CN1715921A - 人rgpr蛋白在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人RGPR蛋白在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用，属生物技术领域，可用于前列腺癌的早期诊断及治疗效果的评价。本发明公开的RGPR诊断试剂盒的制备包括下列步骤：抗体制备，抗体标记，包被抗体聚苯乙烯微孔板制备。优点在于：该试剂盒操作简便，测试灵敏，重现性好。经大量试验检测获得前列腺癌的测定参考范围为，以每毫升RGPR微克计：0.16微克/ml以下为阴性，0·16微克/ml－0.33微克/ml为可疑，0.33微克/ml为阳性。

Description

人RGPR蛋白在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及人RGPR(调钙素启动子相关蛋白，regucalcingene promoter related protein)在制备试剂盒中的应用。可用于前列腺癌的早期诊断及治疗效果的评价。

背景技术

目前，前列腺癌的诊断试剂盒只有PSA诊断试剂盒。PSA是一种前列腺上皮细胞产生并分泌于血清中的丝氨酸蛋白酶，具有很高的前列腺组织特异性。PSA在血液中以三种形式存在：即自由分子形式(FPSA)、与α12抗糜蛋白酶的复合物形式(PSA-ACT)及与α22巨球蛋白酶的复合物形式(PSA-α2M)，其中只有极少部分以FPSA形式存在。正常情况下，由内皮层、基底细胞层和基底膜构成的屏障维持了血清PSA的低浓度状态，只有当肿瘤或其他病变破坏了此屏障时，才可导致外周血PSA水平升高。

但是，由于BPH及PCa患者的TPSA水平存在重叠区域(灰区，即4μg/L＜TPSA≤10μg/L)，另外存在大量其他因素可以影响TPSA水平。因此，作为最常用的诊断方法，TPSA检测缺乏良好的肿瘤特异性，导致大量不必要的前列腺穿刺活检。为了排除各种因素对PSA的影响，增强其特异性及敏感性，各种不同的方法，如检测PSA密度、PSA速度、F/T值及结合PSA与TPSA之比(C/T值)等，均广泛应用于临床并加以研究，但是对于前列腺癌早期诊断均不理想。

PSA诊断试剂盒的诊断特异性较低，仅为25％左右。良性前列腺疾病如BPH、前列腺缺血、急性尿潴留、细菌性前列腺炎及前列腺按摩等都可引起血清PSA增高，降低了PSA诊断前列腺疾病特别是前列腺癌的敏感性和特异性。对t-PSA异常升高的前列腺疾病患者来说，诊断PCa并不困难。但PSA浓度在4.0～10.0μg/L范围内的隐匿性PCa病人或早期局限于腺体内的PCa病人与BPH患者存在交叉，二者难以区别。

综上所述，寻找新的更加有效的诊断前列腺癌的标志物显得极为重要。

发明内容

本发明提供一种人RGPR蛋白在制备检测前列腺癌试剂盒中的应用，以解决目前PSA诊断试剂盒的诊断特异性较低的问题。人RGPR蛋白，调钙素启动子相关蛋白，regucalcin gene promoter related protein。＞tr|Q96GX6|Q96GX6_HUMAN RGPRprotein-Homo sapiens(Human)。

本发明所述的人RGPR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述，MELWAPQRLPQTRGKATAPSKDPDRGFRRDGHHRPVPHSWHNGERFHQWQDNRGSPQPQQEPRADHQQQPHYASRPGDWHQPVSGVDYYEGGYRNQLYSRPGYENSYQSYQSPTMREEYAYGSYYYHGHPQWLQEERVPRQRSPYIWHEDYREQKYLDEHHYENQHSPFGTNSETHFQSNSRNPCKDSPASNSGQEWPGELFPGSLLAEAQKNKPSLASESNLLQQRESGLSSSSYELSQYIRDAPERDDPPASAAWSPVQAEDVSSAGPKAPMKFYIPHVPVSFGPGGQLVRVGPSSPTDGQAALVELHSMEVILNDSEEQEEMRSFSGPLIREDVHKVDIMTFCQQKAAQSCKSETLGSRDSALLWQLLVLLCRQNGSMVGSDIAELLMQDCKKLEKYKRQPPVANLINLTDEDWPVLSSGTPNLLTGEIPPSVETPAQIVEKFTRLLYYGRKKEALEWAMKNHLWGHALFLSSKMDPQTYSWVMSGFTSTLALNDPLQTLFQLMSGRIPQAATCCGEKQWGDWRPHLAVILSNQAGDPELYQRAIVAIGDTLAGKGLVEAAHFCYLMAHVPFGHYTVKTDHLVLLGSSHRYATWEKGNSKDIFQGTVLALVGFYGSSFHFLM。

