CN102326541B - 月桂酸防治南方根结线虫的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种月桂酸防治南方根结线虫的新用途。该新用途为月桂酸用于制备南方根结线虫杀虫剂；在该杀虫剂中，月桂酸可单独作为活性成分，也可与其它具有防治南方根结线虫活性的成分进行配伍共同作为活性成分。所述杀虫剂为月桂酸的甲醇溶液，所述杀虫剂为驱避剂或引诱剂，所述月桂酸在所述驱避剂中的浓度为4.00mM；所述月桂酸在所述引诱剂中的浓度为0.5mM-2.00mM。使用月桂酸的甲醇溶液防治南方根结线虫，安全、无毒、有效，当月桂酸溶液的浓度为4.00mM时可驱避南方根结线虫，并使其致死率高达67％，当月桂酸溶液的浓度为0.50mM-2.00mM时可吸引南方根结线虫，并使其致死率高达39％。

Description

月桂酸防治南方根结线虫的新用途
技术领域
本发明涉及月桂酸的一种新用途，特别涉及月桂酸在防治南方根结线虫中的用途。
背景技术
根结线虫是世界范围内的重要病原生物之一，它给世界农业生产带来了严重的损失，每年全世界因此而造成的农业经济损失高达1570亿。目前世界上已经报道的根结线虫有90余种，而南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)占整个根结线虫的95％。南方根结线虫可造成设施生产的一系列问题，并使大量经济作物减产。在我国北方，以南方根结线虫为主，根结线虫的寄主植物范围广泛，超过3000种植物，包括单子叶植物、双子叶植物、草本植物和木本植物，特别是蔬菜中的茄科、葫芦科等经济价值高的作物，其中的番茄和黄瓜受害后一般可减产30％～40％，甚至绝收。当前，根结线虫的防治主要以化学药品防治为主，其对环境、人畜安全的存在严重危害，正逐渐被立法部门取消。因此，安全、有效、低毒的药品及防治方法迫在眉睫。
根结线虫主要包括六个生育期，而在它的二龄期，可利用发达的受神经支配的头感器，通过头部的嗅觉神经元(AWA，AWC)来感知根系散发出的信号物质，向寄主植物进行趋向性迁移，侵染植物，从而完成其生命周期。因此，在根结线虫的二龄期，可以通过干扰根结线虫的趋向性迁移，起到线虫防治的目的。随着模式动物秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)基因组测序工作的完成，目前已分离和鉴定了19800个能够编码6627个蛋白家族的基因，并对有关基因的功能进行了详细而深入的研究。而且，我们前期工作发现，E-value≤1时，秀丽线虫与南方根结线虫同源基因接近6000个，其中mpk-1基因是Ras途径中的主要功能基因之一，与线虫的趋向性迁移相关，并且mpk-1基因在秀丽线虫和南方根结线虫中同源性较高，所以mpk-1基因的表达情况可以支持并反映南方根结线虫的趋向性迁移。
月桂酸作为一种天然脂肪酸，无毒，在食品添加剂、香料工业、制药等方面均有诸多应用，目前尚未见有用于防治南方根结线虫的报道。
发明内容
本发明的目的是提供月桂酸的一种新用途。该新用途为月桂酸用于制备南方根结线虫杀虫剂；在该杀虫剂中，月桂酸可单独作为活性成分，也可与其它具有防治南方根结线虫活性的成分进行配伍共同作为活性成分。
所述杀虫剂具体可为月桂酸的甲醇溶液。
所述杀虫剂为驱避剂或引诱剂；所述月桂酸在所述驱避剂中的浓度为4.00mM；所述月桂酸在所述引诱剂中的浓度为0.5mM-2.00mM。
本发明还提供两种防治南方根结线虫的方法：
一种方法包括如下步骤：将所述驱避剂用于防治南方根结线虫；所述防治南方根结线虫为驱避并杀死南方根结线虫；
另一种方法包括如下步骤：将所述引诱剂用于防治南方根结线虫；所述防治南方根结线虫为吸引并杀死南方根结线虫。
使用月桂酸的甲醇溶液防治南方根结线虫，安全、无毒、有效，当月桂酸溶液的浓度为4.00mM时可驱避并杀死南方根结线虫，致死率高达67％，当月桂酸溶液的浓度为0.50mM-2.00mM时可吸引并杀死南方根结线虫，致死率高达39％。
