CN1699598A

CN1699598A - 红色裸甲藻的检测探针及检测方法

Info

Publication number: CN1699598A
Application number: CN 200510042291
Authority: CN
Inventors: 于志刚; 李荣秀; 甄毓; 米铁柱; 蔡青松; 何闪英
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2005-04-08
Publication date: 2005-11-23

Abstract

本发明属于利用分子生物学方法检测环境微生物的技术领域。本发明公开了以红色裸甲藻核糖体DNA(rDNA)核苷酸序列为基础设计的寡核苷酸探针，以该核酸分子探针为一对引物进行PCR反应，通过判断相应大小PCR产物的有无可以准确、快速地检测红色裸甲藻。本发明还公开了用这些探针采用荧光定量PCR技术来快速、准确地检测和定量计数红色裸甲藻的方法。

Description

红色裸甲藻的检测探针及检测方法

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法检测海洋环境中微型生物的技术领域。具体地说，涉及一种可用于检测红色裸甲藻的核苷酸序列和以此序列为基础设计的核酸分子探针以及利用该分子探针检测红色裸甲藻的方法。

背景技术

红色裸甲藻(Gymnodinium sanguinea)属于甲藻门裸甲藻属，其可形成大规模赤潮，引起养殖扇贝、海参、鲍鱼的大量死亡，造成巨大经济损失。在胶州湾已记录的40余种赤潮生物中，裸甲藻是主要赤潮藻种之一。因此，及时、准确、快速地检测裸甲藻，随时了解其在海洋中的动态变化具有重要意义。传统的鉴别方法，即从形态学上区分裸甲藻，主要是利用光学显微镜直接观察和计数，操作时存在一定困难，且过程烦琐，费时、费力，当样品量多时工作量极大。因此，采用新方法、新技术快速识别和定量计数裸甲藻极具现实意义。但是，目前国内外并没有针对该藻从这方面进行研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测红色裸甲藻的核酸分子探针以及利用该分子探针检测红色裸甲藻的方法，它可以从遗传本质上客观、准确地对该藻进行检测。具体包括：1.提供用于红色裸甲藻检测的基因片段；2.提供基于前述基因片段的红色裸甲藻的专一性遗传标记，即核酸分子探针；3.提供利用这些遗传标记进行快速检测红色裸甲藻的方法；4.提供利用这些遗传标记同时进行快速检测和定量计数红色裸甲藻的方法。

本发明的理论基础是核糖体基因及其转录间隔区的序列多态性以及5’核酸酶检测法。本发明的发明人首先从NCBI上搜索到红色裸甲藻的rDNA序列，通过与国际互联网(Genbank)中所有已经公开的rDNA区序列比较发现，如序列表中SEQ ID NO.1所示的红色裸甲藻rDNA序列与其它生物的相应区域的序列有很大差别。为此发明人以该序列为基础设计出G.sanguinea primer1、G.sanguinea primer2和G.sanguineaTaqMan Probe三个核酸分子探针。用这三个探针，发明人建立了快速、准确检测和定量计数红色裸甲藻的分子生物学方法。

本发明所提供的用于红色裸甲藻检测的核苷酸序列来源于红色裸甲藻18SrDNA的部分区域，其序列及结构特征如SEQ ID NO.1所示，下划线表示红色裸甲藻专一性核苷酸探针和用于RQ-PCR反应的TaqMan探针在该序列上的确切位置。

本发明所述的红色裸甲藻的其中两个专一性核酸分子探针是以SEQ ID NO.1所示序列为基础，通过Internet(因特网)与国际分子生物学数据库中的其它所有藻类的相应序列比较后，用常规的引物设计软件设计而成的。它们的序列组成及其结构特征分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，序列SEQ ID NO.1中下划线标出了它们的具体位置。SEQ ID NO.2所示的核酸探针(G.sanguinea primer1)是G.sanguinea的18srDNA区域中的一段由23个核苷酸组成的寡核苷酸序列或其互补序列。SEQ ID NO.3所示的核酸探针(G.sanguinea primer2)是G.sanguinea的18s rDNA区域中的一段由24个核苷酸组成的寡核苷酸序列或其互补序列。

