CN1660041A

CN1660041A - 水蛭蛋白酶抑素在化妆品中的应用

Info

Publication number: CN1660041A
Application number: CN 200410004709
Authority: CN
Inventors: 刘凤鸣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-02-24
Filing date: 2004-02-24
Publication date: 2005-08-31
Anticipated expiration: 2024-02-24
Also published as: CN100534410C

Abstract

本发明涉及一种水蛭体内提取的小分子蛋白质—水蛭蛋白酶抑素在制备化妆用品制剂中应用，特别是利用其高效而特异性的弹性蛋白酶抑制作用，使皮肤组织内弹性蛋白的含量增加，进而发挥其抗皱美容的功效。水蛭蛋白酶抑素可以经生物提取法或基因工程体外表达法制得，可以作为霜剂、膏剂、水剂、粉剂、油剂等多种美容护肤用品的功效成分，制备化妆品制剂，具有良好的应用前景。

Description

水蛭蛋白酶抑素在化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及一种水蛭蛋白酶抑素的新用途，特别是在抗皱美容化妆用品中的应用。

背景技术

人体皮肤结构通常分为三层，由深到浅依次为皮下组织、真皮和表皮。表皮是皮肤中最活跃的一层，由基底层、颗粒层和角质层组成，通过不断角质化给皮肤以保护作用。皮下组织是由结缔组织、神经纤维、淋巴管和小血管等组成，其主要功能是减轻撞击、隔热和储存热量。真皮层内部的细胞很少，主要由纤维结缔组织构成。其中有胶原纤维、弹性纤维和网状纤维等，它们对皮肤的弹性、光泽和张力等有很重要的关系。皮肤的松弛、起皱等的老化都是发生在真皮之中。弹性蛋白酶是一种广泛存在于人体组织细胞内的降解弹性蛋白(弹性纤维)的生物酶，在表皮和真皮细胞中含量丰富。人在青少年时代皮肤内该酶的活性相对较低，且弹性蛋白的代谢活跃，维持着皮肤良好的弹性。当人体衰老时，皮肤内该酶的活性逐渐增强，水解真皮层内的弹性蛋白，同时弹性蛋白的合成代谢减慢，使皮肤的弹性逐渐降低，导致皮肤松弛、起皱等的老年性改变。因此，有效地抑制皮肤内弹性蛋白酶的活性，降低弹性蛋白的水解速度，提高真皮层内的弹性蛋白的含量，可起到抗皱、美容的功效。

Jung等人于1995年在水蛭体内分离出一种弹性蛋白酶抑制剂(TheJournal of Biological Chemistry，1995，270：13879-13884)，命名为水蛭蛋白酶抑素，可高效且特异地抑制弹性蛋白酶活性，在酸碱状态下均很稳定，已采用基因工程手段，实现了水蛭蛋白酶抑素的体外高效表达，因此寻求该蛋白在抗皱美容化妆品方面的应用，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水蛭蛋白酶抑素的新用途，特别是用于化妆用品制剂中，以期达到抗皱美容的功效。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

水蛭蛋白酶抑素是存在于水蛭体内的一种小分子蛋白质，水蛭蛋白酶抑素是具有所附序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将所述序列的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与所述序列的氨基酸残基序列相同活性的由所述序列衍生的蛋白质。

所述的水蛭蛋白酶抑素可通过生物提取法(Jung et al，The Journal ofBiological Chemistry，1995，270：13879-13884)或基因工程体外表达法(待批中国专利，申请号：02146788.9)获得。该蛋白质对热稳定，经80℃加热30分钟，活性不减弱，可在室温下长期保存。实验结果表明水蛭蛋白酶抑素是弹性蛋白酶的高效且特异性的抑制剂。它对胰蛋白酶和糜蛋白酶也有较弱的抑制作用，但其作用均不及其对弹性蛋白酶的10％，对其它酶类，如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶等则无明显作用。我们的实验同时证明将水蛭蛋白酶抑素涂于动物皮肤表面，经过一段时间处理后，可使皮肤组织内弹性蛋白的含量增加，且无明显的不良反应。说明水蛭蛋白酶抑素可作为抗皱美容化妆品的功效成分，用于化妆品制剂中。

