CN1796408A - 分泌蛋白及编码序列和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一类新的分泌蛋白，编码分泌蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种分泌蛋白的方法。本发明还公开了编码这类分泌蛋白的多核苷酸的用途。

Description

分泌蛋白及其编码序列和用途

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码人分泌蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。

背景技术

分泌蛋白在生物体具有非常重要的作用，常常与某些生理异常或疾病有关，因此一直是人们研究的重点，本领域迫切需要开发新的人分泌蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的人分泌蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的分泌蛋白，它包括：具有SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳的，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60氨基酸序列的多肽；。

(b)将SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有相同功能的由(a)衍生的多肽。

更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一个核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列至少70％相同性，较佳的85％，更佳的95％：(a)编码上述人分泌蛋白的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳的，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或3所示氨基酸序列的多肽。

更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组：SEQ ID NO.：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59的编码区序列或全长序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人分泌蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达人分泌蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人分泌蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人分泌蛋白特异性结合的抗体。

在本发明的第六方面，提供了检测样品中是否存在分泌蛋白的方法，它包括：将样品与分泌蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在分泌蛋白。

在本发明的第七方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人分泌蛋白活性的激动剂，或者筛选抑制人分泌蛋白活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人分泌蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或者微阵列。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

在本发明中，术语“分泌蛋白”、可互换使用，都指具有人分泌蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的分泌蛋白。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即使天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的分泌蛋白或多肽”是指分泌蛋白基本上不含天然与其相关的其他蛋白、脂类、糖类或其他物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术分泌蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。分泌蛋白的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽、优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人分泌蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人分泌蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原才序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人分泌蛋白”指具有人分泌蛋白活性的SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60序列的多肽。该术语还包括具有人分泌蛋白相同功能的、SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳的1-30个，更佳的1-20个，最佳的1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳的为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能该术语还包括人分泌蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人分泌蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人分泌蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括人分泌蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有人分泌蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人分泌蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人分泌蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人分泌蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳的至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                     表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.1-60中是指编码具有SEQ ID NO：1-60偶数序列所示的蛋白质，但与SEQ IDNO：1-60中奇数序列所示的编码区序列有差别的核酸序列。

在本发明中，术语“人分泌蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人分泌蛋白活性的多肽的核苷酸序列。以NSP059为例，该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳的80％，更佳的90％，最佳的至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的人蛋白相同功能的蛋白的SEQ IDNO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替代形式，他可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳的至少70％，更佳的至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性(以NSP059为例)。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码分泌蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人分泌蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或分泌蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984：224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的分泌蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人分泌蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人分泌蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人分泌蛋白编码DNA序列和合适

的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动于、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(CFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强于是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内，或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人分泌蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗分泌蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗分泌蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人分泌蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人分泌蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人分泌蛋白DNA或是其片段编码的多肚具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人分泌蛋白的基因产物或片段。较佳地，指那些能与人分泌蛋白的基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人分泌蛋白的分子，也包括那些并不影响人分泌蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人分泌蛋白的基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链：抗体轻链；遗传工程改造的单链h分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人分泌蛋白的基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人分泌蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用免疫动物生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodys and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人分泌蛋白功能的抗体以及不影响人分泌蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人分泌蛋白的基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人分泌蛋白的基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人分泌蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人分泌蛋白。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人分泌蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人分泌蛋白的产生或活性。抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人分泌蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人分泌蛋白阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用人分泌蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与分泌蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明分泌蛋白或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的分泌蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况

下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人分泌蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于分泌蛋白的无表达或异常/无活性的分泌蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的分泌蛋白，以抑制内源性的分泌蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将分泌蛋白的基因转移至细胞内。构建携带分泌蛋白的基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人分泌蛋白的基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人分泌蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人分泌蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人分泌蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人分泌蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人分泌蛋白水平，可以用作解释人分泌蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断分泌蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在分泌蛋白的方法是利用分泌蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与分泌蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在分泌蛋白。

分泌蛋白的多聚核苷酸可用于分泌蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，分泌蛋白的多聚核苷酸可用于检分泌蛋白的表达与否或在疾病状态下分泌蛋白的异常表达。如分泌蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断分泌蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用分泌蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测分泌蛋白的转录产物。

