CN1688299A - 抑制细胞毒性蛋白构象异构体 - Google Patents
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Abstract
本发明披露了预防淀粉状蛋白相关疾病的方法,包括采用公开的多环化合物相关的筛选和方法学防止初原纤维形成。
Description
技术领域
本发明涉及多环化合物和使用一种或多种多环化合物,优选具有三至五个环的取代的或未取代的多并苯化合物治疗和预防多种以淀粉状蛋白为基础的疾病状态的方法。在一个特殊的方面,发明涉及破坏糊精从可溶形式向不溶形式转变的方法。在另一个方面,发明涉及抑制淀粉状蛋白前-或初原纤维和原纤维的聚集,以及抑制淀粉状蛋白β-原纤维和β-片层形成所产生的转变诱导毒性的方法。本发明提供了破坏II型糖尿病病人胰岛淀粉状蛋白,以及鉴定和评价用于预防或治疗淀粉状蛋白相关疾病的多环化合物的方法。
背景技术
如所有具有优先权的申请一样,在此提到的所有文章都整体合并为参考文献。
1854年,Rudolph Virchow提出并推广了术语淀粉状蛋白,以表示肉眼可见的具有阳性碘染色反应的组织异常。随后的偏振光光镜研究证明了淀粉样沉积物所固有的双折射性,这种特性在用刚果红染料染色后大大增加。1959年,淀粉样变性组织超薄切片的电镜观察发现了原纤维的存在,其长度不确定,宽度恒定为80至100。采用Congophilia和原纤维形态学标准,在动物中已经鉴定了20或更多种生物学上不同形式的淀粉状蛋白;每种形式都特别地与一种独特的临床综合征有关。原纤维,宽度也是80至100,已经采用差示沉淀或溶解法从组织匀浆中分离。X-线衍射分析表明原纤维排列成β折叠构造,多肽骨架的方向与原纤维轴垂直(交叉β结构)。
淀粉样变性是一组病理学状态,其中正常的可溶性蛋白聚合形成不溶的淀粉样原纤维和淀粉样沉积物。有超过15种蛋白形成通常与多种临床状况有关的淀粉样原纤维。淀粉样变性通常可分为全身性淀粉样变性和局部淀粉样变性。全身淀粉样变性(和括号中已经被认为引起该变性的蛋白)包括AL淀粉样变性(AL淀粉状蛋白)、淀粉样A淀粉样变性(淀粉样A蛋白)和家族性甲状腺运载蛋白淀粉样变性(甲状腺运载蛋白)。局部淀粉样变性(和括号中已经被认为引起该变性的蛋白)包括Alzheimer病(淀粉样β-肽)、朊病毒病(绵羊疯痒病朊病毒蛋白)和II型糖尿病(人胰岛淀粉状蛋白)。
淀粉状蛋白或淀粉样蛋白是指一组各不相同的细胞外蛋白,它们形成具有某种形态学、结构和化学特性的淀粉样沉积物。各种淀粉样沉积物与某些染料具有相似的亲合力,在偏振光下具有特征性的外观。尽管它们在氨基酸序列上不同,但在淀粉样沉积物中发现的淀粉状蛋白由含有平行排列的原纤维交叉束的聚集物组成,其中原纤维中的蛋白组织成β-折叠片结构。淀粉样沉积物中许多淀粉状蛋白富含β-折叠片结构的事实是刚果红染色后淀粉样原纤维双折射性极大增加的原因(Glenner等人,J.Histochem.Cytochem 22:1141-1158(1974);Glenner和Page,Int.Rev.Exp.Pathol.15:1-92(1976);Glenner,N.Engl.J.Med.302:1283-1292(Pt.1)和133-1343(Pt.2)(1980))。
淀粉状蛋白原纤维,不论形成它们的是何种淀粉状蛋白,已被认为对多种类型细胞有细胞毒效应,包括原代培养的海马神经元(Yankner等人,Science250:279-282(1990))、胰岛B细胞(Lorenzo等人,Nature 368:756-760(1994))和无性细胞系(Behl等人,Biochem Biophys.Res.Commun.186:944-952(1992);O′Brien等人,Am.J.Pathol.147:609-616(1995))。的确,仅有原纤维形式中的淀粉状蛋白显示有细胞毒性(Pike等人,Brain Res.563:311-314(1991);Lorenzo和Yankner,Proc.Natl.Acad.Sci.91:12243-12247(1994))。曾假设原纤维的细胞毒效应是由共同的机制介导的(Lorenzo和Yankner id.(1994);Schubert等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA92:1989-1993(1995))。淀粉样肽从可溶性单体向不溶性纤维沉淀物的自发转变可成为与Alzheimer病有关的神经变性的原因。在胰腺中纤维状人胰岛淀粉状蛋白的淀粉样沉积物在II型糖尿病中是主导性因素。
糖尿病可定义为慢性代谢性紊乱,其特征是血糖升高(高血糖症),与胰岛素的分泌或功能缺陷有关,伴随着慢性血管并发症,是最终引起疾病和死亡的主要原因(Zimmet等人,Nature,414:782-787(2001))。糖尿病有两种主要形式,I型和II型。I型糖尿病是一种自体免疫性疾病,由胰腺β细胞的进行性破坏所引起的,其次是异常的细胞免疫所引起的。这种疾病的特征是绝对需要胰岛素治疗才能生存,和在疾病的急性期中胰岛的淋巴细胞浸润。另一方面,II型糖尿病是一种代谢性疾病,其特征是存在胰岛β细胞功能的进行性衰竭,形成细胞毒性胰岛淀粉状蛋白(可溶或不溶形式),和胰岛素抵抗。这些变化引起了血糖调节的进行性衰竭,血糖升高(高血糖症),最终可引起并发症,包括糖尿病性眼,肾脏和神经病变,和动脉疾病和其他疾病,这些疾病可导致心脏病发作,中风和坏疽。尽管现在对这些原发性疾病没有一致认可的分子基础,外周胰岛素抵抗可能是启动疾病进展的原发病因。
在II型糖尿病的早期,外周胰岛素抵抗可能会被增加的胰岛素量和胰岛β细胞的增生所代偿,仅导致轻微的症状(Bell & Polonsky,Nature,414:788-791(2001))。但增加的胰岛素量也可增加胰岛淀粉状蛋白形成的可能性和随后其在胰岛β细胞邻近的细胞外沉积(MacArthur等人,Diabetologia,42:1219-1227(1999);Hoppener等人,N.Engl.J. Med.,343:411-419(2000);Jaikaran & Clark,Biochi.m Biophys.Acia,1537:179-203(2001))。
在II型糖尿病中胰岛淀粉状蛋白的出现在一个世纪以前就已经发现了。最初,在1869年,Paul Langerhans是第一个描述内分泌胰腺以及束细胞如何在腺泡细胞中悬浮和与其不连接的。1893年Laguesse将这些神秘的细胞命名为胰岛或朗格罕岛。1889年Oskar Minkowski在其切除胰腺的狗中获得的发现,将胰腺和糖尿病联系在一起。Bliss,M.,“胰岛素的发现”C.J.Pathol.19:873-82(1943)。但在1901年,在Johns Hopkins大学,Eugene Opie提供了一种缺失的联系,即显示在朗格罕岛中糖尿病与透明退行性变之间的病理学联系。他描述了一种透明染色物质,现在称为胰岛淀粉状蛋白,并注意到它和糖尿病之间的联系。Opie,E.L,“糖尿病与胰腺病变的关系:朗格罕岛的透明退行性变,”J,Exp.Med.5:527-40(1901)。这种透明物质的含淀粉特征是由Ahronheim在1943年所确定的,并由Ehrlick和Ratner在1961年通过碱性刚果红染色证实。Ahronheim,J-H.,“糖尿病中胰岛透明物质的特征”,Am.J.Pathol.19:873-82(1943);Ehrlich J.C.,Ratner I.M.,“朗格罕岛的淀粉样变性。在糖尿病和非糖尿病个体中胰岛透明物质的再研究”,Am.J.Pathol38:49-59(1961)。
1987年Cooper等人首先报道他们发现这种透明染色物质含有37个氨基酸单体,称为胰岛淀粉状蛋白。Cooper G.J.S.,Willis A.C.,“来自II型糖尿病病人富含淀粉状蛋白的胰腺的肽的纯化和定性”,Proc.Natl.Acad,Sci.USA 84:8628-32(1987)。淀粉状蛋白和II型糖尿病的综述见Melvin R Hayden和Suresh C Tyagi,“在II型糖尿病中‘A’是胰岛淀粉状蛋白和淀粉状蛋白”,JOP.J.Pancreas(Online)2(4):124-139(2001)。因此,胰岛淀粉状蛋白的主要成分是37氨基酸肽激素,胰岛淀粉状蛋白,通常是由胰腺内的β细胞分泌的(Cooper等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:8628-8632(1987);Cooper等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:7763-7766(1988);Cooper等人,Biochim.Biophys.Acta,1014:247-258(1989);Cooper,Endocr.Rev.,15:163-201(1994);Cooper & Tse,Drugs & Aging,9:202-212(1996))。胰岛淀粉状蛋白的分泌通常是和胰岛素的产生共同调节和共同分泌的,受相同的启动子和转录元件的控制。但其机制没有完全清楚,但可能是由过度分泌引起的,胰岛淀粉状蛋白相互作用形成纤维状聚集物,已知是胰岛淀粉状蛋白(Cooper,Endocr.Rev.,15:163-201(1994))。其他的特异胰岛淀粉状蛋白分子,如来自猴和猫的,含有可引起淀粉样原纤维形成的氨基酸序列(Cooper,Endocr.Rev.,15:163-201(1994);Goldsbury等人,J.Struct.Biol.,119:17-27(1997);Goldsbury等人,J.Mol.Biol.,285:33-39(1999))。在体外由全长人胰岛淀粉状蛋白(1-37)和这种多肽的片段一人胰岛淀粉状蛋白(8-37)和人胰岛淀粉状蛋白(20-29)形成的原纤维进行了详细地比较。据报道圆二色光谱发现原纤维的形成伴有不规则螺旋向β-片层/α-螺旋结构的构象转变。原纤维的形态学可通过电子显微镜来观察,显示了不同宽度和数量的初原纤维的形成。Goldsbury等人,“胰岛淀粉状蛋白全长和片段形成的淀粉样原纤维”,J.Structural Biol.130(2-3):352-362(June 2000)。也见Walsh等人,“淀粉样β蛋白原纤维形成”,J.Biol.Chem.274(36):25945-25952(1999)。
胰岛淀粉状蛋白与大量的淀粉状蛋白病理学情况有关,涉及几种疾病如Alzheimer病,免疫球蛋白轻链淀粉样变性,多种器官和全身淀粉样变性,和朊病毒脑病(Tjernberg等人,J Biol Chem,274:12619-12625(1999);Sipe & Cohen,J.Struct.Biol.,130:88-98(2000);Collinge,Annu Rev Neurosci,24:519-550(2001);Jaikaran &Clark,Biochim.Biophys.Acta.,1537:179-203(2001);Prusincr,N.Engl.J.Med.344:1516-1526(2001))。Alzheimer病是一种神经变性疾病,其特征是神经元的丧失和与其有关的细胞外老年斑和神经原纤维缠结的出现(Lanza等人,NatureBiotechnology,14:1107-1111(1996);Yankner,Naure Medicine,2:850-852(1996);Selkoe,Nature,399:A23-31(1999))。淀粉样沉积物主要是由β-淀粉样肽(Aβ)的聚合形式组成的(Goldsbury等人,Trends MoL Med.,7:582(2001))。朊病毒病也是神经变性疾病,主要是由正常细胞宿主朊病毒蛋白,PrPc的破坏形式组成的(Collinge,Annual Rev.Neurosci,24:519-550(2001))。在含有这些不同的淀粉样变的蛋白之间没有已知的结构同源性(Sipe & Cohen,J.Struct.Biol,130:88-98(2000)),但特别是在胰岛淀粉状蛋白和Alzheimer病和朊病毒脑病中见到的淀粉状蛋白结构之间有一些基本的差异(Tjernberg等人,J Biol Chem,274:12619-12625(1999);Goldsbury等人,J Struct Biol,130:217-231(2000);Baskakov等人,J.Biol.Chem.,276:19687-19690(2001);Collinge,Annual Rev.Neurosci.,24:519-550(2001);Goldsbury等人,Trends Mol.Med.,7:582(2001);Kallberg等人,J.Biol.Chem.,276:12945-12950(2001);Yang等人,Amyloid,8:10-19(2001));(Goldsbury等人,J.Struct.Biol.,119:17-27(1997);Goldsbury等人,J.Mol.Biol.,285:33-39(1999);Goldsbury等人,J.Struct.Biol.,130:352-362(2000);Jaikaran & Clark,BiochimBiophys Acta,1537:179-203(2001))。