本发明可以生物提取法或基因工程体外表达法制得的水蛭蛋白酶抑素作为原料，制备化妆品制剂，可以是霜剂、膏剂、水剂、粉剂、油剂等多种剂型。上述各种剂型的化妆品制剂均可以按照化妆品制剂领域的常规方法制备。

本发明创造性地将水蛭蛋白酶抑素用于化妆品制剂中，通过其对弹性蛋白酶的抑制作用，提高弹性蛋白在皮肤组织中的含量，进而发挥其抗皱美容的功效，具有良好的应用前景。

具体实施方式：

实施例1、水蛭蛋白酶抑素表达基因的合成

1、小片段的人工合成：将序列1水蛭蛋白酶抑素基因分为二段，第一段序列为cDNA正链，第二段序列为cDNA互补链。在第一段的3’端外加8个与第二段3’互补的碱基，总长105个碱基，为序列表中的序列2，在第二段的3’端外加8个与第一段3’端互补的碱基，总长111个碱基，为序列表中的序列3。在两片段5’端分别加上NdeI和NotI酶切位点，用DNA合成仪合成。

将DNA合成仪合成的片段，用单一循环的PCR反应连接合成序列1的全序列水蛭蛋白酶抑素基因，如图1所示，证明得到的序列正确。

实施例2、水蛭蛋白酶抑素体外表达

1、切取该PCR片段，装入pGEM-T-EASY质粒内，构建pGEM-GUM克隆载体。

2、pGEM-GUM表达质粒的构建

采用购自美国Invitrogen公司的高效表达质粒pPIC9K，用NdeI和NotI分别酶切pGEM-GUM质粒和pPIC9K质粒，凝胶电泳收集目标片段，用T4连接酶16℃过夜连接。经常规方法的转化，挑菌，扩增获得表达质粒pGEM-GUM，其结构图谱如图2所示。酶切鉴定，证明表达质粒的结构正确。

3、将质粒pGEM-GUM用SacI线性化.采用浙江新芝公司电基因导入仪，将线性化的pGEM-GUM导入GS115毕赤酵母菌(购自Invitrogen公司)内，经培养，挑选，筛选等过程，获得抗G 418mg/ml的单克隆菌。

4、挑选单克隆菌，接种于5ml培养基中，30℃过夜，然后转入250ml培养基中，继续培养至OD₆₀₀＝10-20，收集菌体，用无碳源培养基稀释至OD₆₀₀＝50，继续培养24小时，加入甲醇至终浓度为2％诱导表达，每隔24小时加甲醇一次，至96小时。离心取上清液，进行凝胶电泳分析和功能测定。取10ml上清液，用12％SDS-PAGE电泳，并经考马斯亮兰染色。结果可见，在6KD的位置，有诱导的蛋白表达，并根据BSA对照，估测表达量为103mg/L。

在本实施例中，培养单克隆菌体时用甲醇进行诱导意义很大，在没有诱导之前，培养液中基本无目标蛋白，如图3所示，诱导后的培养液中有显著的目标蛋白带，大小与序列2的蛋白相同，而诱导前的培养液中没有显著的目标蛋白带。

5、蛋白质纯化：实验用含50mM Tris-HCl(pH8.0)，1M(NH₄)₂SO₄平衡phenylsepharose层析柱，将培养上清液以1ml/分钟上样，经清洗后，再用50mMTris-HCl(pH 8.0)洗脱，收集洗脱液，获得纯度在95％左右的水蛭蛋白酶抑素，用Lowry法测定蛋白质含量。

实施例3、本发明水蛭蛋白酶抑素的功能测定

取5支试管，分别标为生理盐水、诱导前上清、诱导后上清，依次分别加入40ul 0.2M Tris-HCl，pH 8.0，20ul 0.37mg/ml猪胰腺弹性蛋白酶(SIGMA，E-1250)，40ul的生理盐水、诱导前上清或诱导后上清纯化液(1umol/L)，混匀，再加入400ul 0.1mM反应底物SucA3PNA(SIGMA)，室温反应10分钟后，在410nm处比色，以生理盐水作比较，计算酶活性抑制百分率，计算公式为OD₄₁₀测定样/OD₄₁₀生理盐水。结果如图4所示，诱导前上清与生理盐水组无明显差异，而诱导后上清的酶活性抑制百分率为98％。表明表达产物即为水蛭蛋白酶抑素，并有良好的弹性蛋白酶抑制作用。