检测分泌蛋白的基因的突变也可用于诊断分泌蛋白相关的疾病。分泌蛋白突变的形式包括与正常野生型分泌蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的.简而言之，根据本发明分泌蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian lnheritance in Man(可通过与Johns Hopkins UniversityWelch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1人分泌蛋白基因的克隆

1.mRNA的分离(mRNA isolation)

取人的脑垂体、肝癌组织、下丘脑等各种不同组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。用带Oligod(T)的纤维素柱分离总RNA中的mRNA，定量。

3.cDNA文库的构建(Construction of cDNA library)

以mRNA为模板，合成双链cDNA，反转录引物见SEQ ID NO.1。补平末端后，加含EcoRI切点的接头，接头序列分别见SEQ ID NO.1-58中的偶数序列和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性内切酶消化1.5小时，再进行片段分离。过柱筛选长度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，无菌水溶解，连接至Uni-ZAP XR载体(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)进行包装，宿主茵使用XL 1-Blue MRF’(Stratagene，CA9203，USA)细菌。涂板并测定滴度。

4.测序及数据库建立(Seqencing and Database Constructing)

挑选文库中有外源片段插入的克隆，扩增后抽提质粒(Oiagen，Germany)，用T3和T7作为3’端和5’端的通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABl377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行EST大规模测序。测序结果用FACTURA软件去除载体序列，传输到SUN Ultra 450Server上进行下一步的处理。所有的序列信息再用6CG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，将无同源性或同源性低于95％的序列视为新基因建立数据库。

5.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

在得到的新基因片段序列信息基础上，进行cDNA全长克隆

(1)“电子克隆”(Electronic Cloning)

以新基因片段序列作为探针搜寻dbEST数据库，将重叠序列，50bp，同源性在98％以上的表达序列标签(Expressed Sequence TaS，简称“EST”)序列认为同一序列(consensus sequence)，取出井用AUTOASSEMBLER软件进行拼接，部分EST可以延伸探针序列。再用STRIDER软件分析被延伸的序列是否具有完整的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜寻Cenbank或SwissProt以确定该序列在核苷酸和氨基酸水平上是否与其他物种有同源性，以帮助判别所得到的基因全长完整性如何。通过电子克隆的方法，通常可获取人分泌蛋白基因的全长序列。

(2)cDNA末端快速扩增(Rapld A 叩“fication of cDNA Ends，RACE)

如果通过“电子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全长，则在已有序列的5’或3’端设计引物，在人类肝脏Marathon-Ready cDNA文库(ClontechLab，Inc，USA)中进行长距离PCR反应。然后对PCR产物克隆、测序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER软件分析被延长的序列有无完整的ORF，如无，重复上述过程直至获得全长。

(3)RT-PCR

对于5’和3’端已知的序列，如果中间尚有一段间隙(gap)无法从已有的公共数据库或自身数据库获得，可考虑采用RT-PCR的方法。在序列5’端设计引物，3’端引物采用Oligo-dT，在肝脏总RNA库中进行扩增。然后对产物进行克隆、测序。最后拼接井获得全长。

通过组合使用上述3种方法，获得了30种人分泌蛋白的全长编码序列编码的分泌蛋白如表2所示：

                                 表2

基因名称	DNA序列	氨基酸序列	克隆来源	备注
					NSP059	SEQ IDNO.1	SEQ IDNO.2	人脑垂体	基因长度：2155bp，编码框长度：735bp，其编码244个氨基酸，该蛋白理论分子量为24995.41Da，理论等电点是4.44，它的N端含有一个长17氨基酸的信号肽。
NSP062	SBQ IDNO.3	SEQ IDNO.4	人脑垂体	基因长度：944bp，编码框长度：519bp，其编码173个氨基酸，该蛋白理论分子量为18856.4Da，理论等电点是5.51，它的N端含有一个长31氨基酸的信号肽。
					NSP063	SEQ IDNO.5	SEQ IDNO.6	人脑垂体	基因长度：3651bp，编码框长度：678bp，其编码226个氨基酸，该蛋白理论分子量为24250.83Da，理论等电点是5.71，它的N端含有一个长21氨基酸的信号肽。