本发明所述的红色裸甲藻的其中两个专一性核酸分子探针(G.sanguinea primer1和G.sanguinea primer2)可按照本发明已描述过的序列，通过常规的DNA合成方法合成而得(例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成)。这两个探针可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

本发明所述的两个红色裸甲藻专一性核酸分子探针具有较好的种特异性。以它们为一对引物进行常规PCR反应，结果只能从含有红色裸甲藻的材料的DNA提取物中扩增出大小为104bp的PCR产物。因此，以这两个核酸分子探针为引物进行常规PCR反应，通过判断相应大小PCR产物的有无可以准确、快速地检测红色裸甲藻，而且所需的样品量很少。

以SEQ ID NO.1所示序列为基础，通过Internet(因特网)与国际分子生物学数据库中的其它所有藻类的相应序列比较后，本发明的发明人还设计出了红色裸甲藻的另一个专一性核酸分子探针，其序列组成和结构特征如SEQ ID NO.4所述(名称为G.sanguinea TaqMan Probe)；其在序列G.sanguinea18s rDNA中的位置如SEQ IDNO.1所示。它是G.sanguinea的18s rDNA区域中的一段由24个核苷酸组成的寡核苷酸序列或其互补序列。该探针可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。将该序列的5’端用报告荧光基团如羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)等标记，3’端用淬灭荧光基团如TAMRA或Dabcyl等标记后即可用于对红色裸甲藻进行定性和定量分析的实时荧光定量PCR(RQ-PCR)反应。

以G.sanguinea primer1和G.sanguinea primer2红色裸甲藻的两个专一性核酸分子探针作为引物，以标记好的G.sanguinea TaqMan Probe(5’端用报告荧光基团如FAM等标记，3’端用淬灭荧光基团如TAMRA或Dabcyl等标记)为TaqMan探针，本发明的发明人发明了一种可同时对红色裸甲藻进行检测和定量计数分析方法，即实时荧光定量PCR(RQ-PC R)反应。这种分析方法不仅克服了常规定量PCR方法中的误差，而且分析所需的样品量少，检出限低，灵敏度高。

附图说明

图1为红色裸甲藻核糖体DNA(rDNA)及转录单元间隔区(ITS)在染色体上的排列顺序。其中18s rDNA区域为本发明所涉及的核苷酸序列存在的区域。图中，SSU为小亚基，LSU为大亚基，ITS为转录单元间隔区。

图2为PCR结果。其中，所用引物为G.sanguinea primer1和G.sanguinea primer2；各电泳道所对应的藻种为：Lane2.旋链角毛藻；Lane3.柔弱角毛藻；Lane4.纤细角毛藻；Lane5.微型角毛藻；Lane6.尖刺拟菱形藻；Lane7.米氏裸甲藻；Lane8.裸甲藻；Lane9.赤潮异湾藻；Lane10.塔玛亚历山大藻；Lane12.新月菱形藻；Lane13.中肋骨条藻；Lane14.红色裸甲藻；Lane15.直链藻；Lane16.膜质周形藻；Lane17.圆海链藻；Lane18.海链藻；Lane19.微小原甲藻；Lane20.H₂O；Lane1，11.DNA标记DL2,000(从上到下各条带大小依次为2000bp，1000bp,750bp，500bp，250bp，100bp)。

图3为各稀释度DNA溶液在PCR过程中的荧光信号曲线。图中横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度，与横坐标平行的双箭头粗线为临界线(Threshold)。从左至右各曲线对应的红色裸甲藻细胞浓度(个细胞/μlDNA)依次为1.3×10⁷、1.3×10⁶、1.3×10⁵、1.3×10⁴、1.3×10³、1.3×10²，每个浓度分别上样三次。

图4为RQ-PCR定量计数红色裸甲藻的标准曲线。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1.红色裸甲藻的培养及其DNA样品的制备：