圆二色光谱显示胰岛淀粉样原纤维的形成伴有不规则螺旋向β-片层/α-螺旋结构的构象转变(Goldsbury等人,J.Struct.Biol,130:352-362(2000))。相比,Alzheimer和朊病毒淀粉样变性包括多种不同类型的淀粉状蛋白生成蛋白,其中淀粉状蛋白的形成伴有α-螺旋含量的减少和β-片层结构的增加(Barrow等人,J.Mol.Biol.,225:1075-1093(1992);Pan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:10962-10966(1993))。特别是,Aβ和PrP在一个应该形成β链的多肽片段中隐藏了一个α-螺旋(Kallberg等人,J Biol Chem.,276:12945-12950(2001))。在PrPc中,这个区出现在螺旋2,位点179-191,而对于Alzheimer Aβ-肽,这种不一致性出现在位点16-23。当残基14-23被去除或改变为非不一致序列时,Aβ原纤维就不再形成了(Kallberg等人,J.Bio.l Chem.,276:12945-12950(2001))。相同的抑制效应通过将Aβ与对应于残基16-20的五肽孵育而产生(Tjernberg等人,J.Biol.Chem.,271:8545-8548(1996))。因此,α-螺旋/β-链不协调的伸展与这种类型的淀粉样原纤维的形成有关,对于Aβ和PrPc,涉及一种α-螺旋结构向β链形成的转变,见(Kallberg等人,J Biol.Chem.,276:12945-12950(2001))。这些发现支持的观点是在胰岛淀粉状蛋白和其他淀粉状蛋白病理学之间存在明显的结构/功能的联系。
以前关于Alzheimer病和朊病毒脑病的研究主要集中在Aβ的聚合特性上(Mazziotti & Perlmutter,Biochem.J.,332(Pt 2):517-524(1998);Bohrmann等人,J.Biol.Chem.274:15990-15995(1999);Tjernberg等人,J.Biol.Chem.,274:12619-12625(1999);Tjemberg等人,Chem.Biol,6:53-62(1999);Goldsbury等人,J.Struct.Bio.l,130:217-231(2000);Jensen等人,Mol.Med.,6:291-302(2000);Lannfelt & Nordstedt,J.Neural.Transm.Suppl.59:155-161(2000);Nunomura等人,J.Neuropathol Exp.Neurol.,59:1011-1017(2000);Chishti等人,J.Biol.Chem.,276:21562-21570(2001);Yang等人,Amyloid,8:10-19(2001)),和正常细胞朊病毒蛋白,PrPc转变为相应的绵羊疯痒病异构体,PrPSc(Hill等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:10248-10253(2000);Kourie & Shorthouse,Am.J.Physiol.Cell Physiol.,278:C1063-1087(2000);Thellung等人,Int.J.Dev.Neurosci.,18:481-492(2000);Baskakov等人,J.Biol.Chem.,276:19687-19690(2001);Jackson & Collinge,Mol.Pathol.,54:393-399(2001);Jansen等人,Biol.Chem.,382:683-691(2001);Prusiner,N.Engl.J.Med.,344:1516-1526(2001);Rudd等人,Biochemistry,40:3759-3766(2001);Tagliavini等人,Adv.Protein Chem.,57:171-201(2001))。由于这些淀粉样变与疾病的病理有关或是其主要原因,很多研究都集中于在体内阻止淀粉状蛋白形成的策略上。对于Aβ,很多研究是针对某些肽和非肽化合物,试图调节原纤维的形成,可通过许多体外测定方法来检测(Tjemberg等人,J.Biol.Chem.,271:8545-8548(1996);Bohrmann等人,J.Biol.Chem.,274:15990-15995(1999);Chyan等人,J.Biol.Chem.,274:21937-21942(1999);Findeis & Molineaux,Methods Enzymol,309:476-488(1999);Findeis等人,Biochemistry,38:6791-6800(1999);Bohrmann等人,J.Struct.Biol.,130:232-246(2000);Findeis,Biochim.Biophys.Acta.,1502:76-84(2000);Kuner等人,J.Biol.Chem.,275:1673-1678(2000);Forloni等人,FEBS Lett.,487:404-407(2001);Poeggeler等人,Biochemistry,40:14995-15001(2001))。
采用电子显微镜,硫磺素-T结合测定,和对胰岛素消化作用的易感性,典型的抗生素,四环素和强力霉素,据报道似乎可调节Aβ的形成和去除存在的淀粉状蛋白(Forloni等人,FEBS Lett.,487:404-407(2001))。蒽环霉素的另一个类型,4′碘化-4′-去氧阿霉素(IDOX)据报道也可在体外和体内抑制Aβ淀粉状蛋白的形成,以及其他的淀粉状蛋白生成蛋白(Merlini等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:2959-2963(1995))。作者推测IDOX可降低Aβ淀粉状蛋白的形成,增加存在的斑块的可溶性,因此可通过正常细胞的机制加速清除率(Merlini等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:2959-2963(1995))。Szarek等人(美国专利申请20010027186(2001年5月17日)宣称可通过含有膦酸酯和羧酸酯基团的化合物破坏Aβ-淀粉状蛋白。也可见Szarek等人1999年2月9日发布的美国专利No.5,869,469,“治疗淀粉样变性的膦酰羧酸酯化合物”,据说涉及在受者体内通过使用一种含有膦酸酯和羧酸酯基团,或一种药用可接受的盐类或其酯的化合物来调节淀粉状蛋白沉积的方法。专利宣称在优选的实施例中,在淀粉状蛋白生成蛋白和基底膜成分之间的相互作用可被调节。
刚果红,通常用作淀粉状蛋白染色的一种化合物(Khurana等人,J.Biol.Chem.,276:22715-22721(2001)),和多种衍生物也已经被认为在细胞培养中可抑制Aβ淀粉状蛋白的神经毒性,可能是通过稳定Aβ前淀粉状蛋白单体(Lorenzo & Yankner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:12243-12247(1994);Findeis,Biochim.Biophys.Acta.,1502:76-84(2000))。也见Caughey和Race于1994年1月4日发布的美国专利No.5,276,059,“抑制与淀粉状蛋白形成相关的疾病”。专利提到,刚果红可用于以下的方法,即鉴定一种哺乳动物患有与斑块中淀粉状蛋白生成蛋白沉积有关的疾病,并“为所述哺乳动物应用一种药理学有效量的药用可接受盐类或其衍生物,或其用量足以干扰淀粉状蛋白生成蛋白的形成或使已经在哺乳动物体内形成的淀粉状蛋白生成蛋白的结构不稳定”。专利深入提到该方法考虑到治疗大量的这种淀粉状蛋白生成的疾病,“发明的优选形式”据说是治疗,防止和/或抑制“在中枢神经系统组织出现的与斑块有关的疾病”。在另一种形式中,该法据说可用于针对涉及淀粉样斑块形成的内部器官疾病,包括胰腺内的斑块和“治疗胰腺中出现斑块的成人II型糖尿病”。
对于朊病毒脑病的其他策略最近也有报道(Aguzzi等人,Nat.Rev.Neurosci.,2:745-749(2001))。朊病毒专门是由一种错构的朊病毒异构体PrPSc组成的,来自PrPc的一种主要构象变化,后者是一种正常的宿主编码的糖酯锚着蛋白(Collinge,Annu.Rev.Neurosci.,24:519-550(2001))。已报道的关于吖啶和吩噻嗪衍生物的发现使作者相信许多化合物可作为治疗Creutzfeldt-Jakob病和其他朊病毒疾病的中间候选物质(Korth等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:9836-9841(2001))。检测了一定范围的三环化合物,据报道氯丙嗪和奎纳克林也可有效的逆转绵羊疯痒病毒感染的鼠细胞培养物中可形成疾病的朊病毒斑块(Korth等人,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,98:9836-9841(2001))。作者注意到中央三环上的脂肪族侧链是最大限度抑制朊病毒斑块形成羧必须的。Id.在另一项研究中,报道四环素可以:(i)结合和抑制淀粉样原纤维的装配,该原纤维是由对应于人PrPc残基106-126和82-146的合成肽产生的;(ii)去除从Creutzfeldt-Jakob病患者脑组织中提取的PrP肽聚集物和PrPSc的蛋白酶抗性;(iii)防止体外PrP肽诱导的神经元死亡和星形胶质细胞的增殖。据报道NMR光谱也发现了四环素的芳香质子和PrP106-126的Ala(117-119),Val(121-122)以及Leu(125)侧链质子之间的几种空间相互作用(Tagliavini等人,J.Mol.Biol.,300:1309-1322(2000))。
胰岛淀粉状蛋白在II型糖尿病的发病机制中的地位已经争论了很长时间,现在仍然不清楚(Cooper,Endocr.Rev.,15:163-201(1994);Cooper&Tse,Drugs &Aging,9:202-212(1996);Cooper,生理学手册。第7章:内分泌系统。第II卷:内分泌胰腺和代谢的调节(2001))。但在此认为胰岛淀粉状蛋白的慢性沉积可加速β细胞的丧失,是在II型糖尿病晚期β细胞功能丧失的重要因素。这种说法可由几种已出现的证据体系所支持。首先,人胰岛淀粉状蛋白可在大多数II型糖尿病患者中形成胰岛淀粉状蛋白(Hoppener等人,N.Engl.J.Mod.,343:411-419(2000);Jaikaran & Clark,Biochim Biophys Acta,1537:179-203(2001))。第二,人胰岛淀粉状蛋白,但不是非形成原纤维的变异体,可在细胞培养系统中引起胰腺胰岛β细胞的死亡(Lorenzo & Yankner,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:12243-12247(1994);Bai等人,Biochem.J.,343 Pt 1:53-61(1999))。第三,在转基因小鼠的胰腺中人胰岛淀粉状蛋白的位点特异性表达可通过β细胞的丧失重新产生糖尿病样的综合征(Verchere等人,Hormone &.Metabolic Research,29:311-316(1997);Soeller等人,Diabetes,47:743-750(1998);Hoppener等人,Diabetologia,42:427-434(1999))。
还有其他的不同于在此所描述和声明的一些途径已经用来尝试治疗淀粉状蛋白相关的疾病。Findeis等人公布的美国专利No,5,854,204,“可调节β淀粉状蛋白聚集的αβ肽”认为使用一种淀粉状蛋白生成蛋白或其肽片段,直接或间接与至少一种修饰基团偶联,这样化合物化合物当与天然的淀粉状蛋白生成蛋白或肽接触时,可调节天然淀粉状蛋白或肽的聚集。专利提到淀粉状蛋白生成蛋白或片段可以是甲状腺运载蛋白(TTR),朊病毒蛋白(PrP),胰岛淀粉状蛋白(LAPP),心钠利尿因子(ANF),κ轻链,λ轻链,淀粉状蛋白A,procalcitonin,cystatin C,β2微球蛋白,ApoA-I,凝溶胶蛋白,降钙素,纤维蛋白原或溶菌酶。
Simpkins等人于1999年1月12日公布的美国专利No.5,859,001,“多环苯酚化合物的神经保护效应”据说涉及使用一种在四环的环戊烷菲化合物结构中具有一个末端苯酚基团的非雌激素化合物来为细胞赋予神经保护作用,并治疗神经变性疾病。也可见Simpkins等人在2001年3月6日公布的美国专利No.6,197,833,“多环苯酚化合物的神经保护效应”。
Reiner等人在2001年4月24日公布的美国专利No.6,221,667,“调节淀粉样变的方法和组合物”中涉及的方法和组合物宣称可用于治疗淀粉样变和与其相关的疾病和状态,如Alzheimer病,通过给予可调节淀粉样变前体蛋白分解和淀粉状蛋白沉积的药剂,用来抑制出现淀粉状蛋白沉积的疾病中的淀粉样变。该法的基础据说是通过使用一种可移动的离子载体,如羰基氰化物p-(三氟甲氧基)苯腙在含有淀粉样变前体蛋白的细胞中调节淀粉样变前体蛋白的分解代谢。
Findeis等人在2001年8月21日公布的美国专利No.6,277,826,“含有D-氨基酸的β-淀粉样肽聚集物的调节物”据说涉及完全由D-氨基酸组成的肽,可调节天然β淀粉样肽的聚集。这些肽据说优选基于一种β淀粉样肽,优选含有3-5 D-氨基酸残基,包括至少两个D-氨基酸残基,分别选自D-亮氨酸,D-苯丙氨酸和D-缬氨酸。在一个特别优选的实施例中,专利提到肽是β淀粉样肽的一种retro-inverso异构体,在某些实施例中,该肽在氨基末端,羧基末端或两个末端进行修饰。优选的氨基末端修饰基团据说包括环状的,杂环的,多环的和分支的烷基,优选的羧基末端修饰基团据说包括酰胺基团,烷基酰胺基团,芳基酰胺基团或羟基。也见Findeis等人2001年10月16日公布的美国专利No.6,303,567,“含有D-氨基酸的β-淀粉样肽聚集物的调节物”。
现在还没有一种化合物被证明能够干扰胰岛淀粉状蛋白形成或破坏已有的胰岛淀粉状蛋白。据报道刚果红可在体外抑制胰腺细胞中人淀粉状多肽的毒性。但不是胰岛淀粉状蛋白原纤维的形成(Lorenzo & Yankner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:12243-12247(1994))。相反,据报道刚果红可通过抑制原纤维形成或通过与已形成的Aβ原纤维结合而抑制Aβ淀粉状蛋白的神经毒性。Id.
