CN1649578A - 杀线虫的脂肪酸和脂肪酸酯相关化合物 - Google Patents

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Abstract

描述了某些脂肪酸和相关化合物，所述物质可用于防治侵染植物或植物所在地的线虫。寄生于动物的线虫也可使用本发明的方法和化合物来防治。

Description

杀线虫的脂肪酸和脂肪酸酯相关化合物
背景技术
线虫(来源于希腊词汇-线(thread)是生活在潮湿表面上或液体环境中的活跃的、可弯曲的细长生物，其中包括土壤内的水膜和其它生物体内的含水组织(mois tissue)。虽然只有20000种线虫已被鉴别出来，但估计实际存在有40000至1000万种。一些线虫种类已进化成既能成功寄生于植物又能寄生于动物的寄生虫，并且是造成农业和家畜重大经济损失以及人类患病和死亡的原因(Whitehead(1998)Plant Nematode Control.CAB International，New York)。
植物线虫寄生虫可存在于植物的所有部分，包括根、发育的花芽、叶和茎。植物寄生虫根据其摄食习性被分成下列主要类别：迁移性外寄生线虫、迁移性内寄生线虫和定居性内寄生线虫。定居性(sedentary)内寄生线虫包括根结线虫(Meloidogyne)和胞囊线虫(Globodera和Heterodera)，能感应摄食位点并形成根内长期感染，这通常对作物造成严重损伤(Whitehead，supra)。据估计，世界范围内，寄生线虫每年造成园艺业和农业的损失超过$780亿，这是根据预计遍及所有主要作物平均12％的年度损失得出的。例如，据估计，线虫导致世界范围内每年的大豆损失为约$32亿(Barker等(1994)Plant and Soil Nematodes：Societal Impact and Focus for the Future.The Committee on National Needs andPriorities in Nematology.Cooperative State Research Service，US Department ofAgriculture and Society of Nematologists)。有若干因素使得迫切需要安全和有效的线虫防治。持续的人口增长、饥荒和环境恶化增强了对农业持续增长的关注，并且新的政府法规可能阻止或严格限制多种可用的农业驱蠕虫剂的使用。
只有少量的化合物可用于防治线虫(Becker(1999)Agricultural ResearchMagazine 47(3)：22-24；美国专利号6048714)。尽管如此，施用化学杀线虫剂一直是线虫防治的主要方式。通常，化学杀线虫剂是已知能引起相当大的环境影响的高毒化合物，并且受到对其使用数量和使用位置的日益严格的限制。例如土壤熏蒸剂溴甲烷，该物质已被有效用于减少多种特殊作物的线虫侵染，根据U.N.Montreal Protocol被规定为臭氧消耗物质，预计于2005年在美国消除(Carter(2001)California Agriculture，55(3)：2)。如果没有发现溴甲烷的合适替换物，预计草莓和其它商品作物业将受到显著影响。同样地，广谱杀线虫剂如二氯丙烯(Telone)(1，3-二氯丙烯的各种制剂)因其毒理关系严重地限制了其使用(Carter(2001)California Agriculture，Vol.55(3)：12-18)。
大环内酯(例如阿维菌素(avermectins)和米尔螨素(milbemycins)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)的δ-毒素是原则上对于植物寄生线虫具有出色的特异性和效力的化学物质并且能环境上安全地防治植物寄生线虫。不幸地是，在实践中，这两种杀线虫剂已被证实在农业应用中对根部病原体不太有效。尽管某些阿维菌素对植物寄生线虫显示出极强的活性，但这些化学物质因其光敏感性、被土壤微生物降解和紧密地结合于土粒造成的较差的生物利用率使其应用受到阻碍(Lasota & Dybas(1990)Acta Leiden 59(1-2)：217-225；Wright &Perry(1998)Musculature and Neurobiology.In：The Physiology and Biochemistryof Free-Living and Plant-parasitic Nematodes(eds R.N.Perry & D.J.Wright)，CABInternational 1998)。因此，尽管进行了多年的研究并被广泛地应用对抗动物寄生线虫、螨虫和昆虫(植物和动物施用)，大环内酯(例如阿维菌素和米尔螨素)从未在商业上发展用于防治土壤中的植物寄生线虫。
苏云金芽孢杆菌的δ-毒素必须被摄食后才能影响其靶标器官-中肠上皮细胞的刷状缘(brush border)(Marroquin等(2000)Genetics.155(4)：1693-1699)因此，可预料到其对田间分散的、不进食的、幼年期植物寄生线虫无效。由于幼年期线虫当敏感寄主被侵染后才开始摄食，杀线虫剂可能需要渗透植物表皮才能有效。透表皮吸收65-130kDa蛋白质-典型的苏云金芽孢杆菌δ-毒素的大小-是不可能的。此外，预计土壤迁移性较差。甚至是转基因方法也受到苏云金芽孢杆菌δ-毒素大小的阻碍，因为某些植物寄生线虫如胞囊线虫属(Heterodera)的食管拒绝大颗粒而可能使植物内(in planta)输送被抑制(Atkinson等(1998)Engineering resistance to plant-parasitic nematodes.In：The Physiology andBiochemistry of Free-Living and Plant-parasitic Nematodes(eds R.N.Perry & D.J.Wright)，CAB International 1998)。
脂肪酸是一类天然化合物，已被研究用作有毒的非特异性有机磷酸酯、氨基甲酸酯和熏蒸剂农药的替换物(Stadler等.(1994)Planta Medica 60(2)：128-132；美国专利号5192546；5346698；5674897；5698592；6124359)。已经有人提出脂肪酸是通过去垢作用(增溶作用)干扰线虫表皮或下皮，或通过脂肪酸与靶标质膜的亲脂区的直接相互作用而得到其杀虫作用(Davis等.(1997)Journal ofNematology 29(4S)：677-684)。考虑到这种预测的作用模式，脂肪酸被用于各种农药应用就不令人惊讶了，其中包括用作除草剂(例如Dow Agrosciences生产的SCYTHE是C9饱和脂肪酸-壬酸)、杀细菌剂和杀真菌剂(美国专利号4771571；5246716)和杀虫剂(例如Safer，Inc.生产的SAFER INSECTICIDALSOAP)。
脂肪酸的植物毒性对其广泛应用于苗后农业应用来说是主要的限制(美国专利号5093124)，减轻这些不希望的作用、同时保留农药活性是研究的主要领域。由于脂肪酸在田间条件下的半衰期相对较短，苗后施用是可取的。
脂肪酸的酯化能显著降低其植物毒性(美国专利号5674897；5698592；6124359)。然而这种改性会导致杀线虫活性的损失，例如亚油酸、亚麻酸和油酸(Stadler等.(1994)Planta Medica 60(2)：128-132)，并且由于杀虫脂肪酸的非特异性作用模式，完全消除其植物毒性和杀线虫活性的相互影响是不可能的。也许不令人吃惊的是，杀线虫脂肪酸-壬酸甲酯(美国专利号5674897；5698592；6124359)在开始显示杀虫活性和观察到显著的植物毒性之间的“有效治疗范围(Window)”相对较小(Davis等.(1997)J Nematol 29(4S)：677-684)。如果植物毒性和杀线虫活性均源于非特异性的瓦解质膜的完整性，则这是可预期的结果。
利用外翻的仓鼠空肠和回肠部分的试验显示蓖麻油的主要成分-蓖麻油酸对水和电解质吸收有抑制作用(Gaginella等.(1975)J Pharmacol Exp Ther195(2)：355-61)，并且对分离出来的肠上皮细胞有细胞毒性(Gaginella等.(1977)JPharmacol Exp Ther 201(1)：259-66)。这些特性可能是被用作人和家畜泻剂的蓖麻油的缓泻性能的来源(例如蓖麻油因为缓泻性能而成为一些驱蠕虫药处方的一种成分)。相反，在仓鼠模型中蓖麻油酸的甲基酯对于抑制水分吸收无效(Gaginella等.(1975)J Pharmacol Exp Ther 195(2)：355-61)。
已有报道短链和中链脂肪酸及盐(例如C6-C12)具有优良的杀真菌活性(美国专利号5093124和5246716)。并不令人吃惊的是商品化的杀真菌和杀苔藓产品De-Moss主要含有在此大小范围内的脂肪酸及其盐。这些较短的脂肪酸的植物毒性还使其在以较高浓度使用时适用做广谱除草剂，例如商品化的除草剂SCYTHE含有C9脂肪酸-壬酸。美国专利号5093124、5192546、5246716和5346698教导C16-C20脂肪酸和盐如油酸(C18:1)是适宜的杀虫脂肪酸。杀虫脂肪酸产品如M-PEDE和SAFER Insecticidal Concentrate体现了此科学信息真正的世界应用，上述产品中的活性成分包含较长链的脂肪酸，其中富含C16和C18成分。相反，现有技术几乎没有教导选择适宜的广谱杀线虫脂肪酸，现有的信息通常是与之矛盾的。
Stadler及其同事(Stadler等.(1994)Planta Medica 60(2)：128-132)测试了一系列脂肪酸对L4和成虫期秀丽隐杆线虫(c.elegans)的作用，并发现许多普通的长链脂肪酸如亚油酸(C18:2)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈油酸(C16:1)和油酸(C18:1)具有显著的杀线虫活性。秀丽隐杆线虫对C6-C10(中链)脂肪酸不很敏感。Stadler等评论说它们的结果与早期对植物寄生线虫稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)的研究结果相反，早期研究中发现C8-C12脂肪酸是高活性的，而亚油酸-一种C18脂肪酸-显示无活性。特定的线虫对各种脂肪酸不同的敏感性在Djian及其合作者(Djian et al.(1994)Pestic.Biochem.Physiol.50(3)：229-239)的研究中再次明显显示出来，它们证明了短链易挥发性脂肪酸如戊酸的活性在各品种间有变化(例如南方根结线虫(Meloidogyne incognita)比Panagrellus redivicus敏感超过100倍)。Momin和Nair最近发现(Momin & Nair(2002)J.Agric.Food Chem.50(16)：4475-4478)油酸在100μg/ml浓度下在24小时内对Panagrellus redivicus或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)没有杀线虫活性，这进一步使情况混乱了，因为这与Stadler及其合作者测定的25μg/ml的LD50(LD90 100μg/ml)直接冲突。
总之，与杀真菌剂、除草剂和杀虫剂的情况不同，现有技术没有提供有助于选择适宜的杀线虫脂肪酸的明确或可信的指导。而且，尽管De-Moss、SCYTHE、M-PEDE和SAFER分别是上述三个领域中的农药脂肪酸产品的成功实例，但目前没有广泛应用的商品化杀线虫脂肪酸产品的实例。
已知许多植物品种对线虫有高抗性。其中已得到最好证明的包括万寿菊属(Tagetes spp.)、大托叶猪屎豆(Crotalaria spectabilis)、菊属(Chrysanthemum spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、黄楝(Azardiracta indica)和紫菀科(family Compositae)的许多成员(Hackney & Dickerson.(1975)J Nematol 7(1)：84-90)。就紫菀科(Asteraceae)来说，光中发荧光化合物α-terthienyl已显示出对根的强杀线虫活性。在种植(set)采种作物前，施用(plow under)蓖麻子作为绿肥。但蓖麻类植物的一个显著缺点是其种子含有能杀死人类、宠物和家畜的有毒化合物(如蓖麻毒素)并且还是高致敏的。然而，在许多情况下，植物杀线虫活性的有效成分还未被发现，仍然难以从这些抗性植物中得到商品化成功的杀线虫产品或将所述抗性转移到农业上重要的作物如大豆和棉花中。
在一些商品化的栽培品种(例如大豆)中存在对某些线虫的遗传抗性，但栽培品种的数量和可用性方面受到限制，希望的农业特性和抗性都是有限的。以通过有性杂交进行基因重组为基础的常规作物育种生产线虫抗性商品化品种是一个缓慢的过程并且还经常受缺乏适宜的种质所累。
现在仍迫切需要开发防治植物寄生性线虫的环境上安全、靶标特异性的方法。在专业作物市场上，由线虫侵染导致的经济困难在草莓、橡胶和其它高价值的蔬菜和水果方面是最大的。在大面积作物市场上，线虫损害在大豆和棉花中是最严重的。然而，还有许多其它作物遭受线虫侵染之苦，其中包括马铃薯、胡椒、洋葱、柑橘、咖啡、甘蔗、温室观赏植物和高尔夫球场草皮。
脊椎动物(例如人、家畜和陪伴动物)的寄生线虫包括肠蛔虫、钩虫(hookworm)、蛲虫、鞭虫和丝虫。它们可以通过各种方式，包括水污染、皮肤渗透、吸咬昆虫或食用被污染的食物进行传播。
