 1186-1192)和来源于V.faba豆球蛋白的信号肽[nt 1189-1257； et al.，Nucleic Acids Reg.14(6)：2707-2720(1986)]。人 IgA2m(2)恒定区的序列(nt 3663-3633)以前已有报道(Chintalacharuvu，et al.，J.Imm.152：5299-5304，1994)。编码内质网滞留信号SEKDEL[SEQ ID NO：4]的序列加在重链的末端(nt 3634-3654)。核苷酸3663～3933来源于胭脂碱合酶的3＇端(翻译终止和多聚腺苷酸化信号；Depicker et al.，1982)。质粒的其他序列来源于质粒pSP72(Promega)。

质粒pSHuJ(图8C)长度为4283bp。核苷酸14～1136为超启动子(Ni et al.，Plant Journal 7：661～676，1995)。核苷酸1137-1648如图8[SEQID NO：11]所示，包含编码包括天然信号肽之人J链的序列(Max andKorsmeyer，J Imm.152：5299-5304，1985)和接头序列。还包括增强翻译起始的共有Kozak序列(Kozak，Cell 44(2)：283-92，1986)(nt1162-1168)。核苷酸1649-1902来源于胭脂碱合酶的3′端(翻译终止和多聚腺苷酸化信号；Depicker et al.，J Mol Appl Genet 1(6)：561-73，1982)。质粒的其他序列来源于质粒pSP72(Promega)。

质粒pSHuSC(图8D)长度为5650bp。核苷酸13～1136为超启动子(Ni et al.，Plant Journal 7：661～676，1995)。核苷酸1137～2981包含编码包括天然信号肽之人分泌组分的序列(Krajci，et al.，Biochem.andBiophys.Res.Comm 158：783，1994)和接头序列[SEQ ID NO：12]。还包括增强翻译起始的共有Kozak序列(Kozak，Cell 44(2)：283-92，1986)(nt1151～1157)。核苷酸2982-3236来源于胭脂碱合酶的3′端，提供翻译终止和多聚腺苷酸化信号，在Depicker et al.，J Mol Appl Genet 1(6)：561-73，(1982)中有所描述。质粒的其他序列来源于质粒pSP72(Promega)。

质粒pBMSP-1[SEQ ID NO：13和图8E]来源于pGPTV-KAN。Becker等在Plant Molecular Biology，20，1195-1197，(1992)中描述了左侧T-DNA边界附近具有选择标记的新的植物二元载体和左侧及右侧边界之外的序列。pBMSP-1的核苷酸18～187为右侧T-DNA边界，核苷酸1811～775为superMAS启动子。核苷酸2393～2663为NOS启动子(Depicker et al.，J Mol Appl Genet 1(6)：561-73，1982)，核苷酸2698-3492编码NPTII基因(赋予卡那霉素抗性)，核苷酸3511～3733是来源于A.tumefaciens基因7的多聚腺苷酸化信号(Gielen et al.，Embo J 3：835-46，1984)。核苷酸1768～976编码NPTII基因，核苷酸4317～4464为左侧T-DNA边界。

质粒pBMSP-1spJSC[SEQ ID NO：14和图8F]是pBMSP的衍生物，包含位于超启动子控制下的J和SC。在该质粒中，核苷酸1～149为左侧T-DNA边界，核苷酸955～773为来源于A.tumefaciens基因的多聚腺苷酸化信号，核苷酸1768～976编码NPTII基因(赋予卡那霉素抗性)，核苷酸2393～2663为NOS启动子。核苷酸2635～3768为superMAS启动子。核苷酸3774～5595编码人分泌组分，核苷酸5603～5857为NOS多聚腺苷酸化信号。核苷酸5880～6991为superMAS启动子，核苷酸7007～7490编码人连接链，核苷酸7504～7757为NOS多聚腺苷酸化信号。核苷酸7886～8057为右侧T-DNA边界。

编码赋予潮霉素抗性的酶质粒pGPTV-HPT可以从Max-Planck-Institut für züchtungsforschung(德国)购买。Becker等在Plant MolecularBiology，20，1195-1197，(1992)中对其进行了介绍。

B.植物转化和ICAM-1免疫粘附素在植物中的表达

上述的表达序列盒用于在植物中生成组装的免疫粘附素。质粒pSSPICAMHuA2、pSHuJ、pSHuSC和pBMSP-1通过基因枪同时转到烟草叶组织中(N.tabacum cultivar Xanthi)，转化的微愈伤组织在存在有卡那霉素的营养琼脂上加以选择。将指示为独立转化事件的个体微愈伤组织和亲本组织相分离，并在具有卡那霉素的营养琼脂上繁殖。

筛选有转基因表达的愈伤组织。免疫印迹分析和PCR结果表明愈伤组织#7132表达嵌合ICAM-1免疫粘附素和J链(数据未列出)。该愈伤组织不具有编码SC的DNA。愈伤组织在培养基中生长良好，在积累了足够物质时，对#7132再次用基因枪转化，这次转化上述的两个质粒；即包含J链和SC表达序列盒的pBMSP-1SpJSC以及包含赋予潮霉素抗性的、hpt I基因表达序列盒的pGPTV-HPT。选择并在营养琼脂上生长一段时间后，通过免疫印迹分析鉴定到了几个独立的转化子，这些转化子表达多种组装状态的嵌合ICAM-1分子、J链和SC。

图3说明了嵌合ICAM-1分子在独立转化的烟草愈伤组织中的表达。图3A所示为含有不同转化的烟草愈伤组织(C)和水提物(Aq)的样品在非还原性SD-聚丙烯酰胺凝胶上电泳、并探测人ICAM存在与否的免疫印迹图。免疫粘附素的可溶性使我们能够容易地进行提取，我们将信号的相似性认为是表达的重复性。3B所示为含有从愈伤组织Rhi107-11中部分纯化的免疫粘附素各级分的非还原性SD-聚丙烯酰胺凝胶的免疫印迹图。用抗人ICAM(～ICAM)、人IgA重链(～α)、人分泌组分(～SC)和人J链(～J)的抗体探测，进行印迹分析。为了使用碱性磷酸酶来标记免疫阳性带，使用二级酶联抗体是必要的。在不表达的愈伤组织提取物中检测不到免疫阳性带(未列出)，证明了免疫印迹的特异性。没有糖基化的二聚化嵌合ICAM-1的预期MW是173，318；这种形式的分子可能存在于迁移至250kD标记物下方的带中，因为它对ICAM-1和重链呈现免疫阳性。该带(预期总MW为～248kD)还对SC呈现免疫阳性，但是不对J链呈现免疫阳性，该结果有些出乎意料，因为sIgA组装的规范途径涉及2类细胞类型(哺乳动物中)，在组装SC之前需要J链的存在。包含J链信号分子和SC信号分子的四聚化免疫粘附素在糖基化之前预期MW为～440kD。显而易见，存在有分子量超过200kD、用四个探针都呈现为免疫阳性的几个物种。