现在需要其他的方法来阻断淀粉状蛋白的产生和阻断与可溶性胰岛淀粉状蛋白向不溶性淀粉状多肽转变相关的毒性,并阻断初原纤维的形成。也需要阻断淀粉样β肽在神经元中的毒性,抑制淀粉样β肽的产生,并阻断可引起疾病的多种其他细胞毒性淀粉状蛋白的产生。
发明内容
本发明提供了采用一种或多种已确定类型的多环化合物在细胞中阻断淀粉状蛋白毒性的方法。也提供了减少细胞中淀粉状蛋白产生的方法。本发明的化合物和方法可用来防止和治疗各种类型的疾病状态,已知为所有淀粉状蛋白沉积物引起的淀粉样变性。
根据发明的另一个方面,提供了鉴定可阻断通常与淀粉状蛋白有关的毒性的化合物的方法,这些毒性作用来自可溶的胰岛淀粉状蛋白向不溶的胰岛淀粉状蛋白的转变和初原纤维的形成。
本发明也提供了鉴定多种淀粉样变性肽的有活性的细胞毒性构象异构体,并防止它们形成的方法。还提供了筛选用于本发明方法的化合物的方法,包括有效破坏胰岛淀粉状蛋白从可溶形式向不溶形式转变的化合物,抑制淀粉状蛋白前原纤维和原纤维聚集的化合物,和抑制淀粉状蛋白β原纤维和β片层形成转变所诱导的毒性的化合物。
本发明进一步涉及II型糖尿病的治疗和其中使用的药物。因此,在一个方面,本发明包括在受者体内治疗II型糖尿病的方法,优选人或其他哺乳动物受者或其他需要的合适个体,该方法包括通过给予本发明的适合的多环化合物从胰岛β细胞内或细胞外破坏胰岛淀粉状蛋白。在进一步的方面,本发明包括在受者体内治疗II型糖尿病的方法,优选人或其他哺乳动物受者或其他需要的合适个体,该方法包括通过给予本发明的适合的多环化合物从胰岛β细胞内或细胞外破坏胰岛淀粉状蛋白初原纤维形成。仍然在进一步的方面,本发明包括通过保护所述患者的胰岛β细胞免于死亡,通过从所述β细胞内或细胞外破坏胰岛淀粉状蛋白或胰岛淀粉状蛋白初原纤维的形成治疗受者的方法,优选人或其他哺乳动物受者或其他需要的合适个体。仍在进一步的方面,本发明包括治疗受者的方法,优选人或其他哺乳动物受者或有需求的其他合适个体,包括但不限于患有或有II型糖尿病危险的受者,在用在此所描述和声明的多环化合物治疗后得到胰岛β细胞功能衰竭的改善或减轻。仍在一个深入的方面,本发明包括治疗受者的方法,优选人或其他哺乳动物受者或其他有需求的合适个体,包括但不限于患有或有II型糖尿病危险的受者,包括从所述胰岛β细胞内或细胞外破坏胰岛淀粉状蛋白,并有助于清除胰岛淀粉状蛋白。仍在进一步的方面,本发明包括治疗受者的方法,优选人或其他哺乳动物受者或其他有需求的合适个体,包括但不限于患有或有II型糖尿病危险的受者,包括破坏人胰岛淀粉状蛋白,并帮助免疫识别和清除淀粉状蛋白。仍在进一步的方面,本发明包括治疗受者的方法,优选人或其他哺乳动物受者或其他有需求的合适个体,包括但不限于患有或有II型糖尿病危险的受者,包括用发明的多环化合物联合一种辅助治疗共同治疗所述的受者,所述辅助治疗如免疫治疗,可促进体内胰岛淀粉状蛋白或胰岛淀粉状蛋白前体或胰岛淀粉状蛋白初原纤维的清除。仍在进一步的方面,本发明包括治疗受者的方法,优选人或其他哺乳动物受者,或其他有需求的合适个体,包括但不限于患有或有II型糖尿病危险的受者,在用本发明的多环化合物联合其他辅助治疗共同治疗后得到胰岛β细胞功能衰竭的改善或减轻,所述辅助治疗如免疫治疗,可激发体内对胰岛淀粉状蛋白、胰岛淀粉状蛋白前体或胰岛淀粉状蛋白初原纤维的清除机制。仍在进一步的方面,本发明包括治疗受者的方法,优选人或其他哺乳动物受者或其他有需求的合适个体,包括但不限于患有或有II型糖尿病危险的受者,含有或包括用发明的多环化合物和如免疫治疗的辅助治疗方法联合治疗所述患者,它们共同破坏已经形成的人胰岛淀粉状蛋白和/或在所述β细胞中抑制从胰岛淀粉状蛋白形成胰岛淀粉状蛋白。
仍在进一步的方面,本发明包括采用硫磺素-T增强荧光法、放射活性淀粉状蛋白沉淀测定、电子显微镜法和在培养的胰岛β细胞中测定胰岛淀粉状蛋白的细胞毒性以及圆二色光谱体外测定多环化合物所致胰岛淀粉状蛋白破坏的方法。仍在进一步的方面,本发明涉及预防淀粉状蛋白相关疾病的方法,包括防止初原纤维的形成和/或减少已存在的初原纤维沉积物。
仍在进一步的方面,本发明包括采用硫磺素-T增强荧光法、放射活性淀粉状蛋白沉淀测定、电子显微镜法和在培养的胰岛β细胞中测定胰岛淀粉状蛋白的细胞毒性以及圆二色光谱在体外筛选作为破坏胰岛淀粉状蛋白的潜在药物的多环化合物的方法。
仍在进一步的方面,本发明包括使用发明的一个或多个多环化合物制造含有或包括多环化合物和其合适的药物载体的药物组合物,该组合物用于治疗受者,优选人或其他哺乳动物受者或其他有需求的合适个体,包括但不限于患有或有II型糖尿病危险的受者,通过下列的一项或多项:(i)破坏已形成的人胰岛淀粉状蛋白;(ii)抑制随后胰岛淀粉状蛋白形成胰岛淀粉状蛋白;(iii)改善胰岛β细胞功能;和/或(iv)减轻胰岛β细胞的功能衰竭。
本发明包括但不限于以前和/或在此所描述的对所有患有II型糖尿病或有进展为II型糖尿病或胰腺胰岛淀粉状蛋白或胰岛β细胞功能不良危险的哺乳动物种属的治疗方法。
申请人的发明是指采用一种或多种在此公开的、已鉴定的和/或声明的化合物制备和/或制造一种(多种)药物以治疗一种或多种紊乱、疾病、状态和/或在此提到的目的的方法。
附图说明
图1通过硫磺素-T荧光的增强显示了四环素和刚果红对人胰岛淀粉状蛋白的效应。
图2通过硫磺素-T荧光的增强显示了氯丙嗪对人胰岛淀粉状蛋白的效应。
图3通过硫磺素-T荧光的增强显示了选择的多环化合物对人胰岛淀粉状蛋白的效应。
图4显示了在四环素存在和不存在的情况下人胰岛淀粉状蛋白原纤维的电镜照片。
图5显示了在存在和不存在奎纳克林的情况下人胰岛淀粉状蛋白原纤维的电镜照片。
图6显示了在存在和不存在选择的多环化合物的情况下人胰岛淀粉状蛋白原纤维的电镜照片。
图7通过放射性标记沉淀显示了四环素对胰岛糊精原纤维的效应。
图8通过放射性标记沉淀显示了选择的多环化合物对胰岛糊精原纤维的效应。
图9通过圆二色光谱显示了刚果红对胰岛糊精原纤维的效应。
图10显示了刚果红对胰岛淀粉状蛋白原纤维介导的RJNm5F细胞毒性的保护效应。
发明详述
申请人已经发现了某些多环化合物可用于破坏胰岛淀粉状蛋白的形成,并可用于治疗II型糖尿病。这种策略并不依赖于通过受体介导的机制来阻断胰岛淀粉状蛋白介导的作用。实际上,对于胰岛淀粉状蛋白的细胞毒性成分不需要任何特异的机制进行结合,该策略主要针对破坏胰岛淀粉状蛋白的形成。在临床的环境下,在体内调节胰岛淀粉状蛋白,结合内源性清除机制,有改善β功能或防止β细胞功能进一步丧失和减少损失的潜在可能性。
本申请公开了细胞毒性效应是来自可溶的胰岛淀粉状蛋白向不溶性的转变,不管实际原纤维的形成与否,β链的形成可引起普遍的β-折叠片层结构。此外,这种转变作用的破坏可保护β细胞免受死亡。
在此胰岛淀粉状蛋白定义为含有人糊精,通过单体的人糊精的聚集形成不溶性的胰岛淀粉状蛋白或可溶的淀粉状蛋白前体,或对胰岛β细胞有细胞毒性的任何形式的人糊精。如在文中所提到的,人糊精原纤维在此也定义为胰岛淀粉状蛋白的成分。
通过多环化合物破坏胰岛淀粉状蛋白在此定义为不溶的人胰岛淀粉状蛋白全部或部分转变为可溶的前体,和/或减少或防止人糊精形成胰岛淀粉状蛋白的速率。在此定义中所包括的是多环化合物与胰岛淀粉状蛋白的相互作用,可引起胰岛淀粉状蛋白对胰岛β细胞的细胞毒性特性的改变。本申请认为有效使用非肽分子的前景在于:(i)减慢人胰岛淀粉状蛋白形成的速率或抑制其形成,和/或(ii)破坏人胰岛淀粉状蛋白的已存在形式。我们相信使用非肽多环化合物的方法可达到(i)和(ii),可作为一种专门的治疗方法或于其他治疗方法联合使用。
本发明认识到多环化合物已经以单一的用药方案用于治疗普通的精神失调(Drisko,J.Clin.Periodontol.,25:947-952(1998);Klein & Cunha,Med.Clin.NorthAm.,85:125-132(2001))。特别合适的是通过方便的途径如口服或胃肠外给予人体的一些组合物,这样可使这些化合物缓慢的应用于有II型糖尿病危险或已经患有该病的患者。
如在此所使用的,提到“多环化合物”也包括合适的多环化合物的组合。可破坏胰岛淀粉状蛋白的多环化合物,包括的化合物如奎纳克林(一种抗疟疾化合物),氯丙嗪(一种抗精神病化合物),和四环素(一种抗生素)。其他具有四环素,阿迪平,氯丙嗪和刚果红的核心结构的结构(如,吖啶,酚噻嗪,蒽环霉素以及融合环和联苯基结构的结合体)也是本发明的多环化合物。
根据本发明,提供了阻断通常与淀粉状蛋白有关的毒性的方法,所述的毒性来自细胞中可溶的胰岛淀粉状蛋白向不溶性胰岛淀粉状蛋白的转变和初原纤维的形成,所述的方法包括将所述的细胞与有效量的至少一种多环化合物接触,该化合物选自在此所包含的一组多环化合物。特别地是,该组多环化合物包括蒽,phenalene,菲,奎纳克林,吖啶,吖啶橙,中性红,氯丙嗪,亚甲蓝,酚噻嗪,芘,屈,苯[a]蒽,苯[m]蒽,苯[c]菲,和并四苯。这些分子共享一个多环结构的通用结构。也可使用具有相似多环结构的分子。
发明的方法可选择性的采用上述化合物的药物学可接受的盐类发挥效应。这些盐类通常可通过将化合物与一种合适的有机或无机酸或碱反应而制备。代表性的有机盐类包括甲磺酸盐,乙酸盐,草酸盐,己二酸盐,藻酸盐,天冬氨酸,戊酸盐,油酸盐,月桂酸盐,硼酸盐,苯甲酸盐,乳酸盐,磷酸盐,甲苯磺酸盐(tosylate),柠檬酸盐,苹果酸盐,马来酸盐,富马酸盐,琥珀酸盐,酒石酸盐,萘磺酸盐,甲磺酸盐,2-萘磺酸盐,烟酸盐,苯磺酸盐,丁酸盐,樟脑酸盐,樟脑磺酸盐,环戊烷丙酸盐,二葡萄糖酸盐,十二烷基硫酸酯,葡萄糖庚酸盐(glucoheptanoate),甘油磷酸盐,heptanoate,己酸盐,十一烷酸盐(undecanoate),2-羟基乙磺酸盐,乙磺酸盐等。代表性的无机盐类可从无机酸形成,如硫酸盐,重硫酸盐,半硫酸盐,盐酸盐,氯酸盐,高氯酸盐,氢溴酸盐,氢碘酸盐等。碱性盐的实例包括铵盐;碱金属盐类如钠盐,钾盐,等;碱土金属如钙盐,镁盐等;含有机碱的盐类如二环己基铵盐,N-甲基-D-葡萄糖胺,苯乙胺等;含氨基酸的盐类如精氨酸,赖氨酸等。这样的盐类可很容易地采用本领域已知的方法来制备。
如在此所使用的,术语“阻断通常与淀粉状蛋白有关的毒性”是指防止或抑制可溶性胰岛淀粉状蛋白向不溶性胰岛淀粉状蛋白转变和初原纤维形成所引起的对细胞和组织的有害和致死作用。
如在此所使用的,术语“β-构象异构体”是指具有某些程度β片层结构的非单体胰岛淀粉状蛋白。
如在此所使用的,术语“初原纤维”是指单一的初原纤维和更高等级的初原纤维结构,包括人胰岛淀粉状蛋白或其他哺乳动物胰岛淀粉状蛋白变异体的寡聚体形式,显示有一定数量的β-构象异构体,并是非单体的。
不受任何一种机制的限制,可以认识到能干扰可溶性胰岛淀粉状蛋白向不溶性胰岛淀粉状蛋白的转变和初原纤维形成的化合物能够阻断通常与淀粉状蛋白有关的毒性。这些化合物包括如在此所述的多环化合物。
另外,可防止或抑制淀粉样肽产生的组合物和防止或抑制淀粉样原纤维形成的化合物能够阻断通常与淀粉状蛋白有关的毒性。
传统的观点认为过高水平的淀粉状蛋白对细胞有细胞毒性作用,可导致细胞死亡。申请人发现构象的变化(如从可溶性胰岛淀粉状蛋白转变为不溶性胰岛淀粉状蛋白,β-构象异构体和/或初原纤维形成)是治疗所需的靶标。
此外,以前认为淀粉状蛋白聚集形成淀粉样原纤维可能是细胞毒性作用所需要的,但形成淀粉状蛋白毒性的生化机制尚不明确。申请人证明了聚集对细胞毒性的形成不是必须的;但抑制淀粉状蛋白的聚集是减少细胞毒性的另一种方式。
如在此所使用的,“淀粉状蛋白毒性”是指淀粉状蛋白对细胞的任何有害效应,特别是所述的构象转变或前原纤维的形成引起了有害的作用。
如在此所使用的,术语“接触”是指将化合物提供给细胞或细胞靶标。接触可发生在固相,液相或气相,是指发生在细胞外和细胞内的事件。本领域那些专业技术人员将认识到在体内将化合物提供给细胞可通过多种给药方式来达到,包括口服,舌下,静脉,皮下,经皮,肌肉,皮内,鞘内,硬膜外,眼内,颅内,吸入,直肠,阴道等。
如在此所应用的,术语“有效量”,当用在使用多环化合物的发明的方法时,是指化合物的剂量足以提供足够高的浓度以获得所需的结果。对于任何一种化合物的特异有效量依赖于多种因素,包括细胞的类型,给药的时间,疾病的严重性,所使用的特异化合物的活性,给药的途径,特异化合物的清除速率,细胞接触化合物的暴露周期,与特异化合物联合使用或一起使用的药物等。
在本发明的一个实施例中,提供了阻断淀粉状蛋白毒性的方法,通过阻断可溶的胰岛淀粉状蛋白向不溶的胰岛淀粉状蛋白的转变,和初原纤维的形成,其中淀粉状蛋白的毒性是淀粉状蛋白β肽的毒性。如在此所使用的,“淀粉状蛋白β肽”(Aβ)是指大约40至43个氨基酸残基的蛋白。淀粉状蛋白β肽主要是40个氨基酸的形式,即淀粉状蛋白β1-40,但淀粉状蛋白β1-42和淀粉状蛋白β1-43也与淀粉样原纤维和沉积有关。蛋白是通过其更大的前体水解裂解得到的,这些前体已知是淀粉样β前体蛋白(AβPP)。AβPP,淀粉状蛋白前体样蛋白家族的一个成员,以三种主要的亚型存在,分别为695,751和770个氨基酸残基,每种均含有淀粉样β肽的氨基酸序列。AβPP在粗面内质网中合成,传递至细胞表面作为内膜蛋白。AβPP存在于树突中,细胞体中和神经元轴突中,尽管其正常的神经元功能并不清楚。在细胞膜中的一些AβPP被内化至细胞中,在此被酶解处理成为一种淀粉状蛋白β肽。
经历几种分泌酶的蛋白水解AβPP形成多种形式的淀粉状蛋白β肽。分泌酶的一种类型,γ-分泌酶,在前体的羧基末端区切断AβPP,从每个前体分子中产生淀粉状蛋白β肽的单一拷贝。另一种类型的分泌酶,α-分泌酶,可在淀粉状蛋白β序列之中切断前体,因此这种酶的切割不产生淀粉状蛋白β肽。
淀粉状蛋白β肽是在Alzheimer病患者中枢神经系统中发现的老年斑中的主要成分。老年(或神经炎斑块),由淀粉状蛋白β蛋白的细胞外沉积物,营养不良的轴突和星形胶质细胞和小胶质细胞瘤组成,可分布在整个神经纤维网和大脑血管壁中。
