CN1680584A - 提高标准化的松果菊制备物的免疫调节活性的方法 - Google Patents

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Abstract

具有标准的菊苣酸含量并且诱导提高水平的免疫刺激活性的松果菊制备物。通过选择松果菊植物的收获时间来实现提高免疫刺激活性，该收获时间是完全开花之前的植物成熟阶段。通过在完全开花之前收获的松果菊植物提高免疫刺激作用的方法。

Description

提高标准化的松果菊制备物的免疫调节活性的方法
技术背景
松果菊属(Genus Echinacea)植物的提取物常常被用于在调节哺乳动物免疫反应。松果菊属植物是生产黄雏菊的多年生植物，并且在首次种植后能够进行多年收割。松果菊属植物需要种植两年。在收获之前，各个新种植的植物经过数个成熟阶段。在第一到第七阶段，松果菊属植物经过营养阶段从发芽到开花，然后到完全开花。松果菊属作物通常在全开花期收获，并且被加工来提取具有医学特性的产品。
对于调节哺乳动物中的免疫反应的特定松果菊属化合物是未知的。但是，松果菊属植物含有大量活性植物化学物质，例如咖啡酸衍生物(例如菊苣酸)、烷基胺(例如十二碳四烯酸丁胺)，和糖蛋白/多糖。摄食松果菊属中的所有植物化学物质来获得组合的效果。去除一类组分会降低有效作用。植物提取物被规格化来含有特定含量标记化合物。典型地，松果菊提取物被规格化来含有已知含量的一种或多种菊苣酸，多糖或烷基胺。
发明内容
本发明所描述方法中的一个实施方案是用于确定药用植物的最佳收获期(window)，通过从植物的各种大量不同成熟阶段获收获至少一种植物；将植物的制备物加入到细胞培养物中；收获细胞培养物；分析细胞培养物中药用植物诱导的产物的水平；和观察对应于各个不同成熟阶段的产物的水平。
在此描述的方法的另一个实施方案是通过在完全开花期之前，在成熟阶段收获松果菊植物提高松果菊的免疫调节作用的方法。优选地，松果菊植物在阶段6成熟的过程中或者之前被收获。阶段6的特征在于颜色为绿色或白色的直立叶舌花。更加优选地，在特征为植物具有约18mm的小芽的阶段3成熟期或之前收获松果菊植物。最优选地，在营养期(成熟期1)收获植物。
在此描述的还有另一个本发明的实施方案是具有标准浓度的菊苣酸和被提高含量的免疫激活活性的松果菊制备物，其中制备物从在完全开花之前的成熟期中收获的松果菊植物中获得。
术语“提高”被用于指所观察的活性升高。
术语“苞叶”是指保护花序的被修饰的叶片或叶片样植物部分。
术语“免疫调节”和“免疫刺激”被用于指信使核糖核酸(mRNA)转录或者与免疫反应相关的蛋白质的生产水平的改变。
术语“诱导”(induce)或“诱导”(induction)(例如免疫细胞因子mRNA的诱导)是指通过定量RNA或蛋白质含量测定总的转录或翻译产物或活性的升高。
术语“花序”是指植物的开花部分。
术语“舌叶”或“舌叶花”是指复合花(a composite flower)的伞形花序小花的花冠。
术语“成熟期”或“阶段”是指在各个年周期中的植物发育过程的一个阶段。该术语不是指多年生作物的年龄(以年计算)。
术语“分生组织”是指生成新细胞的组织。
术语“制备物”是指从脱水和/或粉碎的植物原料或者从植物材料的化学提取物中获得的松果菊植物产品。
附图说明
附图1是描述在用来自在成熟期1、3和6收获的松果菊植物的提取物处理后由THP-1细胞产生的细胞因子IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-8和IL-10的mRNA含量以及IFN-g、MIP-1和TNF-a的含量的柱形图，与用作阳性对照的标准脂多糖(LPS)溶液比较。
具体实施方式
药用植物例如松果菊的用途通常基于或者衍生于这些植物的最初发现者的使用。松果菊的最初发现者根据经验选择使用特定的植物。例如，早期的松果菊使用者可根据植物成熟(readiness)的视觉线索，知道何时收获植物，来获得期望的结果。最近，开发出更加精确的方法。该方法由进行化学分析一种或多种标记化合物的存在和含量构成。
菊苣酸是紫花松果菊制备物的优选标记化合物，这是由于该标记在品种鉴定中的应用是有价值的。