用包被有DNA的微粒进行基因枪转化，生成植物转化子和动物转化子(Sanford et al.，Meth.Enz.217：483-509，1993作有评论)。利用Bio-Rad生产的PDS-1000/He颗粒加速器，使用编码本发明免疫粘附素的载体进行颗粒介导的转化。PDS-1000/He颗粒加速器系统使用Helium压力将包被有DNA的微粒朝靶细胞方向加速。该技术的物理特征使之有多方面用途，易于使用。我们已经成功地使用分泌型IgA的四个组分同时转化了烟草。

基本的基因枪转化程序如下：将60mg颗粒混在1mL无水乙醇中制备储备性微粒悬液。振荡该悬液，取出25～50μL加至灭菌的小离心管中。离心30秒后，弃除乙醇，沉淀重悬于1mL无菌水中，离心5分钟。将水弃除，沉淀重悬于包含质粒DNA混合物的DNA溶液中，这些质粒DNA通常，但不总是等摩尔量的。每次制备加入DNA的量在0.5ng和1μg之间变动。依次加入：220μL无菌水，250μL 2.5mol/L CaCl₂，50μL 0.1mol/L精胺。将混合物振荡至少10min，然后离心5min。弃除上清液，DNA/微粒沉淀在600μL无水乙醇中，混匀并离心1min。弃除乙醇，沉淀重悬于36μL乙醇中。10μL悬液尽量均衡地加到由Kapton(DuPont)制成的微载体片中心上，使乙醇挥发。将微载体片和破裂(rupture)皿置于一个单元中。包含表面消毒的烟草叶子的培养皿置于中止屏的下方。药室定为28～29mmHg，对靶轰击一次。对烟草的方案已经作了优化，可以通过改变参数，如He压力、包被颗粒的量、微载体和中止屏之间的距离以及从中止屏到组织的飞行距离，对其他植物的方案加以优化。

还将嵌合ICAM-1分子的表达序列盒组装在双元载体中，用于农杆菌介导的转化。将设计用于表达人J链和人分泌组分，以及卡那霉素抗性的农杆菌双元载体导入A.tumefaciens菌株LBA4404中。还使用另一个双元载体中的嵌合ICAM/IgA分子转化LBA4404。根据标准方案，将两个菌株的过夜培养物同时和烟草叶片“共培养”(Horschet al.，Science 227：1229-1231，1985)。

使用标准方案，再生基因枪转化和农杆菌转化的烟草叶盘(Horschet al.，Science 227：1229-1231，1985)。由于从基因枪轰击的组织中再生的转化植物在成熟过程中经常遭受基因沉默，因此通过农杆菌街道的转化来制备转基因烟草植物，从而获得更高的表达产量和成熟植物。

3.纯化组装的ICAM-1免疫粘附素

纯化根据实施例3表达的免疫粘附素。大量培养愈伤组织，以便促进提取进程。部分纯化计划提供了存在于各种缓冲条件中的稳定浓缩物，随后利用层析技术进一步纯化免疫粘附素(参见图3)。在包含柠檬酸钠(0.6mol/L，pH 7.4)和脲(终浓度2mol/L)的缓冲液中洗过的愈伤组织用榨汁机中提取，榨汁机能够将两个不锈钢齿轮之间的组织榨碎。汁液(～1mL/g鲜重)通过干酪包布进行粗过滤后，用0.67体积的饱和硫酸胺沉淀。离心后收集绿色沉淀物，并用Dounce匀浆器用小体积的50mmol/L柠檬酸钠(pH 6.6)彻底提取。进一步离心后，收集褐色的澄清上清液，在脱盐模式的缓冲液交换过程中通过Sephadex G-100柱加以部分纯化。脱盐/缓冲液交换步骤使得在所需缓冲液中制备部分纯化的浓缩物(-0.2mL/g鲜重愈伤组织)；用0.25×磷酸盐缓冲液洗脱G-100柱。洗脱物在2～8℃至少能够稳定10天。

4.ICAM-1免疫粘附素抑制人鼻病毒感染性

根据实施例3制备的免疫粘附素能够抑制人鼻病毒对细胞的感染性。根据实施例3制备的愈伤组织提取物成功地竞争抗ICAM-1单克隆抗体和可溶性ICAM-1的结合。图4所示为从酶联免疫分析(ELISA)获得的数据。对于该分析来说，用0.25μg可溶性ICAM-1/mL包被96-孔板。方框表示sICAM增加的浓度，圆圈表示用于和吸附的ICAM竞争与恒定量小鼠(抗人ICAM)抗体的结合的愈伤组织提取物(从G-100获得的无菌过滤级分)增加量。将孔洗涤后，使用偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠抗体检测吸附的小鼠抗体。以邻苯二胺为底物，在490nm处测定吸附的酶活性。用S型曲线OD490＝y＝y0+a/[1+e^-{(x-x0)/b}]来描述所得数据(方框，sICAM；圆圈，提取物)，其中a＝y max，y0＝y min，b＝曲线中快速变化部分的斜率，x0＝50％应答水平上的x值。相对于可溶性ICAM-1而言，这里检验的免疫粘附素提取物含量相当于～250μgICAM/mL；由于ICAM-1-重链融合体的二聚化和四聚化装配体的预期亲和力效应，这是一个高估值。因此，这种ELISA分析说明了免疫粘附素和可溶性ICAM-1竞争与抗-ICAM mAb的结合。

通过比较产生50％应答所需的各级分的正常量，竞争性ELISA能够对回收的活性进行定量评价。纯化后，免疫粘附素制剂的滴度可以表示为相应的稀释度，或1毫克免疫粘附素产生50％应答所需稀释成的毫升数。这种ELISA将促进免疫粘附素纯化方法的建立。

细胞病变分析(CPE)说明部分纯化的免疫粘附素抑制人鼻病毒对人细胞的感染性的特定能力(图5)。将鼻病毒亚型HRV-39和人ICAM-1，ICAM/IgA融合体(Tim Springer博士惠赠)，或来源于表达我们的ICAM-1/SigA免疫粘附素或另一个不同抗体的愈伤组织的提取物预孵育，然后33℃下将各种混合物和HeLa S3细胞铺板。3天后，对存活的细胞加以固定，并用结晶紫的甲醇溶液进行染色；570nm处的光密度表示细胞存活比例。

来源于包含免疫粘附素的Rhi107-11的两个提取物抑制病毒感染并杀伤HeLa S3细胞的能力(图5，右侧向上和上侧向下的三角形)。因为提取物仅是部分纯化的，我们还分析了以类似方法制备的、包含抗一种化疗试剂Doxorubicin的人IgA2m(2)的提取物。这种包含具有不相干结合特异性的类似免疫球蛋白的提取物不能够抑制鼻病毒的感染性，说明ICAM-1-重链融合体的表达赋予抑制特异性。如所期望的，CPE分析说明了可溶性ICAM-1和IC1-5/IgA(Martin，et al.，1993)抑制病毒感染性(图5B)的不同能力。图5B中的插图所示为可溶性ICAM(1.35μg/mL)或IC1-5D/IgA(0.12μg/mL；小11.3倍)的IC₅₀范围的比例尺放大图。

