CN1646688A

CN1646688A - 生长调控蛋白质

Info

Publication number: CN1646688A
Application number: CNA038088304A
Authority: CN
Inventors: E·哈芬; H·斯托克; P·德拉姆; B·辛德尔霍茨; S·布鲁尔
Original assignee: GENETICS Co; Universitaet Zuerich
Current assignee: GENETICS Co; Universitaet Zuerich
Priority date: 2002-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2005-07-27
Also published as: WO2003083113A3; EP1487981A2; AU2003215857A1; US20050164194A1; EP1487981B1; JP2005537783A; WO2003083113A2; US7192706B2; DE60313855D1; ES2286450T3; DE60313855T2; ATE362533T1

Abstract

本申请公开了称为epsin样蛋白质(ELP)的蛋白质新家族。所述蛋白质包含ENTH结构域(Epsin氨基末端同源性结构域)，且具有生长抑制活性。该公开的蛋白质可用于过度增殖疾病的诊断以及基因疗法目的。

Description

生长调控蛋白质

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请号60/368,457的优先权，本文完整收录了它的公开内容。

发明领域

本发明涉及具有生长抑制活性的蛋白质新家族及其诊断和治疗用途。

发明背景

生长不仅与正常发育而且与异常状况诸如肿瘤发生和癌症密切相关。尽管它重要，然而我们对生长如何在细胞水平、组织和器官水平、或者整个生物体水平得到调控仍然了解得较少。由于生长通常与细胞增殖有关，因此为了理解调控生长的机制而进行的许多努力集中于细胞周期调控的机制。事实上，我们关于细胞如何进行细胞周期的知识已经大大增加(Nurse，2000)。对细胞分裂控制的专注导致推测生长受到控制细胞周期的因素的调控。然而，在果蝇成虫盘中进行的精致实验提醒了我们过去在酵母中的发现，即是生长调控着细胞周期而非相反(Nurse，1975)。果蝇实验显示，在细胞克隆中加速细胞周期时间并不刺激净生长(通过克隆占据的面积进行测量)，而是生成了更多但更小的细胞来占据与对照克隆相同的面积。相反，通过过度表达RB同系物RBF来减缓细胞周期则生成了更少但更大的细胞，同样占据相同面积(Neufeld、de la Cruz等人，1998)。因此，理解正常和异常发育过程中的生长调控需要的不仅是对细胞周期控制的理解。理解生长如何在细胞和组织水平得到调控也将为癌症治疗提供新方法和目标。事实上，阻断细胞生长的抑制剂诸如雷帕霉素目前在临床试验中作为抗癌药物使用(Hidalgo和Rowinsky，2000)。因此，迫切需要能够诊断和治疗过度增殖病的方法。

发明内容

由此，本发明的一般目的是提供包含ENTH结构域且具有生长抑制活性的蛋白质。

术语ENTH结构域(Epsin氨基末端同源性结构域)在用于本文时指首先在epsin家族的蛋白质中发现的保守蛋白质结构域。通常，该结构域位于蛋白质的氨基末端，所述结构域的特征为16个绝对保守的残基：N-x(11-13)-V-x2-A-T-x(34-36)-R-x(7-8)-W-R-x3-K-x12-G-x-E-x15-L-x11-12-D-x-G-R-x11-D-x7-R。

在一个优选实施方案中，所述蛋白质缺乏与Eps15相互作用的NPF结构域，且缺乏结合网格蛋白接头AP2的DPW结构域。

在另一个优选实施方案中，所述蛋白质具有与SEQ ID NO：2(人ELP)、SEQ ID NO：5(hELP18aa)、或SEQ ID NO：4(果蝇ELP)所列氨基酸序列至少40％、优选50％、更优选60％、甚至更优选80％且最优选90％相同的氨基酸序列。

在一个特别优选实施方案中，所述蛋白质具有与SEQ ID NO：2(人类)、SEQ ID NO：4(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、或SEQ ID NO：5(人类hELP18aa)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是编码本发明蛋白质的核酸序列。在一个优选实施方案中，所述核酸选自SEQ ID NO：1(hELP)和SEQ ID NO：3(dELP)。

本发明的另一个目的是确定受试者如人患者是否有风险患上特征为有害细胞增殖或异常分化控制的疾病的方法。

本发明的另一个方面提供了与epsin样蛋白质的表位特异反应的抗体和抗体制剂。

本发明的另一个目的是本发明的蛋白质和/或核酸用于基因疗法目的的用途。

在另一个方面，本发明涉及本发明的蛋白质和/或核酸用于治疗过度增殖病诸如癌症的用途。

在另一个方面，本发明涉及包含编码本发明蛋白质的核苷酸序列的载体。通常，载体包含在宿主细胞中实现表达所需要的调控序列，它可以包含进行质粒复制所需要的必需序列，以便以附加体状态存在，或者它可以设计用于染色体整合。术语调控序列在用于本文时涵盖本发明基因的天然调控序列以及异源调控序列。

