CN1687445A - 一种重组全长人脑红素、其生产方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌表达生产重组全长人脑红素rhNGB的方法以及用该方法得到的重组全长人脑红素rhNGB，该方法包括将工程菌接种培养、细菌反复冻融、菌体裂解、包涵体裂解、层析纯化和目的蛋白复性等步骤。本发明是在构建人脑红素基因片段NSV并构建高效表达菌株的基础上，建立了一整套工程菌诱导表达、包涵体分离裂解、蛋白质复性纯化的工艺，从而获得了重组全长人脑红素纯品，并对重组全长人脑红素的生物学活性进行描述。实验表明本发明得到的全长人脑红素可以作为药物用于预防和治疗中枢和外周神经系统疾病。

Description

一种重组全长人脑红素、其生产方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及具有神经保护功能的脑红素(NGB)的制备方法。

背景技术

脑红素(Neuroglobin，NGB)是德国学者Burmester等于2000年发现的除了血红蛋白和肌红蛋白之外体内第三类重要的携氧珠蛋白，在神经系统中特异表达，广泛分布于脑组织内。人脑红素有151个氨基酸，分子量为17千道尔顿。随后一系列报道发现，脑红素和血红蛋白、肌红蛋白一样能可逆地结合氧，且与氧有很高的亲和力。脑红素结合氧的能力介于血红蛋白和肌红蛋白之间。发明人及美国学者Greenberg等在2002发现，在多种因素(如缺血、缺氧、组织水肿等)导致神经系统氧供应不足时，脑红素在神经细胞中的表达将显著增高，可促进氧向神经细胞的扩散，并加速氧在神经细胞内向线粒体的转运过程，从而大幅度提高氧在神经细胞内的利用程度，增强神经细胞在多种损伤情况下的存活能力。对神经细胞而言，如果脑红素的含量降低，或者没有脑红素的表达的话，神经细胞将丧失对分子氧的利用能力，从而导致神经细胞死亡。因此，脑红素可被视为神经细胞内的“氧吧”，决定了神经细胞对氧的生物利用能力。神经细胞内正常含量的脑红素将促进神经细胞的正常有氧代谢过程，反之，如果神经细胞中缺乏或者没有脑红素的话，即使脑内血液供应充足，神经细胞也无法获得足够的氧以完成正常的功能活动。因此，脑红素是一个具有神经保护作用的重要功能分子。

文献记载的人脑红素的制备，一般采用融合蛋白方式表达，其表达产物往往含有融合蛋白(例如谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GST)等)部分。这种表达产物对于进行脑红素的功能研究一般没有较大的影响，但是由于表达产物中含有外源蛋白成分，并不能代表天然蛋白质。同时，目前几乎所有文献中所报道的人脑红素的制备并没有经过氨基酸序列测定确认，一般是通过免疫印迹技术进行鉴定，这对于科学研究是可以接受的，但是对于作为拟投放市场的产品的鉴定是不够的。另外，文献中所报道的用来进行科学研究的大鼠脑红素或者小鼠脑红素的制备方式，有通过原核表达方式实现的，也有直接从动物脑组织中提取分离的。这些制备方法均无法获得人脑红素。这些人脑红素的制备方法所存在的缺陷反过来均可被本专利申请所描述的方法所克服。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种细菌表达获取的具有生物活性的重组全长人脑红素(rhNGB)。

本发明另一目的是提供一种用细菌表达获取具有生物活性的重组全长人脑红素(rhNGB)的方法。

本发明再一目的是提供重组全长人脑红素rhNGB在制备预防神经系统疾病的药物中的用途。

本发明的重组全长人脑红素rhNGB，是通过包括将工程菌接种培养、诱导细菌反复冻融、菌体裂解、包涵体裂解、层析纯化和目的蛋白复性步骤生产所得到的。

本发明重组全长人脑红素rhNGB的生产方法，包括将工程菌接种培养、细菌反复冻融、菌体裂解、包涵体裂解、层析纯化和目的蛋白复性等步骤。

上述方法中，所述工程菌为重组pBV220-rhNGB/HB101工程菌；所述工程菌接种培养基为含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基；所述包涵体裂解步骤中将所述包涵体冰浴超声破碎后，于100℃煮沸5min；所述层析纯化步骤顺序包括凝胶过滤和阴离子交换层析；所述凝胶过滤用Sephacryls-200凝胶层析柱；所述阴离子交换层析采用Amersham Q Sepharose FF强阴离子交换层析柱。