5.生成并纯化用于临床和毒理学研究的免疫粘附素

通过获得转基因烟草植物，生成计划的临床和毒理学研究需要的足量免疫粘附素。通过农杆菌介导的转化产生表达免疫粘附素(不具有ER滞留信号)的转基因植物。由于新生的SIgA在整个高尔基体，具体地包括反向高尔基体中加工，脉冲-跟踪实验表明SC在这里和dIgA共价相连接，因此ER滞留信号的缺失期望能够加速组装(Chintalacharuvu &Morrison，Immunotechnology 4：165-174，1999)。因为农杆菌介导的转化更有可能产生具有恒定水平转基因表达的植物，这些植物的子代将用于生成临床级别的免疫粘附素。

为了使表达水平达到最高，产生真正可繁殖的株系，需要产生纯合的植物。在收集种子之前，产量最高的植物(T0代)在温室里能够自受精。1/4的T1植物应该是纯合的。将这些植物种植在温室里，从多株植物获得的种子样本分别在含有卡那霉素的培养基中发芽。从纯合阳性植物获得的所有子代(T2)都应该是绿色的。杂合植物的一些子代应该是白色或淡黄色的。通过和野生型植物回交，对子代提取物进行免疫印迹分析来验证纯合性。

在生产过程中收获和加工可以紧密配合，特别是一次种植进行多次收获，即一次收获割到土壤水平的植物接着培养，以便下一次收获。在确立免疫粘附素的生产规模时，需要确定免疫粘附素成品的需要量，说明表达水平(mg存在的免疫粘附素/kg鲜重烟草)，了解植物的生长速率和期望的平均植物重量，纯化方案的总产量(定为20％)。将总需要定在3g免疫粘附素成品需要进行4次收获，每次收获产量为1g免疫粘附素成品。

给定了这些目标和参数，就可以确定所需的植物数以及植物种植所需的空间。图6所示为对生产1克免疫粘附素成品所需的必需物进行评价的图。在该图中，列出了产率为20％、达到预期表达水平的条件下所需的植物数和植物重量。在不同免疫粘附素表达水平(mg/kg鲜重)和总回收率(定在20％)条件下，为了获得特定的生产目标(1g/收获)，可以在一个具有合理可能性的窗口(点所围起的面积)中确定各植物重量以及植物总数。随着生长期和再生长期数目的增加，所需的植物数减少。预期的生物量的产生、起作用时间和生长条件影响收获时间和收获间时间。可以通过错开种植和收获时间将这些生长期和纯化计划相协调。例如，从具有100mg免疫粘附素/kg鲜重之合理表达水平的植物中获得1g免疫粘附素成品，以200g/植株(发芽后80天)比例收获时需要250株植物。以这种规模来说，这些植物需要约10m²的生长空间，150天中收获两次。

一次加工50+kg生物物质需要多项中等大规模操作，在食品加工工业中的操作有这些操作的对应部分。它们包括大块材料的处理、形状的减小、榨汁和过滤。使用Vincent Press和Durco过滤系统对大批材料进行有效加工。榨汁步骤中使用被证实且简单的柠檬酸钠和脲的缓冲液。这些组分对提取物起到缓冲作用，有助于防止酚类物质的氧化，防止它们和蛋白质相缔合(Gegenheimer，Methods in Enzymology 182：174-193，1990；Loomis，Methods in Enzymology，31：528-544，1974；Van Sumere，etal.，植物蛋白质的化学和生物化学，1975)，保证随后的酸沉淀过程中免疫粘附素的可溶性。

通过切向超滤过滤酸不溶性的脂类和蛋白质(总量的～90％)，浓缩免疫粘附素，弃除小的蛋白质，尤其是酚类物质。透析能够促进小分子的去除，促进短期保存制剂中缓冲液的交换，促进随后的层析。SP-Sepharose(pH 5.0或pH 5.0之下的条件下结合)或Q-Sepharose(pH 5.0或pH 5.0之上的条件下结合)都可用作过滤免疫粘附素的离子交换剂。它们易于获得、可称量、强度大并具有高容量。具体地说，可以用延伸管柱式的凝胶来降低前面过滤步骤的严格性。首先采用比阴离子交换层析更为可选的阳离子交换层析。免疫粘附素从蛋白质潜在性存在的多个物种中纯化到至少95％蛋白质以ICAM-1/IgA、ICAM-1/dIgA或ICAM-1/SigA形式存在的程度，二价和四价ICAM-1结构域的存在对于强的抗病毒活性是关键的。验证纯化的免疫粘附素对内毒素、诸如烟碱之类的生物碱以及生物负荷的可接受水平。另外，监测效应水平(ELISA和CPE分析测定的)、蛋白质浓度、pH和表象。然后，测定免疫粘附素临床份额的稳定性，保证患者接受充分强的免疫粘附素。即使是部分纯化的提取物在冰箱中也能够保持10天的稳定性。还验证了在-20℃、2～8℃和37℃保存3至6个月的时间时临床制剂中免疫粘附素的滴度和效力(磷酸盐缓冲液)。

6.免疫粘附素具有植物特异性糖基化

对生成的免疫粘附素进行分析，测定糖基化的模式。Cabanes-Macheteau et al.，Glycobiology 9(4)：365-372(1999)说明了植物表达的抗体构建体上几个植物中典型糖基的存在。使用他们的方法来说明根据实施例1、2和3生成的免疫粘附素具有植物特异性糖基化模式。我们期望这种多样性也是免疫粘附素变异性的原因。由于有研究表明粗提物具有体外抗病毒活性(数据未列出)，糖基化并不影响这种效力。N-连接糖基化(图2表明仅在嵌合ICAM-1就有15个潜在位点)可能和免疫印迹分析中条带的多样性相关。在印迹分析之前，用N-糖苷酶A对免疫粘附素进行消化，结果表明条带模式变为成较少、离散的条带。通过这种方式，使用还原性和非还原性聚丙烯酰胺凝胶对糖基化形式进行分析。另外，通过CPE分析和竞争性ELISA验证消化级分和模拟消化级分，说明了N-连接的糖基化对体外效力和滴度的影响。

7.ICAM-1免疫粘附素灭活人鼻病毒

分析根据实施例1、2和3制备的免疫粘附素通过和病毒相结合，阻断病毒侵入和诱导空病毒衣壳的形成而灭活HRV的能力。为了测定免疫粘附素和HRV的结合，将免疫粘附素和[³H]亮氨酸标记的HRV-39孵育30min，然后加入到HeLa细胞中孵育1hr。洗板后，利用Triton X-100分离细胞和结合态病毒，在液闪仪中测定[³H]。