在家养动物中，线虫防治或“驱蠕虫”对于家畜生产者的经济生存能力来说是必要的，并且是陪伴动物的兽医照料的必要部分。由于寄生线虫抑制被感染动物吸收营养物质的能力，寄生线虫导致动物死亡(例如狗和猫中的心丝虫)和病态。寄生线虫诱导的营养素缺乏导致家畜和陪伴动物的疾病和生长停滞。例如，在牛和乳畜群中，一次未处理的奥斯特线虫(brown stomach worm)感染能够长期限制动物将食物转化成肌肉块或奶的能力。
有两个因素使得我们需要防治动物寄生线虫的新的驱蠕虫剂和疫苗。首先，家畜寄生线虫的一些比较普遍的品种正在对目前可用的驱蠕虫药物产生抗性，这意味着这些产品最终将失去其效力。这些变化不是令人惊讶的，因为只有少数的有效驱蠕虫药是可用的，并且其中绝大多数被持续使用。一些寄生线虫品种已经发展出对绝大多数驱蠕虫药的抗性(Geents等.(1997)ParasitologyToday 13：149-151；Prichard(1994)Veterinary Parasitology 54：259-268)。许多驱蠕虫药具有相似的作用模式的事实使事情变得复杂，因为寄生线虫对一种要素丧失敏感性经常伴随着副抗性-即对同一类的其它药物的抗性(Sangster &Gill(1999)Parasitology Today 15(4)：141-146)。其次，目前可用的主要化合物有一些关于毒性的问题。
寄生线虫的感染导致大量人死亡和患病，特别是在非洲、亚洲和美洲的热带地区。世界卫生组织估计有29亿人被感染，在一些地区，85％的人口携带蠕虫。虽然依照感染的比例来说，死亡率是很低的，但患病率相当高，全世界竞争性(rivals)糖尿病和肺癌导致的劳动力丧失改变了寿命(DALY)测量结果。
人寄生线虫的实例包括钩虫、丝虫和蛲虫。钩虫(13亿感染)是造成上百万儿童贫血的主要原因，导致生长延缓并损害了认知心理发育。丝虫品种侵入淋巴管，导致长期肿胀和四肢残疾(象皮病)和导致眼睛患非洲盘尾丝虫病(Africanriver blindness)。大肠蛔虫人蛔虫(Ascaris lumbricoides)在世界范围内感染超过10亿人，引起营养不良和梗阻性肠病。在发达国家，蛲虫是很平常的，经常通过日托的儿童进行传播。
在无症状的寄生线虫感染中，线虫仍能使寄主丧失有用的营养物质，并且增强了其它生物形成二次感染的能力。在一些情况下，感染能导致衰老疾病并且能引起贫血、腹泻、脱水、食欲不振或死亡。
尽管在药物可用性和公共健康基础设施方面有一些进展，以及近期消除了一种热带线虫(水生的麦地那龙(water-borne Guinea)线虫)，但绝大多数线虫疾病仍是难以治疗的问题。例如，在高发病率地区，用驱蠕虫药物治疗蛲虫疾病不能提供足够的控制，因为治疗后会出现迅速的二次感染。实际上，在过去的50年间，尽管美国、欧洲和日本的线虫感染率降低了，但世界范围内的感染总数随着世界人口的增加而增加。地方政府、世界卫生组织、基金会和药物公司的大规模行动正在试图用目前可用的工具控制线虫感染，其中包括三个项目：非洲和美洲采用伊维菌素(ivermectin)和媒介物防治来防治Onchocerciasis(盘尾丝虫病)(river blindness)；The Global Alliance使用DEC、阿苯达唑(albendazole)和伊维菌素消除淋巴丝虫病；和非常成功的Guinea Worm Eradication Program。在发现能防止寄生线虫感染的安全和有效的疫苗以前，驱蠕虫药物将一直用于预防和治疗人和家养动物的寄生线虫感染。
由于寄生线虫难以在实验室培养，使得发现针对寄生线虫的有效化合物和疫苗是难以实现的。寄生线虫一般是裂殖(generation)时间缓慢的专性寄生虫(即它们仅能在其各自的寄主如植物、动物和/或人中生存)。因此，难以在人工条件下生长，这使得遗传和分子实验是困难或不可能的。为了绕过这些限制，科学家们使用秀丽隐杆线虫作为寄生线虫发现工作的模型系统。
秀丽隐杆线虫是一种小型的自由生活的食细菌线虫，多年来一直充当多细胞动物的重要模型系统(Burglin(1998)Int.J.Parasitol.28(3)：395-411)。秀丽隐杆线虫的基因组已被完全排序，这种线虫与脊椎动物共享许多通用的发育和基本的细胞过程(Ruvkin等(1998)Science 282：2033-41)。这一特点加上其裂殖周期短和易于培养使其成为较高级的真核细胞的备选模型系统(Abbobaker等(2000)Ann.Med.32：23-30)。
虽然秀丽隐杆线虫可用作脊椎动物的良好模型系统，但它是一种研究寄生线虫的更好的模型，因为秀丽隐杆线虫和其它线虫共享未见于脊椎动物的独特的生物过程。例如，与脊椎动物不同，线虫产生和使用几丁质，具有由innexin而非连接蛋白构成的缝隙连接并且含有谷氨酸盐控制的氯化物通道而非甘氨酸控制(gated)的氯化物通道(Bargmann(1998)Science 282：2028-33)。已知阿维菌素(avermectin)类药物被认为作用于谷氨酸盐控制的氯化物受体并且对非脊椎动物具有高选择性，因此后一性能是特别相关的(Martin(1997)Vet.J.154：11-34)。
涉及线虫特异性过程的一组基因将是线虫中保守的，并且是其它门的同源生物缺乏或有显著差异的。换言之，可以预期的是至少一些与线虫特有功能有关的基因具有有限的系统发育分布。秀丽隐杆线虫基因组项目的完成和来自许多线虫的日益增大的已表达序列标签数据库有利于鉴定出这些“线虫-特异性”基因。此外，预计涉及线虫特异性过程的保守基因在不同的线虫中保持相同或非常相似的功能。这种功能相当性已通过在一些情况下用来自其它线虫的同源基因转化秀丽隐杆线虫得以证实(Kwa等(1995)J.Mol.Biol.246：500-10；Redmond等(2001)Mol.Biochem.Parasitol.112：125-131)。这种数据传送已在保守基因的门间对比中显现出来并且预计在同一门的不同品种间更活跃。因此，就保守的线虫过程而论，秀丽隐杆线虫和其它自由生活线虫品种可能是寄生线虫的出色替代品。
秀丽隐杆线虫中的许多表达基因和其它自由生活线虫中的某些基因可通过被成为RNA干扰(RNAi)的方法从遗传上“剔除”，RNA干扰是一种为线虫的基因功能研究提供有效的实验手段的技术(Fire等(1998)Nature391(6669)：806-811；Montgomery等(1998)Proc，Natl.Acad Sci USA95(26)：15502-15507)。用选定基因的双链RNA处理线虫能破坏对应于选定基因的表达序列，从而减少相应蛋白质的表达。通过阻止特定蛋白质的翻译，能够评价其功能意义和对线虫的必要性。使用秀丽隐杆线虫作为模型系统确定必需基因及其相应的蛋白质将有助于合理设计抗寄生线虫防治产品。
本发明描述了组合物，所述组合物部分由于选择性地抑制被证明是线虫必需的并且是脊椎动物和植物缺乏或非必需的的代谢过程，从而显示出惊人的杀线虫活性。因此本发明提供迫切需要的化合物和环境上安全的防治寄生线虫的方法。
概述
本发明涉及组合物和防治线虫的方法。在一个实施方案中，本发明的主题包括使用某些脂肪酸、脂肪酸酯和相关化合物防治感染植物或植物所在地的线虫。使用本发明的方法和化合物还能防治寄生于动物的线虫。
某些有用的杀线虫脂肪酸(游离脂肪酸及其盐)和类似物(例如酯类)被预见是线虫δ-12脂肪酸脱饱和酶(在本文也称为线虫δ-12脱饱和酶)的抑制物。这些有用的脂肪酸和类似物是例如环氧化物，环丙烷，环丙烯，氧代、甲基化或羟基化的脂肪酸或类似物。在某些位置，所述化合物还可含有硫代替碳。在本发明主题的一个优选实施方案中，脂肪酸和类似物是抑制δ-12脱饱和酶的脂肪酸和酯。术语脂肪酸类似物也用于表示特殊脂肪酸(即含有例如环氧化物、环丙烷、环丙烯、氧代、羟基、共轭双键、三键或其它特殊基团的那些脂肪酸)的游离脂肪酸、脂肪酸盐和脂肪酸酯。
按照本发明主题可用的优选脂肪酸和酯是链长C15-C19(即具有含15、16、17、18或19个碳原子的碳链，例如直链碳链)、在δ-9位置(即从羰基(羧基)碳(C＝O)开始数起的C9和C10之间)有顺(Z)或反(E)碳双键和在C12或C13或C12和C13位置处的各种变型。优选的，脂肪酸及其酯还包括硫代脂肪酸和硫代脂肪酸酯，其中在12、13或12和13位置处的碳被硫代替。最优选的化合物是链长C16或C18的。实例包括蓖麻油酸(12-羟基-顺-9-十八碳烯酸)和蓖麻油酸甲酯，反蓖麻酸(12-羟基-反-9-十八碳烯酸)和反蓖麻酸甲酯，斑鸠菊酸((12，13)-环氧-顺-9-十八碳烯酸)和斑鸠菊酸甲酯，(12，，13)-环氧-顺-9-十八碳烯酸和(12，13)-环氧-反-9-十八碳烯酸甲酯，12-氧代-9(Z)-十八碳烯酸和12-氧代-9(Z)-十八碳烯酸甲酯，12-氧代-9(E)-十八碳烯酸和12-氧代-9(E)-十八碳烯酸甲酯。要特别排除的是δ-12脱饱和酶的正常底物(例如顺-9-十八碳烯酯(油酸酯)，顺-9-十六碳烯酯(棕榈烯酸甲酯(Palmitoleate)，底物如反-9十八碳烯酸酯(elaidate)的异构体和δ-12脱饱和酶的正常产物(例如顺-9，12-十八碳二烯酸酯(亚油酸酯)，顺-9，12-十六碳二烯酸酯)。对于唯一的变型是δ-9位置的单独的顺或反双键(即C9和C10之间的顺或反双键)、或是δ-9(C9和C10间的顺或反双键)和δ-12(C12和C13之间的顺或反双键)位置同时双键的脂肪酸化合物以及某些天然存在的酯如甘油三酸酯、二酰基甘油酯和磷脂一般是不优选的。优选的含硫脂肪酸类似物的实例包括12-硫代-油酸甲酯和13-硫代油酸甲酯。
具有特异性抑制δ-12脱饱和酶特性的脂肪酸类似物(例如游离脂肪酸、盐、酯)在有δ-12脂肪酸脱饱和酶产物(例如亚油酸酯)存在时比有酶底物(例如油酸酯)存在时抑制线虫δ-12脱饱和酶的程度低。这些竞争性实验中使用的底物(例如油酸酯)和产物(亚油酸酯)是等量的。这些效应可通过体外δ-12脂肪酸脱饱和酶(本文也称为δ-12脱饱和酶)、含δ-12脱饱和酶的转基因细胞或含δ-12脱饱和酶的完整生物(例如线虫)来证明。在此试验的一个实施方案中，δ-12脱饱和酶的底物和产物等浓度存在。
本发明的特征还在于在转录或翻译水平抑制δ-12脱饱和酶表达的化合物。本发明还包括损伤δ-12脱饱和酶的变型，从而导致该脱饱和酶的活性或定位改变的化合物。
本发明的特征还在于是相对于一种或多种植物或动物脂肪酸脱饱和酶-类-多肽而言的一种或多种线虫δ-12脱饱和酶多肽的相对选择性抑制剂的化合物。所述化合物对于线虫脂肪酸脱饱和酶的Ki是其对植物或动物脂肪酸脱饱和酶-类多肽的Ki的低10倍、100倍、1000倍或更多，所述植物或动物例如该线虫的寄主植物或动物。本发明的特征还在于相对无选择性的抑制剂以及完全无选择性的抑制剂。
在另一方面，本发明的特征在于治疗由患者如寄主植物或寄主动物内的线虫(例如南方根结线虫(M.incognita)，大豆胞囊线虫(H.glycines)，捻转血矛线虫(H.contortus)，猪蛔虫(A.suum))引起的疾病(例如感染)的方法。该方法包括给患者服用有效量的本发明脂肪酸(游离脂肪酸或盐)或脂肪酸类似物(酯)，例如δ-12脱饱和酶多肽活性的抑制剂化合物或δ-12脱饱和酶多肽表达的抑制剂化合物或损伤δ-12脱饱和酶变型从而导致该脱饱和酶的活性或定位改变的抑制剂化合物。所述抑制剂可通过多种方式包括饲料添加剂、药丸或注射输送。
另一方面，提供了抑制线虫(例如南方根结线虫，大豆胞囊线虫，捻转血矛线虫，猪蛔虫)δ-12脱饱和酶的方法。所述方法包括下列步骤：(a)提供一种线虫例如含δ-12脂肪酸脱饱和酶类基因的线虫；(b)用本发明的脂肪酸(游离脂肪酸或盐)或脂肪酸类似物(酯)接触该线虫。某些上述化合物可抑制δ-12脱饱和酶的活性。还提供了挽救所述抑制剂作用的方法。所述方法包括下列步骤：(a)抑制该酶和(b)提供外源δ-12不饱和脂肪酸(例如亚油酸盐)。
另一方面，提供了使用本发明的杀线虫脂肪酸或脂肪酸类似物，例如δ-12脱饱和酶的抑制剂降低线虫生存力和繁殖力或减缓其生长或发育或抑制其传染性的方法。所述方法包括下列步骤：(a)提供一种含δ-12脱饱和酶类基因的线虫；(b)用特定的脂肪酸或脂肪酸类似物，例如δ-12脂肪酸脱饱和酶抑制剂接触该线虫；(c)降低该线虫的生存力或繁殖力。还提供了挽救所述脂肪酸脱饱和酶抑制剂或其它抑制剂作用的方法。所述方法包括用外源δ-12不饱和脂肪酸接触该线虫。
本发明的特征在于降低线虫生存力、生长或繁殖力的方法，该方法包括将线虫暴露于本发明的脂肪酸或脂肪酸类似物，例如能抑制脂肪酸脱饱和酶类多肽(例如δ-12脂肪酸脱饱和酶)活性的化合物，和保护植物免于线虫感染的方法，该方法包括向植物、土壤、或植物的种子施用本发明的脂肪酸和脂肪酸类似物。
本发明的特征还在于保护脊椎动物(例如鸟或哺乳动物)免于线虫感染的方法，该方法包括给哺乳动物使用本发明的脂肪酸或脂肪酸类似物，例如线虫脂肪酸脱饱和酶类多肽(例如δ-12脂肪酸脱饱和酶)的抑制剂。在优选的实施方案中，抑制剂不显著抑制脊椎动物表达的脂肪酸脱饱和酶类多肽，或至少其抑制程度不至于显著损害植物的生长。鸟可以是家禽(例如鸡、火鸡、鸭子或鹅)。哺乳动物可以是家养动物例如陪伴动物(例如猫、狗或兔)或家畜(例如牛、绵羊、马、猪、山羊、羊驼或骆驼(llama))。
本发明方法对于防治线虫侵袭需要作物、观赏植物和草皮草的根特别重要。需要作物可以是例如大豆、棉花、草莓、西红柿、香蕉、糖用甘蔗、糖用甜菜、马铃薯或柑橘。
本发明一方面的特征在于杀线虫组合物，所述组合物含有：
(a)有效量的下式化合物：
其中：