本发明是在人脑红素基因编码区(Neurosurvivin，NSV)构建高效表达菌株的基础上，建立了一整套工程菌诱导表达、包涵体分离裂解、蛋白质复性纯化的工艺，从而获得了重组全长人脑红素纯品，并对重组全长人脑红素的生物学活性进行描述，表明全长人脑红素具有预防和治疗中枢和外周神经系统疾病的用途。检测证明，用本发明人脑红素的生产方法确实可以得到纯度较高具有生物活性的人脑红素。

附图说明

图1为本发明生产工艺流程图；

图2为本发明rhNGB进行氨基端测序谱图；

图3-1为通过PCR技术获得rhNGB扩增产物后的电泳图片，其中

     A  DL-2000分子量标准；B  PCR扩增产物

图3-2为rhNGB工程菌株构建的示意图；

图3-3为通过PCR方法鉴定rhNGB阳性克隆的图片，其中

     A  DL-2000分子量标准；B-G  连接产物PCR鉴定

图3-4为通过酶切方法鉴定rhNGB阳性克隆的图片，其中

     A  DL-2000分子量标准；B  pBV220空载体对照；C-F  连接产物酶切鉴定

图4A为本发明rhNGB在难治性癫痫患者颞叶病灶中的表达图片，图4B为本发明rhNGB在难治性癫痫患者海马组织中的表达，(免疫组化染色结果，放大倍数×100)；

图5A为使用PCR技术对转rhNGB基因小鼠进行基因组整合情况鉴定的图片；

图5B为采用RT-PCR技术对所获得的转基因小鼠脑内rhNGB表达进行检测的图片；

图5C为采用免疫印迹技术对所获得的转基因小鼠脑内rhNGB表达进行检测的图片；

图6A为通过免疫印迹技术检测转rhNGB基因小鼠在单侧局灶性缺血模型后的表达；

图6B显示未转染rhNGB基因的同品系小鼠在单侧局灶性缺血模型后，大脑皮层的梗塞面积较大；

图6C显示转染rhNGB基因的小鼠在单侧局灶性缺血模型后，大脑皮层的梗塞面积较小，说明rhNGB对局灶性脑缺血具有保护作用。

具体实施方式

本发明在构建人脑红素基因并构建高效表达菌株的基础上，建立了一整套包括工程菌诱导表达、包涵体分离裂解和蛋白质复性纯化的工艺，具体生产工艺流程参见附图1。本发明中，人脑红素基因片段命名为Neurosurvivin(NSV)，可以从人胎脑cDNA文库中通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增获得(一参考文献：Burmester T，Weich B，Reinhardt S，Hankeln T.A vertebrate globin expressed in the brain.Nature.2000 Sep 28；407(6803)：520-523)。

一、本发明重组全长人脑红素(rhNGB)的制备：具体通过以下操作实现：

1.  重组pBV220-rhNGB/HB101工程菌的构建：

1)引物的合成：根据hNGB基因(人脑红素基因片段NSV)已知序列设计并合成特异性引物pU和pD，pU引物5’端引入了EcoRI酶切位点及起始密码子ATG，pD引物5’端引入了BamHI酶切位点，引物由上海博亚生物技术公司合成。

pU：5’-CCggAATTCATggAgCgCCCggAg-3’

pD：5’-ggTggATCCTTACTCgCCATCCCAgCCTCg-3’