将和免疫粘附孵育所致的HRV-39失活和sICAM-1所致的HRV失活相比较。和单体sICAM-1孵育并不能使HRV-39显著失活(<0.5log10感染性的降低)，而和IC1-5D/IgA孵育降低感染性约1.0log10(Arruda，etal.，Antimicrob.Agents Chemother.36：1186-1191，1992；Crump，et al.，Antimicrob.Agents Chemother.38：1425-7，1994)。为了验证免疫粘附素HRV-39的能力，将106个HRV-39的50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)在培养基中于33℃下在摇床上孵育1hr，该培养基包含sICAM-1或免疫粘附素浓度为各分子对病毒的IC₅₀的10倍；或在单纯培养基中于33℃在摇床上孵育1hr。将各病毒-免疫粘附素或病毒-培养基混合物稀释成10倍梯度稀释物，于96-孔板中在HeLa细胞上测定滴度。

通过将HeLa细胞和MOI为0.3的HRV-39在存在或不存在免疫粘附素的条件下孵育，验证免疫粘附素对HRV吸附宿主细胞的影响。吸收在4℃下进行1小时，洗细胞，换成加有或没有免疫粘附素的培养基。细胞于33℃孵育10小时(使进行一轮复制)，通过将细胞冻/融来收获病毒。在HeLa细胞上测定病毒滴度。

在诱导HRV构象改变、导致空而无感染性的病毒颗粒的形成方面，ICAM-IgA(IC1-5D/IgA)比sICAM-1更为有效(Martin，et al.J.Virol.67：3561-8，1993)。为了测定根据实施例1、2和3生产的免疫粘附素诱导HRV构象改变、导致病毒RNA释放的能力，将纯化的免疫粘附素和[³H]亮氨酸标记的HRV-39孵育30min，然后将病毒加到5％至30％蔗糖梯度上。40,000rpm离心90min后，收集级分，测定[³H]，分析级分的感染性。[在蔗糖梯度上完整HRV沉降在149S处，而缺失RNA的空衣壳沉降在75S处(Martin，et al.，J.Virol.67：3561-8，1993)]。由于其效价增加，我们希望ICAM/SigA免疫粘附素在诱导空而无感染性的颗粒方面比ICAM-IgA更为有效。

使用CPE分析法测定纯化免疫粘附素对主要和次要(不使用ICAM-1作为受体)HRV血清型的抑制作用。ICAM-1抑制HRV感染的能力随病毒分离物的不同而不同。研究表明(Crump，et al.，Antimicrob.AgentsChemother.38：1425-7，1994)使用HeLa细胞验证sICAM-1对一组HRV主要受体亚型的影响时，sICAM-1的EC₅₀从0.6μg/mL变动至>32μg/mL。我们的试验组包括9个主要血清型(HRV-3、-13、-14、-16、-23、-39、-68、-73和-80)和次要受体血清型HRV-1A1。

8.临床研究表明了ICAM-1免疫粘附素降低人体内感染性的能力：剂量上升耐受研究

在两个随机对照试验中对本发明的免疫粘附素进行验证，测定经鼻施用免疫粘附素对实验性鼻病毒感冒中感染、IL-8应答和疾病的影响。这两项研究评价了鼻病毒感染之前或之后受试者服用的免疫粘附素。这里所采用的临床方案根据以前用于评价重组可溶性ICAM-1分子对鼻病毒感染之作用的方案(Turner，et al.，JAMA 281：1797-804，1999)。

A.受试者

从Charlottesville，Virginia大学的大学社区中招集受试者。要求受试者健康状况良好、不抽烟、18至60岁之间。如果受试者在过去2周内有过敏性疾病或非过敏性鼻炎、异常鼻解剖特征或黏膜、呼吸道感染的病史，则予以排除。怀孕或哺乳的妇女，或不采取医学上认可的计划生育的妇女也排除在外。在实验性病毒激发研究(I/II期，参见下文)中，受试者需要对研究病毒敏感，表现为试验开始后90天内测定到的对病毒的血清中和抗体滴度为1∶4或更低。

B.研究药疗法

本发明的免疫粘附素配制成包含2.6mg/mL免疫粘附素的磷酸盐缓冲液(PBS)形式的喷雾液。安慰剂由PBS组成，外观上和活性制剂相同。使用配有计量性鼻喷雾泵的药瓶施用溶液。每次喷射时泵出70μL包含183μg免疫粘附素的溶液。每个鼻孔喷射两下，每天6次来使用药物，一天的总剂量为4.4mg。这种剂量和用于tramacamra研究感染中的可溶性ICAM-1的剂量(Turner，et al.，JAMA 281：1797-804，1999)相同。1摩尔免疫粘附素的质量是1摩尔sICAM-1的两倍。但是，考虑到sICAM-1和ICAM/IgA融合体之间体外活性的不同，免疫粘附素是同摩尔数的sICAM-1有效许多倍。因此，该量是对需要量的保守计算值。使用该量，除非剂量上升研究表明该剂量下有问题。

C.研究设计

使用单一上升剂量研究和多上升剂量研究来评价免疫粘附素的安全性。在各种情况下，在各剂量水平上来评价3个受试者，其中2个受试者接受免疫粘附素，1个受试者接受安慰剂。在单一上升剂量研究中，对4个剂量水平进行了评价。最低的个体剂量是用于激发研究中的预期剂量的一半，最高个体剂量是预期激发研究剂量的2倍。剂量水平如下：每个鼻孔喷一次(共366μg)、每个鼻孔喷两次(共732μg)、每个鼻孔喷三次(共1098μg)、每个鼻孔喷四次(共1464μg)。

多上升剂量研究中使用相同的剂量水平。受试者每3个小时接受用药，持续5天。在各个剂量水平上对两项研究中的受试者进行评价，错开下一水平的起始点，直至在上一水平上明显没有急性毒性。所有受试者接受首次剂量21天后再接受一个单一剂量，然后在第6周继续接受一个单一剂量(测定抗免疫粘附素的血清抗体)。

由12个受试者组成的单独试验组服用一个剂量，每个鼻孔喷两次(共732μg)，在1、2、4、8和16小时的时间点上进行鼻灌洗(一个时间点两个受试者)。在Panorama Research通过免疫粘附素的ELISA分析法对灌洗液进行分析，计算其体内半衰期。用在剂量上升研究和半衰期测定研究(共28个受试者)中的免疫粘附素总量约为270mg。

D.安全性评价

除了记录常规的副作用外，还通过三种方式评价了免疫粘附素的安全性。第一种方式是：在首次剂量之前、末次计量之后研究者进行了鼻黏膜观察，具体是寻找刺激或炎症现象。记录任何可见的变化。第二种方式是：对处理前和研究第1、4和8天(和多上升计量研究的第21天)末次剂量之后收集的样品进行标准的血液安全性评价。第三种方式是：保存、冷冻血清样品，用语测定免疫粘附素是否能够透过鼻黏膜进入血液中。通过两种方式实现这一目的。其一，通过ELISA测定血清样品中免疫粘附素的存在。在这种分析中，吸附在微孔板上的抗-人IgA抗体捕获血清中的免疫粘附素，通过抗-ICAM抗体检测捕获的免疫粘附素。使用添加有已知浓度免疫粘附素的正常人血清样品测定这种分析的灵敏性。或者，将抗-ICAM抗体吸附在板上来捕获血清中的免疫粘附素，通过抗-IgA测定捕获的免疫粘附素。其二，通过使用吸附在微孔板上的免疫粘附素的ELISA方法，分析针对免疫粘附素免疫应答的存在。血清中的抗-免疫粘附素抗体与免疫粘附素结合，使用抗-人IgG或抗-人IgM加以检测。将处理前和处理后的血清样品相比较，将滴度的变化认为是服用免疫粘附素的表现。如果结果显示为抗-免疫粘附素抗体阳性，则进行额外的分析来区分抗-ICAM-1和抗-IgA活性。

