CN1678752A - 用于体外测定婴儿配方食品的蛋白质可消化性的分析方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于体外测定营养产品中蛋白质的可消化性的方法。该方法使用经过标准化以模仿体内消化过程的体外消化过程的胃和肠的酶。另外，通过氨基酸分布测定消化的特异性。

Description

用于体外测定婴儿配方食品的蛋白质可消化性的分析方法
                        发明领域
本发明涉及一种量化婴儿配方食品的蛋白质可消化性的方法。更具体地，本发明涉及通过对婴儿配方食品样品的总的和可溶性部分的氨基酸分布分析来测定蛋白质的可消化性，所述婴儿配方食品样品在体外经过USP消化酶的消化。
                        发明背景
婴儿配方食品在商业上现有多种形式，包括即食食品、浓缩液体以及粉状形式。婴儿配方食品一般含有酪蛋白和/或乳清以确保喂养该配方食品的婴儿吸收足够量的氨基酸，尤其是对于适当营养必需的氨基酸。测定食物蛋白质的营养品质的两种因素是可消化性和生物有效度。一般地，这些配方食品包含比在人乳奶中所发现的水平更高水平的蛋白质。用更高水平的蛋白质制造婴儿配方食品以解决假定的蛋白质的较低的可消化性。
婴儿配方食品的研究已经显示在这些配方食品的制造过程中所使用的方法具有营养学的后果，如在配方食品中蛋白质降低的可溶性和/或可消化性。例如，在延长的时间阶段上的热处理已经显示降低蛋白质的可消化性，所述时间用于生产浓缩液体和即食婴儿配方食品。作为热处理的结果，蛋白质变性或聚结，有可能改变其可消化性。对高温下的乳处理也已进行了研究并已显示增强了称为Maillard反应的氨基酸与糖类的反应。这些反应已显示通过限制蛋白分解酶的易接近性降低了氨基酸的生物有效度。
体内的蛋白质消化是一个两步的过程。第一步是氨基酸与预可消化性的酶胃蛋白酶相接触。第二步包括胰酶的水解。由于蛋白质消化产物被快速地传送入小肠并被其吸收，对体内氨基酸有效性的评估是困难的。此外，可能存在内源性蛋白质并以不同于作为食物或以食品添加剂的形式吸收的蛋白质的速度消化和吸收。因而，已经发展了蛋白质可消化性的体外分析。已通过酶水解比色分析(利用TNBS的水解的程度)和大小排阻色谱技术如高效液相色谱(HPLC)进行了婴儿配方食品可消化性的评估。这些方法所提供的信息的准确度和精确度被不可溶蛋白质的存在和/或被分光光度和色谱干涉所证实。
已经利用预可消化性酶胃蛋白酶和胰酶进行了婴儿配方食品的体外消化。在体外消化过程之后通过测量非蛋白氮(NPN)的升高水平来测定蛋白质的可消化性，所述体外消化过程由Kjeldahl分析进行测定。但是，在这些研究中所用的酶未包括酶活性的标准化，因而在消化中所用的酶的活性可以变化很大。另外，用Kjeldahl法的氮分析在消化和未消化的蛋白质的量化中缺乏特异性。消化的氨基酸的类型的特异性为配制包括婴儿配方食品的营养产品、进一步保证喂以该配方食品的婴儿吸收和消化必需的氨基酸提供了更好的指导。
可消化性研究包括测定蛋白质，如测定在消化过程中所用的胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性水平的分析。胃蛋白酶活性已经通过三羧酶(TCA)可溶性产物的单位的方式进行了测量。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性已经通过特定氨基酸的水解速率进行了测量。尽管测定所用酶的活性水平能够提高这种分析的标准化，但增加的测量酶活性的步骤是繁琐和费时的。
需要一种利用具有标准化活性的酶的体外蛋白质可消化性测定的方法。还需要这些方法的结果以提供在氨基酸可消化性中的特异性。
本发明提供一种测定蛋白质可消化性的方法，同时提供在量化消化的和总的(消化的和未消化的)蛋白质中的特异性。
                        发明概述
本发明的一个实施方案是一种测定蛋白质可消化性的方法，该方法包括以至少一种酶消化一种营养产品的样品和一种试剂空白；终止消化过程；测定样品和空白对照的多种氨基酸的总浓度；测定样品和空白对照的总的色氨酸浓度；测定样品和空白对照的多种氨基酸的可溶性浓度；测定样品和空白对照的色氨酸的可溶性浓度；和计算可溶性氨基酸在消化的营养产品的样品中的百分率的步骤。