但是，在任何单独的特定标记和所观察免疫调节活性之间不存在确定的关系。经验的或化学的方法都不能揭示最佳的收获期，来获得细胞水平上的最有利的免疫刺激活性。通常在完全开花期收获松果菊。但是在植物成熟的较早阶段收获松果菊作物能够获得更好的免疫调节或者免疫刺激，通过人细胞中的基因反应来产生，并且维持高水平的用于标准化的标记化合物。在此描述的方法通过使用体外分析来测定免疫刺激核酸和/或蛋白质的诱导，确定理想的收获期，来获得最佳水平的免疫刺激。
紫花松果菊植物经过在此确定为成熟期1-7的多个成熟阶段。阶段1是营养期。阶段2特征在于隐芽(hidden bud)形成。为了观察阶段2，环绕顶端分生组织的叶子必需被打开以确定存在指示花序开始的苞叶。阶段3是小芽时期，其中苞叶直径约一个美国硬币的大小(18mm)。阶段4是芽长大阶段，其中苞叶的直径约美国五分镍币的大小(21mm)。阶段5的特征在于球果(cone)形成。球果是密集排列的小花的复合物。在阶段6中，舌叶出现并直立生长。阶段6的直立舌叶沿着球果的周边形成，为绿色或白色。阶段7是完全开花期，一旦舌叶伸长，凋萎变色，该阶段结束。颜色在粉色到深紫色之间变化。
在上述的各个成熟期中，剪除地面以上约5厘米的整个松果菊植物。地面以上约5厘米是田地里机械收割松果菊植物的位置。收获生长了6年的植物。在春季重新种植该植物。在重新种植该植物后约71天收获阶段1的植物。在重新种植该植物后约76天收获阶段3的植物。在重新种植该植物后约83天收获阶段6的植物。采集植物的5厘米以上的所有空中部分，用修枝剪刀剪成约1-2英寸大小的碎片，在烘干机中54℃(130°F)下脱水24h。然后被切碎和干燥的植物用咖啡磨研磨成粉末。可以通过许多方法，例如剁碎、切碎、研磨、碾磨或者通过其他方法来降低植物材料的颗粒大小。
由于个体间的发育步调的天然变化，各个植物的发育阶段可能不同于邻近的植物。理想地，全部被种植的植物都在期望收获的发育阶段。但是，由于发育步调的自然变化，约80％的种植植物在任何时间处于特定阶段。观察到阶段1的成熟约90-100％一致。阶段3约80％一致，而阶段6约70％一致。目前一般实践是在完全开花期收获松果菊。在完全开花期收获可能收集到一些已经开始退化的植物。
                            HPLC分析
已经被干燥和降低大小的干燥植物材料被加到80％的甲醇水溶液中，加热到60℃(140°F)1小时，并摇晃。随后，将植物材料放到摇床上，在室温下1小时，然后根据分析需要被过滤和稀释。
通过高压液相层析(HPLC)确定各个成熟阶段的植物提取物的菊苣酸含量。HPLC系统装备了Photo Diode Array探测器。所用的柱是Waters公司(Milford，MA)的Symmetry C18，P/N WATO54215，4.6mm×250mm，5μm(微米)颗粒直径。采用如下条件：
移动相：A：0.2％磷酸水溶液
        B：100％甲醇
        C：100％乙腈
溶剂程序：
梯度：
时间 溶剂A 溶剂B 溶剂C
0  70％ 20％ 10％
25  54％ 36％ 10％
30  25％ 40％ 35％
35  70％ 20％ 10％
45  70％ 20％ 10％
流速：0.6mL/min
注入体积：10uL
柱温度：室温25℃(77°F)；检测波长：330nm。
被检测的各个成熟阶段的分析结果显示在表1中
             表1.菊苣酸浓度
阶段 菊苣酸浓度(％)
平均数 标准误差
 1营养期 3.49  0.09
 2隐芽 3.52  0.16
 3小芽 3.26  0.10
 4提高芽 3.62  0.11
 5球果形成 3.36  0.12
 6舌叶直立 3.54  0.14
 7舌叶变色 2.59  0.10
在成熟期1-6中测定的松果菊的菊苣酸含量基本上相似或相同。在成熟期7收获的松果菊植物具有较低的商业价值，由于在这个阶段观察到菊苣酸含量下降。也就是说，表1中所列的菊苣酸含量之间的变化，属于本领域技术人员通常可接受的个体植物之间的变化的水平内，或者属于用于这些类型的分析的可接受耐受的变化。
作为植物的药用产品，标记例如菊苣酸的标准化满足市场或调节的期望是重要的。通过基因诱导测定的松果菊提取物的功能性随着成熟阶段而变化，而阶段1-6的标记含量基本上不受收获时间的变化的影响。
                          基因诱导分析
被干燥和通过剪切和/或研磨降低到较小碎片的植物材料首先被溶解在体积为50∶30∶20的二甲基亚砜(DMSO)∶乙醇∶水的混合物中。随后，提取物进一步用期望体积的细胞培养叶稀释来获得用于基因诱导分析的特定浓度。