附图说明
图1为不同浓度月桂酸的甲醇溶液检测南方根结线虫趋向性的示意图。其中，A表示添加甲醇的圈，B表示添加月桂酸溶液的圈，C表示放线虫位置。
图2为不同浓度月桂酸的甲醇溶液对南方根结线虫趋向性的影响。
图3为不同浓度月桂酸的甲醇溶液对南方根结线虫死亡率的影响。
图4为不同浓度月桂酸的甲醇溶液对南方根结线虫Mi-mpk-1表达的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、不同浓度月桂酸的甲醇溶液对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的影响
1、材料：将月桂酸(CAS：143-07-7，Sigma)用色谱纯甲醇配成浓度为0.50mM、1.00mM、2.00mM和4.00mM的溶液，分别得到0.50mM月桂酸的甲醇溶液(杀虫剂1)、1.00mM月桂酸的甲醇溶液(杀虫剂2)、2.00mM月桂酸的甲醇溶液(杀虫剂3)和4.00mM月桂酸的甲醇溶液(杀虫剂4)。于-20℃冰箱保存备用。
南方根结线虫(Meloidogyne incognita)(武扬，郑经武，商晗武.根结线虫分类和鉴定途径及进展.浙江农业学报.2005，17：106-110，公众可从中国农业大学获得)的二龄幼虫。
2、方法：使用杀虫剂1-4及色谱纯甲醇(对照)分别处理南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的二龄幼虫，利用趋向性指数、线虫死亡率、Mi-mpk-1基因表达的结果，从生理水平和分子水平说明月桂酸作为南方根结线虫杀虫剂的效果。
实验室条件下，按照Ward(Ward Samuel.Chemotaxis by the nematodeCaenorhabditis elegans：Identification of attractants and analysi sof theresponse by use of mutants.Proc.Nat.Acad.Sci.USA.1973，70，817-821)和Bargmann等(Bargmann C.I.，Hartweig E.，Horvitz H.R.Odorant selective genesand neurons mediate olfaction in C.elegans.Cell，1993，74，515-527)所提供的方法，采用直径为6cm的培养皿，分别在一个直径的距离培养皿边缘1cm处标记直径为1cm的圆。每个培养皿中加入10ml 0.8％的琼脂。在标记双圈的培养皿中，一侧圈内加入10ml的色谱纯甲醇，另一侧加入10ml不同浓度的月桂酸溶液。在两侧圆中，均加入10μL色谱纯甲醇作为阴性对照。加入化合物后的培养皿，先放入25℃培养箱中避光孵化2小时，取出后在每个培养皿的中间部位，与两侧的圆等距的位置(图1)加入50条刚孵化出的南方根结线虫的二龄幼虫，再25℃培养箱避光孵化3小时，按照Bargmann和Horvitz(Bargmann C.I.，Horvitz H.R.Chemosensoryneurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals inC.elegans.Neuron，1991，7，729-742)的方法统计趋向性指数(Chemotaxis Index)，其计算方法为：添加月桂酸溶液圆中线虫的数量与添加甲醇溶剂圆中线虫数量的差，与加入线虫总数的比值，即趋向性指数＝(月桂酸溶液圆中线虫数量-甲醇圆中线虫数量)/加入线虫的总量；趋向性指数≥0.2时，为吸引；0≤趋向性指数＜0.2时，为微弱吸引，趋向性指数≤-0.02时，为排斥。同时统计二龄幼虫的死亡率，死亡率的计算方法为：运动到添加不同浓度月桂酸溶液圆中线虫死亡数与圆中线虫总数的比值。