在另一实施方案中，该方法包括将每一种消化的样品和空白对照分离成一个第一部分和一个第二部分；测定样品的第一部分和空白对照的第一部分的多种氨基酸的总浓度；测定样品的第一部分和空白对照的第一部分的总的色氨酸浓度；将样品的第二部分和空白对照的第二部分各自分离成一个液相和一个固相；测定在液相中的多种氨基酸的可溶性浓度；和测定在液相中的色氨酸的可溶性浓度。
在另一个实施方案中，分离步骤选自酸化、沉淀、离心、过滤和离心与过滤的组合。
在另一个实施方案中，计算可溶性氨基酸的百分率的步骤包括下列步骤：将样品和空白对照的多种氨基酸的总浓度和色氨酸浓度相加；测定在样品和空白对照之间在多种氨基酸的总浓度和色氨酸浓度上的差异；将在样品和空白对照中的多种氨基酸和色氨酸浓度的可溶性浓度相加；测定在样品和空白对照之间在多种氨基酸和色氨酸的可溶性浓度上的差异；将在可溶性浓度上的差异除以在总浓度上的差异以测定商；和以100乘以商的步骤。
在一个实施方案中，营养产品为婴儿配方食品。
在一个实施方案中，消化步骤使用一种或多种酶以模仿人胃肠道的环境。
在另一个实施方案中，酶选自胃蛋白酶、肽酶、胰酶蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。
还在另一个实施方案中，消化样品的步骤包括获得营养产品的样品；调节pH到大约4.5；加入胃蛋白酶；温育样品；提高pH到大约7.0；加入胰酶蛋白酶；和温育样品的步骤。
在另一个实施方案中，终止消化的步骤是将样品浸在沸水浴中。
                        发明详述
可以根据本发明测定可消化性的蛋白质可以以许多形式存在，包括但不限于，营养产品、食品添加剂、药物或其它产品。它们可以用于各种年龄，例如婴儿、儿童或成人。在快速生长的时期，如婴儿期、儿童期和青春期使用它们可能有特定的价值。可以根据本发明测定其可消化性的蛋白质可以被掺入一种营养性的“运载体或载体”中，该载体或载体包括但不限于FDA的法定食品类别：传统食品、特殊食用用途的食品、食品添加剂和医学食品。
营养产品的蛋白质的适当来源包括奶、大豆、大米、肉(例如，牛肉)、动物和植物(例如，豌豆、马铃薯)、蛋(蛋白)、动物胶和鱼。适当的完整蛋白质包括但不限于基于大豆的、基于奶的、酪蛋白质、乳清蛋白质、大米蛋白质、牛肉胶原、豌豆蛋白质、马铃薯蛋白质及其混合物。适当的蛋白质水解产物也包括但不限于大豆蛋白质水解产物、酪蛋白质水解产物、乳清蛋白质水解产物、大米蛋白质水解产物、马铃薯蛋白质水解产物、鱼蛋白质水解产物、蛋白水解产物、动物胶蛋白质水解产物、动物和植物蛋白质水解产物的组合及其混合物。水解的蛋白质(蛋白质水解物)是已经水解的或破碎为较短的肽片段和氨基酸的蛋白质。这种水解的肽片段和游离氨基酸更容易被消化。在最广的意义上，当一个或多个氨基键断裂时蛋白质已经得到了水解。在制造的过程中氨基键的断裂可能无意地或偶然地发生，例如由于加热或剪切。对于本发明的目的，术语水解的蛋白质意为一种已经以一种意在断裂酰胺键的方式进行了加工或处理的蛋白质。预期的水解可以，例如通过用酶或酸处理完整的蛋白质来进行。将优选在根据本发明的配方食品中利用的水解的蛋白质水解到这样一种程度，即氨基氮(AN)与总氮(TN)的比率在约0.1AN/1.0TN到0.4AN/1.0TN。(由于游离氨基酸可以作为一种添加剂加入并且将改变报告值，给出的AN∶TN比率是对于水解产物蛋白质源本身而言的，不代表在最终的婴儿营养配方食品产品中所给出的AN∶TN比率)。蛋白质也可以以游离氨基酸的形式提供。根据本发明的一种配方食品，优选添加以各种游离氨基酸，从而提供更加营养全面和均衡的配方食品。
氨基酸是蛋白质生物合成的单个的构成部件。非必需氨基酸是那些在体内由氨和各种碳源合成的氨基酸。非必需氨基酸包括：丙氨酸(ALA)、丝氨酸(SER)、天冬氨酸(ASP)、谷氨酸(GLU)、半胱氨酸(CYS)、酪氨酸(TYR)、天冬酰胺(ASN)、脯氨酸(PRO)、甘氨酸(GLY)和谷氨酰胺(GLN)。缩写“GLX”指GLU加GLN而缩写“ASX”指ASP加ASN。