筛选对免疫粘附素表现出过敏反应的患者。(在以前的研究中，局部用于鼻的可溶性ICAM或局部应用于口腔的Plantibody都没有副反应)。使用灵敏的两步ELISA(R&D System)检验表现出鼻过敏症状的个体鼻灌洗液中的抗-免疫粘附素特异性IgE抗体。

E.统计学分析

这些研究的样本大小是根据以前利用鼻病毒激发模型所作的研究而定的。用于保护性研究的样本大小应该足以能检测临床感冒发生率从安慰剂组中75％至主动治疗组中25％的降低，1-侧检验值为α＝.05和1-β＝.80。另外，SD为5.8个单位时，样本大小应该足以能检测总症状评分为5个单位的变化。

9.说明免疫粘附素在人体内减低感染性的能力的临床研究：激发研究(challenge studies)

激发研究用于说明病毒激发后，使用本发明的免疫粘附素治疗能够保护肌体免于临床感冒或减轻感冒症状。

A.激发性(challenge)病毒

用作本研究的激发性病毒是鼻病毒39(HRV-39)。39型鼻病毒是需要ICAM-1来吸附细胞的一种主要的鼻病毒。根据共有指南对激发性病毒库进行安全性检验(Gwaltney，et al.，Prog.Med.Virol.39：256-263，1992)。所有的受试者都接种约200正中组织培养感染剂量(TCID₅₀)。受试者仰卧时，将病毒以液滴形式接种，每个鼻孔接种两次250μL，中间间隔约15分钟。

表4

注：在两项研究的第1～5天，在第0、3、6、9、12和15小时给药。

m＝早晨

e＝晚上

B.研究设计

进行两次随机的鼻病毒激发研究(参见表4)。在接种前和接种后的研究中对本发明中同样制剂的免疫粘附素进行评价。在两项研究中，每天施用6个剂量的药物，持续5天。在召集到各研究中时，受试者随机接受免疫粘附素或相应的安慰剂。研究是双盲的，在收集数据之前所有的临床试验人员、受试者和Panorama Research的职员都是盲目的。

在接种前研究中，病毒激发前4小时开始用药。免疫粘附素(或安慰剂)第二个剂量之后1个小时进行病毒激发，第一天的其余4次用药按计划进行。在该研究中，18个受试者接受主动治疗，18个受试者接受安慰剂。

在接种后研究中，病毒激发后24小时开始用药。选择这一时间点，是因为该时间点已经用在保护免受病毒激发的其他研究中，并且这时感冒症状明显存在(Harris & Gwaltney，Clin.Infect.Dis.23：1287-90，1996)。在研究第0天早晨、约研究第一天早晨的首次用药之前24小时进行本研究中的病毒激发。在该研究中，36个受试者接受主动治疗，18个受试者接受安慰剂。

从研究第0天(病毒激发那一天)至研究第6天将受试者分隔在单个宾馆房间中。这期间的每天中，早晨于首次用药之前进行症状评分，进行鼻灌洗来分离病毒，在每晚进行第二次症状评分。在研究第6天，不再将受试者隔开，但每晚继续记录症状分值，直至第14天。在研究第21天，受试者返回研究地点，最后一次采取血清样品，用于检测抗-免疫粘附素抗体。用在两项病毒激发研究(在共54个受试者上进行)中的免疫粘附素总量约为1200mg。

C.病毒分离

通过细胞培养物中的病毒分离物来检测病毒释放。通过往每个鼻孔中滴入5mL0.9％盐溶液来收集鼻灌洗样本。将该灌洗液排到塑料杯中，冰冷状态下1～2小时，直至用于病毒培养。通过吸附在琼脂糖支持物(Affi-Gel 10，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上的抗-ICAM-1进行处理，去除样本中的免疫粘附素。各加工样本中一部分保存于-80℃，另一部分接种到含HeLa细胞的两个管中，其中的HeLa细胞属于大量产生ICAM-1的HeLa细胞系(Arruda，et al.，J.Clin.Microb.34：1277-1279，1996)。通过典型细胞病变效应的产生来鉴定鼻病毒。认为任意激发后研究天数时具有阳性病毒培养物的受试者受到了感染。通过在包含HeLa细胞的微孔板中培养10倍梯度稀释物，测定-80℃保存样本的病毒滴度。

采用标准方法进行血清中和滴度分析，检测激发性病毒的抗体(Gwaltney，et al.，病毒Rickettsial和Chlamydial感染的诊断程序，p.579-614，American Public Health Association)。筛选过程中，于病毒激发之前(急性期)和21天后(康复期)收集用于抗体检验的血清样本。当将康复血清样品和急性血清样品相比较时，认为对激发性病毒的抗体滴度至少有4倍升高的受试者是受到了感染。

D.评价疾病严重性

如以前报道所述评价疾病严重性(Turner，et al.，JAMA 281：1797-804，1999)。在病毒激发之前记录症状分值(基线)，以约12小时的间隔每天记录两次，持续随后的6天。在研究第7天至第14天，各受试者在晚上记录自己的症状分值，每天一次。评价时，要求受试者在最后一次症状评价后的时间间隔里判断下列8个症状的最大严重性：流涕、鼻炎、鼻塞、喉咙痛、咳嗽、头痛、不适和发冷。各症状都有一个0至3的分值，对应于症状严重性报告的无、轻度、中度或严重。如果症状处于基线，则从报告的症状分值中减去基线症状分值。每天的两次评分中较高的值作为各症状的日常症状值。8个症状的日常症状值相加生成总的日常症状值。病毒激发之后的前5天(研究第1～5天)的总日常症状值相加，在研究第5天的晚上，问所有的受试者：“你觉着感冒了吗？”。总症状分值至少为6、至少患有3天鼻炎或主观上认为患有感冒的受试者明确为患有临床感冒。

通过为所有的受试者提供预先称好的几包鼻纸，在第1～7天称量排出的鼻分泌物的重量。纸使用后保存在不透气的塑料袋中。每天早晨收集用过的纸和原包装中未用过的纸，并称重。

E.IL-8分析

最近研究表明宿主炎性应答，具体是白细胞介素-8(IL-8)可能在鼻病毒感染所导致的常见感冒的病理发生中发挥着一定的作用。如以前报道所述(Turner，et al.，JAMA 281：1797-804，1999)，使用商业来源的ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，Minn)测定鼻灌洗液中IL-8的浓度。