本发明所用的红色裸甲藻分离自我国东海天然海水样品。通过反复在显微镜下挑取单个藻细胞获得纯培养物。所用的培养基是常规的F/2培养基，培养条件：光照/黑暗周期为12h/12h，光照强度为4000Lx，培养温度为22℃～25℃。

用0.45μm的微孔滤膜或1000r/min离心收集处于对数生长期的红色裸甲藻藻细胞，用200μl TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)pH8.0，1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)pH8.0)洗下约20mg藻体，加入2倍体积的预热至55℃的抽提缓冲液(3％(w/v)CTAB(十六烷基-三甲基-溴化铵)，1％(w/v)sarkosyl(十二烷酰肌氨酸钠)，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，1％(v/v)α-巯基乙醇)，55℃处理1小时，其间每10分钟颠倒混匀一次；取出于4℃冰箱静置3分钟；加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，颠倒混匀至呈乳浊状，10000r/min，4℃离心10分钟；取水相，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，重复上步一次；之后的操作同常规的DNA提取。最后提取的DNA用50μl TE缓冲液溶解。

实施例2.G.sanguinea primer1和G.sanguinea primer2的设计和合成：

通过与Genbank中所有已知的其它真核生物、原核生物的相应区域的序列做比较，发现如序列表1所示的序列与其他生物的相应序列有很大差别，为此发明人以该序列为基础设计出G.sanguinea primer1和G.sanguinea primer2两个核酸分子探针。根据这两个探针或其互补序列的核苷酸组成和排列，在商业化的DNA合成仪上即可获得如序列表2和序列表3所述的核苷酸序列。

实施例3.用常规PCR法检测红色裸甲藻：

本实施例选用了本实验室藻种库中的几株微藻作为参照藻，它们是：分离自胶州湾的旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(C.debilis)、纤细角毛藻(C.gracile)、微型角毛藻(C.minimum)、裸甲藻(Gymnodinium sp.)、米氏裸甲藻(G.mikimotoi)、诺氏海链藻(Thalassiosira nordenskioeldii)、尖刺拟菱形藻(Pseudonitzschiapungens)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、膜质舟形藻(Navicula membranacea)、直链藻(Melosira sp.)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、海链藻(Thalassiosirasp.)、分离自渤海湾的微小原甲藻(Prorocentrem minimun)，分离自大鹏湾的塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarens)，分离自大连湾的赤潮异湾藻(Heterosigmaakashiwo)，它们均通过反复在显微镜下挑取单个藻细胞获得纯培养物。按实施例1所述的方法培养这些藻和提取这些藻及红色裸甲藻的DNA。

取各种藻的DNA提取物1μl，按实施例1所述的PCR反应体系进行PCR，以SEQ IDNO.2(G.sanguinea primer1)和SEQ ID NO.3(G.sanguinea primer2)所述的核苷酸序列作为正反向引物。PCR程序为：94℃ 3分钟；94℃ 30秒，59℃ 30秒，72℃ 30秒，共30个循环；72℃5分钟。PCR产物于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳后拍照，得到如图2所示的结果。从图2中可知，从红色裸甲藻DNA模板中扩增出一条大小为104bp的PCR产物；从其它藻的DNA模板基本未见到特异性扩增。

因此，对于某待检样品，以其DNA提取物为模板，以G.sanguinea primer1和G.sanguinea primer2为引物，以本实施例所述的PCR程序进行PCR反应，如果PCR产物中有大小为104bp的条带，即可判定该样品中有红色裸甲藻的存在；如果该样品为纯培养物，则可判定该纯培养物为红色裸甲藻。

本方法的优点：由于本方法使用的是红色裸甲藻的专一性引物并通过PCR反应对待测样品进行了扩增，因此该方法能非常准确地检测样品中是否存在红色裸甲藻，只要有相应大小的PCR产物出现，即可判定待检样品中有红色裸甲藻存在，而且根据PCR产物量的多少，还可初步估计样品中红色裸甲藻细胞数的多少。同时本方法灵敏度很高，只要有很少的待检材料即可进行准确检测。