本发明RGPR诊断试剂盒是以RGPR抗原免疫动物，得到相应的抗人RGPR抗血清，采取免疫标记吸咐技术抗原抗体结合反应原理制成的诊断试剂盒。

本发明所述的RGPR抗原是指RGPR纯蛋白抗原；所述的免疫动物包括各种免疫动物如绵羊、兔子、豚鼠等。

本发明RGPR诊断试剂盒中采用的RGPR抗体是RGPR蛋白抗体。

本发明公开的人RGPR蛋白的制备方法如下：

一、从人的前列腺癌的血清中制备，包括下列步骤：

1)取层析柱1×15cm将柱洗净后，于铁架台固定，再以超纯水冲洗干净；

2)取纯化Sepharose 4B装入层析柱中，介质装入高度为5cm，再以超纯水洗涤4柱体积；

3)取100mmol/L CUSO4溶液上柱，流穿4柱体积；

4)再以平衡缓冲液洗柱6柱体积(20mmol/L Tris，0.5mol/L Nacl，4mol/L Urea，0.5mol/L咪唑，PH7.5)；

5)再以吸附缓冲液洗柱12柱体积(20mmol/L Tris，0.5mol/L Nacl，5mol/L Urea，10mmol/L咪唑，PH7.5)上柱，流速4滴/min；

6)样品：人前列腺癌的血清上柱；

7)样品上柱后，停留30min，以洗涤缓冲液洗涤(20mmol/L Tris，0.5mol/LNacl，5mol/L Urea，25mmol/L咪唑，PH7.5)；

8)洗涤缓冲液至紫外检测置基线后，开始进行目标蛋白的洗涤加洗脱缓冲液(20mmol/L Tris，0.5mol/L Nacl，5mol/L Urea，1mol/L咪唑，PH7.5)；

9)根据紫外检测值收集目标人RGPR蛋白。

二、采用GST融合蛋白表达RGPR蛋白。

采用多聚酶链式反应(PCR)方法克隆RGPR基因蛋白编码序列，构建该基因的融合表达质粒，导入BL21的大肠杆菌中，IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达，SDS-PAGE电泳，western blot鉴定，用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白，用HPLC大量分离与纯化蛋白质，以制备兔多抗和小鼠单抗，制备用于前列腺癌早期诊断的RGPR基因诊断试剂盒。具体如下：

据原核表达载体pEGx-4T-2的GsT阅读框架设计引物，使RGPR基因的编码区阅读框与GsT的阅读框架一致。以含NAG7基因的质粒为模板(0.1ug)，加入上述弓I物各10pmol进行扩增，回收PCR产物条带。用Smal I酶切PCR回收产物及pEGx-4T-2载体，产生匹配的粘末端。小胶回收试剂回收线性的4.9kb的载体，NAG7编码区片段。将pEGx-4T-2载体与RGPR基因连接，构建成符合读框的GST-NAG7融合基因。用含融合基因的pEGX-4T-2质粒转化大肠杆菌BL21，小量制备质粒DNA，Sal I和Not I酶切鉴定是否含插入片段，含插入片段的阳性克隆质粒DNA纯化后用DNA自动测序仪测序。