R1＝H，阳离子(例如Na+、K+、NH4 +)或取代的或未取代的C1-C5(即一个、两个、三个、四个或五个碳原子)碳链(例如直链)，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷基、环氧基和取代或未取代的C1-C2(即一个或两个碳原子)碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19(即15、16、17、18或19个碳原子)碳链(例如直链)，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是顺式或反式双键，或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷基、环丙烯、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链。在一些实施方案中，C15-C19碳链可以在除第12和第13个碳原子以外的位置被取代。上述组合物还可含水性表面活性剂和氧化抑制剂或渗透增强剂。
所述组合物可制备成含极少或无水的浓缩形式。组合物可在用于处理植物、种子、土壤或脊椎动物前用水或一些其它溶剂或组合溶剂稀释。阳离子可以是二价的并与两个脂肪酸或脂肪酸酯分子络合。
在各种实施方案中：R1是H和或阳离子；R1是取代或未取代的C1-C5碳链(即含有1、2、3、4或5个碳原子的碳链例如直链)，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2(即一个或两个碳原子)碳链；R1是取代或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；R1或R2或R1和R2的C1-C2碳链被取代，取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、或环氧基；R1或R2或R1和R2的C1-C2碳链被取代，取代基选自下组：羟基、卤素和氨基；R1是被取代的C1甲基；R1是取代或未取代的C1-C2碳链；和R2是取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是顺式或反式双键，或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链。
在其它实施方案中：R2的C1-C2碳链被取代，取代基选自下组：羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、和环氧基；R2的C1-C2碳链被取代，取代基选自下组：羟基、氧、卤素、叠氮基和氨基；R2的C1-C2碳链被单取代；R1是H；R1是阳离子；R2仅在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12或第13个碳原子或第12和第13个碳原子上被取代；R2仅在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12个碳原子上被取代；R2仅在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第13个碳原子上被取代；R2的取代基是极性的并选自：羟基、氧、环氧基、卤素、氨基、氰基和叠氮基；R2的取代基是氢键受体并选自下组：羟基、氧、环氧基、氨基、氰基和叠氮基；R2的取代基选自下组：羟基、氧和环氧基。
在另一实施方案中，本发明的特征在于一种杀线虫组合物，该组合物含有：(a)选自下组的脂肪酸或盐或酯：蓖麻油酸、反蓖麻酸(ricinelaidic)、12-氧代-9(Z)-十八碳烯酸、12-氧代-9(E)-十八碳烯酸、(12，13)-环氧-反式-9-十八碳烯酸和斑鸠菊酸；和(b)一种水性表面活性剂。
在各种优选的实施方案中：水性表面活性剂选自下组：乳酸乙酯、Span 20、Span 40、Span 80、Span 85、Tween 20、Tween 40、Tween 80、Tween 85和IgepalCO 630；组合物还含有一种渗透增强剂(例如环糊精)；组合物还含有一种助溶剂(例如异丙醇、丙酮、1，2-丙二醇、石油基油(例如芳烃200)或矿物油(例如石蜡油)；组合物还含有选自下组的杀线虫剂：阿维菌素、伊维菌素或米尔螨素(milbemycin)；组合物还含有氧化抑制剂(例如丁化羟基苯甲醚(butylatedhydroxyanisole)(BHA)和丁化羟基甲苯(butylated hydroxyltoluene)(BHT)))。
在另一实施方案中，组合物含有至少两种不同的下式化合物：
Figure A0381002200211
其中：
R1＝H，阳离子或取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是顺式或反式双键，或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链。
本发明的特征还在于包含至少一种上述脂肪酸或脂肪酸类似物和水性表面活性剂、助溶剂或抗氧化剂的组合物、由上述成分组成的组合物或基本由上述成分组成的组合物。本发明的特征还在于上述组合物在防治线虫中的应用。本发明还包括含有至少一种上述脂肪酸或脂肪酸类似物和水性表面活性剂和抗氧化剂的组合物、由上述成分组成的组合物或基本由上述成分组成的组合物。一些组合物含有两种、三种、四种或更多种不同的脂肪酸或脂肪酸类似物。
在一个实施方案中，脂肪酸和脂肪酸类似物是化合物的混合物，在其它实施方案中，表面活性剂是化合物的混合物。在另一实施方案中，脂肪酸或脂肪酸类似物和表面活性剂都是化合物的混合物。
渗透增强剂一般是促进本发明的活性化合物例如本发明的脂肪酸或脂肪酸酯穿过细胞膜的试剂。
助溶剂(即潜溶剂或间接溶剂)是在活性溶剂的存在下变成有效溶剂，并能改善主(活性)溶剂的性能的试剂。
所述组合物还可包含一种或多种杀线虫剂如阿维菌素、伊维菌素和米尔螨素。
本发明的特征还在于防治有害线虫的方法，该方法包括向脊椎动物、植物、种子或土壤使用含下列成分的组合物：
(a)下式化合物：
其中：
R1＝H，阳离子或取代的或未取代的C1-C5(即含1、2、3、4或5个碳原子)碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是顺式或反式双键，或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链。在某些实施方案中，C15-C19碳链可以在除第12和/或第13个碳原子以外的位置被取代。
在各实施方案中：组合物还含有水性表面活性剂，R1是H或阳离子；R1是取代或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；R1是取代或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；R1或R2或R1和R2的C1-C2碳链被取代，取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、和环氧基；R1或R2或R1和R2的C1-C2碳链被取代，取代基选自下组：羟基、卤素和氨基；R1是被取代的C1甲基；R1是取代或未取代的C1-C2碳链；和R2是取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是顺式或反式双键，或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链。
在其它实施方案中：R2的C1-C2碳链被取代，取代基选自下组：羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、和环氧基；R2的C1-C2碳链被取代，取代基选自下组：羟基、氧、卤素、叠氮基和氨基；R2的C1-C2碳链被单取代；R1是H；R1是阳离子；R2仅在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12或第13个碳原子或第12和第13个碳原子上被取代；R2仅在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12个碳原子上被取代；R2仅在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第13个碳原子上被取代；R2的取代基是极性的并选自：羟基、氧、环氧基、卤素、氨基、氰基和叠氮基；R2的取代基是氢键受体并选自下组：羟基、氧、环氧基、氨基、氰基和叠氮基；R2的取代基选自下组：羟基、氧和环氧基。
在另一实施方案中，本发明的特征在于向脊椎动物、植物、种子或土壤使用含下列成分的组合物：(a)选自下组的脂肪酸或盐或酯：蓖麻油酸、反蓖麻酸、12-氧代-9(Z)-十八碳烯酸、12-氧代-9(E)-十八碳烯酸、(12，13)-环氧-反式-9-十八碳烯酸和斑鸠菊酸；和(b)水性表面活性剂。
在各种优选的实施方案中：水性表面活性剂选自下组：乳酸乙酯、Span 20、Span 40、Span 80、Span 85、Tween 20、Tween 40、Tween 80、Tween 85和IgepalCO 630；组合物还含有渗透增强剂(例如环糊精)；组合物还含有助溶剂(例如异丙醇、丙酮、1，2-丙二醇、石油基油(例如芳烃200)或矿物油(例如石蜡油))；组合物还含有选自下组的杀线虫剂：阿维菌素、伊维菌素和米尔螨素；组合物还含有氧化抑制剂(例如丁化羟基苯甲醚(BHA)和丁化羟基甲苯(BHT))。
在另一实施方案中，上述方法包括使用含有至少两种不同的下式化合物的组合物：
Figure A0381002200231
其中：
R1＝H，阳离子或取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是顺式或反式双键和或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链。
在方法的各实施方案中：线虫侵染植物，将上述组合物施用到土壤或植物上，在种植前将组合物施用到土壤，在种植后将组合物施用到土壤，使用滴灌系统将组合物施用到土壤，使用浇灌(drench)系统将组合物施用到土壤，将组合物施用到植物根部；将组合物施用到种子；线虫侵染脊椎动物(例如哺乳动物、鸟、非人类的哺乳动物、人)；将组合物配制成灌服药向非人类的脊椎动物给药；和将组合物配制成口服药；将组合物配制成可注射药物。
本发明的特征还在于用于非人类的脊椎动物饲料，所述饲料含有：
(a)适合非人类脊椎动物的饲料；
(b)下式的化合物：
其中：
R1＝H，阳离子或取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是顺式或反式双键，或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链。
在各实施方案中，上述饲料还含有(b)水性表面活性剂；该饲料已经过处理以降低亚油酸或亚麻酸或亚油酸和亚麻酸的含量；该饲料已经过处理以降低γ-亚麻酸和α-亚麻酸的含量；和该饲料选自下组：大豆、小麦、玉米、高粱、黍类(millet)、紫花苜蓿、车轴草(clover)和黑麦。
本发明的特征还在于含下列成分的杀线虫组合物：
(a)有效量的下式化合物：
Figure A0381002200251
其中：
R1＝取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；和
R3＝取代或未取代的C11碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是顺式双键，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环丙烯、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；
R4＝取代或未取代的C2-C6(即2、3、4、5或6个碳原子)碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；
X和Y彼此独立地是取代或未取代的甲基或硫，条件是X和Y中至少一个是硫，并且其中甲基上的取代基选自下组：卤素、氢、氨基和羟基。
在各实施方案中，上述组合物还含有水性表面活性剂；并且X和Y之一是CH2。
本发明的特征还在于含下列成分的杀线虫组合物：
(a)有效量的下式化合物
Figure A0381002200252
其中：
R1＝取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是单键，和或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间是三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环丙烯、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链。
在各实施方案中：上述组合物还含有水性表面活性剂；R2是取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是单键，并且在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间是单键和从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中该取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环丙烯、环氧基和取代或未取代的C1-C2碳链；第12和第13个碳原子被环氧基取代；和第12个碳原子被羟基取代。
本发明的特征还在于包含至少一种杀线虫化合物和水性表面活性剂或助溶剂或渗透增强剂或抗氧化剂的组合物、由上述成分组成的组合物或基本由上述成分组成的组合物及其防治线虫的应用。本发明还包括含有至少一种上述杀线虫化合物和水性表面活性剂和抗氧化剂的组合物、由上述成分组成的组合物或基本由上述成分组成的组合物。某些组合物含有两种、三种、四种或更多种不同的上述杀线虫化合物。