必需氨基酸对于体内蛋白质的合成也是需要的，并且必须从食物来源中获得。它们是异亮氨酸(ILE)、亮氨酸(LEU)、赖氨酸(LYS)、蛋氨酸(MET)、苯丙氨酸(PHE)、苏氨酸(THR)、色氨酸(TRP)、缬氨酸(VAL)、组氨酸(HIS)和精氨酸(ARG)(在年轻成长中的动物中必需，但不在成体中必需)。在必需氨基酸中，色氨酸具有最低的每日摄入需求。
直接的关于蛋白质可消化性的结论可以由分析得到，所述分析测定在体外消化后，溶液(可溶性的或可消化性的部分)中氨基酸的类型和浓度以及消化后固相(不可消化性的部分)中的氨基酸浓度水平。作为加入配方食品的适当的游离氨基酸的例子，包括但不限于L-色氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸、L-氨基乙磺酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸和L-肉碱。
大豆
本发明的营养配方食品的一种组分是大豆蛋白质。如上所述，可以考虑许多大豆蛋白质来源。大豆蛋白质分离自大豆。大豆是一种高质量蛋白质的极佳来源，大豆的大约38％到40％是蛋白质。简而言之(如图表I中所示)，大豆的加工包括从去壳的，并且碎破大豆中提取油料，留下脱脂的大豆薄片。
方案I：大豆加工
一般将脱脂的大豆薄片磨成粉；进行醇提或alkoling/H2O提取以去除香料化合物和糖以使得蛋白质浓缩；用水加工以去除糖和香料化合物，沉淀并干燥以使蛋白质分离。乳清和蛋白纤维是上述过程的副产品。
营养产品
根据目的使用者的年龄和状况的不同，营养产品以各种相对量含有常量营养物，即脂类、蛋白质和糖类，并且经常含有微量营养物如维生素、矿物质和痕量矿物质。术语“食物”包括固体和液体。术语“营养产品”包括但不限于这些FDA的法定食品类别：传统食品、特殊食用用途的食品、医学食品和婴儿配方食品。“特殊食用用途的食品”可以通过供给营养物以补充食品或作为食品的单独组分而补给一种特殊食用需要，所述特殊食用需要由于一种身体的、生理的、病理的状况而存在。“医学食品”是一种配制为在医生的指导下进行食用或肠道给药的食物，它用作一种疾病或状况的特异性膳食管理，对于这种疾病或状况，基于已认识的科学理论通过医学评估确定了与众不同的营养需求。
此外，“食品添加剂”是一种用于通过以片剂、胶囊剂或液体形式摄入以补充食品的产品并且不主张用作一种传统食物或作为一餐或日常饮食的单独一项。
婴儿配方食品
婴儿配方食品是指符合婴儿配方食品法案(21 USC§350(a)et.seq.)的标准和规范并用来代替或补充人乳奶的营养配方食品。尽管这种配方食品在至少三种不同的形式中是现有的(粉状、液体浓缩物和液体即食食品(“RTF”))，通常谈到在“喂养”基础上的营养浓度，并且因而常常描述到RTF，它被理解为根据制造商指导，其它形式重构或稀释到基本相同的组成并且本领域的技术人员能够计算出浓缩或粉状形式的相关组成。
“标准”或“概念”婴儿配方食品是指用于足月出生的婴儿作为第一次饲喂的婴儿配方食品。蛋白质、脂肪和糖类组分分别提供大约热量的8到10、46到50和41到44％；能量密度狭窄地从大约660到大约700kcal/L(或19-21Cal/fl.oz.)，通常大约为675到680kcal/L(20Cal/fl.oz.)。在脂肪、蛋白质和糖类组分中热量的分布可以在不同的概念婴儿配方食品的生产商之间有些不同。SIMILACTM(Ross PoductsDivision，Abbott Laboratories)、ENFAMILTM(Mead JohnsonNutritionals)和GOOD STARTTM(Carnation)是概念婴儿配方食品的例子。
“富营养的”配方食品是指相对于“标准”或“概念”配方食品加强了的婴儿配方食品。区别富营养的配方食品的首要的定义性特征是能量密度；第二个因素是蛋白质浓度。例如，一种具有高于约700kcal/L的能量密度或高于约18g/L的蛋白质浓度的配方食品将被认为是“富营养的”。富营养的配方食品一般还含有较高水平的钙(例如高于约650mg/L)和/或磷(例如高于约450mg/L)。其例子包括SimilacNEOSURETM和Similac Special CareTM配方食品。