F.安全性评价

激发研究中的安全性评价和实施例8所述的剂量上升研究中的安全性评价相同。

G.统计学分析

进行的统计学分析和实施例8所述的剂量上升研究中的统计学分析类似。

技术人员可以容易地将主要说明ICAM-1免疫粘附素的上述实施例和讨论加以改变，实现和完成对其他类型或亚型病毒和细菌病原体有活性的其他类型免疫粘附素的使用。下面的实施例说明了利用炭疽毒素受体(ATR)作为受体蛋白的抗细菌性免疫粘附素实施方案。

10.构建ATR免疫粘附素表达序列盒

通过PCR克隆来制备编码人炭疽毒素受体(ATR)中细胞外结构域一部分的序列盒。具体地说，从质粒ATR(Bradley et al.，2001)或质粒TEM8(St Croix et al.，2000)中扩增编码氨基酸44～216(称作A型vonWillebrand因子结构域)的523bp片段，扩增使用下列寡核苷酸引物：

AATCAGG-3′

(SEQ ID NO：91)

5′-GAGCTCAAAATTGAGTGGATGATGCCTTGCAGAG-3′

(SEQ ID NO：92)

第二个引物(SEQ ID NO：92)的设计能够在ATR细胞外结构编码区的3′端引入Sac I位点(实下划线)。利用Pfu聚合酶(Stratagene)进行PCR以减小错误的积累。从质粒δATG-TOPO#4(Invitrogen克隆载体pCR4-TOPO中植物-优化的5′非翻译区和信号肽的PCR克隆)扩增大小为124bp、包括5′非翻译区和植物信号肽的第二个片段，扩增中使用下列寡核苷酸引物：

5′-GGTACCACTTCTCTCAATCCAACTTTC-3′

(SEQ ID NO：93)

5′-

AGCCAAACTAGTAGAGGTGAACAAAAGC-3′

(SEQ ID NO：94)

第一个引物(SEQ ID NO：93)的设计能够在PCR片段的5′端引入Kpn I位点(实下划线)。两个PCR片段具有20nt的互补序列(点下划线)。将两个PCR片段混合在一起，使用SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：92扩增得到一个大小为626bp的片段。将产生的PCR片段克隆到载体PCRScript(Stratagene)中，测序，并克隆到载体pMSP-coICAM中的Kpn I和Sac I位点之间，产生质粒pMSP-ATR-IgA2。这导致产生ATR细胞外结构域和人IgA2的恒定区的基因融合体。使用适于在烟草细胞中表达的密码子合成了这种人IgA2恒定区。ATR-IgA2融合体(免疫粘附素)的全长核苷酸序列和氨基酸序列如图10所示。在产生的构建体中，嵌合ATR-IgA2分子的表达位于组成型启动子“superMAS”(Ni et al.，1995)和ags3′终止子区的控制之下。

使用限制性酶Asc I移出pMSP-ATR-IgA2中的整个表达序列盒(启动子+ATR-IgA2+终止子)，并克隆到双元农杆菌Ti质粒pGPTV-kan-ocs中，产生质粒pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2。载体pGPTV-kan-ocs来源于pGPTV-kan(Becker et al..，1992)，通过以下方式改造获得。将pGPTV-kan中EcoR I和Hind III位点之间包括整个uid A基因的序列移出，替换为面向npt II基因的ocs3′终止子区(MacDonald et al.，1991)和Asc I及Sac I限制性位点。和右侧T-DNA边界相邻的该终止子目的是消除右侧边界外的植物DNA转录对转基因的转录干扰(Ingelbrecht et al.，1991)。

质粒pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2中T-DNA边界之间的序列如图11所示。左侧和右侧边界外的序列和报道的一样(Becker et al.，1992)。核苷酸18～187为右侧T-DNA边界。核苷酸311～630为ocs3′终止子区。核苷酸927～1976为superMAS启动子。核苷酸1990～2017为来源于Nicotiana sylvestris psaDb基因的5′非翻译区(Yamamoto et al.，1995)。起始密码子ATG周围序列(核苷酸2012～2026)能够和高表达植物基因中的序列相匹配(Sawant et al.，1999)。核苷酸2018～2086包含编码Viciafaba豆球蛋白信号肽之改进版本的序列( et al.，1986)。核苷酸2087-3631包含编码ATR中A型von Willebrand因子结构域的序列(Bradley et al.，2001)。核苷酸2606-3631包含编码人IgA2m(2)恒定区的序列(Chintalacharuvu et al.，1994)。核苷酸3794～4108来源于农杆碱合酶(ags)终止子。核苷酸4530～4800为NOS启动子(Depicker et al.，1982)。核苷酸4835～5626编码npt II基因(赋予卡那霉素抗性)。核苷酸5648～5870是来源于A.tumefactions基因7的多聚腺苷酸化信号(Gielenet al.，1984)。核苷酸6454～6602为左侧T-DNA边界。

还建立了在植物中表达人J链和分泌组分的构建体。该构建体pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC是在载体pGPTV-hpt-ocs的基础上构建的，而pGPTV-hpt-ocs来源于pGPTV-hpt，和上述的pGPTV-hpt-ocs来源相似。智力pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC中T-DNA边界之间的序列如图12所示。左侧和右侧边界外的序列和报道的一样(Becker et al.，1992)。核苷酸1～149为左侧T-DNA边界。核苷酸733-955(互补)为来源于Atumefactions基因7的多聚腺苷酸化信号(Gielen et al.，1984)。核苷酸980～2002(互补)为hpt基因(赋予潮霉素抗性)。核苷酸2049～2318为NOS启动子(Depicker et al.，1982)。核苷酸2898～3230为驱动人分泌组分基因，包括其天然信号肽(核苷酸3236～5056)表达的烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子，核苷酸5060～5445为豌豆rbcS-E9基因的多聚腺苷酸化信号(Mogen et al.，1992)。核苷酸5457～5788为驱动人连接(J)链，包括其天然信号肽(核苷酸5797～6273)表达的第二个拷贝CaMV 35 S启动子，核苷酸6281～6494为基因7的终止子。核苷酸6501～6819(completment)为ocs3′终止子区。核苷酸6944～7113为右侧T-DNA边界。

11.植物转化和植物中ATR免疫粘附素的表达

使用上述的表达序列盒，通过农杆菌介导的转化在植物中生成组装的免疫粘附素。将质粒pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC和pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2分别导入A.tumefaciens菌株LBA4404。根据标准方案(Horsch et al.，1985)，使用两个菌株的过夜培养物同时和烟草叶片“共培养”。在包含卡那霉素(100μg/mL)和潮霉素(25μg/mL)的再生培养基上选择转化植物组织。

从抗生素存在条件下再生的小植株中筛选能够表达转基因的植株。这一步通过在磷酸盐缓冲液(PBS)中制备叶组织提取物，将澄清的提取物点在硝酸纤维素纸上来完成。使用碱性磷酸酶偶联的、对人IgA、J链或分泌组分特异的抗血清对所“点”的点进行探测。初筛中检验为阳性的植株进行进一步筛选，涉及到Western印迹分析和PCR。ATT-IgA2免疫粘附素预测具有MW为59kDa的亚基。由于重链恒定区的天然二聚化，还预测形成～118kDa的二聚体。在植物细胞中J链的存在下，这些二聚体进一步二聚化，形成～252kDa的分子。在加上分泌组分，观察到了～320kDa的分子。