单个阳性菌落接种入含氨卞青霉素(100ug/ml)的2ml LB培养液中，37℃，过夜培养。将400ul过夜培养物分别接种到40ml含氨卞青霉素(100ug/ml)的LB培基中，于37℃培养7h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，培养2.5h，转移至50ml离心管中。室温12000×g离心10min，去尽上清，置于冰上，重悬于预冷的600ul的PBS中。加入终浓度为100ug/ml的溶菌酶、10ug/ml DNase I，用液氮和温水介导的反复冻融法破膜，11000rp离心10min，收集上清。重悬GsT Mi crOSpin纯化柱中的树脂，打开盖及底盖，置于一干净的1.5ml的离心管中，735×g离心1min，弃液体，盖上底盖，柱中加入600ul的细菌裂解液。盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5-10min后打开盖及底盖，置于一干净的1.5ml的离心管中，735×g离心1min，再用400ulPBS用相同的方法洗涤2次。柱中加入200ul的谷胱苷肽洗脱液，盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5～10min。735×g离心1min收集流出液，得RGPR蛋白。

本发明公开的RGPR诊断试剂盒的制备包括下列步骤：

1、抗体制备

取健康免疫动物，用RGPR抗原进行免疫，第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射动物颈淋巴结或皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4-5次，抗原量抗原量根据动物体重增减，免疫最后一次的二周后采血，动物抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到动物抗人RGPRIgG抗体，测定效价，冷冻备用；

2、抗体标记

取RGPRIgG抗体采用常规过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶；

3、包被抗体聚苯乙烯微孔板制备

取标记的RGPRIgG抗体，工作浓度于50mM，pH9.5碳酸盐条件下加入聚苯乙烯微孔，每孔100微升，并于2-8℃条件放置约40小时；取出用生理盐水洗涤5次，烘干，用铝箔袋密封包装。

4，其它应用试剂：

(1)包被液：0.05molpH9.5碳酸盐溶液；

(2)洗涤液：0.8％氯化钠--0.05％Tween20；

(3)稀释液：0.15molpH7.2磷酸盐一氯化钠溶液；

(4)显色缓冲液：0.05molpH5.0磷酸盐一柠檬酸溶液；

(5)显色剂：邻苯二铵；

(6)终止液：2mol硫酸溶液。

RGPR诊断试剂盒具体操作方法为：

每次实验每块包被抗体聚苯乙烯微孔板设RGPR参考标准品(0、0.16、0.33、1.0、2.0微克/毫升)5孔及空白孔1孔，其余各孔加待检人血清样品，每孔加样100微升。置37℃，保持1小时，取出用洗涤液洗涤5次，拍干。除空白孔外，其余各孔加酶标记抗体100微升。置37℃，保持1小时，取出用洗涤液洗涤5次，拍子。各孔加底物显色液100微升。置37℃，保持15分钟，各孔加终止液50微升。

结果判断

(1)采用酶标检测仪，主波长492nm副波长630nm，标准品0微克/毫升校零，测定各孔吸光度值。以RGPR参考

(2)以RGPR参考标准品标示值为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

(3)以待检各孔的吸光度值查标准曲线得出相应的检测结果。

本发明的优点在于：以RGPR抗原得到相应的前列腺癌诊断试剂盒。该试剂盒操作简便，测试灵敏，重现性好。经大量试验检测获得前列腺癌的测定参考范围为(以每毫升RGPR微克计)：0.16微克/ml以下为阴性，0·16微克/ml-0.33微克/ml为可疑，0.33微克/ml为阳性。

具体实施方式

实施例1、羊抗人RGPR蛋白IgG抗体制备

取健康雄性的50kg重成年绵羊，用RGPR纯化蛋白抗原进行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射绵羊颈淋巴结和皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4-5次，抗原量5mg/次。免疫最后一次的二周后采血，羊抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到羊抗人RGPR蛋白IgG抗体，测定效价，冷冻备用。

实施例2、兔抗人RGPR蛋白IgG抗体制备

取健康雄性的成年兔子(5kg)，用RGPR纯化蛋白抗原进行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射兔子皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4次，抗原量0.5mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到兔抗人RGPR蛋白IgG抗体，测定效价，冷冻备用。

实施例3、鼠抗人RGPR蛋白IgG抗体制备

取健康雄性的成年豚鼠，用RGPR纯化蛋白抗原进行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射豚鼠皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4次，抗原量0.1mg/次。免疫最后一次的二周后采血。鼠抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到鼠抗人RGPR蛋白IgG抗体，测定效价，冷冻备用。