本文所用的“纯化的多肽”指已经和与其天然在一起的其它蛋白质、脂类和核酸分离的多肽。该多肽构成纯化制品干重的至少10％、20％、50％、70％、80％或95％。
“分离的核酸”是一种核酸，其结构与任何天然存在的核酸不同，或与天然存在的跨越超过三个分离的基因的基因组核酸的任何片段的结构不同。因此该术语包括例如(a)一种DNA，是天然存在的基因组DNA分子的一部分，但未与两个核酸序列侧接，而这两个核酸序列侧接于该DNA天然存在的生物基因组中的该分子部分；(b)一种核酸分子，该分子被并入载体或原核生物或真核生物的基因组DNA中使得所得到的分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不同；(c)一种单独的分子如cDNA，一种基因组片段，一种通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段或一种限制片段；和(d)一种重组核苷酸序列，是杂种基因即编码融合蛋白质的基因的一部分。要从此定义中特别排除的是存在于不同的(i)DNA分子、(ii)转染细胞或(iii)DNA库中的细胞克隆如cDNA或基因组DNA库中的细胞克隆的混合物中的核酸分子。本发明的分离的核酸分子还包括合成产生的分子以及已被化学改变和/或具有修饰的主链的任何核酸分子。
虽然短语“核酸分子”主要指自然的核酸，短语“核酸序列”指核酸分子中的核苷酸序列，但这两个短语可以互换使用。
本文使用的关于一种特定多肽的术语“基本上纯的”表示该多肽基本没有其它生物大分子。基本上纯的多肽是占干重至少75％(例如80、85、95或99％)纯的。纯度可通过任何适当的标准方法例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析测定。
两种氨基酸序列或两种核酸的“同一性百分比”是使用按照Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877修改的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268算法测定的。上述算法被并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的Blastall(BLASTP、BLASTX、TBLASTN、TBLASTX)或B12seq程序(2.x版或之后的版本)。B12seq使用BLASTN(用于比较核酸序列)或BLASTP(用于比较氨基酸序列)算法对目标序列和靶序列进行比较。通常，当进行氨基酸序列比对时，使用的BLOSUM62计分矩阵的默认参数是gap existence cost为1，extension cost为1，字段长(word size)为3，期望值为10，per residue cost为1，λ比为0.85。输出文件含有靶序列和目标序列间的同源比对区(aligned region)。比对后，即可通过计算与目标序列中的序列比对的靶序列中连续的核苷酸或氨基酸残基数目确定长度(即排除缺口(gaps))，所述目标序列中的序列是从任何匹配的位置开始到任何其它匹配的位置结束。匹配的位置是在靶序列和目标序列中都存在的相同的核苷酸或氨基酸残基所在的任何位置。一个或多个残基的缺口可以被插入靶序列或目标序列中以使结构保守结构域(例如α-螺旋区、β-片区和环)间的序列比对达到最大。
一段特定长度的同一性百分比是通过计算该特定长度中匹配位置的数目，用该数目除以该长度并将所得结果乘以100倍来确定的。例如，如果(i)将500个氨基酸的靶序列与目标氨基酸序列对比，(ii)B12seq程序显示靶序列的200个氨基酸与目标序列区比对，而该200个氨基酸的第一个和最后一个氨基酸与之匹配，和(iii)这200个比对的氨基酸中匹配的数目是180，则该500个氨基酸靶序列含有长度200并且该长度的序列相同度为90％(即180÷200×100＝90)。
可以理解的是与目标序列比对的核酸和氨基酸靶序列能产生许多不同的长度，每个长度具有自己的同一性百分比。应指出同一性百分比值可以四舍五入到最接近的小数点后一位(tenth)。例如，78.11、78.12、78.13和78.14下舍入78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19上舍入78.2。还要指出该长度值将一直是整数。
模板或目标(subiect)多肽中的保守区的鉴定有利于同源多肽序列分析。保守区可通过定位模板多肽的主氨基酸序列中的区域来鉴定，所述区域是重复序列、形成一些二级结构(例如螺旋和β-片)、形成带正电或负电结构域或代表蛋白质基序(motifs)或结构域。参见例如描述各种蛋白质基序和结构域的共同序列的Pfam网址 http：//www.sanger.ac.uk/Pfam/和http：//genome.wustl.edu./Pfam/。Pfam数据库中所包括信息的说明描述于Sonnhammer等(1998)Nucl.Acids.Res.26：320-322；Sonnhammer等(1997)Proteins 28：405-420；和Bateman等(1999)Nucl.Acids.Res.27：260-262。根据Pfam数据库，可将蛋白质基序和结构域的共同序列与模板多肽序列比对以确定保守功能区。
本文所用的术语“转基因(transgene)”表示一种核酸序列(编码例如一种或多种目标多肽)，此序列对于将其引入的转基因植物、动物或细胞来说是部分或完全异源的，即外源的，或者对于将其引入的转基因植物、动物或细胞的内源基因来说是同源的，但被设计成以改变所插入细胞基因组的方式将其插入植物的基因组(例如被插入到与天然基因不同的位置或其插入导致剔除)。转基因可包括一个或多个转录调节序列和其它核酸序列如基因内含子，上述序列可能是选定的核酸的最佳表达所必需的，均可操作地连接到选定的核酸并且可能包括增强子序列。
本文所用的术语“转基因细胞”指含有转基因的细胞。
本文所用的术语“转基因植物”是该植物的一个或多个或所有细胞包含转基因的所有植物。转基因可通过精细的遗传操作如T-DNA介导转移、电穿孔法或原生质体转化法引入细胞前体从而被直接或间接地引入到细胞中。转基因可以被整合到染色体中或可以是染色体外复制DNA。
本文所用的术语“组织特异性启动子”表示一种充当启动子的DNA序列，即该序列调节可操作地连接于该启动子的选定的DNA序列的表达，并且影响选定DNA序列在组织例如叶、根、种子或茎的特异性细胞中的表达。
本文所用的术语“严谨(stringent)条件下的杂交”和“高度严谨条件下的杂交”指在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)缓冲液中，接着在60℃或65℃下在0.2X SSC缓冲液、0.1％SDS中洗两次的条件下杂交。本文所用术语“低严谨条件下的杂交”指在约45℃下在6X SSC缓冲液中，接着在50℃下在6X SSC缓冲液、0.1％(w/v)SDS中洗两次的条件下杂交。
在可操作地连接于核酸序列时，“异源启动子”指与该核酸序列没有天然联接的启动子。
本文所用的具有“驱蠕虫活性”的试剂是一种试剂，该试剂在测试时具有可测的杀线虫活性或导致线虫的生存力或繁殖力降低，使得很少数能存活或无后代产生，或者损害线虫感染或在其寄主中繁殖的能力，或妨碍线虫的生长或发育。该试剂还可显示出线虫驱避性能。在试验中，将该试剂与线虫结合，例如在微量滴定盘的孔内，在含该试剂的液体或固体培养基或土壤中。将分时期的(staged)成虫线虫放在培养基上。测定线虫的存活时间、后代的生存力，和/或运动。相对于未暴露的相似时期的成虫，具有“驱蠕虫活性的”试剂能够例如将线虫成虫的存活时间降低例如约20％、40％、60％、80％或更多。或者，具有“驱蠕虫活性”的试剂还可能导致线虫停止复制、再生和/或产生有生存力的后代，其作用程度例如约20％、40％、60％、80％或更多。上述作用可能立即显示或在连续世代中显示。
本文所用的术语“结合(binding)”指未共价链接的第一化合物和第二化合物物理上相互作用的能力。结合作用的表观离解常数是1mM或更低，例如10nM、1nM和0.1nM或更低。
本文所用术语“特异性结合”指抗体辨别靶配体和非靶配体的能力，从而使得该抗体在同时暴露于靶配体和非靶配体时，和当存在的靶配体和非靶配体的摩尔数均超过该抗体时，该抗体结合到靶配体而非非靶配体上。
本文所用术语“改变活性”指活性水平的改变，或者是活性增加或是活性降低(例如所述多肽结合或调节其它多肽或分子的能力增加或降低)，特别是类脂肪酸脱饱和酶或脂肪酸脱饱和酶活性(例如将双键引入脂肪酸的δ-12位置的能力)的改变。所述变化可以在定量或定性观察中发觉。如果进行定量观察，并且如果对多个观察值进行综合分析，在一种水平改变并且当统计参数p值是例如低于0.05的情况下，本领域技术人员能够进行常规的统计分析来鉴别转变。
除非另有说明，“取代的”碳、碳链或甲基、烷基有一个或多个氢被不同的基团例如卤素或羟基代替。因此，碳或碳链可以被单取代或多取代。
在某种程度上，本文所述的杀线虫脂肪酸和脂肪酸类似物提供抑制线虫代谢、生长、存活力、繁殖力、发育、传染性和/或线虫生活周期的有效的、环境安全的方法。所述化合物可单独使用或结合其它杀线虫剂使用。与现有技术中的非特异性脂肪酸化合物相比，较强的活性降低了本发明许多化合物在活性浓度下的植物毒性(即有效治疗范围较大)，这使得本发明化合物能在种植后施用，并且降低了装卸成本(handling cost)，这提供了除环境益处之外的经济动力。
本发明的一个或多个实施方案的细节将在附图和下面的说明中阐明。本发明的其它特征、目的和优势将从说明书和附图，以及从权利要求中表现出来。
附图说明
图1是秀丽隐杆线虫在油酸甲酯上的生长照片。
图2是秀丽隐杆线虫在亚油酸甲酯上的生长照片。
图3是秀丽隐杆线虫在蓖麻油酸甲酯上的生长照片。
图4是秀丽隐杆线虫在斑鸠菊酸甲酯上的生长照片。
图5是一组描绘蓖麻油酸、反蓖麻酸、12-氧代-9(Z)-十八碳烯酸、12-氧代-9(E)-十八碳烯酸、(12，13)-环氧基-反式-9-十八碳烯酸和斑鸠菊酸的图。显示的碳原子编号以羰基(羧基)碳为碳1。
图6叙述了在百万分之500(ppm)和100ppm蓖麻油酸(Ra)、反蓖麻酸(Rea)和壬酸甲酯(P)浓度下土壤浸液植物毒性实验的结果。
图7叙述了测试施用到罐中生长的西红柿上的反蓖麻酸甲酯的几种制剂对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的作用的实验结果。含100ppm反蓖麻酸甲酯的溶液：MO/S85＝矿物油和Span 85；PG/T40＝丙二醇(1，2-丙二醇)和Tween40；或T20 5:1＝Tween 20。使用了若干对照：fenam 20＝20ppm的苯线磷(Nemacur)；T20 5:1 blnk＝无反蓖麻酸甲酯活性成分的Tween 20制剂空白)；NT＝未处理对照。
发明详述
下文描述了是证明δ-12脂肪酸脱饱和酶活性是线虫生存必需的实验。下文还描述了某些杀线虫脂肪酸和类似物，包括具有与δ-12脂肪酸脱饱和酶抑制剂一致活性的杀线虫脂肪酸和酯。
不饱和脂肪酸是生物膜的正常功能所必需的。在生理温度下，仅含有饱和脂肪酸的极性甘油脂类不能形成液-晶双分子层，而这是生物膜的基本结构。将适当数目的双键引入膜甘油脂类的脂肪酸中(称为去饱和的过程)能降低从凝胶转变成液-晶相的温度并能提供具有必要的流动性的膜。膜流动性对于保持脂类双分子层的屏障性能和某些膜结合酶类的活化和功能是很重要的。还有证据说明不饱和给予了对抗乙醇和氧化胁迫的某种保护，表明膜脂肪酸的不饱和度对温度适应性很重要。不饱和脂肪酸还是动物中的多不饱和酸(PUFAs)花生四烯酸和二十碳五烯酸的前体，上述不饱和酸是前列腺素的重要来源。这些分子是改变其合成细胞活性的局部激素，并且在毗连(adjoining)细胞内，调节繁殖过程、免疫、神经生理学、热生物学和离子及流体运输。
细胞调节其膜不饱和度的能力主要由脂肪酸脱饱和酶的作用决定。脱饱和酶利用分子氧并减少NADH(或NADPH)当量以催化双键的插入，在其脂酰基链底物的特定位置引入不饱和键。在许多体系中，该反应使用了由NAD(P)H、细胞色素b5还原酶和细胞色素b5组成的电子传递短链，以便从NAD(P)H和碳-碳单键向氧往复传递电子，形成水和双键(C＝C)。许多真核脱饱和酶是内质网(ER)结合的非血红素二铁-氧蛋白质，含有三个保守的组氨酸基序和两个疏水残基的长序列段。这些疏水α螺旋结构域被认为用于定位蛋白质，将其大部分暴露于内质网的胞质面和安排活性部位组氨酸与活性二铁-氧部分适当地配位。
虽然绝大多数真核生物包括哺乳动物能将双键引入18-碳脂肪酸的Δ9位置，但哺乳动物不能将双键插入Δ12或Δ15位置。因此，亚油酸酯(18:2，Δ9，12)和亚麻酸酯(18:3，12，15)必需从食物中获得，因而被称为必需脂肪酸。由于开花植物易于将Δ12和Δ15位置脱饱和，因此这些膳食脂肪酸主要来自植物来源。某些非脊椎动物，包括一些昆虫和线虫，能从头合成其全部组成脂肪酸，包括亚油酸酯和亚麻酸酯。例如秀丽隐杆线虫能从头合成多种多不饱和脂肪酸，包括花生四烯酸和二十碳五烯酸，这一特征不是哺乳动物或开花植物所共有的(Spychalla等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci USA 94(4)：1142-7)。
秀丽隐杆线虫脱饱和酶基因fat-2已在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达，并且显示为Δ12脂肪酸脱饱和酶(Peyou-Ndi等(2000)Arch.Biochem.Biophys.376(2)：399-408)。此酶在第12和第13(从羧酸酯末端开始计算)个碳原子间引入双键并能将单-不饱和油酸酯(18:1Δ9)和棕榈烯酸甲酯(Palmitoleate)(16:1Δ9)分别转化成双-不饱和亚油酸酯(18:2Δ9，12)和16:2Δ9，12脂肪酸。