实施例4.RQ-PCR中所用的TaqMan探针的制备：

根据SEQ ID NO.4所述的序列，用FAM荧光物质标记其5’端，用TAMRA标记其3’端。整个合成和标记过程可在商用的探针合成和标记仪上一次性完成。

实施例5.红色裸甲藻的RQ-PCR检测和定量计数：

取处于对数生长期(培养了1周)的红色裸甲藻培养物计数，其细胞浓度为2.6×10⁴个/ml，收集1500ml培养物，于4℃ 10000r/min离心10分钟，小心吸弃上清，沉淀用200μl TE缓冲液溶解，再加入400μl预热至55℃的抽提缓冲液(配方见实施例1)，55℃处理1小时，其间每10分钟颠倒混匀一次；取出于4℃冰箱静置3分钟，加入800μl氯仿：异戊醇(24∶1)，颠倒混匀至呈乳浊状，10000r/min，4℃离心10分钟；取550μl上相，向其中加入550μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，颠倒混匀至呈乳浊状，10000r/min，4℃离心10分钟；之后的操作完全按照Watson公司的植物叶DNA提取试剂盒的有关操作进行，只是最后一步用30μl TE缓冲液从吸附柱上洗下DNA(每1μl DNA溶液对应1.3×10⁷个细胞)。

取上述提取的DNA，按1∶10倍比稀释，共6个稀释度(各稀释度对应的细胞浓度依次为1.3×10⁷个/μl、1.3×10⁶个/μl、1.3×10⁵个/μl、1.3×10⁴个/μl、1.3×10³个/μl、1.3×10²个/μl)。然后分别取1μl DNA溶液加入49μl RQ-PCR反应体系(5×实时定量PCR缓冲液10μl；250mmol/L MgCl₂ 1μl；dNTP混合液(各10mmol/L)1.5μl；20mmol/LG.sanguinea primer1 1μl；20mmol/L G.sanguinea primer2 1μl；20mmol/L G.sanguineaProbe 0.4μl，0.5U/μl聚合酶(Ex Taq HS)0.5μl)，于Bioer Line-gene FQD-33A仪中，按PCR程序(94℃3分钟(94℃15秒 60℃1分钟)65个循环)反应，并实时记录荧光信号，每个浓度做3个平行样，得到如图3所示结果，该图显示了各DNA溶液在PCR过程中的荧光信号随着循环数增加的变化曲线。根据RQ-PCR的原理，临界线(Threshold)与各DNA溶液荧光信号曲线的交点所对应的循环数即为该DNA溶液的C_T值。结合各DNA溶液的稀释度、各向稀释度对应的细胞浓度和C_T值，得到如表1所示的数据。

表1.各DNA溶液的稀释度及其对应的细胞浓度和C_T值、实际用于RQ-PCR的细胞数

稀释倍数	1∶10⁰	1∶10¹	1∶10²	1∶10³	1∶10⁴	1∶10⁵
稀释倍数	1∶10⁰	1∶10¹	1∶10²	1∶10³	1∶10⁴	1∶10⁵	对应实际细胞数(个)	1.3×10⁷	1.3×10⁶	1.3.×10⁵	1.3×10⁴	1.3×10³	1.3×10²
第一次测C_T值	15.42	20.87	23.79	27.7	30.58	33.39	对应实际细胞数(个)	1.3×10⁷	1.3×10⁶	1.3.×10⁵	1.3×10⁴	1.3×10³	1.3×10²
第一次测C_T值	15.42	20.87	23.79	27.7	30.58	33.39	第二次测C_T值	15.02	20.57	23.43	24.94	30.8	33.85
第三次测C_T值	15.67	19.97	23.5	26.76	31.12	33.36	第二次测C_T值	15.02	20.57	23.43	24.94	30.8	33.85
第三次测C_T值	15.67	19.97	23.5	26.76	31.12	33.36	C_T平均值	15.37	20.47	23.57	26.47	30.83	33.53