2)PCR的扩增反应：以人脑红素基因片段(NSV)为模板，利用步骤1)合成的引物，进行PCR扩增。反应条件为先95℃变性5min，再94℃45秒，60℃45秒，72℃45秒，进行30个循环；最后72℃延伸5min，反应结束后，取5ul扩增产物1.2％(w/v)琼脂糖电泳检测扩增结果。扩增产物电泳结果见图3-1：

3)表达质粒的构建：以限制性内切酶EcoRI和BamHI同时消化高效表达载体pBV220和PCR扩增产物，电泳回收，应用T4 DNA连接酶使二者连接(见图3-2)，转化经氯化钙处理的E.coli HB101感受态细胞，挑取转化子接种于3ml LB培养基中，30℃培养过夜，经PCR扩增鉴定后的阳性克隆再提取质粒DNA进行酶切鉴定。结果显示，经PCR扩增及EcoRI和BamHI双酶切后，重组质粒均有一470bp左右的DNA片断，其大小与插入的NGB基因片段NSV基本相符(见图3-3、图3-4)，命名此重组克隆为pBV220-rhNGB/HB101，作为表达rhNGB的工程菌。

2.  基因工程菌种的活化：从4℃保存的稳定细胞株或细菌平皿中吸取5μl菌液或挑取分离良好的单菌落，接种于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30℃200rpm振荡培养8h；按1％(v/v)接种于摇瓶中，培养基同前，30℃200rpm振荡培养16h作为种子液。

3.  摇菌并诱导表达：种子液按照3％(v/v)接种于150ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30℃200rpm荡培养2-3h，待其OD₆₀₀＝0.3~0.4时迅速移入42℃水浴中继续振荡培养5h，诱导rhNGB的表达。

4.  细菌的收集、洗涤、冻融：于4℃6000rpm离心15min收集诱导后的细菌，取少量菌体进行SDS-PAGE检测蛋白表达情况，同时以TE缓冲液(25mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)洗菌体三次，将菌体置于液氮中5min，取出在冰浴中融化，反复冻融三次，加入10倍体积的TE缓冲液(25mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)悬浮菌体。

5.  菌体的裂解：将用TE缓冲液(25mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)悬浮的菌体冰浴超声(超声功率为400W)破碎30s，间歇20s，共超声15次。4℃12000rpm离心20min，弃上清，收集包涵体。

6.  包涵体的洗涤：将包涵体用Tris缓冲液(25mM Tris-HCl，pH8.0，1M NaCl)洗涤，4℃12000rpm离心20min，弃上清，沉淀用TE缓冲液(25mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)洗涤两次，4℃12000rpm离心20min，弃上清，留包涵体。

7.  包涵体的裂解：将包涵体重悬于含有8mol/L脲素和1％(v/v)巯基乙醇的TE缓冲液中，冰浴超声(超声功率为400W)破碎30s，间歇20s，共超声6次。100℃煮沸5min，室温12000rpm离心10min，留上清，弃沉淀。

8.  凝胶过滤：采用Sephacryls-200凝胶层析柱，用含有2mol/L脲素和0.1％(v/v)巯基乙醇的TE缓冲液进行平衡。将已处理过的样品(步骤7)上样，用含有2mol/L脲素和0.1％(v/v)巯基乙醇的TE缓冲液进行洗脱，分步收集洗脱液。将收集的洗脱液各管进行SDS-PAGE电泳，确定含杂蛋白较少的目的蛋白各管。

9.  阴离子交换层析：采用Amersham Q Sepharose FF强阴离子交换层析柱，用含有2mol/L脲素和0.1％(v/v)巯基乙醇的TE缓冲液进行平衡。将已确定的含杂蛋白较少的目的蛋白各管合并后上样，分别用含NaCl浓度0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.5M、0.7M的平衡液(含有2mol/L脲素和0.1％(v/v)巯基乙醇的TE缓冲液)进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，并用含1M NaCl浓度的平衡液对阴离子交换层析柱进行再生，同时取含各浓度NaCl的洗脱管样品进行SDS-PAGE电泳，确定在NaCl浓度为0.7M的平衡液的洗脱管中的蛋白为目的蛋白。