嵌合重链、J链和分泌组分构建体中信号肽的存在对于组装成多聚化的免疫粘附素是重要的。mRNA翻译时，预测信号肽的切割能够将各种蛋白质储存在植物细胞的内质网(ER)中。预测多聚化免疫粘附素的组装发生在ER和高尔基体中，组装好的分子从细胞分泌出来。

12.纯化组装的ATR免疫粘附素

基本上如上文实施例3中ICAM-1免疫粘附素的纯化所述，完成组装的ATR免疫粘附素的纯化。

13.ATR免疫粘附素抑制毒素作用于哺乳动物细胞

使用上述的表达序列盒生成组装的免疫粘附素，并从植物提取物中将其纯化。纯化的免疫粘附素用于保护CHO-K1细胞免受简单生物分析的杀伤。CHO-K1具有PA在细胞表面上能够结合的受体，但是它们对毒素不敏感。当使用PA和LF_N-DTA对细胞进行激发时，细胞被杀死，其中LF_N-DTA是一种有LF的N端255个氨基酸和白喉毒素的催化性A链相连组成的融合蛋白。重组毒素采用同样的LF-PA-受体相互作用，这种相互作用是天然LF和OF蛋白的结合及侵入所必需的。为了检验免疫粘附素的保护作用，在存在有恒定(有毒性)量PA和LF_N-DTA的条件下，将CHO-K1细胞和递增量的ATR-IgA2相混合，随后测定对蛋白质合成的作用。ATR-IgA2是毒素作用的有效抑制剂，比可溶性ATR在更低的摩尔浓度下抑制毒素作用。

14.ATR免疫粘附素在人类受试者体内抑制毒素作用

将纯化的免疫粘附素制备在药学上可接受的缓冲液中，施用于感染有炭疽菌的人类受试者。施用途径可以是吸入性气雾或注射剂。免疫粘附素保护感染末期本应死亡的受试者免受炭疽菌作用。

15.构建另一个ATR免疫粘附素表达序列盒

通过PCR克隆来制备编码人ATR中细胞外结构域一部分的序列盒(氨基酸24～320)。具体地说，从质粒ATR(Bradley et al.，2001)或质粒TEM8(St Croix et al.，2000)中扩增大小为878bp片段，扩增使用下列寡核苷酸引物：

GGGGGTCCAG-3′

(SEQ ID NO：95)

5′-GAGCTCCCGTCAGAACAGTGTGTGGTGGTG-3′

(SEQ ID NO：96)

第二个引物(SEQ ID NO：96)的设计能够在ATR细胞外结构编码区的3′端引入Sac I位点(实下划线)。利用Pfu聚合酶(Stratagene)进行PCR以减小错误的积累。从质粒δATG-TOPO#4扩增大小为121bp、包括5′非翻译区和植物信号肽的第二个片段，扩增中使用下列寡核苷酸引物：

5′-GGTACCACTTCTCTCAATCCAACTTTC-3′

(SEQ ID NO：93)

5′-

AGCCAAACTAGTAGAGGTGAACAAAAG

C-3′

(SEQ ID NO：97)

第一个引物(SEQ ID NO：93)的设计能够在PCR片段的5′端引入Kpn I位点(实下划线)。两个PCR片段具有20nt的互补序列(点下划线)。将两个PCR片段混合在一起，使用SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：96扩增得到一个大小为981bp的片段。以和部分ATR细胞外结构域相同的方式，将产生的PCR片段克隆到植物表达序列盒中，形成具有人IgA2的基因融合体。

另一种形式的构建中，使用同样的方法扩增氨基酸41～227。

上述的实施例不具有限制性，只代表本发明的各个方面和实施方案。所有引用的资料都是本发明所属发明领域技术水平的指示性说明。各资料的内容在此引入以作参考，就象各资料整篇引入作为参考一样，虽然所有的资料都不被认为是优先技术。

本领域的熟练技术人员可以认识到本发明适于实现目标，获得所提到的终产品和优势，以及其中固有的优势。优选实施方案所述的方法和组合物是示例性的，并不限制对本发明的范围。本领域的熟练技术人员可以作某些改动，用作其他用途。这些改动及用途也包括在权利要求书范围所限定的本发明的精神中。

在不背离本发明的范围和精神的条件下可以进行多种替换和改动，这一点对于本领域的熟练技术人员来说是显而易见的。因此，这些额外的实施方案也属于本发明和后面权利要求书的范围。

在缺少这里没有具体公开的一个因素或多个因素、一个限制或多个限制的条件下，可以适当地实施这里示例性描述的发明。所采用的术语和表述是说明性的，而不具有限制性。使用这些术语和表述并不排除所表明和描述特征的相当内容，或其部分。各种改动都有可能在本发明所要求保护的范围内。因此，人们应该明白：虽然优选实施方案具体公开了本发明，但是本领域的熟练技术人员还可以采取这里公开的可选性特征、改动和变通概念，这些改动和变通也在说明书和附加的权利要求书所限定的本发明范围内。

另外，本发明的特征或方面是根据Markush组或其他分组方式进行描述的，本领域的熟练技术人员能够意识到：本发明还根据Markush组或其他组的个体成员或成员亚组的方式进行描述，适当排除某些个体成员。

其他的实施方案也属于下面的权利要求范围。

Claims (57)

1.包含嵌合毒素受体蛋白的免疫粘附素，所述的毒素受体蛋白包含：

和免疫球蛋白重链的至少一部分相连的毒素受体蛋白；以及

和所述嵌合毒素受体蛋白相缔合的J链和分泌组分，

其中所述免疫粘附素在植物中表达和糖基化。

2.权利要求1的免疫粘附素，其中所述的免疫球蛋白重链选自IgA、IgA1、IgA2、IgM和嵌合免疫球蛋白重链。

3.权利要求1的免疫粘附素，其在单子叶植物中产生。

4.权利要求1的免疫粘附素，其在双子叶植物中产生。

5.权利要求1的免疫粘附素，其中所有的蛋白都是人类的。

6.包含嵌合的细菌毒素受体蛋白或病毒毒素受体蛋白的免疫粘附素，所述的毒素受体蛋白包含：和免疫球蛋白重链的至少一部分相连的毒素受体蛋白，其中所述的免疫粘附素在植物中表达和糖基化。

7.权利要求6的免疫粘附素，所述的免疫粘附素进一步包含和所述嵌合毒素受体蛋白相缔合的J链和分泌组分。

8.权利要求6的免疫粘附素，其中所述的免疫球蛋白重链选自IgA、IgA₁、IgA₂、IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgD、IgE、IgM和嵌合免疫球蛋白重链。