根据本发明的另一个实施例,提供了阻断淀粉状蛋白毒性的方法,其中淀粉状蛋白的毒性是朊病毒蛋白毒性。如在此所使用的,“朊病毒”是指人朊病毒基因(称为PRNP)的产物,该基因定位于染色体20的短臂上,其开放可读框包括编码254个残基的一个外显子。正常的朊病毒基因产物,朊病毒蛋白(PrP)是一个结构性表达的细胞表面糖蛋白,通过一个糖脂接头与细胞膜结合。在中枢神经系统的神经元中发现了最高水平的PrP信使,但蛋白的功能未知。正常的细胞朊病毒蛋白和感染的朊病毒蛋白在氨基酸序列上是不同的,但类似于淀粉状蛋白,正常和感染的蛋白具有不同的三维构象。正常的朊病毒蛋白富含α-螺旋,具有四个推测的区域,和少量的β折叠片层构象。相比,感染的蛋白β折叠片层构象较多。正常和感染的蛋白也有不同的糖基化方式(见病理学,3.sup.rd ed.(1999)Rubin和Farber主编,Lippincott-Raven,1492-1496页)。
仍根据本发明的另一个实施例,提供了阻断淀粉状蛋白毒性的方法,其中淀粉状蛋白的毒性是胰岛淀粉状蛋白的毒性。如在此所使用的,“糊精”是指在朗格罕岛中的β细胞所分泌的胰岛素一起分泌的一种多肽。胰岛淀粉状蛋白是一个37-残基,C末端酰胺化的肽,在残基2和1的半胱氨酸之间有一个二硫键,序列中的多个片段足以形成含β片层的淀粉样原纤维(如,Nilsson和Raleigh,J.Mol.Biol.294:1375-85;Rhoades等人,Biochim Biophys Acta 1476:230-8(2000);和Tenidis等人,J.Mol.Biol.295:1055-1071(2000)),在超过95%的II型糖尿病患者中发现有胰腺淀粉状蛋白,是由胰岛淀粉状蛋白聚集形成的。
仍然根据本发明的另一个实施例,提供了阻断淀粉状蛋白毒性的方法,所述的毒性来自可溶性胰岛淀粉状蛋白向不溶性胰岛淀粉状蛋白的转变和初原纤维的形成,其中淀粉状蛋白的毒性是淀粉样A蛋白的毒性。如在此所使用的,“淀粉样A蛋白”是指具有大约76个氨基酸的多肽,来自主要在肝内合成的更大的前体脂蛋白,称为血清淀粉样A蛋白(SAA)。在刺激SAA合成后,SAA被变性,释放入循环中一个称为apoSAA的亚单位,被网状内皮细胞内化。在从网状内皮细胞释放进入含有粘多糖的纤维生成环境的过程中,可形成血清淀粉样P物质,层粘连蛋白,IV型胶原和ApoE和淀粉样原纤维,能形成淀粉状蛋白沉积(见病理学,3.sup.rd ed.见前,1228-1229页)。
仍然根据本发明的另一个实施例,提供了阻断淀粉状蛋白毒性的方法,其中淀粉状蛋白的毒性是甲状腺转运蛋白的毒性。如在此所使用的,“甲状腺转运蛋白”(TTR)是指一个27蛋白的突变形式,由肝脏分泌至血浆中,其正常的功能是作为甲状腺激素的屏障和视黄醛结合蛋白。已经阐明了蛋白的至少60种突变体形式,每种均产生家族性淀粉样变性多发神经病的一种变异体(FAP)。FAP最普遍的变异体是由甲状腺转运蛋白产生的,其中在残基30处发生一个氨基酸取代,由蛋氨酸取代缬氨酸。序列的修饰作用降低了四聚TTR的稳定性,可形成一个单体的中间产物,其构象发生变化(见病理学,3.sup.rd ed.见前,1225,1228页)。
仍然根据本发明的另一个实施例,提供了阻断淀粉状蛋白毒性的方法,其中淀粉状蛋白的毒性是AL淀粉状蛋白的毒性。如在此所使用的,“AL淀粉状蛋白”是指由免疫球蛋白轻链的可变区组成的蛋白,可来自κ或λ部分。免疫球蛋白的过量产生可引起其分泌至循环系统中,由于粘多糖,血清淀粉样P物质,层粘连蛋白,IV型胶原和ApoE的存在而提供了纤维生长的环境。在许多类型的细胞中,包括枯否细胞和内皮细胞,形成的淀粉样原纤维然后被蛋白水解处理,引起淀粉状蛋白沉积的形成(见病理学,3.sup.rd ed.见前,1226-1227页)。
仍根据本发明的另一个实施例,提供了减少细胞中淀粉状蛋白产生的方法,所述的方法包括将所述的细胞与有效量的在此描述的至少一种化合物,或对映异构体,双星状(diasteriomeric)异构体或其中任何两种或更多种的混合物,或其药学可接受的盐类接触。
减少淀粉状蛋白的产生可阻断或防止过量淀粉状蛋白对细胞的细胞毒性作用,并可阻断或防止淀粉样斑块的形成,如那些与多种淀粉状蛋白相关的疾病。可考虑多种减少淀粉状蛋白产生的方法,包括减少或防止淀粉状蛋白前体蛋白的产生,减少或防止可产生淀粉状蛋白的蛋白水解裂解作用,减少或防止淀粉状蛋白的翻译后修饰,通过增加膜稳定性减少或防止淀粉状蛋白前体蛋白的内化,等等。
在本发明的优选实施例中,淀粉状蛋白的产生通过减少淀粉状蛋白β肽,淀粉样朊病毒蛋白,胰岛淀粉状蛋白(胰岛淀粉状蛋白),淀粉样A蛋白,甲状腺运载蛋白或AL淀粉状蛋白而被阻断或防止。
仍根据发明的另一个实施例,提供了抑制神经细胞死亡的方法,所述的方法包括将神经细胞与有效量的在此描述或鉴定的至少一种化合物接触。
如在此所使用的,“神经细胞死亡”是指神经细胞数量的减少或神经细胞功能的丧失。神经细胞死亡的发生可通过凋亡通路的活化或加速,即程序性细胞死亡,或通过不涉及内源性细胞死亡程序的坏死性细胞死亡。坏死性细胞死亡通常来自急性创伤性损伤,典型地涉及细胞膜的迅速溶解。抑制神经细胞死亡可减少与两种类型的神经细胞死亡有关的神经细胞损失或神经细胞功能丧失。
仍然根据本发明的另一个实施例,提供了为需要治疗的受者治疗一种疾病的方法,所述的方法包括为受者使用一种治疗有效量的在此描述或鉴定的化合物。
如在此所使用的,“治疗”是指抑制或静息一种疾病、紊乱或状态的进展和/或使一种疾病,紊乱或状态减轻,缓解或消退。本领域的那些专业技术人员将会理解到多种方法学和检测方法可用来评价一种疾病,紊乱或状态的进展,多种方法学和检测方法可用来评价一种疾病,紊乱或状态的减轻,缓解或消退。
基本上,任何在病因学上与淀粉状蛋白形成和/或沉积有关系的疾病可考虑根据本发明进行治疗。如在此所使用的,“疾病状态”是指下列的紊乱,如Alzheimer病,系统性老年淀粉样变性,朊病毒病,绵羊疯痒病,牛海绵状脑病,克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease),格-斯-切三氏综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker symdrome),II型糖尿病(或任何糖尿病或其它状态,其特征为或具有形成或增加胰岛淀粉状蛋白含量的危险,包括胰岛素瘤),淀粉样A蛋白淀粉样变性,AL淀粉样变性,家族性淀粉样多神经病(葡萄牙,日本和瑞典型),家族性甲状腺运载蛋白淀粉样变性,家族性地中海热,家族性淀粉样肾病伴荨麻疹和耳聋(Muckle-Wells综合征),遗传性非神经性系统性淀粉样变性(家族性淀粉样多神经病III),芬兰型家族性淀粉样变性,家族性淀粉样心肌病(丹麦型),单独性心脏淀粉样变性,单独性动脉淀粉样变性,特发性(原发性)淀粉样变性,骨髓瘤或巨球蛋白血症相关淀粉样变性,与斯耶格伦综合征有关的原发性局部皮肤结节淀粉样变性,反应性(继发性)淀粉样变性,遗传性脑出血伴冰岛型淀粉样变性,与长期血液透析有关的淀粉样变性,纤维蛋白原相关的遗传性肾淀粉样变性,与甲状腺髓样癌有关的淀粉样变性,溶菌酶相关的遗传性系统淀粉样变性,等等。
在诊断有Alzheimer病,神经变性疾病的受者中发现有淀粉状蛋白沉积,神经变形疾病的特征是在大脑皮质,皮质下区和海马中神经细胞的萎缩,存在斑块,营养障碍的轴突和神经纤维缠结。在Alzheimer病中,营养不良或异常的轴突生长,突触丢失,和神经纤维缠结的形成与疾病的严重性强烈相关。营养障碍的神经元特征性的在轴突的细胞浆中含有丰富的电子致密的多层体,并有突触连接的破坏。营养障碍的神经元围绕着淀粉样沉积物,因此形成了遍及脑神经纤维网和脑血管壁的老年斑。发明治疗Alzheimer病的方法可减少或阻断神经细胞的萎缩,减轻或阻断老年斑或神经纤维缠结的形成等,这样疾病的进展被减慢或中止。
在诊断有II型糖尿病的患者的朗格罕岛中也发现了淀粉样沉积物。沉积物含有一种淀粉状蛋白,它来自一种称为胰岛淀粉状蛋白的更大的前体,它在正常动物中具有激素的作用。胰岛淀粉状蛋白由胰岛β细胞产生,对肝脏和横纹肌细胞的葡萄糖摄取有深刻的作用。在给予高脂肪饮食的具有人胰岛淀粉状蛋白转基因的转基因小鼠中,胰岛淀粉状蛋白的过度表达可引起胰岛淀粉状蛋白的沉积(见病理学,3.sup.rd ed,(1999)见前,1226页)。发明的治疗II型糖尿病患者朗格罕岛中淀粉状蛋白沉积的方法可减少或防止淀粉状蛋白的形成,减少或防止淀粉状蛋白形成淀粉状蛋白沉积,等。
淀粉状蛋白沉积很显著的其他疾病还有朊病毒病,海绵状脑病的一种类型。朊病毒病是神经变性疾病,其临床特征是进行性共济失调和痴呆,病理学上可见海绵状脑组织的空泡形成。淀粉状蛋白的沉积与至少一种已知的朊病毒病有关,如库鲁病。在库鲁病中,与结构性表达的细胞表面糖蛋白——正常的朊病毒蛋白相比,大约70%的朊病毒蛋白可在细胞外累积形成斑块(见see Pathology,3.sup.rd ed.见前,1492-1496页)。发明的治疗朊病毒病的方法可减少或防止淀粉状蛋白的产生,减少或防止淀粉状蛋白斑块的沉积,等等。
淀粉状蛋白沉积很明显的其他疾病还有淀粉状蛋白A淀粉样变性。淀粉样A蛋白淀粉样变性是指来自似乎无关的疾病的淀粉样变性,如慢性炎性疾病,肿瘤和遗传性疾病。淀粉状蛋白的沉积继发于基础疾病。前体分子是血清淀粉样A蛋白(SAA),一种急性期反应物,在许多疾病中可用作炎症的一种替代标志物。发明的治疗淀粉状蛋白A淀粉样变性的方法可减少或防止淀粉状蛋白的产生,减少或防止前体产生淀粉状蛋白,防止或减少产生活性淀粉状蛋白的几个必须步骤的任何一个,减少或防止淀粉样斑块的沉积,等等。
淀粉状蛋白沉积很明显的其他疾病还有家族性甲状腺运载蛋白淀粉样变性,是家族性淀粉样变性多神经病(FAP)的最普通形式。人淀粉样病,家族性淀粉样多神经病,家族性淀粉样心肌病和老年系统性淀粉样变性,是由不溶性甲状腺运载蛋白(TTR)原纤维引起的,后者沉积在外周神经和心脏组织中。甲状腺运载蛋白是一种同型四聚体血浆蛋白,涉及甲状腺素和视黄醇的转运。最普通的产生淀粉状蛋白的TTR变异体是V30M-TTR,而L55P-TTR是与FAP最易进展的形式有关的变异体。发明的治疗由甲状腺运载蛋白产生的淀粉样变性的方法可减少或防止淀粉状蛋白的产生,减少或防止前体产生淀粉状蛋白,防止或减少产生活性淀粉状蛋白的几个必须步骤的任何一个,减少或防止淀粉状蛋白斑块的沉积,等等。
此外淀粉状蛋白沉积很显著的疾病还有AL淀粉样变性。AL淀粉样变性是一类与原发性免疫球蛋白产生障碍有关的疾病,包括原发性淀粉样变性,浆细胞恶液质,免疫母细胞淋巴瘤,多发性骨髓瘤,等等。原发性系统性AL(淀粉样轻链)淀粉样变性是一种浆细胞疾病,其中淀粉样轻链蛋白的沉积导致进行性的器官衰竭。原发性淀粉样变性的预后通常很差,中位生存期为1-2年。前体蛋白是在局部和系统性AL-淀粉样变性中都存在的一种免疫球蛋白轻链,显示了相同的一级结构断裂和改变方式。发明的治疗由AL淀粉状蛋白引起的淀粉样变性的方法可减少或防止淀粉状蛋白的产生,减少或防止前体产生淀粉状蛋白,防止或减少产生活性淀粉状蛋白的几个必须步骤的任何一个,减少或防止淀粉状蛋白斑块的沉积等等。
如在此所使用的,“给药”是指向受试者提供治疗有效量的化合物,采用口服,舌下,静脉,经皮,肌肉,皮内,鞘内,脑膜外,眼内,颅内,吸入,直肠,引导和类似的给药。也可考虑以乳膏,洗剂,片剂,胶囊,丸剂,分散剂,颗粒,栓剂,糖浆剂,酏剂,锭剂,可注射溶液,无菌水溶液或不含水的溶液,悬液或乳剂,药膏等。活性成分可与无毒的,药学可接受的载体包括葡萄糖,乳糖,阿拉伯树胶,明胶,甘露醇,淀粉糊,三硅酸镁,滑石,玉米淀粉,角蛋白,胶体硅,马铃薯淀粉,尿素,葡聚糖等混合。
优选的给药途径可根据临床的指征而变化。在剂量上的一些变化必须根据被治疗的病人的状况而进行,无论如何,医生都可为病人单独确定合适的剂量。在各种因素中,每个单位用药量中的化合物有效量依赖于体重,生理状况,所选择的接种方案。一单位化合物用药量是指每次用药所使用的不含载体量的化合物重量(当使用载体时)。
靶向递送系统,如聚合物基质,脂质体,和微球体可在需要治疗药物的部位增加治疗药物的有效浓度,减少治疗药物的副作用。随着治疗药物更有效的递送,药物的全身浓度降低,因为给予了更少量的治疗药物,而获得了相同或更好的治疗结果。用于增加治疗药物递送效率的方法通常集中在将一个靶向部分附着于治疗药物上或载体上,该载体随后可与治疗药物装填在一起。
通过使用如蛋白,肽,多糖,合成聚合物,胶体颗粒(即脂质体,囊泡或微胶粒),微乳剂,微球体和毫颗粒设计了多种药物递送系统。这些载体,含有载于其中的药学有用的药物,是准备用来控制细胞特异性或组织特异性药物的释放。
在此所述的化合物可以脂质体的形式给药。如在本领域中已知的,脂质体一般来自磷脂或其他脂类物质。脂质体是通过单层或多层的含水液体结晶形成的,可以分散在水介质中。可使用任何能够形成脂质体的无毒,生理学可接受的和可代谢的脂类。在此所述的化合物,当以脂质体形式时,除在此所述的化合物以外,还可含有稳定剂,防腐剂,赋形剂等。优选的脂类是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂),天然的和合成的均可。
形成脂质体的方法在本领域中是已知的(见,如Prescott主编,细胞生物学方法,XIV卷,Academic Press,纽约,N.Y.,(1976),33页以及后面等等)。
可使用几种递送方法来将治疗药物绕过血脑屏障递送至脑。这种方法使用鞘内注射,手术植入(Ommaya,Cancer Drug Delivery,1:169-178(1984)和美国专利No,5,222,982),间质输注(Bobo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2076-2080(1994))等。这些策略通过直接用药于脑脊液(CSF)或脑实质(ECF)中将药物递送至CNS中。