10.  目的蛋白rhNGB的复性及脱盐：采用Sephadex G-50凝胶过滤柱，用含有0.1％(v/v)SDS的TE缓冲液进行平衡，将含目的蛋白的洗脱管样品上样，用含有0.1％(v/v)SDS的TE缓冲液冲洗柱子，收集流出液。

经检测，rhNGB的表达量为1.2g/L培养基。将收集得到的rhNGB用作下面实验。

二、重组全长人脑红素(rhNGB)的鉴定

1、rhNGB的核酸序列和氨基酸序列：已知人脑红素基因片段(NSV)(其一参考文献：Burmester T，Weich B，Reinhardt S，Hankeln T.A vertebrate globin expressedin the brain.Nature.2000 Sep 28；407(6803)：520-523)其编码区全长456个碱基，可编码151个氨基酸。具体的核酸序列为(序列1)：

ATGGAGCGCCCGGAGCCCGAGCTGATCCGGCAGAGCTGGCGGGCAGTGAGCCGCAGCCCGCTGGAGCACGGCA

CCGTCCTGTTTGCCAGGCTGTTTGCCCTGGAGCCTGACCTGCTGCCCCTCTTCCAGTACAACTGCCGCCAGTT

CTCCAGCCCAGAGGACTGTCTCTCCTCGCCTGAGTTCCTGGACCACATCAGGAAGGTGATGCTCGTGATTGAT

GCTGCAGTGACCAATGTGGAAGACCTGTCCTCACTGGAGGAGTACCTTGCCAGCCTGGGCAGGAAGCACCGGG

CGGTGGGTGTGAAGCTCAGCTCCTTCTCGACAGTGGGTGAGACTCTGCTCTACATGCTGGAGAAGTGTCTGGG

CCCTGCCTTCACACCAGCCACACGGGCTGCCTGGAGCCAACTCTACGGGGCCGTAGTGCAGGCCATGAGTCGA

GGCTGGGATGGCGAGTAA

对应的氨基酸序列为(序列2)：

MERPEPELIRQSWRAVSRSPLEHGTVLFARLFALEPDLLPLFQYNCRQFSSPEDCLSSPEFLDHIRKVMLVID

AAVTNVEDLSSLEEYLASLGRKHRAVGVKLSSFSTVGETLLYMLEKCLGPAFTPATRAAWSQLYGAVVQAMSR

GWDGE

2、本发明制备的rhNGB的鉴定

用质谱仪对本发明制备的hNGB样品进行鉴定，可得到如下的氨基酸序列：

MERPEPELIR QSWRAVSRSP LEHGTVLFAR LFALEPDLLP LFQYNCRQFS SPEDCLSSPE

FLDHIRKVML VIDAAVTNVE DLSSLEEYLA SLGRKHRAVG VKLSSFSTVG ESLLYMLEKC LGPAFTPATR

AAWSQLYGAV VQAMSRGWDG E

该氨基酸序列中，加黑部分为相匹配的部分(66个氨基酸)，覆盖率占全长人脑红素(151个氨基酸)的43.7％，确认本发明方法所得到的样品是正确的。

进一步对所制备的rhNGB样品进行氨基端测序(使用美国应用生物系统公司491蛋白序列分析仪，环境温度20℃，环境相对湿度28％)，得到样品N末端序列为：M-E-R-P-E-P-E-L-I-R-Q-S-W-R-A-V，参见附图2，该氨基端的16个氨基酸与全长人脑红素的氨基端完全一致，确认本发明所得到的样品是完全正确的。