实施例4、抗体标记

取实施例1-3中任一方法获得的RGPRIgG蛋白抗体采用常规过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶，

(1)RGPR抗体(2mg/ml)0.9ml，加0.1mol pH9.5NaAc；

(2)辣根过氧化物酶10mg溶解于1.0mil.0mmolpH4.0NaAc。

(3)加0.1mol过碘酸钠0.1ml，1.6mmol乙二醇0.1ml于上述辣根过氧化物酶溶液。

(4)将上述辣根过氧化物酶溶液与抗体混合搅拌1-2小时。

(5)加0.1mol四氢硼化钠0.1ml于4～C静止30分钟。

(6)用50％饱和硫酸铵沉淀分离标记物。

(7)标记物用50％丙三醇------PBS溶解，并于冷冻储藏。

实施例5、包被抗体聚苯乙烯微孔板制备

取实施例4获得的标记的RGPRIgG抗体，工作浓度于50mM，pH9.5碳酸盐条件下加入聚苯乙烯微孔，每孔100微升，并于2-8℃条件放置约40小时。取出用生理盐水洗涤5次，烘干，用铝箔袋密封包装。

实施例6、RGPR试剂盒标准

1试剂

包被抗体聚苯乙烯微孔板：固相抗RGPR抗体。

酶标记抗体：酶标记抗RGPR抗体、0.15molpH7.2磷酸盐一氯化钠溶液。

洗涤液(10X)：8％氯化钠---0.5％Tween20。

显色缓冲液：0.05molpH5.0磷酸盐一柠檬酸溶液。

显色剂：邻苯二铵。

终止液：2mol硫酸溶液。

2仪器

酶标检测仪(吸光度测定精度0.0～2.0A±0.001A)。

3分析方法

双抗体夹心法原理定量测定

4样品要求

人血清。

5技术要求：(ELISA法)。

采用酶标检测仪，主波长492nm副波长630nm。

6.计算方法

以RGPR参考标准晶标示值为横坐标，吸光度值为纵坐标准曲线。绘制标准曲线。以待检各孔的吸光度值查标准曲线得出相应的检测结果。

7.性能要求

7.1物理性状

外观：各液体组份应清晰透明，包装无渗漏，密封袋无漏气。

7.2试剂空白吸光度

在主波长492nm副波长630nm处，室温，吸光度应＜0.15A。

7.3分析灵敏度

15分钟，试剂空白

取RGPR标准每毫升0.16微克检测，检测结果±20％。

7.4准确度·

取RGPR标准每毫升0.33微克、检测结果±15％。

7.5精密度

1.0微克CV～15％。

7.6测定范围

2.0微克范围内呈线性，线性误差应≤15％，测定吸光度值与标示值的相关系数r＞0.99.

8.实验方法

8.1物理性状

目测试剂盒各组份外观，结果应符合本标准7.1条款要求。

8.2试剂空白吸光度

以含10％小牛血清生理盐水为空白样品进行检测，按规定操作，以显色底物空白校零，记录吸光度，重复三次取平均值，结果应符合本标准7.2条款要求。

8.3分析灵敏度

检测RGPR标准每毫升0.08微克，重复三次取平均值，结果应符合本标准7.3条款要求。

8.4准确度

检测标准品，RGPR标准每毫升0.33微克、，重复三次，取平均值，结果应符合本标准7.4条款要求。

8.5精密度(重复性)

取RGPR含量约每毫升1.0微克的血清检测进行20次测定(N＝20)，求出20次吸光度变化均值X和标准差S，按下式计算变异系数(CV)，结果应符合本标准7.5条款要求。

CV％＝S/X

8.6测定范围

取RGPR标准每毫升0.08微克、0.16微克、0.33微克、1.0微克、2.0微克，每一浓度重复检测三次，取平均值，结果应符合本标准7.6条款要求。

实施例7、测试实例

基本参数：

采用酶标检测仪，主波长492nm副波长630nm，以RGPR参考标准晶0微克/毫升校零，测定各孔吸光度值。

使用方法：

(1)每次实验每块包被抗体聚苯乙烯微孔板设RGPR参考标准晶(0、0.16、0.33、1，0、2.0微克/毫升)5孔及空白孔1孔，其余各孔加待检血清样品，每孔加样100微升。置37℃，保持1小时，取出用洗涤液洗涤5次，拍干。