药物通过脑脊液向中枢神经系统的递送,例如可通过硬膜下可植入装置来完成,其发明者为其命名为“Ommaya储备池”。药物注射进装置中,随后释放进脑周围的脑脊液中。这样可直接定向于所接触的脑组织的特殊区域,然后可吸收药物。这种吸收是受限制的,因为药物不能自由转移。一种改良的装置被用来进行药物的给药,其中储备池被种植在腹腔中,被注射的药物通过脑脊液(从脊柱中摄取并返回至脊柱中)被转运至脑室腔内。通过Ω-3的衍生作用,部位特异的生物分子复合体可克服受限制的吸收,治疗药物可通过脑组织进行移动。
另一种改善药物向CNS递送的策略是通过增加药物经血脑屏障的吸收(吸收和转运)和细胞对治疗药物的摄取(Broadwell,Acta Neuropathol.,79:117-128(1989);Pardridge等人,J.Pharmacol Experim.Therapeutics,255:893-899(1990);Banks等人,Progress in Brain Research,91:139-148(1992);Pardridge,Fuel Homeostasis andthe Nervous System,ed.:Vranic等人,Plenum Press,New York,43-53(1991))。药物通过血脑屏障进入大脑可通过提高药物本身的渗透性或改变血脑屏障的特性而被增强。因此,通过化学修饰增加药物的脂质溶解度,和/或通过与阳离子载体的偶联,或通过与能够经过血脑屏障转运药物的肽载体共价偶联来促进药物的通过。肽转运载体也已知是血脑屏障渗透剂化合物(美国专利No.5,268,164)。有亲脂特性用于向大脑递送的部位特异性大分子在美国专利No.6,005,004中进行了描述。
其他实例(美国专利No.4,701,521和美国专利No.4,847,240)描述了将一种药物和一种阳离子大分子载体共价结合的方法,该载体可以相对高的速率进入细胞内。这些专利使我们认识到当与阳离子树脂共价结合时,细胞摄取生物分子进入细胞内是增强的。
美国专利No.4,046,722公开了与阳离子聚合物共价结合的抗癌药物,目的是引导它们到达携带特异抗原的细胞。聚合的载体的分子量大约为5,000至500,000。这些聚合的载体可用来将在此所述的化合物以靶向的方式进行递送。
进一步的工作涉及一种药物和一种阳离子聚合物通过一种酸敏感的中间体(也认为是一个间隔子)分子共价结合,在美国专利No.4,631,190和美国专利No.5,144,011中进行了描述。多种间隔分子,如顺式乌头酸,可与药物和聚合载体共价结合。当酸度轻度增加时,如可能发生在细胞的溶酶体中,它们可控制药物从大分子载体中释放。药物可选择性地从分子共轭物中水解,并在细胞中以其未修饰的和活性的形式释放。分子共轭物转运至溶酶体中,在此它们在溶酶体酶的作用下,在较细胞或体内其他区室或液体实质上更酸性的pH下进行代谢。溶酶体的pH显示大约为4.8,而在共轭物消化的最初阶段,pH可能低至3.8。
如在此所使用的,术语“治疗有效量”,当用来说明使用多环化合物的发明的方法时,是指足以提供的循环浓度能够对接受者产生有益影响的化合物的剂量。对任何特殊患者的特殊的有效剂量水平将依赖于多种因素,包括要治疗的疾病,疾病的严重程度,所使用的特殊化合物的活性,给药的途径,特殊化合物的清除率,治疗的持续时间,用来与特殊的化合物联合或一起使用的药物,患者的年龄,体重,性别,饮食和大体健康情况,和在医学领域和科学中为人熟知的类似因素。剂量水平通常的范围是大约0.001至100mg/kg/天;大约0.05至10mg/kg/天范围内的水平是优选的。
根根据发明的另一个实施例,提供了在有发作危险的受试者中防止疾病的方法,所述的方法包括给予所述的受试者治疗有效量的至少一种在此所述的化合物。
如在此所使用的,术语“防止疾病”是指避免有疾病发作危险,但未诊断出患有疾病的受试者发生疾病,障碍或病症。本领域的那些专业技术人员将能够理解可使用多种方法来确定受试者具有患病的危险,受试者是否有患病危险将依赖于本领域专业技术人员所了解的多种因素,包括受试者的遗传结构,年龄,体重,性别,饮食,大体健康状况,职业,与环境条件的接触,婚姻状况和类似因素。
如在此所使用的,“孵育”是指在待化合物和目标细胞之间的接触。细胞可以任何目的细胞,包括神经元细胞,神经胶质细胞,心脏细胞,支气管细胞,子宫细胞,睾丸细胞,肝细胞,肾细胞,肠细胞,胸腺和脾脏的细胞,胎盘细胞,内皮细胞,内分泌细胞包括甲状腺,甲状旁腺,脑垂体和类似细胞,平滑肌细胞,骨骼肌细胞和类似细胞。
候选化合物可从大量的来源中获得,包括合成的或天然的化合物库。例如,大量的方法可用来随机和定向的合成很多种有机化合物和生物分子,包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。可选择的是,可使用或很容易产生以细菌,真菌,植物和动物提取物形式的天然化合物库。可选择的是,天然的或合成产生的库和化合物可以很容易地通过常规的化学,物理和生物化学方式来修饰,可用来产生组合库。已知的药物学物质可进行定向或随机的化学修饰,如酰化作用,烷化作用,酯化作用,酰胺化作用等,来产生结构类似物。
许多其他的试剂包括在筛选测定中,包括盐类,天然蛋白,如白蛋白,去垢剂等,可用来促进最佳的结合和/或减少非特异性或背景相互作用。可使用能提高测定效率的试剂,如蛋白酶抑制剂,核酸酶抑制剂,抗微生物剂等。为提供所需要的结合作用,可以任何顺序加入混合物的各种成分。可在任何合适的温度下进行孵育,一般在4和40℃之间。选择孵育时间以获得最佳的活性,也可优化促进迅速的高通量筛选。一般在0.1和10小时之间就足够了。
仍根据本发明的另一个实施例,提供了调节淀粉状蛋白,特别是胰岛淀粉状蛋白的聚集的方法。调节淀粉状蛋白的聚集可防止或延缓与淀粉状蛋白沉积相关疾病的发作。在调节淀粉状蛋白聚集的方法中,淀粉状蛋白与在此所述的化合物接触,以便改变淀粉状蛋白的聚集。如在此所使用的,术语“调节”是指抑制淀粉状蛋白聚集和促进淀粉状蛋白的聚集。淀粉状蛋白的聚集可被在此所述的一种或多种化合物抑制,与缺乏相同的一种或多种化合物时相比,具有在此所述的一种或多种化合物的情况下,淀粉状蛋白聚集的量和/或速率减小。聚集的抑制包括完全部分抑制淀粉状蛋白。聚集的抑制可以聚集的延迟时间内增加的倍数或在聚集的总体平高限水平(即,聚集的总量)中的降低来定量,使用本领域专业技术人员已知的聚集测定法。可选择地,淀粉状蛋白的聚集可被在此所述的一种或多种化合物促进,与缺乏一种或多种相同的化合物相比,具有在此所述的一种或多种化合物的情况下淀粉状蛋白聚集的量和/或速率是增加的。
因此如在此所使用的,术语“多环化合物”是指具有这些效应或一种效应的任何多环化合物。适合的多环化合物的实例(但仅仅限制于)包括融合的三环化合物,融合的四环化合物,融合的五环结构或其他融合的多环物,以及以二维或非二维方向的融合环和联苯结构的组合。多种化合物描述如下。
如在此所使用的术语“多并苯”是指通常含有两个或多个融合芳香环的分子结构。优选具有三个,四个或五个融合芳香环的多并苯。多并苯的环原子通常是碳结构的,但也可包括一个或多个氮,氧和/或硫。多并苯的核心结构实质上是平面的,其特征是可允许核心原子之间的π-电子广泛的重叠。本发明的多并苯可选择性的被一些取代基取代,例如可增强水溶解度,增强π-堆集效应,或增强药物的功效或改善治疗效果的取代基。
如在此所使用的术语“三,四和五元环的多并苯”是指含有三个,四个和五个融合芳香环的分子结构。三,四和五元环的多并苯的环原子通常是碳,但也可包括一个或多个氮,氧,和/或硫。三元环多并苯的实例包括但不限于蒽,phenalene,菲,奎纳克林,中性红,氯丙嗪,吖啶,吖啶橙,亚甲蓝,邻二氮杂菲,吩嗪和吩噻嗪。四元环多并苯的实例包括芘,屈,苯[a]蒽,苯[m]蒽,和并四苯。五元环多并苯的代表性实例是苯[c]蒽。
多并苯的核心结构优选实质上是平面的,其特征是可允许核心原子之间的π-电子的广泛重叠。本发明的多并苯可选择性的被一些取代基取代,例如可增强水溶解度,增强π-堆集效应,或增强药物的功效或改善治疗效果的取代基。
从商业途径可获得众多取代的三-、四-和五-元环多并苯。其它的可采用专业技术人员已知的方法制备。特别用于将取代基引导至三-、四-和五-元环多并苯上的反应是已知为亲电子芳香取代的反应类。亲电子芳香取代的实例包括:Friedel-Crafts烷化作用(用于将烷基附着到三-、四-和/或五-元环多并苯上的一个或多个位点;Friedel-Crafts酰化作用(用于将羧基共价地附着到三-、四-和/或五-元环多并苯上的一个或多个位点;亚硝化作用(用于引导亚硝基部分(-NO)到三-、四-和/或五-元环多并苯上的一个或多个位点;磺化作用(用于引导硫酸根(-SO3-)到三-、四-和/或五-元环多并苯上的一个或多个位点;硝化作用,用于引导硝酸根(-NO2),它也可以是还原的卤化作用,用于引导F、Cl、Br和I;重氮偶合,用于耦合通过(-N=N-)部分连接的芳香环,重氮基见于例如刚果红、柯胺G和苋菜红中。
专业技术人员会承认,经亲电子芳香取代方法导入三-、四-和/或五-元环多并苯的几个成分可被还原。例如,硝基和亚硝基基团可被还原成氨基,磺酸基可被还原成硫醇。此外,专业技术人员会承认,导入三-、四-和/或五-元环多并苯的这几种成分是本身有反应性的并可用作功能基团。例如,氨基和羧基部分用作酰胺键前体;硫醇部分被特别地用作连接子成分。
专业技术人员还会在本发明的其它实施例中考虑部分还原的多并苯,例如,在四环素和强力霉素分子中的并四苯框架。
三-元环多并苯
蒽 PHENALENE 菲
R(在任何化合物中可以是相同或不同的,并可以包括H)表示采用专业技术人员已知的方法导入的成分,例如已知为亲电子芳香取代的方法。上面显示的结构也表示化合物的一个、几个或所有R是氢的情况。融合的三环化合物还包括在任何如上显示编号的核心原子上取代的衍生物。还包括在核心三环的环状结构中的双键结构修饰,以及随后的核心原子或侧链修饰,包括如蒽和菲插图所示在4a、4b、5a、8a、9a和10a原子处的修饰。代表性的例子是奎纳克林、中性红、氯丙嗪、吖啶、吖啶橙、亚甲蓝和苯二嗪(如下)。虽然多并苯分子通常实质上是平面的,专业技术人员公认多并苯的部分还原可引起非平面化。因此,本发明的融合环状化合物可以是平面的或非平面的,并可有饱和或非饱和环状结构的任意联合。结构还可具有位于所展示的任何可选择方位的任意苯基环。
取代和非取代的三-元环多并苯
四-和五-元环多并苯
R(在任何化合物中可以是相同或不同的,并可以包括H)表示采用专业技术人员已知的方法导入的成分,例如已知为亲电子芳香取代的方法。上面显示的结构也表示化合物的一个、几个或所有R是氢的情况。融合的蒽环结构还包括如所示在任何编号的核心原子上取代的衍生物。还包括在核心蒽环的环状结构中的双键结构修饰,以及随后的核心原子或侧链修饰,包括如以上并四苯插图所示在4a、5a、6a、10a、11a和12a原子处的修饰。虽然多并苯分子实质上是平面的,专业技术人员公认多并苯的部分还原引起非平面化。因此,本发明的融合环状化合物可以是平面的或非平面的,并可有饱和或非饱和环状结构的任意组合。结构还可具有位于所展示的任何可选择方位的任意苯基环。代表性的例子是四环素和强力霉素。
四环素 强力霉素
融合环和联苯结构结合的代表性例子
结构也可具有融合的与联苯环同位于所展示的任何可选择方位的任意苯基环的任何组合。这些结构可以是平面的或非平面的,对称的或非-对称的,以及可具有饱和或非饱和环状结构的任何组合。结构还可具有位于所展示的任何可选择方位的任意苯基环。这些结构还包括在任何芳香环原子上取代的衍生物。还包括在环状结构中的双键结构修饰,和随后的原子或侧链修饰。
下面的实施例是要举例说明,并不以任何方式、形态或形式明确地或暗示地限制本发明。虽然可能被使用的是典型的,但本领域技术人员已知的其它步骤、方法学或技术是可选择使用的。
实施例1
材料和方法
材料:合成的人(Lot 5429559和Lot 0551805)和大鼠糊精(Lot 0542554和Lot0542554)是来自Bachem California(Torrance,CA)的HPLC-纯化产物。肽新鲜溶解在灭菌的milliQ水中,然后在适当的缓冲液中稀释至其终浓度。按照以前描述的的方案(25)合成Tritated人糊精(145.3MBq/mmol和大鼠糊精(22.6GBq/mmol)。所有含糊精肽的孵育在22℃进行。所有多环化合物和硫黄素-T购自Sigma(StLouis,MO)。每次实验在灭菌的milliQ水中新鲜制备储备液。钙黄绿素-AM和溴乙非啶同型二聚体-1(EthD-1)获取自分子探针(Eugene,OR,USA)。大鼠胰岛瘤细胞系RINm5F从National Institutes of Health,Bethesda,MD获得,并在含5%CO2的湿化气中37℃培养。细胞培养基及其添加物购自GibcoBRL-Life Technologies(Auckland,New Zealand)。
硫黄素-T结合荧光试验.使用SpectraMAX Gemini XS荧光分光光度计(MolecularDevices Corporation,Sunnyvale,CA),通过荧光分光术检测各种多环化合物对胰岛淀粉形成的影响。采用495nm处分界滤光片设置激发和发射峰值分别为450nm和510nm。硫黄素-T与糊精原纤维结合,但不与单体糊精结合(Goldsbury等人,(1999),J.Mol.Biol.,285:33-39)。当与糊精原纤维结合时,硫黄素-T显示了显著增加的荧光,可以用荧光分光光度计量化(Goldsbury等人,(1999),J.Mol.Biol.,285:33-39)。在有或无可能的抑制性药物的情况下,通过跟踪硫黄素-T荧光测定糊精原纤维形成的速率。在这些条件下,多环化合物四环素、刚果红、中性红、亚甲蓝和氯丙嗪没有固有荧光。在没有糊精情况下,吖啶和吖啶橙的本底荧光被从实验结果中减去。在没有药物情况下,对照制剂含人糊精和硫黄素-T。在这些条件下,荧光增强的速率被用来比较有和无药物情况下糊精原纤维的形成。所有其它的实验条件是相同的。