另外，本发明提供了经过载体转化的宿主细胞，所述载体包含编码本发明蛋白质的核苷酸序列。可以使用能够表达本发明蛋白质的任何宿主细胞，如细菌、脊椎动物和无脊椎动物细胞。例如，所述细胞可用于生成epsin样蛋白质。

在另一个方面，本发明涉及用于生成epsin样蛋白质的方法，其中用包含编码epsin样蛋白质的核酸序列的载体转化合适宿主细胞，在容许蛋白质表达的条件下培养所述宿主细胞，并分离生成的epsin样蛋白质。可以使用能够表达本发明蛋白质的任何宿主细胞，如细菌、脊椎动物和无脊椎动物细胞。

附图描述

考虑下文的发明详述后，将更好的理解本发明，而且上文所列以外的目的将变得清晰。这些描述提到了附图，其中：

图1A显示了作为对照的野生型黑腹果蝇眼的电子扫描显微照片。

图1B显示了主要由纯合dELP突变体组织组成的复眼的电子扫描显微照片。该眼的大小显著增加。照片来自基因型为y w ey-flp/y w；FRT82dELP^4K2/FRT82 w+c13R3的雌蝇。

图2显示了dELP(SEQ ID NO：4)和hELP(SEQ ID NO：2)的序列比对。黑盒：相同残基。灰盒：保守残基。

图3显示了2种h-ELP异构体：h-ELP(SEQ ID NO：2)(来自数据库的序列)和h-ELP18aa(SEQ ID NO：5)(来自EST的序列)的ClustalW比对。比对下面的星号指示相同氨基酸。

图4A显示了h-ELP转录本在人组织中的表达；而图4B显示了h-ELP转录本在多种细胞系中的表达。将Northern印迹(Clonetech)与³²P标记的h-ELP探针(第751-1951位核苷酸)进行杂交。杂交使用ExpressHyb(Clonetech)在68℃进行，最后一次清洗使用0.1x SSC和0.1％SDS在68℃进行10分钟。

图5显示了hELP转录本的表达。将癌症表征阵列(Cancer ProfilingArray)(BD Biosciences，目录编号7841-1)膜与5′标记的hELP探针(第751-1951位核苷酸)进行杂交。杂交在68℃进行，依照制造商的建议，最后一次清洗使用0.2x SSC和0.5％SDS在68℃进行15分钟。样品参考见BD Bioscience产品目录。

图6显示了由delp在成年果蝇的眼和翅中的过度表达引起的生长表型。A)dELP在正在发育的眼中的过度表达在成年眼中诱导了生长抑制表型，而在翅中的过度表达引起严重的翅形减小，这可能还涉及凋亡效应。B)和D)为delp UAS系对照。基因型：A)y w UAS-delp3.15；ey Gal4/+；B)y w UAS-delp 3.15；+/+；C)y w MS 1096/UAS-delp 3.15；D)y w3.15 UAS-delp；+/+；MKRS/TM3。

具体实施方式

为了鉴定在细胞、组织和生物体水平上特异性地参与生长的基因，发明人在果蝇中采用了遗传方法。他们在基因组范围内筛选阻碍或促进细胞生长且不影响细胞分化的隐性突变。这些筛选利用了生成遗传嵌合果蝇的组织特异性重组系统(Newsome、Asling等人，2000)。这些果蝇在头部组织中对随机诱导的突变而言是纯合的，但是在身体和种系中对相同突变而言是杂合的。其产物选择性促进生长的基因(潜在的致癌基因)中的突变将生成小头果蝇，而其产物发挥生长抑制功能的基因(潜在的肿瘤抑制基因)中的突变将生成大头果蝇。通过这种筛选找到涉及肿瘤发生的基因的有效性由下面的鉴定得到了例证，即已知致癌基因的果蝇同系物像雷帕霉素的作用靶TOR、Myc、Ras中的突变引起小头表型，而已知肿瘤抑制基因同系物像PTEN、LATS和TS1中的突变引起大头表型(Huang、Potter等人，1999；Oldham、Montagne等人，2000)。