(2)除空白孔外，其余各孔加酶标记抗体100微升。置37℃，保持1小时，取出用洗涤液洗涤5次，拍干。

(3)各孔加底物显色液100微升。置室温避光，保持15分钟，加终止液50微升，吸光度(OD)0.80查表样品RGPR含量0.52微克/ml。

结果判断：

(1)采用酶标检测仪，主波长492nm副波长630nm，以RGPR参考标准晶0微克/毫升校零，测定各孔吸光度值。

(2)以RGPR参考标准晶标示值为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

(3)样品OD(吸光度)0.80，查标准曲线图，样品RGPR值：0.52微克/ml，此患者血清中RGPR含量0.52微克/ml，前列腺癌阳性。

                                序列表

<110>吉林大学

<120>人RGPR蛋白在制备诊断前列腺癌试剂盒中的应用

<130>pyz200506

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>625

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Glu Leu Trp Ala Pro Gln Arg Leu Pro Gln Thr Arg Gly Lys Ala

1               5                   10                  15

Thr Ala Pro Ser Lys Asp Pro Asp Arg Gly Phe Arg Arg Asp Gly His

             20                  25                  30

His Arg Pro Val Pro His Ser Trp His Asn Gly Glu Arg Phe His Gln

        35                  40                  45

Trp Gln Asp Asn Arg Gly Ser Pro Gln Pro Gln Gln Glu Pro Arg Ala

    50                  55                  60

Asp His Gln Gln Gln Pro His Tyr Ala Ser Arg Pro Gly Asp Trp His

65                  70                  75                  80

Gln Pro Val Ser Gly Val Asp Tyr Tyr Glu Gly Gly Tyr Arg Asn Gln

                85                  90                  95

Leu Tyr Ser Arg Pro Gly Tyr Glu Asn Ser Tyr Gln Ser Tyr Gln Ser

        100                     105                 110

Pro Thr Met Arg Glu Glu Tyr Ala Tyr Gly Ser Tyr Tyr Tyr His Gly

    115                     120                 125

His Pro Gln Trp Leu Gln Glu Glu Arg Val Pro Arg Gln Arg Ser Pro

130                     135                 140

Tyr Ile Trp His Glu Asp Tyr Arg Glu Gln Lys Tyr Leu Asp Glu His

145                 150                 155                 160

His Tyr Glu Asn Gln His Ser Pro Phe Gly Thr Asn Ser Glu Thr His

                165                 170                 175

Phe Gln Ser Asn Ser Arg Asn Pro Cys Lys Asp Ser Pro Ala Ser Asn

            180                 185                 190

Ser Gly Gln Glu Trp Pro Gly Glu Leu Phe Pro Gly Ser Leu Leu Ala

        195                 200                 205

Glu Ala Gln Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ala Ser Glu Ser Asn Leu Leu

    210                 215                 220

Gln Gln Arg Glu Ser Gly Leu Ser Ser Ser Ser Tyr Glu Leu Ser Gln

225                 230                 235                 240

Tyr Ile Arg Asp Ala Pro Glu Arg Asp Asp Pro Pro Ala Ser Ala Ala

                245                 250                 255

Trp Ser Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ser Ser Ala Gly Pro Lys Ala