几个原因使线虫δ-12酶可能是抗线虫化合物的良好靶标。首先，如上所述，哺乳动物被认为没有δ-12脂肪酸脱饱和酶。因此，该酶的抑制剂很可能对哺乳动物无毒性。此外，该酶看来似乎在系统发育上与其植物同源物有很大差异，在氨基酸水平上成对序列同一性低于40％，并且系统分类分析证明线虫δ-12和ω-3脱饱和酶的分类远离其植物同源物。用转基因的拟南芥和大豆的实验显示植物能忍受亚油酸酯或亚麻酸酯的显著减少，表明δ-12脱饱和酶的抑制剂可能对植物无毒(Miquel & Browse(1992)J.Biol.Chem.267(3)：1502-9；Singh等(2000)Biochem.Society Trans.28：940-942；Lee等(1998)Science 280：915-918)。
有许多脂肪酸类似物存在，其中一些可能充当酶的特异性抑制剂，所述酶如作用于脂肪酸的脱饱和酶，或充当特异性受体拮抗剂(Yagalozzff(1995)Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids52(5)：293-7)。苹婆酸-一种油酸的类环丙烯脂肪酸类似物，是δ-9脂肪酸脱饱和酶的有效抑制剂(Schmid &Patterson(1998)Lipids 23(3)：248-52；Waltermann & Steinbuchel(2000)FEMSMicrobiol Lett.190(1)：45-50)。还有人推测亚油酸的类环丙烯类似物可能同样抑制δ-12脂肪酸脱饱和酶(Dulayymi等(1997)Tetrahedron 53(3)：1099-1110)。但值得注意的是δ-8环丙烯脂肪酸在某些系统中似乎是与δ-9环丙烯脂肪酸萍婆酸酯同样的抑制剂(Schmid & Petterson(1998)Lipids 23(3)：248-52)，证明预测一些脂肪酸类似物的抑制模式是多么困难。硫代脂肪酸类似物也可能与反式脂肪酸(Choi等(2001)Biochem Biophys Res Commun 284(3)：689-93)一样是脂肪酸脱饱和酶的抑制剂(Skrede等(1997)Biochim Biophys Acta 1344(2)：115-131；Hovik等(1997)Biochim Biophys Acta 1349(3)：251-256)。但这些类似物的特异性和农药活性仍难以预测(Beach等(1989)Mol Biochem Parasitol 35(1)：57-66)。
亚油酸的某些类似物可能是特异性δ-12抑制剂，包括环氧脂肪酸(斑鸠菊酸)、炔属脂肪酸(还阳参油酸)、12-氧-9(Z)-十八碳烯酸甲酯或羟基脂肪酸(蓖麻油酸和反蓖麻酸)。尽管是天然发现于某些种子油中并已在非本地植物(例如拟南芥(Arabidopsis thaliana))中表达，但不认为脂肪酸类似物如还阳参油酸酯、蓖麻醇酸酯和斑鸠菊酸酯是内源的δ-12脱饱和酶的特异抑制剂(Broun &Somerville(1997)Plant.Physiol.113：933-942；Singh等(2000)Biochem.SocietyTrans.28(6)：940-942)。在表达这些类似物的基因的植物中，油酸酯与亚油酸酯的比率改变改为归因于所涉及的酶之间的负相互作用(Singh等(2001)Planta212：872-879)。向粗糙脉孢菌(Neurospora cyassa)中外源添加蓖麻油酸导致油酸酯(C18:1)的显著减少和亚麻酸酯(C18:3)增加，仍不能显示蓖麻醇酸酯类化合物实际上是特异性的δ-12脱饱和酶抑制剂(Goodrich-Tanrikulu等(1996)ApplMicrobiol Biotechnol.46(4)：382-7)。
我们惊讶地发现某些脂肪酸类似物的母体脂肪酸和甲酯(例如蓖麻醇酸酯、斑鸠菊酸酯)是杀线虫的并且具有与线虫δ-12脱饱和酶特异性抑制剂一致的活性。所述脂肪酸和甲酯显示比其它的十八碳游离脂肪酸和酯如油酸酯、反式油酸酯和亚油酸酯的活性显著增强。与短链的表面上非特异性的杀虫脂肪酸和酯如壬酸酯(壬酸或壬酸甲酯)相反，预测是δ-12脱饱和酶抑制剂的脂肪酸类似物显示植物毒性显著地降低，因此能有效地使用，同时使对非靶标生物的不良损害减至最小。
脂肪酸类似物或其它类型的抑制剂可以从外源供给植物，例如通过喷雾。脂肪酸类似物还可以种衣的形式施用。还可以通过寄主生物或为线虫食物的生物提供抑制剂。寄主生物或为线虫食物的生物可以或可以不通过遗传工程学改变成产生较少量亚油酸酯的。例如，不天然产生线虫脂肪酸脱饱和酶类多肽的抑制剂的寄主细胞可以用编码能产生抑制类似物的酶的基因进行转化，和必要时从外源提供适当的前体化合物。作为选择，活性抑制剂和前体可以通过表达适当的酶而通过内源代谢产生。此外，可以修改酵母菌或其它生物以产生抑制剂。然后将以上述生物为食的线虫暴露于所述抑制剂。
在一个实施方案中，可以形成能产生对脂肪酸有活性的酶(例如脱饱和酶、羟基化酶和/或环氧化酶)的转基因细胞和/或生物。上述酶可以例如在植物、脊椎动物和/或线虫中表达。这些酶可以产生脂肪酸、类似物或其它抑制剂，然后这些物质充当其它酶如脂肪酸脱饱和酶(例如来自Crepis palaestina的δ-12环氧化酶在转基因的拟南芥(Arabidopsis)中产生斑鸠菊酸)的特异性抑制剂(Singh等(2000)Biochem.Society Trans.28：940-942；Lee等(1998)Science 280：915-918)。
本文所用的脂肪酸类似物可以施用到需要线虫防治的动物、植物或植物的环境，或施用到需要线虫防治的动物的食物中。组合物可通过例如浇灌法或滴注法施用。采用滴注施用，可将脂肪酸类似物直接施用到植物的基部或该植物紧邻的土壤中。组合物可通过现有的滴灌系统施用。此方法特别适用于棉花、草莓、西红柿、马铃薯、蔬菜和观赏植物。或者，在需要施用足量的杀线虫组合物以便其渗流到植物的根部区域的情况下，可以采用浇灌施用。浇灌法可用于多种作物和草皮草。浇灌法还可用于动物。优选杀线虫组合物经口给药以提高对内部的寄生线虫的活性。有时，杀线虫组合物还可通过注射寄主动物给药。
在本发明主题的优选实施方案中，本发明的化合物可以含水微乳剂的形式施用。杀线虫组合物的浓度应足以控制线虫，而不造成对所需植物的植物毒性或对寄主动物的过度毒性。本发明的一个重要方面是惊讶地发现被预测是线虫δ-12脱饱和酶的特异性抑制剂的某些脂肪酸类似物(例如蓖麻油酸、蓖麻醇酸甲酯、反蓖麻酸、反蓖麻酸甲酯、斑鸠菊酸甲酯)是杀线虫的并且显示比其它非特异性杀虫脂肪酸酯如油酸酯、反式油酸酯和亚油酸酯显著增强的活性。此外，与非特异性短链杀虫脂肪酸酯如壬酸酯(壬酸或壬酸甲酯)相比，上述化合物显示其植物毒性降低。因此，本发明的组合物在无植物毒性的浓度下显示出出色的杀线虫活性。
本发明的杀线虫脂肪酸类似物可与另一种杀线虫剂结合施用。第二种试剂可以例如同时或顺序地施用。所述杀线虫剂可包括例如阿维菌素用于动物施用。
杀线虫脂肪酸类似物还可配合一种试剂如草甘膦施用以改善植物根的韧皮部流动性(mobility)。
上述杀线虫脂肪酸酯组合物可用于治疗由下列非限制性的示范属的线虫引起的疾病或感染：粒瘿线虫属(Anguina)，茎线虫属(Ditylenchus)，矮化线虫属(Tylenchorhynchus)，短体线虫属(Pratylenchus)，穿孔线虫属(Radopholus)，潜根线虫属(Hirschmanniella)，珍珠线虫属(Nacobbus)，纽带线虫属(Hoplolaimus)，异常盾线虫属(Scutellonema)，盘旋线虫属(Rotylenchus)，螺旋线虫属(Helicotylenchus)，肾形线虫属(Rotylenchulus)，刺线虫属(Belonolaimus)，孢囊线虫属(Heterodera)和其它胞囊(cyst)线虫，根结线虫属(Meloidogyne)，轮线虫属(Criconemoides)，鞘线虫属(Hemicycliophora)，针线虫属(Paratylenchus)，垫刃线虫属(Tylenchulus)，滑刃线虫属(Aphelenchoides)，伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)，细杆滑刃线虫属(Rhadinaphelenchus)，长针线虫属(Longidorus)，剑线虫属(Xiphinema)，毛刺线虫属(Trichodorus)和类毛刺线虫属(Paratrichodorus)，恶丝虫属(Dirofiliaria)，盘尾丝虫属(Onchocera)，布鲁线虫属(Brugia)，棘唇线虫属(Acanthocheilonema)，Aelurostrongylus，钩口线虫属(Anchlostoma)，管圆线虫属(Angiostrongylus)，蛔线虫属(Ascaris)，仰口线虫属(Bunostomum)，毛细线虫属(Capillaria)，夏伯特线虫属(Chabertia)，毛样线虫属(Cooperia)，环体线虫属(Crenosoma)，网尾线虫属(Dictyocaulus)，膨结线虫属(Dioctophyme)，唇棘线虫属(Dipetalonema)，龙线属(Dracunculus)，住肠线虫属(Enterobius)，丝虫属(Filaroides)，血矛线虫属(Haemonchus)，兔唇蛔虫属(Lagochilascaris)，罗阿丝虫属(Loa)，曼森氏丝虫属(Mansonella)，缪氏属(Muellerius)，板口线虫属(Necator)，线虫属(Nematodirus)，食道口线虫属(Oesophagostomum)，奥斯特线虫属(Ostertagia)，Parafilaria，副蛔虫属(Parascaris)，Physaloptera，原圆肺虫属(Protostrongylus)，腹腔丝虫属(Setaria)，旋尾丝虫属(Spirocerca)，冠丝虫属(Stephanogilaria)，类圆线虫属(Strongyloides)，圆线虫属(Strongylus)，吸吮线虫属(Thelazia)，弓蛔线虫属(Toxascaris)，弓蛔虫属(Toxocara)，旋毛形线虫属(Trichinella)，毛圆线虫属(Trichostrongylus)，鞭虫属(Trichuris)，Uncinaria和吴策线虫属(Wuchereria)。特别优选的线虫包括下列属：恶丝虫属(Dirofilaria)，盘尾丝虫属(Onchocera)，布鲁丝虫属(Brugia)，棘唇线虫属(Acanthocheilonema)，唇棘线虫属(Dipetalonema)，罗阿丝虫属(Loa)，曼森氏丝虫属(Mansonella)，Parafilaria，腹腔线虫属(Setaria)，冠丝虫属(Stephanofilaria)和吴策线虫属(Wucheria)，短体线虫属(Pratylenchus)，胞囊线虫属(Heterodera)，根结线虫属(Meloidogyne)，针线虫属(Paratylenchus)。特别优选的种是：犬钩口线虫(Ancylostoma Caninum)，捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)，旋毛形线虫(Trichiella spiralis)，Trichurs muris，犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)，细薄恶丝虫(Dirofilaria tenuis)，匍匐恶丝虫(Dirofilaria repens)，熊恶丝虫(Dirofilari ursi)，猪蛔虫(Ascaris suum)，犬弓首蛔虫(Toxocara canis)，猫弓首蛔虫(Toxocara cati)，Strongyloides ratti，Parastrongyloides trichosuri，大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines)，苍白球异皮线虫(Globodera pallida)，爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)，南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和花生根结线虫(Meloidogynearenaria)，香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)，Longidorus elongatus，北方根结线虫(Meloidogyne hapla)和穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)。
因此，下列实施例应解释为仅仅是说明性的，无论如何不是以任何方式对本公开的残留权(remainder)的限制。因此，本文所引所有出版物全文引入作为参考。
实施例1
RNA介导的干扰(RNAi)
通过被称为RNA介导的干扰(Fire等(1998)Nature 391：806-811，和Gnczy等(2000)Nature 408：331-336)的方法，使用双链RNA(dsRNA)分子钝化细胞内的δ-12脂肪酸脱饱和酶(δ-12 fat-2)基因。dsRNA分子可具有δ-12 fat-2核酸(优选外显子)或其片断的核苷酸序列。将dsRNA分子输送到线虫中可通过直接注射，或通过将线虫浸泡在含浓缩dsRNA的水溶液中，或通过用遗传工程产生dsRNA分子的大肠杆菌饲养食细菌的线虫。
通过注射的RNAi