通过本领域技术人员所公知的一般传统技术制造液体和粉状营养产品，对于所述产品能够测量本发明的蛋白质可消化性。简言之，制备三种浆液，混合在一起，热处理，标准化，喷雾干燥(如果可行的话)，包装并灭菌(如果可行的话)。
液体产品
通过首先在搅拌下加热水到高温以制备一种糖/矿物质浆液。随后加入矿物质。矿物质可以包括但不限于柠檬酸钠、氯化钠、柠檬酸钾、氯化钾、氯化镁、磷酸钙、碳酸钙、碘化钾和痕量矿物质的预混合物。将一种糖源，如一种或多种乳糖、玉米糖浆固体、蔗糖和/或麦芽糖糊精溶于水中，由此形成一种糖溶液。也可以加入一种膳食纤维源，如大豆多糖。将完全的糖/矿物质浆液在搅拌下置于高温中直到它与其它浆液混合，优选持续不超过约12小时。
通过合并和加热基本的油混合物来制备一种油浆液。基本的油混合物一般包含大豆、椰子、棕榈油、高油红花或向日葵油和中间链甘油三酯的某种组合。可以使用乳化剂，如甘油酯、甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、大豆甘油酯、甘油二酯和大豆卵磷脂。可以单独或作为一种预混物的部分加入可溶于油的维生素A、D、E(天然的R，R，R形式或合成的)和K的任何一种或全部。也可以加入作为一种体内抗氧化剂的β-胡萝卜素，以及一种稳定剂如角叉菜胶。能够将包含对于本发明重要的特异性长链聚合物的油加入到油浆液中。由于这些长链聚合物容易降解而变得腐臭，必须小心使用它们。将完全的油浆液在搅拌下置于高温中直到它与其它浆液混合，优选持续不超过约12小时。
通过首先在搅拌下加热水到适当的高温以制备一种在水浆液中的蛋白质。随后在搅拌下向水中加入蛋白质源。一般这种蛋白质源是完整的或水解的乳蛋白质(例如乳清或酪蛋白)、完整的或水解的植物蛋白质(例如大豆)、游离氨基酸及其混合物。通常地，任何已知的氨基氮源都可能够用于本发明。将完全的蛋白质浆液在搅拌下置于高温中直到它与其它浆液混合，优选持续不超过约2小时。或者，可以在蛋白质-脂肪乳剂而非蛋白质-水中混合一些蛋白质。
将在水中的蛋白质和糖类/矿物质以搅拌混合在一起并且将得到的混合浆液保持于高温中。在短暂的停留后(例如几分钟)，将油浆液搅拌加入到来自前面步骤的混合浆液中。作为加入到油混合物中的替代品，能够直接将LCP油加入到由混合蛋白质、糖/矿物质和油浆液所得到的混合物中。
在足以彻底混合所有的组分的时间后，调整完全混合物的pH到期望的范围。随后将混合的浆液进行气泡去除、超高温热处理、乳化和均化，接着冷却到冷冻温度。优选地，在上面的步骤完成后，进行适当的分析性试验以控制质量。基于质量控制试验的分析结果，将适量的水加到该批量中搅拌溶解。
制备包含水溶性维生素和痕量矿物质(包括硒酸盐)的维生素溶液，并在搅拌下加至加工的浆液混合物中。制备一种单独的含核苷的溶液并且也在搅拌下加至加工的混合浆液中。
可以再次调整终产品的pH以达到优化的产品稳定性。随后将完成的产品充入适当的金属、玻璃或塑料容器中并利用传统技术进行终端灭菌。或者，能够对液体产品进行无菌消毒并充入塑料容器中。
粉状产品
如上所述制备一种糖/矿物质浆液，用于液体产品的生产。
如上所述制备一种油浆液，用于液体产品的生产，有下列例外：1)乳化剂(单、二甘油酯、卵磷脂)和稳定剂(角叉菜胶)一般不加至粉末中，2)除了β-胡萝卜素外，还能够加入其它抗氧化剂，如混合的维生素E和抗坏血酸棕榈酸酯，以在任何随后的喷雾干燥过程中帮助保持产品的氧化质量，和3)在混合浆液后加入LCPs，而非加到油浆液中。
如上所述制备在水浆液中的蛋白质，用于液体产品的生产。
以与所述的液体产品的生产相似的方式将糖/矿物质浆液、在水浆液中的蛋白质和油浆液进行混合。在调整完全混合物的pH后，接着将LCPs搅拌加入到混合的浆液中。可预期地，当混合物恰好在均化(在线混合)之前以恒定速率通过一个导管时，LCPs缓慢地计量到产品中。
在除去气泡、超高温处理、乳化和均化后，将加工的混合物进行蒸发以提高混合物的固体水平，促进更有效的喷雾干燥。随后让混合物通过一个预热器和一个高压泵并且利用传统的喷雾干燥技术进行喷雾干燥。喷雾干燥粉末可能会结块，并随后在真空、氮气或其它惰性环境下包装入金属或塑料罐或金属箔/金属薄片盒中。