三、重组全长人脑红素(rhNGB)的功能验证

1.脑红素在难治性癫痫患者脑组织中的表达特征：

脑红素是一个在神经系统特异表达的基因，主要功能是促进神经细胞的氧利用。利用本发明制备的重组全长人脑红素(rhNGB)按常规方法获得高效价单克隆抗体，采用经典的免疫组化技术研究，具体方法为：选择7例2003年8月至2003年10月间在北京天坛医院神经外科进行手术切除治疗的难治性癫痫病例。所有病例均长期服用三种以上抗癫痫药物，反复多次的血药浓度检测提示各种抗癫痫药物均在有效范围之内或高于有效范围。临床上诊断均为原发性癫痫，具体表现为强直阵挛发作。通过采用常规冰冻切片免疫组化ABC法检测NGB的表达。切片厚20μm，4％多聚甲醛固定。采用SP试剂盒(ZYMED公司产品)进行免疫组织化学染色。一抗选用以本发明制备的rhNGB为抗原免疫小鼠制备的NGB单克隆抗体(编号：1E12)，工作浓度为1∶100，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG工作液(1∶400，Santa Cruz公司产品)，经DAB显色后，脱水，透明，封片。阴性对照以PBS替代一抗进行实验。

结果显示在难治性癫痫患者脑内颞叶病灶和海马中，脑红素的表达均随发作年限增加而减少，且颞叶病灶中的阳性细胞数量明显多于海马(参见图4A和4B)，这一结果提示癫痫发作时病灶处需要较多的氧从而导致脑红素表达增高，但随着癫痫发作年限的增加，脑红素在颞叶病灶中的表达情况呈现不可逆的下降，是癫痫的病因之一。因此，该实验说明本发明制备的重组全长人脑红素(rhNGB)可用于癫痫病人的治疗中，可通过提高癫痫病人脑内脑红素的含量达到治疗癫痫的目的。

2、增强脑红素可保护动物抵抗脑缺血损伤：

通过遗传工程技术制备rhNGB基因转小鼠动物模型，从而人为地提高小鼠脑内脑红素rhNGB的表达水平。将人脑红素基因片段(NSV)置于pCMV-Myc载体的CMV启动子下游SalI和XbaI限制性内切酶识别位点间，得到含有本发明的rhNGB基因的重组表达载体pCMV-Myc-rhNGB，将pCMV-Myc-rhNGB表达载体通过电击方式导入小鼠胚胎干细胞(ES细胞)。转染7～8天后挑取并鉴定阳性克隆。将阳性ES细胞通过囊胚显微注射方式构建嵌合体小鼠。通过PCR技术对转rhNGB基因小鼠进行基因组整合情况鉴定，用RT-PCR和Western Blot检测小鼠脑神经组织中rhNGB的表达情况，筛选转基因小鼠，结果如图5A、图5B和图5C所示；其中，RT-PCR引物序列为pFwd(5’-cccgctggagcacggcaccgtcc-3’)和pRvs(5’-ttactcgccatcccagcctcg-3’)；免疫印迹检测中的一抗为以本发明rhNGB为抗原免疫家兔得到的多克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG抗体(购自北京中山试剂公司)。通过进一步的品系繁殖获得成功的转基因小鼠。

图5A为使用PCR技术对转rhNGB基因小鼠进行基因组整合情况鉴定的图片。所采用的引物跨越pCMV-Myc载体部分和rhNGB序列部分。PCR扩增产物预期大小为940bp。图中可见Tg-1和Tg-2为阳性小鼠，其基因组DNA中已经整合有该表达载体。WT为野生型小鼠。P为采用原始质粒作为阳性对照进行PCR扩增。

图5B为采用RT-PCR技术对所获得的转基因小鼠脑内rhNGB表达进行检测的图片。PCR扩增产物预期大小为400bp。Tg-1和Tg-2为阳性小鼠，WT为野生型小鼠。图中可见Tg-1、Tg-2中NGB的表达量显著高于野生型，说明rhNGB已在阳性小鼠中表达(即阳性小鼠中表达的NGB包括了rhNGB和小鼠自身的NGB)。

图5C为采用免疫印迹技术对所获得的转基因小鼠脑内rhNGB表达进行检测的图片。Tg-1和Tg-2为阳性小鼠，WT为野生型小鼠。图中可见Tg-1、Tg-2中NGB的表达量显著高于野生型，说明rhNGB已在阳性小鼠中表达(即阳性小鼠中表达的NGB包括了rhNGB和小鼠自身的NGB)。Actin所指的条带为蛋白质样品质量控制的阳性对照。