以用于RQ-PCR的实际细胞数的对数值为横座标，以相应的C_T值为纵座标，即可绘制出如图4所示的标准曲线。该曲线的方程式为：y＝-3.0883x+39.804；其回归系数为：R²＝0.9926。

对于某一待测样品，先按上述方法提取其DNA并做RQ-PCR，测出其C_T值。以其C_T值即可在图4的标准曲线上算出该待测样品的细胞数，进而推算出其中红色裸甲藻的细胞浓度。

本方法最大的优点是能同时进行定量和定性检测，通过该方法既可知道待检样品中是否有红色裸甲藻存在，还可同时知道有多少该藻种存在。

本方法另一个明显的优点是定量准确，这是由实时荧光定量PCR方法本身以及本方法扩增的针对的靶片段所决定的。对于某一物种来说，核糖体基因在染色体上的拷贝数是恒定的，除有丝分裂外不会随着细胞的生理状态、生活环境的不同而改变，也就是说样品中染色体DNA上核糖体基因的数量与样品中细胞的数量是呈线性相关的，由于本方法扩增的靶片段是染色体DNA上的核糖体基因，因此扩增信号的强弱直接反映了待检样品中细胞数量的多少。

本方法操作过程简单、省时，整个过程4个小时内即可全部完成，因此可以用此方法快速、简便、大批量定量检测该藻，实现海区中红色裸甲藻动态的跟踪监测。

序列表

<110>中国海洋大学

<120>红色裸甲藻的检测探针及检测方法

<160>4

<210>1

<211>200

<212>DNA

<213>红色裸甲藻(Gymnodinium sanguinea)

<400>1

ttagagggac tttgtgtgtc taacgcaagg aagtttgagg caataacagg tctgtgatgc 60

ccttagatgt tctgggctgc acgcgcgcta cactgat gcg gtcaacgagt ttctgcctgg 120

tccggcagg a ttgggtaatc ttctcaaatc gcatcgtgat ggggatagat tattgcaatt 180

attaatcttc aacgaggaat 200

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>2

gtctgtgatg cccttagatg ttc 23

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>3

tgcgatttga gaagattacc caat 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>4

accaggcaga aactcgttga ccgc 24

Claims

1.一种红色裸甲藻的检测探针，其特征是该探针来源于如SEQ ID NO.1所示的红色裸甲藻rDNA核苷酸序列中的两段寡核苷酸序列或其互补序列。

2.根据权利要求1所述的检测探针，其特征是这两个探针可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

3.根据权利要求1所述的检测探针，其特征是其核苷酸如SEQ ID NO.2所示，序列为：5’-gtctgtgatgcccttagatgttc，或其互补序列：5’-gaacatctaagggcatcacagac。

4.根据权利要求1所述的检测探针，其特征是其核苷酸如SEQ ID NO.3所示，序列为：5’-tgcgatttgagaagattacccaat，或其互补序列：5’-attgggtaatcttctcaaatcgca。

5.一种红色裸甲藻的分子检测方法，其特征是采用PCR方法，以SEQ ID NO.2和3两个核酸分子探针为一对PCR引物进行PCR反应，通过判断相应大小PCR产物的有无可以准确、快速地检测红色裸甲藻。

6.一种红色裸甲藻的快速检测和定量计数方法，其特征是采用荧光定量PCR方法，以SEQ ID NO.2和3两个核酸分子探针为PCR引物，以一条用荧光标记的寡核苷酸序列为TaqMan探针进行实时荧光定量PCR。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是所属的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-accaggcagaaactcgttgaccgc，或其互补序列：5’-gcggtcaacgagtttctgcctggt。

8.按照权利要求7所述的用荧光标记的寡核苷酸序列，其特征是其5’端用报告荧光基团如羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)等标记，3’端用淬灭荧光基团如TAMRA、Dabcyl等标记。