任何这些生产方法的变异型对于本领域技术人员都是公知的或将是显而易见的。本发明并不限于任何特定的生产方法。并入本文所提及的所有美国专利的全文作为参考。
胃和肠的酶
本文所述的用作体外消化的酶根据美国药典标准进行生产。因而酶的活性高度一致。美国药典(USP)是一种非政府组织，它通过建立技术状态标准来确保药物质量和其它健康护理技术以促进公共健康。这些标准通过公众参与的过程得以发展并为世界所接受。
由USP所发展的标准公布在美国药典和国家药方(USP-NF)中，它在联邦食品、药品和化妆品法案(21 U.S.C.§321 et seq.)中得到认可。
适于用在本文所述的方法中的酶包括，但不限于胃蛋白酶、肽酶、胰酶蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。
体外蛋白质的消化
体内消化过程难以精确再现。但是，存在于体内的几种条件可以在体外再现。体外可消化性分析应当在与体内环境尽可能相近的条件下进行。例如，消化系统的pH和酶应当纳入体外消化过程。类似地，体外消化应当是一种相应于蛋白质残余物驻留在消化道中时的时期的消化。下面描述的体外消化过程模仿胃的pH和组成以及幼婴的肠酶。体外消化的时间也模仿食物通过幼婴的消化道所需要的进间。通过下列过程进行营养产品的蛋白质消化：
通过获得一定量的即时营养产品、粉末的重组或液体浓度的稀释来制备80mL的营养产品的样品。定量地转移悬浮液至一个100mL的容量瓶并以水稀释至100mL。(应该制备悬浮液使得100mL的容量瓶包含大约1.625克的蛋白质，并且移液至20mL的螺旋帽玻瓶的每份包含约0.1625克的蛋白质。分析结果的质量在某种程度上依赖于酶与样品蛋白质的恒定比率的使用)。
将10mL的稀释样品移液至20mL的螺旋帽玻瓶中。
以1M的盐酸调节10mL整份的pH至4.5。
加入32mg的USP胃蛋白酶(美国药典，12601 TwinbrookParkway，Rockville，MD20852)并搅拌以彻底悬浮胃蛋白酶。
在玻瓶中于37℃温育30分钟。
以0.5M NaHCO3将pH提高至7.0。
加入3mL新鲜制备的在0.1M NaHCO3中的25mg/ml的USP胰蛋白酶淀粉酶(美国药典，12601 Twinbrook Parkway，Rockville，MD20852)悬浮液。搅拌以彻底悬浮酶。
在玻瓶中于37℃温育60分钟。
将玻瓶浸入沸水浴中4分钟。冷却至室温。定量地将得到的消化物转移至一个已经确定了皮重的25mL的容量瓶中，使用水帮助转移。在瓶中以水稀释消化物并记录重量。
对试剂空白与营养样品平行进行消化以用于计算在消化的样品中得到的氨基酸的全部和可溶性部分。
取分离的消化物等份测定氨基酸分布和色氨酸浓度。但是，如果氨基酸分布和色氨酸浓度由同一个消化物等份进行测定，则不需要分离步骤。
                     氨基酸分布
在测试总氨基酸的分布之前，通过移液管将100μL消化物转移到一个已经确定了皮重的2mL安瓿瓶中，并记录重量。加入2.0ml 6MHCL，将安瓿瓶置于氮气笼罩下，闭封并在110℃加热22小时。然后将消化物蒸发至干，然后重悬于2mL Na-S缓冲液中。通过GelmanAcrodisc(0.45μm，Gelman P/N 4497)过滤重悬物。
在测试可溶性氨基酸的分布之前，通过移液管将10mL的消化物转移至一个配衡的50mL的离心管中。加入10mL 24％的三氯乙酸，盖上管帽并充分混合。记录管内容物的重量。以3000倍重力将管和内容物离心30分钟，随后通过Whatman41号纸过滤液体。通过移液管将200μL的过滤物转移至一个已经确定了皮重的2mL的安瓿瓶，并记录样品的重量。如总氨基酸的测试一样，加入2.0mL的6M HCl并将安瓿瓶置于氮气笼罩下，密闭并于110℃加热22小时。随后将消化物蒸发至干燥，接着在2mL的Na-S缓冲液中重悬。通过Gelman Acrodisc(0.45μm，Gelman P/N4497)过滤重悬物。
如果可溶性和总的氨基酸分布和色氨酸浓度由同一个消化物等份样进行测定，则不需要分离步骤(例如离心)。