实施例4、本发明水蛭蛋白酶抑素霜剂的制备：

取辅料护肤霜基质99克，加入浓缩的水蛭蛋白酶抑素纯化液和蒸馏水共1.0毫升，混合搅拌均匀，使水蛭蛋白酶抑素的最终浓度为1umol/L，分装，备用，即为水蛭蛋白酶抑素护肤霜。再取辅料护肤霜基质99克，加入生理盐水1.0毫升，混合搅拌均匀，分装，即为生理盐水对照护肤霜。

护肤霜基质配方为(W/W，％)：A、油相：椰油(辛酸/癸酸)酯10.00；十六、十八醇和十六、十八烷基聚葡糖7.50；酸酯(PL1618)少量；异十六醇5.00；聚二甲基硅氧烷350csks 15.00；2-异辛基-2氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯5.00；维生素E 3.00；甘油基硬脂酸酯2.00。B水相：无离子水43.50；甘油5.00。C添加剂：水解杏仁蛋白3.00；防晒剂1.00。用12.5％柠檬酸调PH到5.5。

护肤霜基质配制法：将油相A组分倒入容器中，搅拌加热到75-80℃，于另一容器中混合水相B组分，搅拌加热到75-80℃。搅拌下加B于A，保温混合15分钟。冷却到50℃，加添加剂C。搅拌冷却到室温。

实施例5、本发明水蛭蛋白酶抑素对小鼠皮肤组织弹性蛋白含量的影响：

实验采用上述制备的水蛭蛋白酶抑素护肤霜(1umol/L)。取由军事医学科学院动物中心提供昆明种小鼠20只，雄雌各半，体重18-22克，随机分成两组，即水蛭蛋白酶抑素组和生理盐水组，背部去毛，分别涂置水蛭蛋白酶抑素护肤霜和生理盐水对照护肤霜，每天三次，连续涂置30天。停用后次日处死小鼠，剥离皮肤、去除脂肪、称重，采用Sandberg et al(Connective TissueResearch.25；139-48，1990)法测定皮肤组织中的弹性蛋白含量。结果如图5，水蛭蛋白酶抑素护肤霜可明显提高皮肤组织中弹性蛋白的含量。

序列表

(1)一般信息：

(ii)发明名称：水蛭蛋白酶抑素在化妆品中的应用

(iii)序列数目：2

(2)序列1：

(i)序列特征：

(A)长度：174bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：序列1

gttgacgaaa acgctgaaga cacccatggt ttgtgcggtg aaaaaacctg ctctccagct 60

caagtctgtc taaacaacga atgcgcttgc actgcaatca gatgcatgat cttctgtcct 120

aacggtttca aagttgatga aaacggttgc gaatacccat gtacctgcgc ttga 174

(3)序列2：

(i)序列特征：

(A)长度：57个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(xi)序列描述：序列2

Val Asp Glu Asn Ala Glu Asp Thr His Gly Leu Cys Gly Glu Lys

1 5 10 15

Thr Cys Ser Pro Ala Gln Val Cys Leu Asn Asn Glu Cys Ala Cys

20 25 30

Thr Ala Ile Arg Cys Met Ile Phe Cys Pro Asn Gly Phe Lys Val

35 40 45

Asp Glu Asn Gly Cys Glu Tyr Pro Cys Thr Cys Ala

50 55 57

Claims

1、一种水蛭蛋白酶抑素的在制备化妆用品制剂中应用，特别是利用其高效而特异性的弹性蛋白酶抑制作用，使皮肤组织内弹性蛋白的含量增加，以期达到抗皱美容的功效。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：水蛭蛋白酶抑素是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将所述序列的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与所述序列的氨基酸残基序列相同活性的由所述序列衍生的蛋白质。

3、根据权利要求2所述的水蛭蛋白酶抑素，其特征在于：水蛭蛋白酶抑素可通过生物提取法或基因工程体外表达法获得。

4、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：其剂型可以是霜剂、膏剂、水剂、粉剂、油剂等多种剂型。上述各种剂型的化妆品制剂均可以按照化妆品制剂领域的常规方法制备。