比较紫花松果菊的3个成熟期的对THP-1单细胞/巨噬细胞系的免疫刺激作用。THP-1细胞系来自人外周血，可从ATCC，Manassas，VA获得(ATCC号：TIB-202)。THP-1单细胞/巨噬细胞系被用作人和其他哺乳动物的循环血单细胞和巨噬细胞模型。循环血单细胞和巨噬细胞在炎症和免疫反应中起重要作用。在体内转录水平上测定巨噬细胞和单细胞来源的细胞因子，包括肿瘤坏死因子α、干扰素γ、白介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6、IL-10，以及趋化因子，包括巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)和IL-8的含量，并被规格化到看家基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。
THP-1细胞在37℃(98.6°F)在具有2mM谷氨酰胺的供应商推荐的RPMI 1640培养液中生长，该培养液被调节以含有1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mMHEPES和1.0mM丙酮酸钠并添加0.05mM 2-巯基乙醇、90％胎牛血清，10％。在试验前的24h，细胞以106个细胞/mL的浓度种植。然后用在成熟期1、3和6收获的植物的松果菊提取物处理细胞。脂多糖(LPS)被用作阳性对照。以在生长液中100ug/ml(微升/毫升)的浓度制备提取物。将提取物加入50％DMSO、30％乙醇、20％水的母液中，以在处理中不超过0.5％的最终溶剂浓度。作为阳性对照的LPS以500ng/ml的最终浓度被使用。在收获细胞之前，细胞培养物在37℃(98.6°F)下培养6h。
通过离心来收获细胞。如Stratagene(La Jolla，CA)的RNA分离试剂盒(#200345)的指示，用常规的Trizol/异硫氰酸胍基础溶解缓冲液分离RNA。还通过刮擦(scraping)和胰蛋白酶消化(trypinizing)来收获细胞培养物。通过已知的定量反转录酶-聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定免疫细胞因子mRNA和趋化因子mRNA的诱导。测定基线测定值为非LPS刺激，并与实时PCR数据比较。该结果显示在附图1中。通过比较该结果与未被诱导的THP-1细胞中的各个基因的表达水平来计算倍数诱导。
当比较紫花松果菊的3个成熟期对THP-1单细胞/巨噬细胞系的免疫刺激作用，阶段1的材料具有最可能的诱导活性，特别是对细胞因子干扰素γ和肿瘤坏死因子α的诱导的作用。
阶段1、3和6的菊苣酸含量没有显著变化，参见表1。显示在附图1中的结果表明，虽然在成熟期之间标准化标记的含量没有显著变化，但是免疫刺激诱导在收获植物的成熟期中发生巨大改变。在完全开花之前收获松果菊植物用作沉积免疫系统的产品不与目前实施的标准操作冲突，但是可能会产生更好的免疫刺激作用。
除了上面讨论的特定制备物外，既便植物制备物发生变化，只要这种变化没有从制备物中去除植物化学物质，有望观察到标记含量的标准化以及免疫刺激反应提高。例如，从摄食来自在完全开花前的成熟期中收获的松果菊植物的植物化学物质产生的提高的免疫刺激作用，也可以从Menon等人的美国专利6,217,878中的粉末状松果菊制备物中获得。
除非本文另外指出或与本文明显抵触，在描述本发明的文(特别是附随的权利要求书)中使用的术语“一个”和“该”以及类似指示被解释为包括单数和复数。除非本文另外指出，本文的数值范围的引用仅仅是作为分别对应于落入保护范围的各个分离数值的速记方法，各个分离数值被结合到说明书中，如同其在此被分别地引用。除非本文另外指出或与本文明显抵触，本文描述的所有方法可以以任何合适顺序被实施。除非另外要求，在此提供的任何和全部实施例或者示例性用语(例如，“如”或“例如”)的使用仅仅是为了更好地说明本发明，而不是对本发明的保护范围的限定。说明书中的用语都不应当被解释为表示完成发明必需的任何非要求保护的要素。
本发明在此描述的为优选实施方案，包括发明人知晓的实施发明的最佳模式。当然，那些优选实施方案的改变对于本领域技术人员来说在阅读了前面的描述后是显而易见的。本发明人期望本领域技术人员适当地进行这种改变，并且本发明人期望以不同于在这种特别描述的其他方式来实施本发明。因此，本发明包括所附的权利要求中引用主题的专利法所允许的所有改进和等同形式。而且，除非本文或别处另外指出，本发明包括以上描述的要素以其所有可能变化的任何组合。