通过酸水解将蛋白质水解为它们的组成氨基酸，并且通过一种自动氨基酸分析仪(Model 6300氨基酸分析仪，BeckmanInstruments，Inc.，Palo Alto，CA)测试酸水解物。分析仪使用离子交换层析以分离单个的氨基酸，并利用茚三酮的柱后衍生作用产生氨基酸衍生物，随后用比色计对它们进行检测和定量。
                        色氨酸检测
通过在S.E.Garcia和J.H.Baxter in Determination of TryptophanContent in Infant Formulas and Medical Nutritionals，J AOAC Int 1992Nov-Dec；75(6)：1112-9中所述的方法进行色氨酸的测定，该文献并入这里作为参考。
将3.0mL的消化物转移至50mL的容量瓶中以进行总蛋白质的色氨酸测定。加入1.0mL的链霉蛋白酶溶液(1.7mg/mL于0.05M TRIS，pH7.5)并以pH7.5的缓冲液将体积稀释至50mL。随后将50mL溶液于50℃温育6小时。接着通过HPLC法测定色氨酸。
对于可溶性蛋白质的色氨酸测定，用移液器将6.0mL制备用来测定可溶性氨基酸的过滤液转移至50mL烧杯中。加入30mL的0.05M的TRIS，pH7.5。利用45％的氢氧化钾将pH调节到7.5。如对总蛋白质色氨酸的测试一样，加入1.0mL链霉蛋白酶溶液(1.7mg/mL于0.05M TRIS，pH7.5)并以pH7.5的缓冲液将体积稀释至50mL。随后将50mL溶液于50℃温育6小时。接着通过HPLC法测定色氨酸。
               用于色氨酸测定的HPLC系统
柱：YMC ODS-AQ，4.6×250mm，120A，5um，Waters#AQ12S052546WT。
流动相A：900mL含H3PO4的0.02M KH2PO4，100mL乙腈；pH3.1。
流动相B：200mL实验室水，800mL乙腈。
流速：0.5mL/分钟。
温度：20℃。
检测：紫外线于280nm，214nm处。
注射：10μL。
运行时间：50分钟。
洗脱程序：0％B 0-5分钟，0-25％B 5-34分钟，25-100％B 34-35分钟，100％B 35-37分钟，100-0％B 37-38分钟。
标准溶液：于实验室水中的约28mg/L(高标准)、约14mg/L(中等标准)和约7mg/L(低标准)的Abbott Laboratories PPD L-色氨酸。
                   蛋白质可消化性的计算
将空白试剂的总蛋白质的氨基酸分布浓度与色氨酸浓度相加。称该值为“RT”。
将空白试剂的可溶性蛋白质的氨基酸分布浓度与色氨酸浓度相加。称该值为“RS”。
将得到的样品消化总蛋白质的氨基酸分布浓度与色氨酸浓度相加。称该值为“IT”。
将得到的样品消化可溶性蛋白质的氨基酸分布浓度与色氨酸浓度相加。称该值为“IS”。
如下计算蛋白质的可消化性：
Figure A0382042500151
如同单个地和具体地指出每一篇参考文献被并入作为参考的程度一样，特此并入本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利作为参考，在本文中提出其全部内容。
在描述发明的上下文(特别是下面的权利要求书的上下文)中的术语″一个″和″一种″和″该″和类似的表示被解释为既覆盖单数也覆盖复数，除非本文另外指明或清楚地为与上下文相抵触。本文中值的范围的列举仅仅是作为一种分别表示落入该范围的每个单独值的速记方法，除非另外指明，并且每个单独值都被整合入说明书中，好像它在本文中被个别列举一样。本文所述的所有方法都能够以任何适当的顺序进行，除非文中另外指明或否则为上下文所清楚地抵触。本文所提供的任何和所有的实施例，或示例性的语言(例如，“如”)的使用，仅仅是为了更好地阐释本发明，并不形成对发明范围的限制，除非另外要求。在说明书中没有语言会被理解成指明任何未要求的要素为对于发明的实施来说是必需的。
尽管一些潜在的益处和目的已在本文中清楚地得以确定，应当理解本发明的一些实施方案可能没有提供全部的，或任何的清楚确定的益处和目的。