带有硫黄素-T的三脯氨酰糊精和大鼠糊精也被用作另外的对照。三脯氨酰糊精是修饰形式的糊精,它不再含有淀粉状蛋白生成区,因而不能形成原纤维(Evans & Krentz,(1999),Drugs R D,2:75-94),而大鼠糊精不能自发地形成原纤维(Cooper,(1994),Endocr.Rev,15:163-201)。
电子显微镜法 在有或无奎纳克林或四环素的情况下,人糊精孵育在10mM tris pH7.4溶液中。在不同的时间点取出样本并准备电子显微镜检查。等分试样(8μl)的糊精原纤维制剂在200目铜网上的辉光放电的碳包被胶棉膜上被吸收1min。吸干铜网,用去离子水滴冲两次并用2%(w/v)乙酸双氧铀染色,在120kV运行的Phillips Technai透射电子显微镜中检查铜网。
放射性标记沉淀试验 放射标记的人和大鼠糊精原纤维沉淀被用作独立的方法,监测在有或无可能的糊精原纤维形成抑制剂的情况下,糊精原纤维的组装。在无或有100μM四环素(这里的实施例5)或200μM可能的抑制性药物(这里的实施例5)的情况下,痕量[3H]-人糊精以不同次数加入至10μM糊精溶液中。然后以16,000xg或100,000xg离心孵育的混合物20min,测定离心后残存在上清中的[3H]-人糊精的量(Beckman LSW3801 β-计数器,USA)。结果表示为每分钟的沉淀性计数相对于上清总放射活性的百分比。
单体人糊精的制备:人糊精(批号0551805)获自Bachem(Torrence,CA)。如Padrick和Miranker,2002所述制备糊精储备液。人糊精溶解在6M盐酸胍/50mM磷酸钾,pH6.0中,并加载在C18反相旋转柱(Harvard Biosciences)上。然后顺序地用10%乙腈、0.2%三氟乙酸和水冲洗柱。以100%HFIP(六氟异丙醇)洗脱单体糊精。此糊精储备液然后用于所有的圆二色性实验。
圆二色性试验(circular dichroism assay).在Pi-Star 180分光仪(AppliedPhotophysics,Leatherhead,UK)上检测圆二色性谱。在100%HFIP或100mM氯化钾/50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)和2.5%HFIP中25℃进行检测。单体人糊精储备液被稀释成2.5%HFIP和大约5μM糊精终浓度的缓冲液以启动糊精原纤维的形成。用25μs的采样周期和±0.01mdeg的适应性抽样,以1nm间隔采集谱。在有或无刚果红或苋菜红的情况下,在人糊精储备液加入磷酸盐缓冲液后立即记录检测结果。
细胞培养和细胞毒性试验 在含10%胎牛血清、290μg/mL L-谷氨酸盐、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养RINm5F细胞。以每孔15×104细胞的密度覆盖细胞,孵育48h,用PBS漂洗并置于含刚果红的新鲜培养基中。在Milli-Q水中新鲜制备的人糊精与刚果红预孵育30min,然后加入细胞培养基中至终浓度30μM。在有或无100μM刚果红的情况下,用人糊精处理细胞22h。通过用钙黄绿素-和溴乙非啶同型二聚体-1双染色测定细胞活力。用配有Zeiss滤器装置#09的Zeiss AxiovertS100显微镜同时显现绿色荧光的活细胞和红色荧光标记核的死细胞。采用ZeissAxioCam数码相机拍摄400x放大倍数的照片。
实施例2
多环化合物对人糊精引起的硫黄素-T荧光增强的影响
四环素和刚果红对人糊精引起的硫黄素-T 荧光增强的影响(图1).在有硫黄素-T(10μM)情况下,四环素(700μM)(▲)或刚果红(700μM)(●)在10mM tris pH7.4中与单体人糊精(70μM)孵育。如本方法所述在72小时内监测反应的荧光。仅含人糊精和硫黄素-T(■)的对照制剂被用来比较没有药物情况下的糊精原纤维形成和存在四环素或刚果红情况下的原纤维形成。带有硫黄素-T的三脯氨酰糊精()和大鼠糊精(◆)作为另外的对照,因为在这些试验条件下,三脯氨酰或大鼠糊精均不自发地形成原纤维。每个数据点表示为三个独立反应的均值±标准差。
在有四环素情况下,糊精原纤维相关的荧光开始形成但明显减少直至2小时,随后在接下来的70小时内荧光逐渐减少(图1A)。此荧光减少与糊精原纤维的分解相关,如电子显微镜法所见。硫黄素-T和人糊精联合在有四环素情况下的初始相(图1B)与硫黄素-T单独与人糊精联合的初始相相似,但低于后者。然而,在有四环素情况下,有第二个显著的硫黄素-T与糊精原纤维的解离相,在对照反应中未见(图1C)。这与24小时及以后的糊精原纤维破坏相关,如电子显微镜下所见。在有刚果红和硫黄素-T情况下,人糊精显示没有超过大鼠对照制剂的荧光增加,提示刚果红可抑制糊精原纤维形成或抑制硫黄素-T与糊精原纤维的结合。
氯丙嗪对人糊精引起的硫黄素-T荧光增强的影响(图2).在有硫黄素-T(10μM)情况下,氯丙嗪(700μM)(▲)在10mM tris pH7.4中与单体人糊精(70μM)孵育。如本方法所述在24小时内监测反应的荧光。曲线显示仅含人糊精和硫黄素-T的对照(■)符合单相关联,而存在氯丙嗪情况下,人糊精和硫黄素-T的曲线符合双相指数关联。每个数据点表示三个独立反应.的均值±标准差。
在有氯丙嗪情况下,糊精原纤维的形成大约抑制60%。含人糊精、硫黄素-T和氯丙嗪的实验结果的最佳拟合曲线显示硫黄素-T与人糊精的初始指数关联,与仅含人糊精和硫黄素-T的对照所见相似。然而,其后跟随对照中未见的第二个较慢的指数关联相,这显示了氯丙嗪对糊精原纤维形成的抑制作用。
选择的多环化合物对人糊精引起的硫黄素-T荧光增强的影响(图3).吖啶、吖啶橙、中性红和亚甲蓝是选择的融合三环环状化合物的实例,四环素是融合的四环化合物,而刚果红是两对具有插入联苯结构的融合环的联合。化合物结构显示在适当插图的旁边。在有硫黄素-T(10μM)情况下,终浓度为1200μM的吖啶橙(◇)、中性红(◆)、亚甲蓝(□)、刚果红(▲)、吖啶(△)、氯丙嗪()和四环素(●),在10mM tris pH7.4中与单体人糊精(60μM)孵育。如本方法所述在24小时内监测反应的荧光。包括仅含人糊精和硫黄素-T(■)的制剂作为无药物比较。在每个实验中,具有硫黄素-T的大鼠糊精(○)作为阴性对照,因为大鼠糊精不自发地形成原纤维。每个数据点表示三个独立试验的均值±标准差。
与人糊精同硫黄素-T单独孵育的荧光立即和持续增加相比,在有20倍摩尔过量的吖啶橙、中性红、亚甲蓝或刚果红存在时,人糊精和硫黄素-T的孵育显示硫黄素-T强化的荧光没有增加。此荧光的相对减少可能是由于结合到现有淀粉状蛋白上的硫黄素-T的置换,或可选择地由于这些多环化合物的存在导致淀粉状蛋白含量的直接减少。
当四环素与人糊精和硫黄素-T孵育时,发生荧光立即增加,随后在接下来的24h内荧光逐渐减少。硫黄素-T与人糊精联合的初始相在有四环素情况下和仅有硫黄素-T和人糊精的情况相似但显著地低。然而,当四环素存在时,具有半衰期为3.4小时的显著的第二个解离相,这在对照反应中并未见到。
此改变与沉淀性淀粉状蛋白含量的减少相关(图7和8),如24h时通过电子显微镜法观察到的淀粉样原纤维形态学的改变(图4C、4D、6C和6D)。在中心芳香环上含脂肪族侧链的三环化合物氯丙嗪,显示对糊精原纤维相关的硫黄素-T荧光增强的抑制很少,表明此化合物与吖啶橙、中性红、亚甲蓝、刚果红和四环素相反,不能有效地置换硫黄素-T或抑制淀粉状蛋白的形成。相反,仅含母体吩嗪结构的吖啶显示可中度程度地降低硫黄素-T强化的荧光。
实施例3
通过电子显微镜法检测多环化合物对人胰岛淀粉状蛋白形成的影响
在有和无四环素情况下人糊精原纤维的电子显微镜观察(图4).10倍摩尔过量的四环素与人糊精孵育。在不同时间点取出样本并按照本方法描述的步骤准备进行电子显微镜观察。
1.70μM人糊精,孵育1.5h后。放大倍率:x20,500
2.70μM人糊精+700μM四环素,孵育1.5h后。放大倍率:x20,500
3.70μM人糊精,孵育5h后。放大倍率:x20,500
4.70μM人糊精+700μM四环素,孵育5h后。放大倍率:x20,500
5.70μM人糊精,孵育29h后。放大倍率:x20,500
6.70μM人糊精+700μM四环素,孵育29h后。放大倍率:x20,500
7.70μM人糊精,孵育48h后。放大倍率:x20,500
8.70μM人糊精+700μM四环素,孵育48h后。放大倍率:x20,500
9.70μM人糊精,孵育29h后。放大倍率:x220,000
10.70μM人糊精+700μM四环素,孵育29h后。放大倍率:x220,000
11.70μM人糊精+700μM四环素,孵育48h后。放大倍率:x105,000
12.70μM人糊精+700μM四环素,孵育48h后。放大倍率:x220,000
同没有四环素的人糊精对照孵育(4A,4C)相比,四环素的存在看起来在1.5小时和5小时的孵育早期时间点可减慢人糊精原纤维形成的速率(4B,4D)。在29小时和48小时的较晚时间点,四环素的存在显示可改变人糊精原纤维的形态学以及原纤维形成的速率。形态学上以短的成碎片的原纤维为特征(4F,4H),相比各自的对照表现为较长的、更密集和特征性的糊精原纤维(4E,4G)。在较高的放大倍数下,可见我们称为初原纤维(较轻染色的原纤维)的不同类型原纤维结构与原纤维的短片段在一起(4J-4L)。这些初原纤维在糊精对照中以高放大倍数观察不到(4I)。这些初原纤维的存在提示现有不溶性糊精原纤维的破坏。
在有和无奎纳克林情况下人糊精原纤维的电子显微镜观察(图5).100倍摩尔过量的奎纳克林与人糊精孵育。在不同时间点取出样本并按照本方法描述的步骤准备进行电子显微镜观察。
A.70μM人糊精,孵育1.5h后。放大倍率:x20,500
B.70μM人糊精+7000μM奎纳克林,孵育1.5h后。放大倍率:x20,500
C.70μM人糊精,孵育5h后。放大倍率:x20,500
D.70μM人糊精+7000μM奎纳克林,孵育5h后。放大倍率:x20,500
E.70μM人糊精,孵育26h后。放大倍率:x20,500
F.70μM人糊精+7000μM奎纳克林,孵育26h后。放大倍率:x20,500
G.70μM人糊精+7000μM奎纳克林,孵育26h后。放大倍率:x20,500
H.70μM人糊精+7000μM奎纳克林,孵育26h后。
I.放大倍率:x220,000
同没有奎纳克林的人糊精对照孵育(4A,4C,4E)相比,奎纳克林的存在看起来在1.5小时、5小时和26小时孵育的所有三个时间点上减慢人糊精原纤维形成的速率(4B,4D,4F)。在5小时和26小时还出现原纤维形态学上的差异(4D,4F,4G),糊精原纤维已形成大的聚集物,含有很少的已确定的原纤维(4F,4G),而不是对照中所见的特征性的较长纤维(4E)。有四环素情况下所见的人糊精短的成碎片的原纤维在人糊精和奎纳克林情况下未观察到。然而,初原纤维(4H中的轻染色原纤维)可在26小时孵育时间点中出现。这些初原纤维也见于糊精与四环素孵育的电子显微照片中。
在有和无选择的多环化合物情况下人糊精原纤维的电子显微镜观察(图6).在有或无四环素、刚果红、中性红或氯丙嗪(1200μM)情况下,人糊精(60μM)在10mMtris pH7.4中孵育24h。如本方法描述的方法取出样本并准备进行电子显微镜观察。所有实验重复进行三次,以上照片是每个放大倍数拍摄的至少6个照片中典型的。人糊精(Ax20,500,Bx105,000);与四环素孵育的人糊精(Cx20,500,Dx105,000);与刚果红孵育的人糊精(Ex20,500);与中性红孵育的人糊精(Fx20,500);与氯丙嗪孵育的人糊精(Gx20,500)。
人糊精与四环素孵育24h的透射电子显微镜显示,得到的淀粉样原纤维在形态学上有显著的改变(图6)。这里,原纤维在形态学上以短的成碎片的结构为特征(图6C),相比各自对照为较长的、更密集和特征性的糊精原纤维表现(图6A)。以较高的放大倍数可见沿着原纤维的短片段有小球状的轻染色结构(图6D)。这些球状结构在糊精对照中以较高的放大倍数没有观察到(图6B)。这些结构的存在提示现有的糊精原纤维在与四环素孵育后破坏。有趣地,当人糊精与其它多环化合物孵育时没有观察到球状结构。当人糊精与刚果红(图6E)、中性红(图6F)或氯丙嗪(图6G)孵育时,仍然形成特征性的糊精原纤维。另外的实验中,当人糊精制剂预孵育20h,随后与四环素孵育48h时,也显示糊精原纤维片段内部分布着与图6C、6D所见相似的较小原纤维。
实施例4
通过放射活性沉淀检测多环化合物对人胰岛淀粉状蛋白形成的作用
通过放射性标记沉淀观察四环素对糊精原纤维形成的影响(图7).在无(▲)或有(●)100μM四环素的情况下,10μM人糊精在10mM tris pH7.4中与痕量[3H]-人糊精孵育。[3H]-糊精掺入糊精原纤维进行24小时。通过16,000xg(图7A)或100,000xg(图7B)离心沉淀人糊精原纤维。存在[3H]-大鼠糊精时大鼠糊精(10μM)被用作无原纤维形成的对照(◆)(图7A)。结果显示为每个时间点的沉淀性放射活性糊精相对于上清总放射活性的百分比。每个数据点表示为三个独立反应.的均值±标准差。
在人糊精原纤维形成过程中,放射活性单体糊精的掺入可被用于检测在有或无可能的抑制性药物情况下糊精原纤维形成的速率。糊精原纤维可以通过离心从溶液中分离,然后糊精原纤维团中放射活性糊精沉淀的量被用来检测当时存在的糊精原纤维的量。
图5显示,如果没有四环素,那么在2小时孵育后,可获得的总放射活性人糊精的大约75%被掺入沉淀性糊精原纤维中。然而,在有四环素情况下,放射活性人糊精掺入沉淀性糊精原纤维减少大约50%。而且,此减少不随时间增加。通过100,000xg离心反应混合物也不影响四环素沉淀性糊精原纤维的百分比(图7B)。这些观察显示,四环素存在对胰岛淀粉状蛋白形成的抑制是由于不溶性糊精聚集物的减少。