Claims (22)

1.用于确定药用植物的最佳收获期的方法，该方法包括的步骤为：
在多个植物成熟阶段收获至少一棵植物；
将植物制备物加入细胞培养物中；
收获细胞培养物；
分析细胞培养物中的药用植物诱导的产物的含量；
观察对应于各个不同成熟期的产物的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括在多个成熟阶段确定各个植物的标记化合物的浓度的步骤。
3.用确定松果菊植物的最佳收获期的方法，该方法包括的步骤为：
在多个植物成熟阶段收获至少一棵植物；
将植物制备物加入细胞培养物中；
收获细胞培养物；
分析细胞培养物中的由松果菊诱导的免疫刺激产物的含量；和
观察对应于各个不同成熟期的免疫刺激产物的含量。
4.根据权利要求3所述的方法，还包括在多个成熟阶段确定各个植物的标记化合物的浓度的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中标记化合物选自菊苣酸、烷基胺、糖蛋白、多糖以及它们的组合。
6.根据权利要求3所述的方法，其中免疫刺激产物选自细胞因子mRNA和趋化因子mRNA。
7.根据权利要求3所述的方法，其中免疫刺激产物是选自IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、以及巨噬细胞炎症蛋白-1。
8.增强松果菊提取物的免疫刺激作用的方法，该方法包括步骤：
在成熟阶段收获松果菊植物，包括完全开花之前的阶段；
干燥植物；
降低植物大小；
用溶剂提取植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中成熟阶段是营养期。
10.根据权利要求8所述的方法，还包括维持标准含量菊苣酸的步骤。
11.增强松果菊提取物的免疫刺激作用的方法，该方法包括步骤：
在营养期的成熟阶段收获松果菊植物；
干燥植物；
降低植物大小；
用溶剂提取植物。
12.一种松果菊制备物包括：
标准浓度的菊苣酸；和
提高水平的免疫刺激活性；
其中从在完全开花之前的成熟阶段收获的松果菊植物中获得该制备物。
13.根据权利要求12所述的制备物，其中提高水平的免疫刺激活性通过在THP-1细胞中诱导选自IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、以及巨噬细胞炎症蛋白-1的mRNA转录本来测定。
14.根据权利要求12所述的制备物，其中提高水平的免疫刺激活性通过在THP-1细胞中诱导选自肿瘤坏死因子α和干扰素γ的mRNA转录本来测定。
15.一种松果菊制备物包括：
标准浓度的菊苣酸；和
提高水平的免疫刺激活性；
其中从营养期收获的松果菊植物中获得该制备物。
16.根据权利要求15所述的制备物，其中提高水平的免疫刺激活性通过在THP-1细胞中诱导选自IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、以及巨噬细胞炎症蛋白-1的mRNA转录本来测定。
17.根据权利要求15所述的制备物，其中提高水平的免疫刺激活性通过在THP-1细胞中诱导选自肿瘤坏死因子α和干扰素γ的mRNA转录本来测定。
18.一种松果菊制备物包括：
标准浓度的菊苣酸，
其中该制备物诱导提高水平的免疫刺激活性；和
其中从营养期收获的松果菊植物中获得该制备物。
19.根据权利要求18所述的制备物，其中提高水平的免疫刺激活性通过在THP-1细胞中诱导选自IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、以及巨噬细胞炎症蛋白-1的mRNA转录本来测定。
20.根据权利要求18所述的制备物，其中提高水平的免疫刺激活性通过在THP-1细胞中诱导选自肿瘤坏死因子α和干扰素γ的mRNA转录本来测定。
21.紫花松果菊制备物包括：
通过HPLC分析测定至少约3.49百分含量的标准浓度的菊苣酸；
其中制备物在THP-1细胞中产生至少100倍的提高免疫刺激反应。
22.根据权利要求21所述的制备物，其中提高水平的免疫刺激反应通过在细胞中诱导选自肿瘤坏死因子α和干扰素γ的mRNA转录本来测定。
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