为检验抑制δ-12 fat-2活性的作用，将对应于秀丽隐杆线虫δ-12 fat-2基因的dsRNA注入线虫中，基本上如Mello等(1991)EMBO J.10：3959-3970所述。简单地说，构建含有一部分秀丽隐杆线虫δ-12 fat-2序列，特别是651个核苷酸长度的片断的质粒，该部分序列含有完整的第一个外显子并就在第一个外显子和第一个内含子间的保守的内含子剪接点前终止。此构建体(construct)大约编码秀丽隐杆线虫δ-12 fat-2基因的前217个氨基酸。使用引物特异性地扩增此序列，形成线状dsRNA。使用T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶从这些片断转录单链RNA(相当于有意义RNA和反义RNA的RNAs)。将RNA沉淀并重悬浮于无RNAse的水中。为将ssRNAs退火以形成dsRNAs，将ssRNA合并，加热至95℃ 2分钟，然后在1.5-2.5小时内令其从70℃冷却至室温。
将dsRNA注入15-20只雌雄同体秀丽隐杆线虫新鲜成虫的体腔中。将线虫固定在琼脂糖垫上，通常注射浓度是1mg/ml。使用例如配备10倍和40倍DIC物镜的Zeiss Axiovert复式显微镜进行目测注射。显微注射用的针使用Narishigeneedle puller、镜台显微操作器(Leitz)和设定在10-20p.s.i的N2-驱动注射器(Narishige)制备。注射后，向琼脂糖垫上加入200μl恢复缓冲液(0.1％鲑鱼精DNA，4％葡萄糖，2.4mM KCl，66mM NaCl，3mM CaCl2，3mM HEPES，pH7.2)，令线虫在琼脂糖垫上恢复0.5-4小时。恢复(recovery)后，将线虫转移到NGM琼脂平板上，该平板上接种了大肠杆菌菌株OP50菌苔作为食物源。接下来的一天和之后的连续三天，将7只注射过的健康蠕虫个体转移到用OP50接种的新的NGM平板上。测定每天每只线虫的产卵数和孵化并达到能生育的成虫期的卵数。作为对照，制造绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA并使用相同的方法注射。GFP是一种常用的报道基因，最初从水母中分离到，并且广泛用于原核和真核系统。GFP基因不存在于野生型秀丽隐杆线虫基因组中，因此GFP dsRNA不会触发野生型秀丽隐杆线虫的RNAi表现型。秀丽隐杆线虫δ-12 FAT RNAi注射表现型表现为F1孵化率大幅度降低，少数存活的个体在幼虫早期就停止生长。
通过摄食的RNAi
秀丽隐杆线虫可在大肠杆菌菌苔上生长，所述大肠杆菌是经遗传工程改变为能产生为抑制δ-12 fat-2表达设计的双链RNA(dsRNA)。简单地说，用秀丽隐杆线虫fat-2基因序列的一部分基因组片断，特别是651个核苷酸长度的片断来转化大肠杆菌，所述片断含有完整的第一个外显子并就在第一个外显子和第一个内含子间的保守的内含子剪接点前终止。此构建体大约编码秀丽隐杆线虫δ-12 FAT-2基因的头217个氨基酸。将651个核苷酸基因组片断克隆到大肠杆菌表达载体相反(opposing)的T7聚合酶启动子间。然后将此克隆转化到携带IPTG-诱导的T7聚合酶的大肠杆菌菌株内。作为对照，用编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因转化大肠杆菌。摄食RNAi从秀丽隐杆线虫卵或秀丽隐杆线虫L4s开始。当在23℃、含IPTG和表达秀丽隐杆线虫δ-12 FAT或GFP dsRNA的大肠杆菌的NGM平板上用秀丽隐杆线虫卵开始进行摄食RNAi时，秀丽杆菌δ-12 FAT RNAi摄食表现型表现为部分不育的F1个体和死亡的F2胚胎。当在23℃、含IPTG和表达秀丽隐杆线虫δ-12 FAT或GFP dsRNA的大肠杆菌的NGM平板上用秀丽隐杆线虫L4幼虫开始进行摄食RNAi时，秀丽杆菌RNAi摄食表现型表现为发育停滞的部分不育的P0个体(即最初暴露的个体)，不育的F1线虫。fat-2基因的序列的复杂度(即唯一性)十分高，因此RNAi不可能体现(represent)与其它基因的交叉反应性。
在表达dsRNA的大肠杆菌存在下生长的秀丽隐杆线虫培养物和用来自δ-12 FAT基因的dsRNA注射过的那些秀丽隐杆线虫受到强烈地损害，显示脂肪酸脱饱和酶类基因提供了一项线虫的基本功能，来自脂肪酸脱饱和酶类基因的dsRNA当被摄食或注射到秀丽隐杆线虫中时是致命的。
实施例2
通过亚油酸甲酯拯救秀丽隐杆线虫δ-12 fat RNAi摄食表现型
秀丽隐杆线虫δ-12脂肪酸脱饱和酶(FAT-2蛋白)将单不饱和油酸转化成双不饱和亚油酸。δ-12 FAT RNAi阻止δ-12脂肪酸脱饱和酶的表达，预计这会造成线虫的亚油酸水平降低，导致发育停滞和死亡。向用于RNAi实验的NGM培养基中添加3mM亚油酸甲酯能部分挽救δ-12 FAT RNAi摄食表现型。添加3mM油酸甲酯不能挽救该δ-12 FAT RNAi摄食表现型(见下表1)。
表1：秀丽隐杆线虫δ-12 FAT RNAi摄食表现型(以秀丽隐杆线虫L4幼虫开始，作为P0动物)
添加的脂肪酸   P0表现型     F1表现型   F2表现型
无 产卵严重地减少(几乎不育) 发育停滞和不育 NA
油酸甲酯 产卵严重地减少(几乎不育) 发育停滞和不育 NA
亚油酸甲酯 产卵减少 中度延迟发育和中度减少产卵 发育稍微延迟
实施例3
秀丽隐杆线虫和脂肪酸的制备
使用M9溶液将混合状态的秀丽隐杆线虫从接种OP50细菌的平板上洗下。向24-孔板的每个孔内用移液管吸入250μl M9溶液，其中含有约50-100只蠕虫。
除反蓖麻酸的脂肪酸盐和游离酸以外的所有其它脂肪酸乳液均按照Kim等(美国专利号5698592)的教导制备。简单地说，将10μl脂肪酸与20μl表面活性剂Igepal CO630混合于1.5ml微量离心管中来制备1ml 1％的原液。在将脂肪酸和Igepal CO630仔细地混合后，添加850μl ddH2O，并通过柔和的移液操作进行混合，直至获得均匀的溶液。最后，添加120μl纯异丙醇并通过柔和的移液操作进行混合。还可准备蓖麻油酸钾盐、反蓖麻酸钠盐、和反蓖麻酸游离酸的1％原液。对于蓖麻油酸钾盐来说，将0.01g溶解于100μl ddH2O中，并与20μl表面活性剂Igepal CO630合并于1.5ml微量离心管中。在将脂肪酸和IgepalCO630仔细地混合后，添加760μl ddH2O并通过柔和的移液操作进行混合，直至获得均匀溶液。最后，添加120μl纯异丙醇并通过柔和的移液操作进行混合。对于反蓖麻酸的钠盐和游离酸来说，将0.01g溶解于100μl丙酮中，并与20μl表面活性剂Igepal CO630合并于1.5ml微量离心管中。在将脂肪酸和IgepalCO630仔细地混合后，添加760μl ddH2O并通过柔和的移液操作进行混合，直至获得均匀溶液。最后，添加120μl纯异丙醇并通过柔和的移液操作进行混合。然后这些原液就可用于制备24-孔平板测定中所用的各种脂肪酸稀释乳液。“丙酮对照”乳液是通过将100μl丙酮、20μl表面活性剂Igepal CO630、760μl ddH2O和120μl纯异丙醇合并于1.5ml微量离心管中并混合至均匀来制备的
实施例4
单个的脂肪酸甲酯乳液对秀丽隐杆线虫的杀线虫活性
向每个孔中添加脂肪酸乳液或对照乳液并通过回荡迅速混合。通过在添加乳液或对照后的24小时内的各时间点进行的目测和游动测定评价线虫生存力。所测试的脂肪酸乳液是壬酸甲酯、蓖麻油酸甲酯、斑鸠菊酸甲酯、亚油酸甲酯、油酸甲酯和缺乏脂肪酸的对照乳液。
蓖麻油酸、反蓖麻酸和斑鸠菊酸的结构绘于图5。
表2：脂肪酸甲酯乳液对秀丽隐杆线虫的杀线虫活性
    脂肪酸     浓度             蠕虫死亡率
    1小时     6小时     24小时
    壬酸(C9-甲酯)     0.1％     100％     100％     100％
    0.003％     50％     50％     50％
    蓖麻油酸(C18-甲酯)     0.1％     90％     90％     90％
    0.003％     60％     60％     60％
    斑鸠菊酸(C18-甲酯)     0.1％     65％     65％     75％
    0.003％     20％     20％     20％
    亚油酸(C18-甲酯)     0.1％     0-5％     0-5％     0-5％
    0.003％     0-5％     0-5％     0-5％
    油酸(C18-甲酯)     0.1％     0-5％     0-5％     0-5％
    0.003％     0-5％     0-5％     0-5％
    对照(无甲酯)     0.1％     0-5％     0-5％     0-5％
    0.003％     0-5％     0-5％     0-5％
壬酸和蓖麻油酸甲酯乳液在0.1％浓度下都是强杀线虫活性的。壬酸甲酯乳液使得线虫运动几乎立即停止并且随后死亡，而蓖麻油酸甲酯乳液明显显示强杀死作用需要至多几个小时。然而，在0.003％浓度下，壬酸甲酯乳液暂时性的“击晕(stun)”秀丽隐杆线虫，最初表现为100％死亡表现型。接种后几个小时，许多线虫恢复并再次开始移动。使用其它脂肪酸乳液未观察到比“击晕”效果。
实施例5
单独的脂肪酸甲酯、盐和游离脂肪酸乳液对秀丽隐杆线虫N2s和永久幼虫 的杀线虫活性
L：亚油酸，R：蓖麻油酸，Re：反蓖麻酸；V-trans：(12，13)-环氧基-反式-9-十八碳烯酸
表3：对秀丽隐杆线虫的结果(蠕虫死亡)
    脂肪酸     0.1％     0.01％     0.001％
    蓖麻油     10％     ＜5％     NA
    壬酸甲酯     100％     100％     30％
    L甲酯(ME)     ＜5％     ＜5％     ＜5％
    L游离酸     10％     ＜5％     ＜5％
    R甲酯     80％     40％     20％
    R游离酸     95％     50％     ＜5％
    Re甲酯     100％     100％     80％
    Re游离酸*     100％     98％     40％
    R钾盐     90％     15％     5％
    Re钠盐     100％     100％     NA
    丙酮对照     10％     5％     5％
表4：对秀丽隐杆线虫永久幼虫的结果(蠕虫(worm)死亡)
    脂肪酸     0.1％     0.01％     0.001％
    蓖麻油     NA     NA     NA
    壬酸甲酯     NA     NA     NA
    L甲酯     40％     20％     NA
    L游离酸     50％     40％     NA
    R甲酯     70％     30％     NA
    R游离酸     90％     75％     NA
    Re甲酯     100％     100％     NA
    Re游离酸*     75％     75％     NA
    R钾盐     75％     20％     NA
    Re钠盐     NA     NA     NA
    丙酮对照     35％     20％     NA
    V-trans甲酯     90％     50％     NA
从表3和4可以看出，蓖麻油酸和反蓖麻酸、盐和甲酯以及(12，13)-环氧基-反式-9-十八碳烯酸甲酯(斑鸠菊酸甲酯的反式异构体)显示出对正常饲养的秀丽隐杆线虫N2蠕虫和秀丽隐杆线虫永久幼虫都有显著的杀线虫活性。在秀丽隐杆线虫中，永久的途径是由于拥挤和饥饿而改变所进入的生活周期。永久幼虫是一种对环境有抗性的阶段，据认为与某些寄生线虫的扩散幼虫期(例如根结线虫和孢囊线虫属的J2期)在功能上相似。在此测定中，蓖麻油(蓖麻油酸的天然甘油三酸酯形式)、亚油酸和亚油酸甲酯不是强杀线虫活性的。
实施例6
根结线虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.))J2幼虫的制备
南方根结线虫和爪哇根结线虫均从西红柿根中制取。将根漂洗，并通过过滤，接着蔗糖密度梯度离心将碎片与J2幼虫和卵分离。卵在15℃孵化4天，通过过滤器，接着离心收集J2幼虫。
实施例7
脂肪酸甲酯乳剂对根结线虫(根结线虫属)的杀线虫活性
将线虫和乳液在室温下振摇孵育48小时。将每个孔的内容物均转移到没有细菌的各NGM平板上成一小斑点。转移到平板后大约24小时时，分别计算接种斑之上和之外不活的或活的蠕虫数。如果蠕虫爬离接种斑，或者其在移动时，则认为其是活的。如果蠕虫留在接种斑处，则认为其是不活的。
表5：脂肪酸甲酯乳剂对南方根结线虫和爪哇根结线虫的杀线虫活性
    脂肪酸(0.1％)     爪哇根结线虫(不活％)     南方根结线虫(不活％)
    斑鸠菊酸(C18-甲酯)     90％     100％
    壬酸(C9-甲酯)     100％     100％
    蓖麻油酸(C18-甲酯)     60％     95％
    油酸(C18-甲酯)     20％     25％
壬酸、斑鸠菊酸和蓖麻油酸甲酯乳液在浓度0.1％时对根结线虫(根结线虫属)有显著的杀线虫活性。
实施例8
对脂肪酸甲酯植物毒性的评价