NSP064	SBQ IDNO.7	SEQ IDNO.8	人脑垂体	基因长度：848bp，编码框长度：363bp，其编码121个氨基酸，该蛋白理论分子量为17836.35Da，理论等电点是8.89，它的N端含有一个长32氨基酸的信号肽。
					NSP065	SEQ IDNO.9	SEQ IDNO.10	人脑垂体	基因长度：1229bp，编码框长度：864bp，其编码288个氨基酸，该蛋白理论分子量为32165.69Da，理论等电点是8.64，它的N端含有一个长17氨基酸的信号肽。
NSP066	SBQ IDNO：11	SEQ IDNO.12	人脑垂体	基因长度：632bp，编码框长度：504bp，其编码168个氨基酸，该蛋白理论分子量为18176.67Da，理论等电点是9.43，它的N端含有一个长18氨基酸的信号肽。
					NSP067	SEQ IDNO.13	SEQ IDNO.14	人脑垂体	基因长度：2671bp，编码框长度：813bp，其编码271个氨基酸，该蛋白理论分子量为30731.19Da，理论等电点是8.95，它的N端含有一个长21氨基酸的信号肽。
NSP068	SEQ IDNO.15	SEQ IDNO.16	人脑垂体	基因长度：1933bp，编码框长度：915bp，其编码305个氨基酸，该蛋白理论分子量为32945.15Da，理论等电点是4.67，它的N端含有一个长26氨基酸的信号肽。
					NSP069	SBQ IDNO：17	SEQ IDNO.18	人脑垂体	基因长度：1413bp，编码框长度：657bp，其编码219个氨基酸，该蛋白理论分子量为24933.8Da，理论等电点是8.91，它的N端含有一个长15氨基酸的信号肽。
NSP070	SEQ IDNO.19	SEQ IDNO.20	人脑垂体	基因长度：639bp，编码框长度：351bp，其编码117个氨基酸，该蛋白理论分子量为13302.29Da，理论等电点是9.73，它的N端含有一个长25氨基酸的信号肽。
					NSP071	SEQ IDNO.21	SEQ IDNO.22	人脑垂体	基因长度：1340bp，编码框长度：882bp，其编码294个氨基酸，该蛋白理论分子量为32261.91Da，理论等电点是6.37，它的N端含有一个长28氨基酸的信号肽。

NSP072	SBQ IDNO：23	SEQ IDNO.24	人脑垂体	基因长度：2367bp，编码框长度：1362bp，其编码454个氨基酸，该蛋白理论分子量为50179.41Da，理论等电点是10.5，它的N端含有一个长31氨基酸的信号肽。
					NSP073	SEQ IDNO.25	SEQ IDNO.26	人脑垂体	基因长度：1109bp，编码框长度：882bp，其编码294个氨基酸，该蛋白理论分子量为31206.88Da，理论等电点是8.47，它的N端含有一个长23氨基酸的信号肽。
NSP075	SEQ IDNO.27	SEQ IDNO.28	人脑垂体	基因长度：1060bp，编码框长度：743bp，其编码248个氨基酸，该蛋白理论分子量为27766.39Da，理论等电点是8.45，它的N端含有一个长24氨基酸的信号肽。
					NSP076	SBQ IDNO：29	SEQ IDNO.30	人脑垂体	基因长度：2467bp，编码框长度：761bp，其编码253个氨基酸，该蛋白理论分子量为27784.34Da，理论等电点是9.07，它的N端含有一个长27氨基酸的信号肽。
NSP078	SEQ IDNO.31	SEQ IDNO.32	人脑垂体	基因长度：2854bp，编码框长度：444bp，其编码148个氨基酸，该蛋白理论分子量为16162.86Da，理论等电点是9.41，它的N端含有一个长15氨基酸的信号肽。
					NSP079	SEQ IDNO.33	SEQ IDNO.34	人脑垂体	基因长度：812bp，编码框长度：414bp，其编码138个氨基酸，该蛋白理论分子量为14289.36Da，理论等电点是7.82，它的N端含有一个长30氨基酸的信号肽。
NSP080	SBQ IDNO：35	SEQ IDNO.36	人脑垂体	基因长度：1123bp，编码框长度：945bp，其编码315个氨基酸，该蛋白理论分子量为35640.9Da，理论等电点是5.12，它的N端含有一个长23氨基酸的信号肽。
					NSP081	SEQ IDNO.37	SEQ IDNO.38	人脑垂体	基因长度：2629bp，编码框长度：1032bp，其编码344个氨基酸，该蛋白理论分子量为33840Da，理论等电点是6.31，它的N端含有一个长26氨基酸的信号肽。