在本文中对本发明的优选的实施方案进行了描述，包括发明者已知的实施本发明的最佳方式。当然，那些优选的实施方案的变异型对于本领域普通技术人员来说在阅读前述说明书后会变得显而易见。本发明人希望熟练的技术人员适当地使用这些变异型，并且发明人指出本发明能够以与不同于本文所具体描述的方式而得以实施。因此，本发明包括对在此所附的权利要求书中列举的主题的所有改进和等同物，正如适用法律所允许的。而且，在其所有可能的变异型中，上述要素的任何组合都为本发明所包含，除非文中指明或否则为上下文所清楚地抵触。
                         实施例
下面的实施例进一步阐释了本发明，但是当然，不应当理解为以任何方式限制它的范围。
实施例1
由Arla Foods Ingredients amba Nr.Vium DK-6920 Videbaek丹麦获得三种粉状Arla乳清蛋白质水解物(WPH)。将含有约1.625克蛋白质的80mL重构粉状WPHs和也含有约1.625克蛋白质的80mL重构雀巢GOOD STARTTM，在体外根据本文所述的方法与试剂空白平行地进行消化。测定氨基酸分布以获得总消化和本文所述的消化的可溶性部分。氨基酸分布显示于表1中。蛋白质的可消化性的比较显示于表2。
表1.实施例1的消化的样品的氨基酸分布。浓度以氨基酸克数/100克总蛋白质表示。
 氨基酸  Arla 1  Arla 2  Arla 3  雀巢GOODSTARTTM
 ASX  9.70  11.7  10.1  10.3
 THR  6.57  7.73  6.87  7.11
 SER  4.46  5.21  4.64  4.69
 GLX  16.2  19.6  17.0  16.7
 PRO  5.73  6.88  5.97  5.83
 GLY  1.34  1.64  1.33  1.32
 ALA  4.46  5.22  4.69  4.74
 CYS  1.66  2.03  1.81  0.99
 VAL  4.97  5.90  5.54  5.34
 MET  1.64  1.87  1.66  1.69
 ILE  5.38  6.45  6.11  6.26
 LEU  8.84  10.2  9.88  9.40
 TYR  2.40  2.59  2.63  2.31
 PHE  2.64  2.91  3.02  2.76
 HIS  1.70  1.94  1.82  1.76
 LYS  8.78  10.3  9.06  8.69
 氨基酸  Arla 1  Arla2  Arla 3  雀巢GOODSTARTTM
 ARG  2.07  2.44  2.26  2.06
 TRP  1.36  1.27  1.50  1.22
 总计  89.9  105.9  95.9  93.2
注：色氨酸通过HPLC进行测定。这些值分别基于Arla 1、Arla 2、Arla 3和GOOD START Power的77.0％、78.0％、78.5％和12.3％的总蛋白浓度。
表2.蛋白质的可消化性的比较。
乳清蛋白质产品 消化后的可溶性蛋白质(克氨基酸/100克蛋白质)*
 雀巢GOOD STARTTM  93.2
 Arla WPH Alternate 1  89.9
 Arla WPH Alternate 2  105.9
 Arla WPH Alternate 3  95.9
*即，可溶性蛋白质中的总氨基酸克数/100克总的样品蛋白质。
由于WPH的可消化性可能被婴儿配方食品的生产过程所降低，所以关于这种营养产品的可消化性的确切结论最好由婴儿配方食品的比较得出。
实施例2
将三种低铁的SIMILACTM样品和三种雀巢GOOD STARTTM奶粉样品中的每一种都用水进行重构，每种重构物的80mL都包含约1.625克蛋白质。根据本文所述的方法与试剂空白平行在体外消化配方食品样品。早先描述的体外消化方法，在参数pH、酶的存在以及消化时间上都模仿幼婴的消化系统。如本文所述地，测定氨基酸分布和色氨酸浓度以获知总的消化和消化的可溶性部分。一个氨基酸分布的例子显示于表3中。进行本文所述的蛋白质的可消化性的计算。蛋白质的可消化性的比较显示于表4中。
表4.实施例2的消化的样品的氨基酸分布。浓度以样品悬浮液的mg/L表示。
 氨基酸     试剂空白     婴儿配方食品