将消毒后的西红柿种子在含Gamborg’s琼脂培养基的品红色罐中开始生长。生长2周后，用250μl 1％的脂肪酸甲酯乳液(壬酸、蓖麻油酸、反蓖麻酸、油酸或没有任何脂肪酸的对照乳液)处理幼苗，处理时直接施用到茎-培养基分界面。在乳液施用后的不同时间评价西红柿幼苗。在所测试的脂肪酸中，只有1％的壬酸甲酯乳液显示出对西红柿的明显影响。在壬酸乳液施用后的18小时内，这些西红柿显示出膨胀压明显降低(萎蔫表现型)和表观上明显变得不够绿。在24小时内，壬酸处理过的西红柿几乎完全褪色成灰白色并且几乎完全萎蔫，多数叶子直接倒向琼脂培养基表面。重要的是，用其它脂肪酸甲酯乳液处理过的西红柿没有显示出明显的影响。因此，蓖麻油酸和反蓖麻酸(见实施例9-12)甲酯由于结合了高杀线虫性能和良好的低植物毒性而显示出作为驱蠕虫化合物的出色潜力。
此外，从图6中可以看出，在根浇灌土壤实验中，甚至是蓖麻油酸和反蓖麻酸的游离脂肪酸也显示出对西红柿的植物毒性比壬酸甲酯低。
实施例9
单独的脂肪酸甲酯乳液对多种自由生活的动物寄生性和植物寄生性线虫 的杀线虫活性
简单地说，添加所示脂肪酸乳剂并通过回荡迅速地混合。添加乳液后24小时内(对于植物寄生线虫根结线虫(Meloidogyne)和孢囊线虫属(Heterodera)是48小时)通过目测和游动测定评价线虫生存力。所测试的脂肪酸乳液是壬酸甲酯、反蓖麻酸甲酯、蓖麻油酸甲酯、斑鸠菊酸甲酯、亚油酸甲酯和油酸甲酯。脂肪酸乳液对抗自由生活的动物寄生性和植物寄生性线虫的结果合并于一个表中以有利于对比不同的乳剂对于显示不同生活方式的线虫的活性。所示结果是多个独立实验所得值的平均值％。
表6：各种脂肪酸甲酯对各种自由生活的动物寄生性和植物寄生性线虫的杀线虫活性
                          蠕虫死亡％(24小时)
        -对照             抑制剂    +对照
蠕虫(溶液％)秀丽隐杆线虫(0.1％)     油酸＜10     亚油酸＜10   斑鸠菊酸80   蓖麻油酸100   反蓖麻酸100     壬酸100
秀丽隐杆线虫(0.1％)     ＜10     ＜10   50   80   100     100
秀丽隐杆线虫(0.1％)P.trichosuri(0.1％) ～10     ＜10～25   30～95   30～50   75100     30
P.trichosuri(0.01％)     ～10     ～25   ～90   ～60   100
P.trichosuri(0.001％)M.incognita(0.1％) 20 98 95 ～99 100
M.incognita(0.01％)     20   73   83   ～99
M.incognita(0.001％)   97
M.javanica(0.1％)     20   90   60   100     100
M.javanica(0.01％)     0-5   60   5   100
M.javanica(0.001％)H.glycines(0.1％) ＜10 ＜20 30 ～60   ～60100 100
H.glycines(0.01％)H.glycines(0.001％)P.scribneri(0.1％)     ＜10＜10＜20     ＜20＜20＜20   2018＜20   ～60～40＜20   100100～70     ＞95＜20
P.scribneri(0.01％)     ＜20     ＜20   ＜20   ＜20   ～40     ＜20
P.scribneri(0.001％)
秀丽隐杆线虫(Caenorhabiditis elegans)是混合不同时期(stage)的群体。在几种其它自由生活的线虫种中看到了相似的作用。Parastrongyloides trichosuri(澳洲bushtail possum的寄生虫)是类永久性的传染性第3期幼虫。相似的作用还可见于自由生活阶段。南方根结线虫和Meloidogyne javanica(爪哇根结线虫)是第2期幼体(类永久传染期)。Heterodera glycines(大豆孢囊线虫)是第2期幼体(类永久传染期)。最后，Pratylenchus scribneri(玉米短体线虫)是混合时期的群体。
如上表中的数据所证明的，反蓖麻酸和蓖麻油酸甲酯乳液在0.1％和0.01％浓度下均是强杀线虫活性的。特别是反蓖麻酸甲酯对广谱的不同线虫属均显示出良好的杀线虫活性。
实施例10
用Tween 20(代替Igepal CO630)制备的单独的脂肪酸甲酯乳液对秀丽隐杆 线虫的杀线虫活性
如实施例9所述测定的，一些线虫对用表面活性剂Igepal CO630制备的乳液缺乏耐受性。因此，用Tween-20-基乳液重复了一些测定。
简单地说，通过将10μl脂肪酸甲酯与20μl表面活性剂Tween-20混合于1.5ml微量离心管中来制备1ml 1％的原液乳液。在将脂肪酸和Tween-20仔细地混合后，添加850μl ddH2O并通过柔和的移液操作进行混合，直至获得均匀溶液。最后，添加120μl纯异丙醇并通过柔和的移液操作进行混合。然后这些原液就可用于制备24-孔平板测定中所用的各种脂肪酸甲酯稀释乳液。
表7：用Tween-20制备的各种脂肪酸甲酯乳液对秀丽隐杆线虫的杀线虫活性
                      蠕虫死亡％(24小时)
     -对照              抑制剂     +对照
  蠕虫(溶液％) 油酸     亚油酸 斑鸠菊酸   蓖麻油酸   反蓖麻酸     壬酸
  秀丽隐杆线虫(0.1％)     ＜10   100   100     100
  秀丽隐杆线虫(0.01％)     ＜10   100   100     100
  秀丽隐杆线虫(0.001％)   40   60     30
如上表所示，用Tween-20代替Igepal CO630制备的脂肪酸甲酯乳液显示出与Igepal基乳液的杀线虫活性相似。
实施例11
用环糊精(代替异丙醇)制备的单独的脂肪酸甲酯乳液对秀丽隐杆线虫的杀 线虫活性
在努力增加脂肪酸甲酯乳液的生物利用度的过程中，用两种(甲基-β-环糊精或2-羟丙基-β-环糊精)之一代替异丙醇。
表8：用环糊精制备的各种脂肪酸甲酯乳液对秀丽隐杆线虫的杀线虫活性
                           蠕虫死亡％(24小时)
     -对照               抑制剂   +对照
蠕虫(溶液％) 油酸   亚油酸 斑鸠菊酸   蓖麻油酸   反蓖麻酸   壬酸
秀丽隐杆线虫(0.1％)   ＜10   ＞95
秀丽隐杆线虫(0.01)   ＜10   ＞80
秀丽隐杆线虫(0.001％)   ～50
上表显示了最有效的环糊精乳液制剂(10μl脂肪酸，20μl igepal CO630，60μl2-羟丙基β-环糊精和910μl H2O)的结果。
实施例12
脂肪酸甲酯乳液对动物寄生性微丝蚴线虫(马来布鲁线虫(Brugia malayi)) 的杀线虫活性
向每个孔中添加Tween-基脂肪酸乳液并通过回荡迅速混合。通过在添加乳液后的24小时和48小时内进行的目测游动性测定评价线虫微丝蚴生存力。所测试的脂肪酸乳液是蓖麻油酸甲酯、斑鸠菊酸甲酯、反蓖麻酸甲酯、油酸甲酯和不含脂肪酸的对照乳液。此研究的结果示于表9，表示为接种后24小时不运动的微丝蚴的百分数，表10中表示的是接种48小时后不运动的微丝蚴的百分数。
表9：脂肪酸甲酯乳液对马来布鲁线虫接种24小时后的杀线虫效力
抑制剂 0.0％  0.0008％  0.0016％  0.003％  0.005％  0.067％  0.008％
蓖麻油酸 0  0  24.7  100  100  100  100
斑鸠菊酸 0  0  0  0  66  100  100
反蓖麻酸 0  0  19.1  100  100  100  100
油酸 0  0  0  0  0  0  0
空白 0  0  0  0  0  0  0
表10：脂肪酸甲酯乳液对马来布鲁线虫接种48小时后的杀线虫效力
抑制剂 0.0％  0.0008％  0.0016％  0.003％  0.005％  0.067％  0.008％
蓖麻油酸 0  0  64.2  100  100  100  100
斑鸠菊酸 0  0  0  5  100  100  100
反蓖麻酸 0  0  49.4  100  100  100  100
油酸 0  0  0  0  0  0  0
空白 0  0  0  0  0  0  0
如上表中的结果所示，在Tween-基的乳液中，蓖麻油酸和反蓖麻酸甲酯均显示出对马来布鲁线虫的强杀微丝蚴(microfilarialcidal)活性(有时比斑鸠菊酸甲酯的活性还强)。
实施例13
脂肪酸甲酯乳液混合物对秀丽隐杆线虫的杀线虫活性
向每个孔中添加脂肪酸乳液混合物或对照乳液并通过回荡迅速混合。通过在添加乳液或对照后的24小时内各时间点进行的目测和游动性测定评价线虫生存力。所测试的脂肪酸乳液是反蓖麻酸甲酯、蓖麻油酸甲酯、油酸甲酯和不含脂肪酸的对照乳液。
表11：脂肪酸甲酯乳液混合物对接种24小时后的秀丽隐杆线虫的杀线虫活性
脂肪酸混合物 全部脂肪酸％  死亡％
75％反蓖麻酸/25％蓖麻油酸 0.1  100
0.01  100
50％反蓖麻酸/50％蓖麻油酸 0.1  100
0.01  99
25％反蓖麻酸/75％蓖麻油酸 0.1  100
0.01  97
75％反蓖麻酸/25％油酸 0.1  100
0.01  100
50％反蓖麻酸/50％油酸 0.1  99
0.01  99
25％反蓖麻酸/75％油酸 0.1  97
0.01  38
75％反蓖麻酸/25％空白 0.075  100
0.0075  100
50％反蓖麻酸/50％空白 0.05  100
0.005  100
25％反蓖麻酸/75％空白 0.025  100
0.0025  100
注：空白是不添加脂肪酸的原液。由于空白中没有脂肪酸，当在相同百分数浓度下比较时，反蓖麻酸/蓖麻油酸、反蓖麻酸/油酸和反蓖麻酸(RE)/空白混合物比较具有等量的乳液成分和等量的反蓖麻酸。但反蓖麻酸/空白实验的总脂肪酸较低，因此0.1％和0.01％测定必须乘以反蓖麻酸％，才能得到添加的总脂肪酸数。
实施例14
脂肪酸乳液混合物对秀丽隐杆线虫的杀线虫活性
向每个孔中添加脂肪酸乳液混合物或对照乳液并通过回荡迅速混合。通过在添加乳液或对照后的24小时内各时间点进行的目测和游动性测定评价线虫生存力。所测试的脂肪酸乳液是反蓖麻酸、蓖麻油酸、油酸和不含脂肪酸的对照乳液。
表12：脂肪酸乳液混合物对接种24小时后的秀丽隐杆线虫的杀线虫活性
脂肪酸混合物 全部脂肪酸％ 死亡％
100％反蓖麻酸 0.1 100
0.01 100
100％蓖麻油酸 0.1 99
0.01 ＜10
100％油酸 0.1 ＜10
0.01 ＜10
75％反蓖麻酸/25％蓖麻油酸 0.1 100
0.01 100
50％反蓖麻酸/50％蓖麻油酸 0.1 100
0.01 100
25％反蓖麻酸/75％蓖麻油酸 0.1 100
  0.01   96.5
  75％反蓖麻酸/25％油酸   0.1   100
  0.01   100
  50％反蓖麻酸/50％油酸   0.1   100
  0.01   100
  25％反蓖麻酸/75％油酸   0.1   100
  0.01   89
实施例15
各种反蓖麻酸甲酯制剂在西红柿罐试验中对Meloidogyne incognita(南方根 结线虫)的杀线虫活性
在接种前一天，将在含壤土的罐中生长的三周大的西红柿用反蓖麻酸甲酯制剂或对照制剂浇灌。根据在田间湿度下的土壤重量，施用100或500ppm的反蓖麻酸甲酯。然后用5000只南方根结线虫的J2幼虫接种土壤。接种后3周时，测定根瘿率和上部/根部鲜重。
如图7所示，在土壤测定中，表面活性剂和助溶剂的选择能影响反蓖麻酸甲酯对根结线虫的效力。与目前使用的环境毒性的杀线虫剂苯线磷比较显示，在土壤测定中，用反蓖麻酸甲酯防治线虫的水平很显著。
本发明已描述了许多实施方案。但显然在不背离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其它实施方案也在下列权利要求的范围内。

Claims (84)

1.一种杀线虫组合物，含有：
(a)有效量的下式化合物
其中：
R1＝H，阳离子或取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间有顺式或反式双键和或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；和
(b)水性表面活性剂。
2.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中R1是H或阳离子。
3.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中R1是取代或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链。
4.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R1是取代或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链。
5.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R1和R2之一或二者的C1-C2碳链是被取代的并且取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基或环氧基。
6.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R1和R2之一或二者的C1-C2碳链是被取代的并且取代基选自羟基、卤素或氨基。
7.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R1是取代的C1甲基。