NSP082	SEQ IDNO.39	SEQ IDNO.40	人脑垂体	基因长度：1574bp，编码框长度：747bp，其编码249个氨基酸，该蛋白理论分子量为28309.72Da，理论等电点是4.6，它的N端含有一个长19氨基酸的信号肽。
					NSP083	SBQ IDNO：41	SEQ IDNO.42	人脑垂体	基因长度：1976bp，编码框长度：1722bp，其编码574个氨基酸，该蛋白理论分子量为61915.61Da，理论等电点是5.2，它的N端含有一个长22氨基酸的信号肽。
NSP085	SEQ IDNO.43	SEQ IDNO.44	人脑垂体	基因长度：1145bp，编码框长度：978bp，其编码326个氨基酸，该蛋白理论分子量为34196.31Da，理论等电点是6.65，它的N端含有一个长26氨基酸的信号肽。
					NSP086	SEQ IDNO.45	SEQ IDNO.46	人脑垂体	基因长度：1826bp，编码框长度：636bp，其编码212个氨基酸，该蛋白理论分子量为24273.2Da，理论等电点是5.3，它的N端含有一个长18氨基酸的信号肽。
NSP087	SBQ IDNO：47	SEQ IDNO.48	人脑垂体	基因长度：2066bp，编码框长度：864bp，其编码288个氨基酸，该蛋白理论分子量为29591.17Da，理论等电点是5.62，它的N端含有一个长17氨基酸的信号肽。
					NSP088	SEQ IDNO.49	SEQ IDNO.50	人脑垂体	基因长度：2475bp，编码框长度：1209bp，其编码403个氨基酸，该蛋白理论分子量为45950.89Da，理论等电点是8.29，它的N端含有一个长22氨基酸的信号肽。
NSP089	SEQ IDNO.51	SEQ IDNO.52	人脑垂体	基因长度：2144bp，编码框长度：1725bp，其编码575个氨基酸，该蛋白理论分子量为30297.2Da，理论等电点是7.88，它的N端含有一个长28氨基酸的信号肽。
					NSP090	SEQ IDNO.53	SEQ IDNO.54	人脑垂体	基因长度：4103bp，编码框长度：1731bp，其编码577个氨基酸，该蛋白理论分子量为64180.21Da，理论等电点是5.35，它的N端含有一个长24氨基酸的信号肽。

NSP091	SBQ IDNO：55	SEQ IDNO.56	人脑垂体	基因长度：2476bp，编码框长度：1161bp，其编码387个氨基酸，该蛋白理论分子量为61450.44Da，理论等电点是9.02，它的N端含有一个长18氨基酸的信号肽。
					hBolA3	SBQ IDNO：57	SEQ IDNO.58	人脑垂体	基因长度：536bp，编码框长度：324bp，其编码108个氨基酸，该蛋白理论分子量为12114.17Da，理论等电点是9.66。
hBolA2	SBQ IDNO：59	SEQ IDNO.60	人脑垂体	基因长度：1030bp，编码框长度：459bp，其编码153个氨基酸，该蛋白理论分子量为16932.38Da，理论等电点是8.41。

实施例2人分泌蛋白的制备和提纯

在该实施例中，将全长的人分泌蛋白编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

1.将人分泌蛋白以帕T融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。

原校表达载体的构建，以及转化大肠杆菌

根据人分泌蛋白的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5’和3’端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pGEX-2T载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将人分泌蛋白基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pGEX-2T载体(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鉴定好的表达载体利用CaCl₂方法转入大肠杆菌DH5。，筛选鉴定得到含有pGEX-2T-分泌蛋白表达载体的工程菌DH5Q-pGEX-2T-分泌蛋白。

表达GST-分泌蛋白重组蛋白的工程苗的分离鉴定

挑取单菌落的DH5α-pGEX-2T-分泌蛋白工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5p1)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-分泌蛋白融合蛋白的工程菌。