每个浓度的月桂酸溶液处理做3皿重复，分别统计每皿中添加月桂酸溶液(B)圆中线虫的数量及圆中线虫死亡数，和添加甲醇溶剂(A)圆中的线虫数量，计算趋向性指数、死亡率及各重复的平均值，结果见表1和图2。
表1.不同浓度的月桂酸的甲醇溶液处理南方根结线虫的统计结果
Figure BDA0000101463850000031
Figure BDA0000101463850000041
同时按照Ward和Bargmann等的方法，收集2000条不同处理的二龄幼虫，用于Mi-mpk-1基因表达的分析。基因信息及Real-time PCR采用的引物，如表2所示。
表2.Real-time PCR中Actin与mpk-1基因及引物信息
Figure BDA0000101463850000042
线虫总RNA的提取采用RNease Kit(Tiangen)，总RNA采用RNase-freeDNase(Takara)进行纯化，利用M-MLV(Promega)进行反转，获得第一条cDNA链。以cDNA链为模板(2μg)，进行Real-time PCR，荧光染料采用2×SYBR Green mix(Toyobo)，10μM的上游引物与下游引物各1μL，用高纯水补足至25μl。PCR反应条件为二步法：
第一步：50℃2min，95℃1min
第二步：95℃15s，52℃15s，72℃45s，40个循环，并在72℃采集荧光。
3、结果
(1)不同浓度的月桂酸的甲醇溶液对南方根结线虫趋向性的影响
月桂酸在浓度0.5mM至2.00mM范围内吸引南方根结线虫，并且浓度为1.00mM时，对线虫的吸引达到最大，趋向性指数为0.22，而随着浓度增加至4.00mM时，月桂酸驱避线虫，趋向性指数为-0.1(图2)。结果表明，月桂酸在低浓度(0.5mM-2.00mM)时，吸引线虫，而随着浓度的增加(4.00mM)排斥线虫。
(2)不同浓度的月桂酸对南方根结线虫死亡率的影响
在我们试验浓度范围内，南方根结线虫的死亡率随着月桂酸浓度的增加而增加(图3)。月桂酸浓度0.5mM至4.00mM范围，线虫的死亡率范围为24％-67％。
(3)不同浓度的月桂酸对南方根结线虫Mi-mpk-1表达的影响
在我们试验中，不同浓度月桂酸对Mi-mpk-1的影响表现为先促进后抑制(图4)。与对照相比(0mM)，月桂酸在0.5mM至2.00mM范围内，上调Mi-mpk-1的相对表达量，并且在1.00mM时，Mi-mpk-1的相对表达量达到最大值。当月桂酸浓度达到4.00mM，Mi-mpk-1的表达量均被下调。结果表明，在0.5mM至2.00mM范围的月桂酸，促进Mi-mpk-1的相对表达，而浓度达到4.00mM时，月桂酸抑制Mi-mpk-1的相对表达。
4、结论
生理数据及分子数据表明：0.50mM至2.00mM范围内的月桂酸的甲醇溶液可作为引诱剂，吸引南方根结线虫，并使其死亡，致死率高达39％；4.00mM的月桂酸的甲醇溶液可作为驱避剂，排斥南方根结线虫，并使其死亡，致死率高达67％。
Figure IDA0000101463940000011
Figure IDA0000101463940000021
Figure IDA0000101463940000031

Claims (3)

1.月桂酸在制备南方根结线虫杀虫剂中的应用，其特征在于：所述南方根结线虫杀虫剂的活性成分为月桂酸；所述月桂酸的浓度为4.00mM或0.5mM-2.00mM；所述南方根结线虫杀虫剂为月桂酸的甲醇溶液。
2.一种防治南方根结线虫的方法,包括如下步骤：将月桂酸的甲醇溶液作为驱避剂用于防治南方根结线虫；所述防治南方根结线虫为驱避并杀死南方根结线虫；所述月桂酸在所述驱避剂中的浓度为4.00mM。
3.一种防治南方根结线虫的方法,包括如下步骤：将月桂酸的甲醇溶液作为引诱剂用于防治南方根结线虫；所述防治南方根结线虫为吸引并杀死南方根结线虫；所述月桂酸在所述引诱剂中的浓度为0.5mM-2.00mM。
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