8.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R1是取代或未取代的C1-C2碳链。
9.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R2是取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间有顺式或反式双键和或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链。
10.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R2的C1-C2碳链是被取代的，并且取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基或环氧基。
11.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R2的C1-C2碳链是被取代的，并且取代基选自羟基、氧、卤素、叠氮基或氨基。
12.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R2的C1-C2碳链是被单取代的。
13.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R1是H。
14.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R1是阳离子。
15.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中的R2是仅在从羰基(羧基)碳开始数起的第12和13碳原子之一或之二处被取代。
16.权利要求15所述的杀线虫组合物，其中的R2仅在从羰基(羧基)碳开始数起的第12个碳原子被取代。
17.权利要求15所述的杀线虫组合物，其中的R2仅在从羰基(羧基)碳开始数起的第13个碳原子被取代。
18.权利要求15所述的杀线虫组合物，其中R2内的取代基是极性的并且选自羟基、氧、环氧基、卤素、氨基、氰基或叠氮基。
19.权利要求15所述的杀线虫组合物，其中R2内的取代基是氢键受体并且选自：羟基、氧、环氧基、氨基、氰基或叠氮基。
20.权利要求15所述的杀线虫组合物，其中R2内的取代基选自：羟基、氧或环氧基。
21.一种杀线虫组合物，含有：
(a)选自下组的脂肪酸或盐或酯：蓖麻油酸，反蓖麻酸，12-氧代-9(Z)-十八碳烯酸，12-氧代-9(E)-十八碳烯酸，(12，13)-环氧基-反式-9-十八碳烯酸和斑鸠菊酸；和
(b)水性表面活性剂。
22.权利要求1或21所述的杀线虫组合物，其中的水性表面活性剂选自乳酸乙酯、Span 20、Span 40、Span 80、Span 85、Tween 20、Tween 40、Tween 80、Tween 85或Igepal CO 630。
23.权利要求1或21所述的杀线虫组合物，其中该组合物还含有(c)渗透增强剂。
24.权利要求23所述的杀线虫组合物，其中的渗透增强剂是环糊精。
25.权利要求1或21所述的杀线虫组合物，其中该组合物还含有：(c)助溶剂。
26.权利要求25所述的杀线虫组合物，其中的助溶剂选自异丙醇、丙酮、1，2-丙二醇、石油基油或矿物油。
27.权利要求1或21所述的杀线虫组合物还含有选自下组的杀线虫剂：阿维菌素、伊维菌素或米尔螨素。
28.权利要求1或21所述的杀线虫组合物还含有氧化抑制剂。
29.权利要求28所述的杀线虫组合物，其中的氧化抑制剂选自下组：丁化羟基苯甲醚(BHA)或丁化羟基甲苯(BHT)。
30.权利要求1所述的杀线虫组合物，其中该组合物含有至少两种不同的下式化合物
其中：
R1＝H，阳离子或取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间有顺式或反式双键和或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链。
31.一种防治有害线虫的方法，该方法包括向脊椎动物、植物、种子或土壤施用含下列成分的组合物：
(a)下式化合物
其中：
R1＝H，阳离子或取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间有顺式或反式双键和或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；和
(b)水性表面活性剂。
32.权利要求31所述的方法，其中R1是H或阳离子。
33.权利要求31所述的方法，其中R1是取代或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链。
34.权利要求31所述的方法，其中的R1是取代或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链。
35.权利要求31所述的方法，其中的R1和R2之一或二者的C1-C2碳链是被取代的并且取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基或环氧基。
36.权利要求31所述的方法，其中的R1和R2之一或二者的C1-C2碳链是被取代的并且取代基选自羟基、卤素或氨基。
37.权利要求31所述的方法，其中的R1是取代的Cl甲基。
38.权利要求31所述的方法，其中的R1是取代或未取代的C1-C2碳链。
39.权利要求31所述的方法，其中的R2是取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间有顺式或反式双键和或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链。
40.权利要求31所述的方法，其中的R2的C1-C2碳链是被取代的，并且取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基或环氧基。
41.权利要求31所述的方法，其中的R2的C1-C2碳链是被取代的，并且取代基选自羟基、氧、卤素、叠氮基或氨基。
42.权利要求31所述的方法，其中的R2的C1-C2碳链是被单取代的。
43.权利要求31所述的方法，其中的R1是H。
44.权利要求31所述的方法，其中的R1是阳离子。
45.权利要求31所述的方法，其中的R2是仅在从羰基(羧基)碳开始数起的第12和13碳原子之一或之二处被取代。
46.权利要求45所述的方法，其中的R2仅在从羰基(羧基)碳开始数起的第12个碳原子被取代。
47.权利要求45所述的方法，其中的R2仅在从羰基(羧基)碳开始数起的第13个碳原子被取代。
48.权利要求45所述的方法，其中R2内的取代基是极性的并且选自：羟基、氧、环氧基、卤素、氨基、氰基或叠氮基。
49.权利要求45所述的方法，其中R2内的取代基是氢键受体并且选自：羟基、氧、环氧基、氨基、氰基或叠氮基。
50.权利要求45所述的方法，其中R2内的取代基选自：羟基、氧或环氧基。
51.一种防治有害线虫的方法，该方法包括向脊椎动物、植物、种子或土壤施用含下列成分的组合物：
(a)选自下组的脂肪酸或盐或酯：蓖麻油酸，反蓖麻酸，12-氧代-9(Z)-十八碳烯酸，12-氧代-9(E)-十八碳烯酸，(12，13)-环氧基-反式-9-十八碳烯酸或斑鸠菊酸；和
(b)水性表面活性剂。
52.权利要求31或51所述的方法，其中的水性表面活性剂选自下组：乳酸乙酯、Span 20、Span 40、Span 80、Span 85、Tween 20、Tween 40、Tween80、Tween 85和Igepal CO 630。
53.权利要求31或51所述的方法，其中该组合物还含有(c)渗透增强剂。
54.权利要求53所述的方法，其中的渗透增强剂是环糊精。
55.权利要求31或51所述的方法，其中该组合物还含有：(c)助溶剂。
56.权利要求55所述的方法，其中的助溶剂选自下组：异丙醇、丙酮、1，2-丙二醇、石油基油或矿物油。
57.权利要求31或51所述的方法，还含有选自下组的杀线虫剂：阿维菌素、伊维菌素或米尔螨素。
58.权利要求31或51所述的方法，还含有氧化抑制剂。
59.权利要求31或51所述的方法，其中的氧化抑制剂选自下组：丁化羟基苯甲醚(BHA)和丁化羟基甲苯(BHT)。
60.权利要求31或51所述的方法，其中的线虫感染植物并且将该组合物施用到土壤或植物。
61.权利要求60所述的方法，其中在种植前将该组合物施用到土壤。
62.权利要求60所述的方法，其中在种植后将该组合物施用到土壤。
63.权利要求60所述的方法，其中使用滴灌系统将该组合物施用到土壤。
64.权利要求60所述的方法，其中使用浇灌系统将该组合物施用到土壤。
65.权利要求60所述的方法，其中该组合物施用到植物根部。
66.权利要求60所述的方法，其中该组合物施用到种子。
67.权利要求31或51所述的方法，其中线虫感染脊椎动物。
68.权利要求67所述的方法，其中的脊椎动物是哺乳动物。
69.权利要求67所述的方法，其中的脊椎动物是鸟。
70.权利要求67所述的方法，其中将该组合物给非人类的哺乳动物使用。
71.权利要求67所述的方法，其中将该组合物给人使用。
72.权利要求67所述的方法，其中将该组合物配制成灌服药给非人类的脊椎动物使用。
73.权利要求67所述的方法，其中将该组合物配制成口服给药的药物。
74.权利要求67所述的方法，其中将该组合物配制成可注射的药物。
75.一种用于非人类的脊椎动物的饲料，含有：
(a)适合非人类脊椎动物的饲料；
(b)下式的化合物：
其中：
R1＝H，阳离子或取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间有顺式或反式双键和或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间有三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、氧、卤素、氨基、氰基、叠氮基、环丙烷、环丙烯、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；和
(b)水性表面活性剂。
76.权利要求75所述的饲料，其中该饲料已经过处理以降低亚油酸含量、亚麻酸含量或二者的含量。
77.权利要求76所述的饲料，其中的γ-亚麻酸含量和α-亚麻酸含量已被降低。
78.权利要求75所述的饲料，其中的饲料选自下组：大豆、小麦、玉米、高梁、黍类、紫花苜蓿、车轴草和黑麦。
79.一种杀线虫组合物，含有：
(a)有效量的下式化合物：
Figure A038100220008C2
其中：
R1＝取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；和
R3＝取代或未取代的C11碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间有顺式双键，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环丙烯、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；
R4＝取代或未取代的C2-C6碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；
X和Y彼此独立地是取代或未取代的甲基或硫，条件是X和Y中至少一个是硫，并且其中甲基上的取代基选自下组：卤素、氢、氨基和羟基；和
(b)水性表面活性剂。
80.权利要求79所述的杀线虫组合物，其中X和Y之一是CH2。
81.一种杀线虫组合物，含有：
(a)有效量的下式化合物
Figure A038100220009C1
其中：
R1＝取代的或未取代的C1-C5碳链，其中的取代基选自下组：羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；和
R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是单键，和或者：(i)从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间是三键或(ii)第12和第13个碳原子间为单键或双键并且第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中的取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环丙烯、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链；和
(b)水性表面活性剂。
82.权利要求81所述的杀线虫组合物，其中R2＝取代或未取代的C15-C19碳链，所述碳链在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第9和第10个碳原子间是单键，并且在从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子间是单键和从羰基(羧基)碳原子开始数起的第12和第13个碳原子之一或同时有至少一个取代基，其中该取代基选自羟基、卤素、氨基、氰基、环丙烷、环丙烯、环氧基或取代或未取代的C1-C2碳链。
83.权利要求81所述的杀线虫组合物，其中的第12和第13个碳原子被环氧基取代。
84.权利要求81所述的杀线虫组合物，其中第12个碳原子被羟基取代。
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