采用常规的线栓法制备转rhNGB基因小鼠脑缺血模型，用TTC染色法检测脑内梗塞面积的大小，以反映动物大脑皮层脑缺血程度。

图6为采用常规的线栓法制备转rhNGB基因小鼠单侧局灶性缺血模型，检测大脑皮层梗塞面积的变化图片。其中图6A为通过免疫印迹方法跟踪检测转rhNGB基因小鼠rhNGB在单侧局灶性缺血模型后的表达情况，说明rhNGB的表达随着缺血时间的延长而增加；图6B为未转染rhNGB基因的同品系小鼠(正常对照小鼠)在单侧局灶性缺血模型后，大脑皮层的梗塞面积较大；图6C为转染rhNGB基因的小鼠在单侧局灶性缺血模型后，大脑皮层的梗塞面积较小，说明rhNGB对局灶性脑缺血具有保护作用。

对TTC染色法检测小鼠脑内梗塞面积的大小统计分析显示，转rhNGB基因小鼠大脑的梗塞面积(71.74±22.61)比对照小鼠的(102.49±11.05)显著减少(P＜0.01)。该结果显示本发明得到的rhNGB可显著保护动物对抗缺血性损伤(脑中风)所带来的脑梗塞。

                       序列表

<160>2

<210>1

<211>456

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

atggagcgcc cggagcccga gctgatccgg cagagctggc gggcagtgag ccgcagcccg     60

ctggagcacg gcaccgtcct gtttgccagg ctgtttgccc tggagcctga cctgctgccc    120

ctcttccagt acaactgccg ccagttctcc agcccagagg actgtctctc ctcgcctgag    180

ttcctggacc acatcaggaa ggtgatgctc gtgattgatg ctgcagtgac caatgtggaa    240

gacctgtcct cactggagga gtaccttgcc agcctgggca ggaagcaccg ggcggtgggt    300

gtgaagctca gctccttctc gacagtgggt gagactctgc tctacatgct ggagaagtgt    360

ctgggccctg ccttcacacc agccacacgg gctgcctgga gccaactcta cggggccgta    420

gtgcaggcca tgagtcgagg ctgggatggc gagtaa                              456

<210>2

<211>151

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Met Glu Arg Pro Glu Pro Glu Leu Ile Arg Gln Ser Trp Arg Ala Val

1               5                   10                  15

Ser Arg Ser Pro Leu Glu His Gly Thr Val Leu Phe Ala Arg Leu Phe

            20                  25                  30

Ala Leu Glu Pro Asp Leu Leu Pro Leu Phe Gln Tyr Asn Cys Arg Gln

        35                  40                  45

Phe Ser Ser Pro Glu Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Phe Leu Asp His

    50                  55                  60

Ile Arg Lys Val Met Leu Val Ile Asp Ala Ala Val Thr Asn Val Glu

65                  70                  75                  80

Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Gly Arg Lys His

                85                  90                  95

Arg Ala Val Gly Val Lys Leu Ser Ser Phe Ser Thr Val Gly Glu Thr

            100                 105                 110

Leu Leu Tyr Met Leu Glu Lys Cys Leu Gly Pro Ala Phe Thr Pro Ala

        115                 120                 125

Thr Arg Ala Ala Trp Ser Gln Leu Tyr Gly Ala Val Val Gln Ala Met

    130                 135                 140

Ser Arg Gly Trp Asp Gly Glu

145                 150

Claims (10)