9.权利要求6的免疫粘附素，包含至少一种额外的嵌合毒素受体蛋白。

10.权利要求6的免疫粘附素，其中所述的毒素受体蛋白由所述毒素受体蛋白细胞外结构域的任意部分组成；所述的免疫球蛋白重链包含IgA2重链的至少一部分。

11.权利要求6的免疫粘附素，其中所有的蛋白都是人类的，或和感染和/或病理发生过程中的人宿主相关。

12.权利要求6的免疫粘附素，其在单子叶植物中表达。

13.权利要求6的免疫粘附素，其在双子叶植物中表达。

14.包含免疫粘附素和植物物质的组合物，其中所述的免疫粘附素在植物中表达和糖基化并且包含嵌合毒素受体蛋白，所述的嵌合毒素受体蛋白和免疫球蛋白重链的至少一部分相连。

15.权利要求14的组合物，进一步包含和所述嵌合毒素受体蛋白相缔合的J链及分泌组分。

16.权利要求14的组合物，其中所述的嵌合毒素受体蛋白由所述毒素受体蛋白细胞外结构域的任意部分组成。

17.权利要求14的组合物；其中所述的免疫球蛋白重链选自IgA、IgA₁、IgA₂、IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgD、IgE、IgM和嵌合免疫球蛋白重链。

18.权利要求14的组合物，包含至少一种额外的嵌合毒素受体蛋白。

19.权利要求14的组合物，其中所述的毒素受体蛋白由所述毒素受体蛋白细胞外结构域的任意部分组成；所述的免疫球蛋白重链包含IgA2重链的至少一部分。

20.有效量的权利要求1中的免疫粘附素在制备治疗人类受试者体内细菌或病毒毒素致死和发病的药物中的用途，其中所述的免疫粘附素和所述毒素结合，降低其毒性。

21.一种药用组合物，包含存在于药学上可接受的缓冲剂中的权利要求1的免疫粘附素。

22.权利要求1的免疫粘附素，其中所述嵌合受体蛋白包括ICAM-1。

23.权利要求6的组合物，其中所中所述嵌合受体蛋白包括ICAM-1。

24.包含嵌合毒素受体蛋白的免疫粘附素，所述的毒素受体蛋白包含：

和免疫球蛋白重链的至少一部分相连的毒素受体蛋白，其中所述免疫球蛋白重链的所述部分赋予抗体效应功能或结合J链；以及

和所述嵌合毒素受体蛋白相缔合的J链和分泌组分，

其中所述毒素受体蛋白是炭疽毒素受体蛋白，其由炭疽毒素受体蛋白的细胞外结构域或其任何部分组成。

25.权利要求24的免疫粘附素；其中所述的免疫球蛋白重链选自IgA、IgA₁、IgA₂、IgM和嵌合免疫球蛋白重链。

26.权利要求24的免疫粘附素，包含至少一种额外的嵌合炭疽毒素受体蛋白。

27.权利要求24的免疫粘附素，其中所述的炭疽毒素受体蛋白由所述毒素受体蛋白细胞外结构域的任意部分组成；所述的免疫球蛋白重链包含IgA2重链的至少一部分。

28.权利要求24的免疫粘附素，其在转基因植物中表达。

29.权利要求24的免疫粘附素，其在单子叶植物中表达。

30.权利要求24的免疫粘附素，其在双子叶植物中表达。

31.权利要求24的免疫粘附素，其中所有的蛋白都是人类的。

32.权利要求24的免疫粘附素，其在来源于植物、脊椎动物或无脊椎动物的异源细胞中表达。

33.权利要求24的免疫粘附素，其在哺乳动物细胞中表达。

34.权利要求24的免疫粘附素，在发根培养物中表达。

35.权利要求24的免疫粘附素，其在组织培养物的植物细胞中表达。

36.包含嵌合的炭疽毒素受体蛋白的免疫粘附素，所述的毒素受体蛋白包含：和免疫球蛋白重链的至少一部分相连的炭疽毒素受体蛋白，其中所述免疫球蛋白重链的所述部分赋予抗体效应功能或结合J链，以及其中所述的免疫粘附素在植物中表达和糖基化。

37.权利要求36的免疫粘附素，所述的免疫粘附素进一步包含和所述嵌合炭疽毒素受体蛋白相缔合的J链和分泌组分。

38.权利要求36的免疫粘附素，所述的炭疽毒素受体蛋白由炭疽毒素受体的细胞外结构域或其任意部分组成。

39.权利要求36的免疫粘附素，其中所述的免疫球蛋白重链选自IgA、IgA₁、IgA₂、IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgD、IgE、IgM和嵌合免疫球蛋白重链。

40.权利要求36或37的免疫粘附素，包含至少一种额外的嵌合毒素受体蛋白。

41.权利要求36或37的免疫粘附素，其中所述的毒素受体蛋白由所述炭疽毒素受体蛋白细胞外结构域的任意部分组成；所述的免疫球蛋白重链包含IgA2重链的至少一部分。

42.权利要求36的免疫粘附素，其中所有的蛋白都是人类的，或和感染和/或病理发生过程中的人宿主相关。

43.权利要求36的免疫粘附素，其在来源于植物、脊椎动物或无脊椎动物的异源细胞中表达。

44.权利要求36的免疫粘附素，其在发根培养物中表达。

45.权利要求36的免疫粘附素，其在组织培养物的植物细胞中表达。

46.权利要求36的免疫粘附素，其在转基因植物中表达。

47.权利要求36的免疫粘附素，其在单子叶植物中表达。

48.权利要求36的免疫粘附素，其在双子叶植物中表达。

49.包含免疫粘附素和植物物质的组合物，其中所述的免疫粘附素包含嵌合炭疽毒素受体蛋白，所述的嵌合炭疽毒素受体蛋白和免疫球蛋白重链的至少一部分相连，其中所述免疫球蛋白重链的所述部分赋予抗体效应功能或结合J链。

50.权利要求49的组合物，进一步包含和所述嵌合炭疽毒素受体蛋白相缔合的J链及分泌组分。

51.权利要求49的组合物，其中所述的嵌合炭疽毒素受体蛋白由所述毒素受体蛋白细胞外结构域的任意部分组成；所述的免疫粘附素具有植物特异的糖基化。

52.权利要求49的组合物，其中所述的免疫球蛋白重链选自IgA、IgA₁、IgA₂、IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgD、IgE、IgM和嵌合免疫球蛋白重链。

53.权利要求49的组合物，包含至少一种额外的嵌合炭疽毒素受体蛋白。

54.权利要求49的组合物，其中所述的炭疽毒素受体蛋白由所述毒素受体蛋白细胞外结构域的任意部分组成；所述的免疫球蛋白重链包含IgA2重链的至少一部分。

55.有效量的权利要求24中的免疫粘附素在制备治疗人类受试者体内炭疽病毒毒素致死和发病的药物中的用途，其中所述的免疫粘附素和所述毒素结合，降低其毒性。

56.一种药用组合物，包含存在于药学上可接受的缓冲剂中的权利要求24的免疫粘附素。

57.一种表达载体，包含编码与植物启动子可操作性相连的嵌合炭疽毒素受体蛋白的基因，所述的嵌合炭疽毒素受体蛋白和免疫球蛋白重链的至少一部分相连。

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