            260                 265                 270

Pro Met Lys Phe Tyr Ile Pro His Val Pro Val Ser Phe Gly Pro Gly

        275                 280                 285

Gly Gln Leu Val Arg Val Gly Pro Ser Ser Pro Thr Asp Gly Gln Ala

    290                 295                 300

Ala Leu Val Glu Leu His Ser Met Glu Val Ile Leu Asn Asp Ser Glu

305                 310                 315                 320

Glu Gln Glu Glu Met Arg Ser Phe Ser Gly Pro Leu Ile Arg Glu Asp

                325                 330                 335

Val His Lys Val Asp Ile Met Thr Phe Cys Gln Gln Lys Ala Ala Gln

            340                 345                 350

Ser Cys Lys Ser Glu Thr Leu Gly Ser Arg Asp Ser Ala Leu Leu Trp

        355                 360                 365

Gln Leu Leu Val Leu Leu Cys Arg Gln Asn Gly Ser Met Val Gly Ser

    370                 375                 380

Asp Ile Ala Glu Leu Leu Met Gln Asp Cys Lys Lys Leu Glu Lys Tyr

385                 390                 395                 400

Lys Arg Gln Pro Pro Val Ala Asn Leu Ile Asn Leu Thr Asp Glu Asp

                405                 410                 415

Trp Pro Val Leu Ser Ser Gly Thr Pro Asn Leu Leu Thr Gly Glu Ile

            420                 425                 430

Pro Pro Ser Val Glu Thr Pro Ala Gln Ile Val Glu Lys Phe Thr Arg

        435                 440                 445

Leu Leu Tyr Tyr Gly Arg Lys Lys Glu Ala Leu Glu Trp Ala Met Lys

    450                 455                 460

Asn His Leu Trp Gly His Ala Leu Phe Leu Ser Ser Lys Met Asp Pro

465                 470                 475                 480

Gln Thr Tyr Ser Trp Val Met Ser Gly Phe Thr Ser Thr Leu Ala Leu

                485                 490                 495

Asn Asp Pro Leu Gln Thr Leu Phe Gln Leu Met Ser Gly Arg Ile Pro

            500                 505                 510

Gln Ala Ala Thr Cys Cys Gly Glu Lys Gln Trp Gly Asp Trp Arg Pro

        515                 520                 525

His Leu Ala Val Ile Leu Ser Asn Gln Ala Gly Asp Pro Glu Leu Tyr

    530                 535                 540

Gln Arg Ala Ile Val Ala Ile Gly Asp Thr Leu Ala Gly Lys Gly Leu

545                 550                 555                 560

Val Glu Ala Ala His Phe Cys Tyr Leu Met Ale His Val Pro Phe Gly

                565                 570                 575

His Tyr Thr Val Lys Thr Asp His Leu Val Leu Leu Gly Ser Ser His

            580                 585                 590

Arg Tyr Ala Thr Trp Glu Lys Gly Asn Ser Lys Asp Ile Phe Gln Gly

        595                 600                 605

Thr Val Leu Ala Leu Val Gly Phe Tyr Gly Ser Ser Phe His Phe Leu

    610                 615                 620

Met

625

Claims (2)

1、人RGPR蛋白在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用。

2、根据权利要求1所述的人RGPR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述MELWAPQRLPQTRGKATAPSKDPDRGFRRDGHHRPVPHSWHNGERFHQWQDNRGSPQPQQEPRADHQQQPHYASRPGDWHQPVSGVDYYEGGYRNQLYSRPGYENSYQSYQSPTMREEYAYGSYYYHGHPQWLQEERVPRQRSPYIWHEDYREQKYLDEHHYENQHSPFGTNSETHFQSNSRNPCKDSPASNSGQEWPGELFPGSLLAEAQKNKPSLASESNLLQQRESGLSSSSYELSQYIRDAPERDDPPASAAWSPVQAEDVSSAGPKAPMKFYIPHVPVSFGPGGQLVRVGPSSPTDGQAALVELHSMEVILNDSEEQEEMRSFSGPLIREDVHKVDIMTFCQQKAAQSCKSETLGSRDSALLWQLLVLLCRQNGSMVGSDIAELLMQDCKKLEKYKRQPPVANLINLTDEDWPVLSSGTPNLLTGEIPPSVETPAQIVEKFTRLLYYGRKKEALEWAMKNHLWGHALFLSSKMDPQTYSWVMSGFTSTLALNDPLQTLFQLMSGRIPQAATCCGEKQWGDWRPHLAVILSNQAGDPELYQRAIVAIGDTLAGKGLVEAAHFCYLMAHVPFGHYTVKTDHLVLLGSSHRYATWEKGNSKDIFQGTVLALVGFYGSSFHFLM。