1、一种重组全长人脑红素rhNGB，是通过包括将工程菌接种培养、诱导细菌反复冻融、菌体裂解、包涵体裂解、层析纯化和目的蛋白复性步骤生产得到。

2、一种重组全长人脑红素rhNGB的生产方法，具体步骤包括：将工程菌接种培养、细菌反复冻融、菌体裂解、包涵体裂解、层析纯化和目的蛋白复性。

3、根据权利要求2所述重组全长人脑红素rhNGB的生产方法，其特征在于，所述工程菌为重组pBV220-rhNGB/HB101工程菌。

4、根据权利要求2所述重组全长人脑红素rhNGB的生产方法，其特征在于，所述工程菌接种培养基为含有100μg/ml氨苄青霉素的LB。

5、根据权利要求2所述重组全长人脑红素rhNGB的生产方法，其特征在于，所述包涵体裂解步骤中将所述包涵体冰浴超声破碎后，于100℃煮沸5min。

6、根据权利要求2所述重组全长人脑红素rhNGB的生产方法，其特征在于，所述层析纯化步骤顺序包括凝胶过滤和阴离子交换层析。

7、根据权利要求6所述重组全长人脑红素rhNGB的生产方法，其特征在于，所述凝胶过滤用Sephacryls-200凝胶层析柱。

8、根据权利要求6所述重组全长人脑红素rhNGB的生产方法，其特征在于，所述阴离子交换层析采用Amersham Q Sepharose FF强阴离子交换层析柱。

9、根据权利要求2所述重组全长人脑红素rhNGB的生产方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：

1)构建重组pBV220-rhNGB/HB101工程菌；

2)基因工程菌种的活化：挑取分离良好的单菌落，接种于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30℃ 200rpm振荡培养8h；1％(v/v)接种于摇瓶中，培养基同前，30℃ 200rpm振荡培养16h作为种子液；

3)摇菌培养：种子液按照3％(v/v)接种于150ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30℃ 200rpm荡培养2-3h，待其OD₆₀₀＝0.3~0.4时迅速移入42℃水浴中继续振荡培养5h；

4)细菌的收集、洗涤、冻融：于4℃ 6000rpm离心15min收集诱导后的细菌，以TE缓冲液洗菌体三次，将菌体置于液氮中5min，取出在冰浴中融化，反复冻融三次，加入10倍体积的TE缓冲液悬浮菌体；所述TE缓冲液为25mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA；

5)菌体的裂解：将上步悬浮的菌体冰浴超声破碎30s(超声功率为400W)，间歇20s，共超声15次；4℃、12000rpm离心20min，弃上清，收集包涵体，并洗涤包涵体；

6)包涵体的裂解：将包涵体重悬于含有8mol/L的脲素和1％(v/v)巯基乙醇的TE缓冲液中，冰浴超声破碎30s(超声功率为400W)，间歇20s，共超声6次；然后于100℃煮沸5min，室温12000rpm离心10min，留上清，弃沉淀；

7)凝胶过滤：采用Sephacryls-200凝胶层析柱，用含有2mol/L的脲素和0.1％(v/v)巯基乙醇的TE缓冲液进行平衡；将步骤6)得到的上清液上样，目的蛋白位于主峰，收集主峰；将主峰各管进行SDS-PAGE电泳，取含杂蛋白较少的目的蛋白各管；

8)阴离子交换层析：采用Amersham Q Sepharose FF强阴离子交换层析柱，用含有2mol/L的脲素和0.1％(v/v)巯基乙醇的TE缓冲液进行平衡；将步骤7)已确定的含杂蛋白较少的目的蛋白各管合并后上样，分别用含NaCl浓度0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.5M、0.7M的平衡液进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，通过SDS-PAGE电泳观察各洗脱峰，并确定NaCl浓度为0.7M的洗脱管中的蛋白为目的蛋白；所述平衡液为含有2mol/L的脲素和0.1％(v/v)巯基乙醇的TE缓冲液；

9)目的蛋白的复性及脱盐：采用Sephadex G-50凝胶过滤柱，用含有0.1％(w/v)SDS的TE缓冲液进行平衡，将含目的蛋白的洗脱管样品上样，含有0.1％(w/v)SDS的TE缓冲液冲洗柱子，收集流出液即为重组全长人脑红素液体。

10、权利要求1所述的重组全长人脑红素rhNGB在制备预防或治疗神经系统疾病的药物中的应用。

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