GST-分泌蛋白融合蛋白的提取纯化

按上述方法诱导表达GST-分泌蛋白融合表达蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-分泌蛋白。诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20mlPBS重悬细菌，超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm离心10分钟沉淀结合了GST-分泌蛋白的谷胱苷肽Sepharose 4B，弃上清。按每毫升超声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm离心10分钟，上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。获得人分泌蛋白(SEQ ID NO.1-58中的偶数序列)。

实施例3人分泌蛋白或多肽在人胚肾293细胞中进行真核细胞表达

1.人分泌蛋白杆状病毒表达载体的构建及转染293细胞株

根据人分泌蛋白的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将人分泌蛋白cDNA在保证阅读框架的前提下克隆至pcDNA3.1A载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鉴定好的表达载体3μg，pcDNA3.1ADNA(BaculoGold^TMACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofectinn(Cibco-BRL，NY)25μl，加入1ml无血清的DMEM培养基中，振荡15秒混匀，室温孵育15分钟备用。取1ml(2×10⁶)293细胞悬液于60mm组织培养板中，贴壁1小时后换转染培养基，室温孵育15分钟后弃培养基，加入前面制备好的DNA载体转染混合物，Parafilm密封培养板，于室温27℃振摇培养4小时，而后换完全培养基培养3天，收集上清备用。

2.转入重组表达载体的293细胞株的筛选鉴定

转染3天后的293细胞进行Western鉴定。将细胞裂解后进行SDS-PAGE电泳，电泳后的胶于Pharmacia的Multiphor II半干电转移仪中将蛋白质转印到硝酸纤维膜上，将硝酸纤维膜置于封闭液中封闭1小时，而后于抗人分泌蛋白的抗体溶液中封闭1小时，TBS液振摇清洗5分钟共2次，而后将膜置于生物素标记的抗人分泌蛋白一抗的第二抗体溶液中振摇1小时，TBS清洗，加入亲和素-碱性磷酸酶复合物反应30分钟，TBS清洗2次，加入新鲜配制的显色液显色观察蛋白条带。挑取高表达人分泌蛋白的293细胞克隆。

3.人分泌蛋白的提取纯化

用高表达人分泌蛋白的Sf9细胞克隆收集细胞，PBS洗涤。每2×10⁸细胞加入20ml细胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na₃PO₄(磷酸钠，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na₃VO₄(钒酸钠)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破细胞，12000×g离心20min去除细胞碎片，上清按每2×10⁸的细胞加入2ml NTA-琼脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小时。而后用含100nM咪唑的His缓冲液洗涤两次，用含20mM N，N’-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的缓冲液洗脱以得到纯化的蛋白。洗脱液保存于4℃，井进行SDS-PAGE电泳检测提取的人分泌蛋白的纯度。得到各人分泌蛋白(SEQ ID NO.1-50中的偶数序列)。

实施例4抗人分泌蛋白抗体的制备

1.免疫小鼠和脾细胞的制备：将实施例2和3制备的本发明SEQ IDNO.1-58中的偶数序列所示的分泌蛋白用层析法进行分离后备用，也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中割下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。取6-8周龄Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量再加强免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾细胞制备见鄂征主编，《组织培养和分子细胞学技术》，北京出版社，第210页。

2.按《组织培养和分子细胞学技术》(同上)，第371页中的方法，制备饲养细胞。

3.按《组织培养和分子细胞学技术》(同上)，第213页中的方法，进行细胞融合。

4.抗体的检测：在细胞融合10一15天后，需逐孔进行检查，一旦发现旺盛的杂交细胞集落生长，就应用人分泌蛋白做抗体活性的初步筛选，常用的方法有：免疫荧光试验、发射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。检查出抗体活性的孔后，立刻进行克隆培养，并分离出抗体。获得的抗体的特异反应活性用它在体外沉淀对应分泌蛋白的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种分离的人分泌蛋白，其特征在于，该多肽含有SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、60的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列如SEQID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60所示。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO.：2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组：SEQ ID NO.：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59的编码区序列或全长序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种分泌蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养如权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出分泌蛋白。

9.一种能与权利要求1所述的人分泌蛋白特异性结合的抗体。

10.一种检测样品中是否存在分泌蛋白的方法，其特征在于，包括：

将样品与权利要求9所述的抗体接触，

观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在分泌蛋白。