通过放射性标记沉淀观察选择的多环化合物对糊精原纤维形成的影响(图5).在无(■)或有200μM吖啶(△)、氯丙嗪()、亚甲蓝(□)、硫黄素-T()、刚果红(▲)、四环素(●)、吖啶橙(◇)或中性红(◆)情况下,添加了[3H]-人糊精的人糊精10μM孵育在10mM tris pH7.4中。化合物结构显示在适当插图的旁边。硫黄素-T,尽管不是多环的,被广泛用于荧光试验中检测糊精原纤维的形成。放射活性的掺入在指示的时间段内监测以16,000xg离心20分钟的反应混合物的等分试样沉淀中掺入的放射活性。在每个实验中,具有添加的[3H]-大鼠糊精的大鼠糊精(10μM)被用作无原纤维形成对照(○)。结果显示为每个时间点的沉淀性放射活性淀粉状蛋白相对于上清总放射活性的百分比。每个数据点表示为三个独立实验的均值±标准差。
这些沉淀实验清楚地显示,如硫黄素-T一样,三环化合物吖啶、氯丙嗪和亚甲蓝对淀粉状蛋白形成没有影响。相反地,刚果红显示显著而快速的抑制作用,5h后大约减少淀粉状蛋白含量3倍并随孵育时间持续下去。在没有刚果红情况下,人糊精在5h孵育后显示超过75%的放射性标记糊精掺入沉淀性淀粉状蛋白中。
吖啶橙也显示沉淀性淀粉状蛋白形成的显著减少,72h后达50%水平,使整体减少30%。中性红,另一个在结构上与吖啶橙相似的三环分子,显示较小但显著的减少。四环素也具有显著的抑制作用,但仅在50h孵育期间后,其间百分比减少从大约85%至60%。在此情况下,抑制作用的方式得自于硫黄素-T荧光实验所见,即淀粉状蛋白初始形成后随时间出现四环素依赖的裂解相。
亚甲蓝是对原纤维相关的硫黄素-T荧光显示完全抑制作用的化合物实例,但对沉淀性淀粉状蛋白含量没有影响,表明硫黄素-T与现有淀粉状蛋白结合和/或置换不一定与淀粉状蛋白形成的抑制作用相关。
实施例5
通过圆二色光谱检测多环化合物对人糊精原纤维形成的抑制作用
通过圆二色光谱刚果红对糊精原纤维形成的影响(图9).下面概述的数据显示多环化合物刚果红对糊精原纤维形成抑制作用的影响,采用圆二色光谱分光光度法技术,用于比较纯二级结构的圆二色光谱谱(图9A)。如本方法所述,在C18旋转柱上纯化人糊精(100μg)以得到100%HFIP的储备液。此储备液的光谱在0.1cm道宽的石英室内以1nm间隔采集(图9B)。单体糊精的100%HFIP储备液在100mM氯化钾/50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)中稀释至2.5%HFIP。人糊精浓度大约为5μM。在无(图9C)或有超过人糊精20倍摩尔过量刚果红(图9D)的情况下,在0.5cm道宽的石英室内以1nm间隔采集光谱。如图所示,单体糊精的100%HFIP储备液在含浓度渐减的刚果红的100mM氯化钾/50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)中稀释至4%HFIP。人糊精浓度大约为4μM。在0.1cm道宽的石英室内以1nm间隔采集光谱(图9E)。单体糊精的100%HFIP储备液在含200μM苋菜红的100mM氯化钾/50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)中稀释至4%HFIP。人糊精浓度大约为4μM。在0.1cm道宽的石英室内以1nm间隔采集光谱(图9F)。
纯化的糊精当保存在100%HFIP溶液中时稳定于随意卷曲的构型(图9B)。室温下,溶液数天时间内在构造上是稳定的。不形成原纤维的大鼠糊精在水溶液中显示相似的光谱。然而,在人糊精从储备液稀释成磷酸盐缓冲液时,立即出现β-片层形成,如特征性的217nm最小值所示(图9C)。形成人糊精β-片层构象异构体是不溶性糊精原纤维形成的第一个步骤。
相反,糊精稀释于含过量刚果红的缓冲液阻止形成β-片层构象异构体(图9D),而改为引起糊精成为α-螺旋构造(在205和223nm的最小值)。糊精以此α-螺旋结构保持稳定至少24hr,且不发生不溶性原纤维的形成。渐减浓度的刚果红对人糊精的滴定(图9E)显示,在亚化学计量的刚果红浓度下,可引起从α-螺旋(200μM和4μM刚果红)直至随意卷曲(0.8μM刚果红)的改变,然后形成β-片层(0.8μM刚果红,1hr后)。看起来,刚果红以化学计量的比率与糊精结合以阻止形成β-片层。
刚果红是多环化合物实例,在所述条件下,看起来引起糊精成为α-螺旋构造状态并阻止进行β-构象异构体形成,从而阻止不溶性原纤维的形成。
苋菜红是在结构上与刚果红相关的食品染料,对糊精的作用与刚果红相似,即过量的苋菜红阻止β-构象异构体的形成,并相反引起糊精成为α-螺旋构造。
实施例6
多环化合物对糊精原纤维介导的毒性的防护作用
刚果红在RINm5F细胞中对糊精原纤维介导的毒性的防护作用(图10).在培养的RINm5Fβ细胞中进一步研究对淀粉状蛋白形成显示抑制作用的化合物对淀粉状蛋白引起的细胞毒性的潜在效应。
A.用30μM人糊精处理22h并用钙黄绿素-AM和溴乙非啶同型二聚体-1染色以显示活细胞(绿色)和死细胞(红色)的RINm5F细胞典型荧光显微照片。箭头表示死细胞实例。
B.用30μM人糊精处理和100μM刚果红如上染色的RINm5F细胞典型显微照片。
C.测定活细胞百分比,细胞用赋形剂、30μM人糊精、30μM人糊精与100μM刚果红、或30μM大鼠糊精处理22h。除人糊精加刚果红(A+CR)实验重复五次以外,所有实验分别重复10次。误差棒表示每个条件6-12个视野内活的和死细胞计数的标准差。统计学显著性通过单侧ANOV A检验,随后采用Dunnett′s检验通过pos-hoc分析检验。***p<0.001,##p<0.01。
中性红、吖啶橙和四环素化合物在对淀粉状蛋白聚集产生抑制作用的相对摩尔比率(低μM)下,对RINm5F β细胞是有细胞毒性的。因此,研究仅限于在这些实验条件下不显示固有细胞毒作用的刚果红。结果显示,同赋形剂对照相比,用30μM糊精孵育RIN5mF细胞22h引起细胞死亡的显著增加(图10C)。相反,在相同条件下大鼠糊精制剂是无细胞毒的。死细胞是在绿色活细胞本底上可见到的红色细胞(图10A)。人糊精与3倍摩尔过量的刚果红共孵育抑制了糊精的细胞毒作用(图10B,10C)。在本底上可见到糊精原纤维的红色刚果红染色(图10B)。对三个不同商品批次的糊精进行这些实验,每次都观察到刚果红存在的显著防护作用。
在此研究中,探索应用小的多环化合物作为淀粉状蛋白形成的抑制剂。为了解可能的结构/性关系,根据化合物的芳香环拓扑学及侧链成分,或根据以前报道的对其它淀粉状蛋白相关过程的抑制作用,选择代表性的系列小多环化合物。刚果红是常规在组织病理学中用作诊断性非特异淀粉状蛋白染色的共扼联苯结构(Khurana等人,J.Biol,Chem.276:22715-22721(2001))。此化合物也曾报道在原代大鼠海马趾培养物中抑制原纤维β-淀粉状蛋白的神经毒性(Lorenzo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:12243-12247(1994)),可能是通过稳定淀粉状蛋白前体的单体。又见Forloni G等人,FEBS Lett.487:404-407(2001)关于四元并四苯衍生物四环素的报道,抑制β-淀粉状蛋白的形成并裂解预先形成的β-淀粉状蛋白。吩噻嗪衍生物氯丙嗪,据报道在绵羊疯痒病感染的小鼠细胞培养物中逆转形成疾病的朊病毒斑并延长细胞生存(Korth等人,Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A 98:9836-9841(2001))。其异构体硫黄素-T已被广泛地用作荧光探针以检测淀粉状蛋白的形成(Goldsbury CS等人(2000)J.Struct.Biol 130:217-231)。像氯丙嗪一样,亚甲蓝具有三环核心结构,临床用于治疗高铁血红蛋白症以及在组织病理学中作为组织染色的染料(Wright RO等人(1999)Ann.Emerg.Med 34:646-656)。三环吩嗪衍生物中性红常规地用作特异性荧光染料标记以鉴定和分离胰腺胰岛(Jager S等人(1990 Eur,Surg.Res.22:8-13)。吖啶和吖啶橙分别是核心结构和衍化的吩嗪结构的实例。
本研究显示,发明的多环化合物可以在体外抑制淀粉状蛋白的形成。芳香吩嗪核心足以使原纤维结合,如化合物吖啶所证明的作用。在此核心结构的2和8位置添加两个二甲胺基则产生了吖啶橙,它作为不溶性淀粉状蛋白形成的强力抑制剂起作用。吩嗪衍生物中性红也抑制淀粉状蛋白形成,但显著地比吖啶橙速率低。相反,除吩噻嗪核心以外与吖啶橙结构相同的亚甲蓝则没有作用。
如放射性沉淀研究所示,这些三环化合物间对淀粉状蛋白形成的惊人差异清楚地表明,存在使淀粉状蛋白结合并能够抑制淀粉状蛋白形成的明显结构关系。特别地,可能通过芳香π-π相互作用,当核心环结构足以结合淀粉状蛋白时(Gazit EFASEB J 16:77-83(2002)),从环上发出的二甲胺侧链的存在对于抑制淀粉状蛋白形成是重要的。同样地,带电荷或不带电荷的吩噻嗪衍生物的作用显著地低于其各自的吩嗪衍生物。侧链基团相互作用的重要性也可应用于扩大范围的联苯结构和并四苯衍生物,分别以刚果红和四环素为代表。
观察到的淀粉状蛋白含量减少的分子机制尚不清楚。与包括Alzheimer β-淀粉和朊病毒但被,PrPc的其它淀粉样变性病不同,其中α-螺旋/β-链-不协调延伸看起来与淀粉状蛋白形成有关(Kallberg Y等人J.Biol.Chem.276:12945-12950(2001)),关于糊精的淀粉形成可能通过一个途径进行,该途径涉及相对不折叠的淀粉状蛋白形成区的聚集。尽管涉及的折叠组装的精确特性不确定,这些聚集物导致形成由延伸的β-片层结构组成的初原纤维,其β-链方向与长轴垂直。特别引起注意的是,产生淀粉状蛋白的区域由包括序列NFGAIL的残基20-29限定的区域(Tenidis K.等人,J.Mol Biol 295:1055-1071(2000))。在此区域内,25、28和29位置的脯氨酰残基取代足以充分地减少完整分子产生的淀粉状蛋白形成。本研究中试验的一些多环化合物所观察到的沉淀性淀粉状蛋白含量的减少可能是由于这些淀粉状蛋白形成区内的破坏性相互作用所致。
含刚果红和人糊精的制剂比单独用人糊精孵育对培养的胰岛β-细胞的细胞毒性小。因此,通过多环化合物破坏淀粉状蛋白可能不一定是有细胞毒的,甚至可能是保护细胞的。此外,体内对胰岛淀粉状蛋白形成的更敏感的抑制作用可能足以补偿内在的清除机制以控制和促进淀粉状蛋白的去除。
这些发现证明应用小的多环化合物可作为胰岛淀粉状蛋白形成的潜在抑制剂。
Claims (124)
1.一种抑制细胞毒性蛋白构象异构体的方法,包括给予有效剂量的三-元环多并苯、取代的三-元环多并苯、四-元环多并苯、五-元环多并苯、融合的四环化合物或融合环和联苯化合物。
2.一种预防淀粉状蛋白相关疾病的方法,包括预防初原纤维形成和/或减少现有的初原纤维沉积物。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述的疾病在哺乳动物内预防。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述的疾病在人类中预防。
5.根据权利要求2所述的方法,其中所述的疾病选自AL淀粉样变性病、淀粉A淀粉样变性病、家族性甲状腺运载蛋白淀粉样变性病、Alzheimer′s病、朊病毒病或II型糖尿病。
6.根据权利要求2所述的方法,其中所述的疾病是AL淀粉样变性病。
7.根据权利要求2所述的方法,其中所述的疾病是淀粉A淀粉样变性病。
8.根据权利要求2所述的方法,其中所述的疾病是家族性甲状腺运载蛋白淀粉样变性病。
9.根据权利要求2所述的方法,其中所述的疾病是Alzheimer′s病。
10.根据权利要求2所述的方法,其中所述的疾病是朊病毒病。
11.根据权利要求2所述的方法,其中所述的疾病是II型糖尿病。
12.根据权利要求2所述的方法,其中所述的初原纤维形成通过给予有效剂量的三-元环多并苯、取代的三-元环多并苯、四-元环多并苯、五-元环多并苯、融合的四环化合物或融合环和联苯化合物而预防。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述的三-元环多并苯包括蒽、phenalene或菲。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述的取代的三-元环多并苯包括奎纳克林、中性红、氯丙嗪、吖啶、吖啶橙、亚甲蓝或吩噻嗪。
15.根据权利要求12所述的方法,其中所述的四-元环多并苯包括芘、屈、苯[α]蒽、苯[m]蒽或并四苯。
16.根据权利要求12所述的方法,其中所述的五-元环多并苯包括苯并[c]菲。
17.根据权利要求12所述的方法,其中所述的融合的四环化合物包括四环素或强力霉素。
18.根据权利要求12所述的方法,其中所述的融合环和联苯化合物包括刚果红或柯胺G或苋菜红。
19.根据权利要求12所述的方法,其中所述的三-元环多并苯是蒽。
20.根据权利要求12所述的方法,其中所述的三-元环多并苯是phenalene。
21.根据权利要求12所述的方法,其中所述的三-元环多并苯是菲。
22.根据权利要求13所述的方法,其中所述的取代的三-元环多并苯是奎纳克林。
23.根据权利要求13所述的方法,其中所述的取代的三-元环多并苯是中性红。
24.根据权利要求13所述的方法,其中所述的取代的三-元环多并苯是氯丙嗪。
25.根据权利要求13所述的方法,其中所述的取代的三-元环多并苯是吖啶。
26.根据权利要求13所述的方法,其中所述的取代的三-元环多并苯是吖啶橙。
27.根据权利要求13所述的方法,其中所述的取代的三-元环多并苯是亚甲蓝。
28.根据权利要求13所述的方法,其中所述的取代的三-元环多并苯是吩噻嗪。
29.根据权利要求14所述的方法,其中所述的四-元环多并苯是芘。
30.根据权利要求14所述的方法,其中所述的四-元环多并苯是屈。
31.根据权利要求14所述的方法,其中所述的四-元环多并苯是苯[α]蒽。
32.根据权利要求14所述的方法,其中所述的四-元环多并苯是苯[m]蒽。
33.根据权利要求14所述的方法,其中所述的四-元环多并苯是苯并[c]菲。