本发明所描述的基因中的突变生成头比正常更大的果蝇(图1)，有力地说明了它具有实质性的生长抑制功能。该基因稍后经鉴定是全新的，并由于与果蝇Epsin蛋白质享有共同结构域而被命名为Epsin样蛋白质(ELP)。在涉及由受体介导的内吞和生长受体的调控(Carbone，1997；Nakashima、Morinaka等人，1999)的所有Epsin家族蛋白质中都发现有(Rosenthal，Chen等人，1999)这个结构域，称为Epsin氨基末端同源性(ENTH)结构域(Kay、Yamabhai等人，1999)。然而，ELP缺乏Epsin中涉及内吞的两个重要结构域：与Eps15相互作用的C末端NPF结构域(Chen，Fre等人，1998)和结合网格蛋白接头AP2(Robinson，PJ、Liu，JP，Trends in neuroscience，1994)和网格蛋白(Rosenthal、Chen等人，1999)的DPW中心基序。由于ENTH结构域的三维结构与犰狳重复片段之一类似，因此推测该结构域可能也介导核-胞质穿梭(Hyman、Chen等人，2000；Vecchi、Polo等人，2001)。

据称ENTH结构域据可结合磷脂酰肌醇-4，5-磷酸二酯(PIP2)(Itoh、Koshiba等人，2001)，即膜磷脂PI(3，4，5)P3的脱磷酸化形式，它在由膜受体至下游成分的信号传播中发挥中枢作用(Martin，2001)。由此，与含PH结构域(已知结合PIP3且受PIP3水平调控)的蛋白质类似，含ENTH结构域的蛋白质的定位和功能可能受到PIP2水平的调控。

在缺失肿瘤抑制基因LATS的细胞中观察到的生长表型与对于本文所述基因中的突变而言是纯合的细胞中的生长表型非常相似的事实指示ELP可能也构成肿瘤抑制基因。

在本发明的范围内，鉴定了黑腹果蝇ELP蛋白质和两种人ELP异构体以及相应基因。

本发明的第一个方面涉及特征为存在ENTH结构域及其生长抑制活性的epsin样蛋白质(ELP)。在本发明的范围内，克隆并鉴定了黑腹果蝇和人的epsin样蛋白质。

可以显示dELP过度表达在果蝇翅中诱导了细胞死亡，并剧烈缩小了复眼的大小(再次指示其对生长的负作用)，而且hELP和dELP转基因在反式杂等位基因突变型黑腹果蝇背景中的过度表达部分挽救了纯合突变体由幼虫晚期至蛹阶段的致死性。这些发现证明果蝇和人蛋白质具有相同功能。

所述蛋白质的生长抑制活性指示epsin样蛋白质发挥着肿瘤抑制功能。

术语ELP蛋白质还包括上文所定义的任何蛋白质的功能片段、变体、或衍生物。本发明的蛋白质可以以嵌合蛋白的形式提供，例如重组融合蛋白。

“嵌合蛋白”或“融合蛋白”指编码目的ELP多肽之一的第一氨基酸序列与确定对于该ELP蛋白质之一的任何结构域而言是外来的且非实质性同源的结构域的第二氨基酸序列的融合体。嵌合蛋白中可以存在在同样表达该第一种蛋白质的生物体中(虽然在不同蛋白质中)发现的外来结构域，或者它可以是由不同种类的生物体表达的蛋白质结构的“物种间”、“基因间”等的融合。一般而言，融合蛋白可以表述成通式X-ELP-Y，其中ELP表示由一种ELP蛋白质衍生的蛋白质片段，而X和Y独立地不存在或表示与生物体中的一种ELP序列(包括天然存在的突变体)无关的氨基酸序列。

在第二个方面中，本发明涉及编码ELP蛋白质的核酸序列。本发明还包括确实导致ELP氨基酸序列变化的DNA序列多态性。本领域熟练技术人员将认识到，由于天然等位基因变异，在指定物种的个体中，编码具有ELP多肽活性的多肽的核酸中可以有一个或多个核苷酸(可多达大约3-5％的核苷酸)中存在这些变异。编码epsin样蛋白质的活性片段的核酸片段也属于本发明的范围之内。在用于本文时，elp基因片段指核苷酸数目少于编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所列ELP完整氨基酸序列的核苷酸序列的核酸，然而优选编码保留全长蛋白质的一些生物学活性或者在存在合适激动剂/拮抗剂时恢复一些生物学活性的肽。本发明范围内的核酸片段包括那些能够在高或中严谨条件下与来自其它物种的核酸杂交的核酸片段，用于在筛选方案中检测并分离其它elp等位基因和/或同系物，以及那些能够与来自人样品的核酸杂交的核酸片段，用于检测编码ELP蛋白质(包括其它异构体，如mRNA剪接变体)的核酸的存在。本发明范围内的核酸还可包含接头序列、经修饰的限制性内切核酸酶位点、以及对选定多肽的重组形式的分子克隆、表达或纯化有用的其它序列。