 总蛋白质  可溶性蛋白质  总蛋白质  可溶性蛋白质
 ASX  430  375  1914  1703
 THR  161  134  1065  939
 SER  204  173  1082  981
 GLX  434  391  3693  3428
 PRO  152  130  1562  1232
 GLY  242  209  558  462
 ALA  167  141  825  739
 CYS  45  29  181  136
 VAL  170  137  1218  1003
 MET  34  27  407  372
 ILE  142  113  1107  954
 LEU  182  143  1861  1580
 TYR  150  127  850  757
 PHE  112  90  825  650
 HIS  88  75  496  420
 LYS  237  218  1613  1533
 ARG  224  205  733  676
氨基酸     试剂空白     婴儿配方食品
 总蛋白质  可溶性蛋白质  总蛋白质  可溶性蛋白质
TRP  85  69  306  244
总计  3259  2786  20,296  17,809
表4.SIMILACTM和雀巢GOOD STARTTM Powders的蛋白质的可消化性的比较
婴儿配方食品  体外蛋白质的可消化性
雀巢GOOD STARTTM奶粉#107EWGS0159S 89.0％+/-1.2％(n＝3)
SIMILACTM低铁奶粉#61927RE 87.8％+/-0.6％(n＝3)

Claims (12)

1.一种测定蛋白质的可消化性的方法，该方法包括下列步骤：
以至少一种酶消化一种营养产品的样品和试剂空白；
终止消化过程；
测定样品和空白对照各自的多种氨基酸的总浓度；
测定样品和空白对照的总的色氨酸浓度；
测定样品和空白对照各自的多种氨基酸的可溶性浓度；
测定样品和空白对照的色氨酸的可溶性浓度；
计算可溶性氨基酸在营养产品的消化样品中的百分率。
2.权利要求1的方法，进一步包含下列步骤：
将消化的样品和空白对照中的每一个分离成一种第一部分和一种第二部分；
测定样品的第一部分和空白对照的第一部分的多种氨基酸的总浓度；
测定样品的第一部分和空白对照的第一部分的总的色氨酸浓度；
将样品的第二部分和空白对照的第二部分中的每一个分离成为一个液相和一个固相；
测定液相中多种氨基酸的可溶性浓度；和
测定液相中色氨酸的可溶性浓度。
3.权利要求2的方法，其中分离步骤选自酸化、沉淀、离心、过滤和离心与过滤的组合。
4.权利要求1的方法，其中计算可溶性氨基酸的百分率的步骤包括：
将样品和空白对照的多种氨基酸的总浓度和色氨酸的浓度相加；
测定在样品和空白对照之间在多种氨基酸和色氨酸的总浓度上的差异；
将在样品和空白对照中的多种氨基酸的可溶性浓度和色氨酸的可溶性浓度相加；
测定在样品和空白对照之间在多种氨基酸和色氨酸的可溶性上浓度的差异；
将在可溶性浓度上的差异除以在总浓度上的差异以确定商；和
以100乘以商。
5.权利要求1的方法，其中营养产品为婴儿配方食品。
6.权利要求1的方法，其中消化步骤使用一种或多种酶以模仿人胃肠道的环境。
7.权利要求6的方法，其中酶选自胃蛋白酶、肽酶、胰酶蛋白酶、胰蛋白酶淀粉酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。
8.权利要求1的方法，其中消化样品的步骤包括下列步骤：
获得营养产品的样品；
调节pH到大约4.5；
加入胃蛋白酶；
温育样品；
提高pH到大约7.0；
加入胰酶蛋白酶；和
温育样品。
9.权利要求8的方法，其中通过美国药典的酶活性标准制备胃蛋白酶。
10.权利要求8的方法，其中通过美国药典的酶活性标准制备胰酶蛋白酶。
11.权利要求11的方法，其中终止消化的步骤包括将样品浸入沸水浴中。
12.权利要求1的方法，其中至少一种酶为通过美国药典的酶活性标准制备的胃或肠的酶。
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