34.根据权利要求14所述的方法,其中所述的四-元环多并苯是并四苯。
35.根据权利要求16所述的方法,其中所述的融合的四环化合物是四环素。
36.根据权利要求16所述的方法,其中所述的融合的四环化合物是强力霉素。
37.根据权利要求17所述的方法,其中所述的融合环和联苯化合物是刚果红。
38.根据权利要求17所述的方法,其中所述的融合环和联苯化合物是柯胺G。
39.根据权利要求12所述的方法,其中所述的给予的化合物基本上选自蒽、菲、奎纳克林、中性红、氯丙嗪、吖啶、吖啶橙、亚甲蓝、苯二嗪、吩噻嗪、四环素、强力霉素、刚果红、芘、屈、苯[α]蒽、苯[m]蒽、苯并[c]菲和并四苯。
40.根据权利要求12所述的方法,其中所述的初原纤维形成通过联合给予三-元环多并苯、取代的三-元环多并苯、四-元环多并苯、五-元环多并苯、融合的四环化合物和/或融合环和联苯化合物而被预防。
41.一种预防或抑制初原纤维形成的方法,包括给予有效剂量的三-元环多并苯、取代的三-元环多并苯、四-元环多并苯、五-元环多并苯、融合的四环化合物、或融合环和联苯化合物。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述的三-元环多并苯、取代的三-元环多并苯、四-元环多并苯、五-元环多并苯、融合的四环化合物、或融合环和联苯化合物包括蒽、菲、奎纳克林、中性红、氯丙嗪、吖啶、吖啶橙、亚甲蓝、苯二嗪、吩噻嗪、四环素、强力霉素、刚果红、芘、屈、苯[α]蒽、苯[m]蒽、苯并(c)菲或并四苯。
43.一种改善淀粉状蛋白相关疾病的方法,包括防止初原纤维形成。
44.一种预防胰岛β-细胞死亡的方法,包括防止初原纤维形成。
45.一种在易患者中预防淀粉状蛋白相关疾病的方法,包括防止初原纤维形成。
46.一种防止可溶性糊精转变成不溶性糊精的方法,包括给予有效剂量的适合的三-元环多并苯、取代的三-元环多并苯、四-元环多并苯、五-元环多并苯、融合的四环化合物、或融合环和联苯化合物。
47.一种防止细胞毒性β-构象异构体形成的方法,包括给予有效剂量的三-元环多并苯、取代的三-元环多并苯、四-元环多并苯、五-元环多并苯、融合的四环化合物、或融合环和联苯化合物。
48.一种预防或改善淀粉样变性病相关疾病的方法,包括在初原纤维形成前给予有效剂量的三-元环多并苯、取代的三-元环多并苯、四-元环多并苯、五-元环多并苯、融合的四环化合物、或融合环和联苯化合物。
49.一种筛选有效下调糊精例如人糊精β-构象异构体的化合物的方法,含有或包括以下步骤:
(i)将该化合物用于有或无β-构象异构体存在的糊精制剂中;
(ii)鉴定和/或测定β-构象异构体的水平,从而确定有效性。
50.一种鉴定能够阻断通常与淀粉状蛋白相关的毒性的化合物的方法,包括将化合物用于糊精制剂中并观察β-构象异构体的形成,其中所述的淀粉状蛋白来自可溶性糊精转变成不溶性糊精或初原纤维的形成。
51.一种筛选有效下调糊精例如人糊精β-构象异构体的化合物的方法,含有或包括以下步骤:
(i)将该化合物用于有或无β-构象异构体存在的糊精制剂中;
(ii)鉴定和/或测定β-构象异构体的水平,从而确定有效性。
52.根据权利要求51所述的方法,其中的化合物是多环的。
53.根据权利要求51所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过物理分离、纯化、离析和/或沉淀进行。
54.根据权利要求51所述的方法,其中的糊精至少部分被标记和/或做记号。
55.根据权利要求51所述的方法,其中的标记或记号包括以下任何一种或多种:放射性同位素、荧光记号、抗体、光学可探测物或酶。
56.根据权利要求51所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过亲合性标记的结合或释放进行。
57.根据权利要求51所述的方法,其中的亲合性标记是硫黄素-T。
58.根据权利要求51所述的方法,其中的亲合性标记是肝素或其功能变体。
59.根据权利要求51所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过圆二色光谱进行。
60.根据权利要求51所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过电子显微镜法进行。
61.根据权利要求51的方法鉴定的化合物。
62.一种筛选化合物所述的方法,该化合物有效抑制人糊精从含有或包括随意卷曲和/或α-螺旋的构型转变成含有或包括β-片层的构型和/或降低所述的转变的速率,其中所述的方法含有或包括以下步骤:
(i)将该化合物用于有或无β-构象异构体存在的糊精制剂中;
(ii)鉴定和/或测定β-构象异构体的水平,从而确定有效性。
63.根据权利要求62所述的方法,其中的化合物是多环的。
64.根据权利要求62所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过物理分离、纯化、离析和/或沉淀进行。
65.根据权利要求62所述的方法,其中的糊精至少部分被标记和/或做记号。
66.根据权利要求62所述的方法,其中的标记或记号包括以下任何一种或多种:放射性同位素、荧光记号、抗体、光学可探测物或酶。
67.根据权利要求62所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过亲合性标记的结合或释放进行。
68.根据权利要求62所述的方法,其中的亲合性标记是硫黄素-T。
69.根据权利要求62所述的方法,其中的亲合性标记是肝素或其功能变体。
70.根据权利要求62所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过圆二色光谱进行。
71.根据权利要求62所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过电子显微镜法进行。
72.根据权利要求62的方法鉴定的化合物。
73.一种筛选有效抑制胰岛β-细胞变性和/或逆转疾病状态的化合物的方法,含有或包括以下步骤:
(i)将该化合物用于有或无β-构象异构体存在的糊精制剂中;
(ii)鉴定和/或测定β-构象异构体的水平,从而确定有效性。
74.根据权利要求73所述的方法,其中的化合物是多环的。
75.根据权利要求73所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过物理分离、纯化、离析和/或沉淀进行。
76.根据权利要求73所述的方法,其中的糊精至少部分被标记和/或做记号。
77.根据权利要求73所述的方法,其中的标记或记号包括以下任何一种或多种:放射性同位素、荧光记号、抗体、光学可探测物或酶。
78.根据权利要求73所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过亲合性标记的结合或释放进行。
79.根据权利要求73所述的方法,其中的亲合性标记是硫黄素-T。
80.根据权利要求73所述的方法,其中的亲合性标记是肝素或其功能变体。
81.根据权利要求73所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过圆二色光谱进行。
82.根据权利要求73所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过电子显微镜法进行。
根据权利要求73的方法鉴定的化合物。
83.筛选有效抑制胰岛β-细胞变性和/或逆转疾病状态的化合物的方法,含有或包括以下步骤:
(i)将该化合物用于能够产生人糊精β-构象异构体的细胞中;
(ii)鉴定和/或测定细胞内或细胞外β-构象异构体的水平,从而确定有效性;
(iii)将化合物与能够形成细胞毒性β-构象异构体的外源性人糊精一起用于细胞中,通过细胞死亡测定确定对细胞活力的影响。
84.根据权利要求83所述的方法,其中的化合物是多环的。
85.根据权利要求83所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过物理分离、纯化、离析和/或沉淀进行。
86.根据权利要求83所述的方法,其中的糊精至少部分被标记和/或做记号。
87.根据权利要求83所述的方法,其中的标记或记号包括以下任何一种或多种:放射性同位素、荧光记号、抗体、光学可探测物或酶。
88.根据权利要求83所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过亲合性标记的结合或释放进行。
89.根据权利要求83所述的方法,其中的亲合性标记是硫黄素-T。
90.根据权利要求83所述的方法,其中的亲合性标记是肝素或其功能变体。
91.根据权利要求83所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过圆二色光谱进行。
92.根据权利要求83所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过电子显微镜法进行。
93.根据权利要求83的方法鉴定的化合物。
94.一种筛选有效下调人糊精β-构象异构体的化合物的方法,含有或包括以下步骤:
(i)将该化合物用于能够产生人糊精β-构象异构体的细胞中;
(ii)鉴定和/或测定细胞内或细胞外β-构象异构体的水平,从而确定有效性;
(iii)将化合物与能够形成细胞毒性β-构象异构体的外源性人糊精一起用于细胞中,通过细胞死亡测定确定对细胞活力的影响。
95.根据权利要求94所述的方法,其中的化合物是多环的。
96.根据权利要求94所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过物理分离、纯化、离析和/或沉淀进行。
97.根据权利要求94所述的方法,其中的糊精至少部分被标记和/或做记号。
98.根据权利要求94所述的方法,其中的标记或记号包括以下任何一种或多种:放射性同位素、荧光记号、抗体、光学可探测物或酶。
99.根据权利要求94所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过亲合性标记的结合或释放进行。
100.根据权利要求94所述的方法,其中的亲合性标记是硫黄素-T。
101.根据权利要求94所述的方法,其中的亲合性标记是肝素或其功能变体。
102.根据权利要求94所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过圆二色光谱进行。
103.根据权利要求94所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过电子显微镜法进行。
104.根据权利要求94的方法鉴定的化合物。
105.一种筛选化合物的方法,该化合物有效抑制人糊精从含有或包括随意卷曲和/或α-螺旋的构型转变成含有或包括β-片层的构型和/或降低所述的转变的速率,其中所述的方法含有或包括以下步骤:
(i)将该化合物用于能够产生人糊精β-构象异构体的细胞中;
(ii)鉴定和/或测定细胞内或细胞外β-构象异构体的水平,从而确定有效性;
(iii)将化合物与能够形成细胞毒性β-构象异构体的外源性人糊精一起用于细胞中,通过细胞死亡测定确定对细胞活力的影响。
106.根据权利要求105所述的方法,其中的化合物是多环的。
107.根据权利要求105所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过物理分离、纯化、离析和/或沉淀进行。
108.根据权利要求105所述的方法,其中的糊精至少部分被标记和/或做记号。
109.根据权利要求105所述的方法,其中的标记或记号包括以下任何一种或多种:放射性同位素、荧光记号、抗体、光学可探测物或酶。
110.根据权利要求105所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过亲合性标记的结合或释放进行。
111.根据权利要求105所述的方法,其中的亲合性标记是硫黄素-T。
112.根据权利要求105所述的方法,其中的亲合性标记是肝素或其功能变体。
113.根据权利要求105所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过圆二色光谱进行。
114.根据权利要求105所述的方法,其中β-构象异构体的鉴定和/或β-构象异构体水平的测定通过电子显微镜法进行。
115.根据权利要求105的方法鉴定的化合物。
116.一种筛选有效下调人糊精β-构象异构体的化合物的方法,含有或包括以下步骤:
(i)将该化合物用于能够产生人糊精β-构象异构体的细胞中;
(ii)定性和/或测定细胞死亡的细胞标记的活化和/或上调作为无效指示,从而确定有效性。
117.根据权利要求116所述的方法,其中的化合物是多环的。
118.根据权利要求116所述的方法,其中的细胞标记是凋亡标记。
119.根据权利要求116所述的方法,其中的细胞标记是坏死性标记。
120.根据权利要求116所述的方法,其中的细胞标记是选自以下任何一个或多个:caspase8、caspase3、cJun、JNK、p21、WAF1、p53。
121.根据权利要求116所述的方法,其中的定性或测定使用至少一种能够编码以下一个或多个标记的mRNA种类:caspase8、caspase3、cJun、JNK、p21、WAF1、p53。
122.根据权利要求116所述的方法,其中的定性或测定使用RT-PCR、Northern分析、杂交或微阵列。
123.根据权利要求116所述的方法,其中的定性或测定使用以下一个或多个多肽:caspase8、caspase3、cJun、JNK、P21、WAF1、P53。
124.根据权利要求116的方法鉴定的化合物。
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