在另一个方面中，本发明涉及用于确定受试者如人患者是否有风险患上特征为有害细胞增殖或异常分化控制的疾病的方法。该方法包括在受试者的组织样品中检测特征为epsin样基因中的至少一处突变或epsin样基因错误表达的遗传损伤的存在与否。

作为例证，可以由本发明的基因生成核苷酸探针以便于对完整组织和组织样品进行组织学筛选，以确定ELP编码转录本存在与否。针对ELP信使或基因组ELP序列的探针可用于在肿瘤或增生性疾病(如有害细胞生长)中可能显示的等位基因突变的预测性和治疗性评估。寡核苷酸探针可有助于确定可能涉及与epsin样蛋白质表达(或其缺乏)有关的一些异常的发育紊乱的分子基础。例如，可以将多肽合成中的变化与编码序列中的变异区分开。

例如，通过比较肿瘤组织与正常组织中ELP RNA表达的点印迹实验，可以在几种癌症，特别是肺癌样品、肾癌样品、和胃癌样品中发现ELP RNA的显著下调。

在优选实施方案中，诊断方法的特征是包括：在受试者(如人患者)的组织样品中检测特征为下述中至少其一的遗传损伤的存在与否：(1)编码epsin样蛋白质的基因的突变或(2)epsin样蛋白质的错误表达。作为例证，可以通过确定下述中至少一项的存在与否来检测这些遗传损伤：(1)编码epsin样蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的删除、(2)编码epsin样蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的添加、(3)编码epsin样蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的替代、(4)编码epsin样蛋白质的基因的总染色体重排、(5)编码epsin样蛋白质的基因的信使RNA转录本水平的总改变、(6)编码epsin样蛋白质的基因的信使RNA转录本的非野生型剪接模式的存在、(7)epsin样蛋白质的非野生型水平、和(8)elp基因5′非翻译区或3′非翻译区中的突变。

在本发明的一个方面中，提供了探针/引物，其中包含含有能够与SEQ ID NO：1的有义或反义序列或其天然突变体或者与本发明基因天然有关的5′或3′侧翼序列或内含子序列杂交的核苷酸序列区域的寡核苷酸。将探针暴露于组织样品的核酸；并检测探针与样品核酸的杂交。在某些实施方案中，损伤的检测包括在聚合酶链式反应(PCR)(参阅如美国专利号4,683,195和4,683,202)中或者在连接链式反应(LCR)(Landegren、Kaiser等人，1988；Nakazawa、English等人，1994)中使用探针/引物，其中后者可能对于检测基因中的点突变特别有用。或者，可以采用免疫测定法来测定蛋白质水平。

在一个优选实施方案中，elp基因中的突变位于ENTH结构域编码区域、elp基因的5′非翻译区、或与ENTH结构域紧邻的基因区域中。

例如，通过使用由ELP蛋白质衍生的免疫原，如基于cDNA序列，可以通过标准方案生成抗蛋白质/抗肽抗血清或单克隆抗体(Harlow和Lane，1988)。可以用免疫原性形式的肽(如脊椎动物多肽或能够引发抗体应答的抗原性片段)免疫哺乳动物，诸如小鼠、仓鼠、或兔。用于赋予蛋白质或肽以免疫原性的技术包括与载体的缀合或本领域众所周知的其它技术。可以在存在佐剂时施用ELP蛋白质的免疫原性片段。可以通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测免疫过程。可以免疫原作为抗原，使用标准ELISA或其它免疫测定法来评估抗体水平。

在一个优选实施方案中，抗体对于脊椎动物诸如哺乳动物的ELP蛋白质的抗原性决定簇具有免疫特异性。用ELP蛋白质的抗原性制剂免疫动物后，可以获得抗ELP抗血清，如果需要，还可以由血清分离多克隆抗ELP抗体。为了生成单克隆抗体，可以由免疫动物收获抗体生成细胞(淋巴细胞)，并通过标准体细胞融合流程与永生化细胞诸如骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤细胞。这些技术在本领域是众所周知的，包括例如杂交瘤技术(最初由(Kohler和Milstein，1983)开发)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbar，1983)、和用于生成人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，1985)。可以在免疫化学上对杂交瘤细胞筛选与ELP蛋白质特异反应的抗体的生成，并由包含这些条交瘤细胞的培养物分离单克隆抗体。

术语抗体在用于本文时意欲包括其也可与一种ELP多肽特异反应的片段。可以使用常规技术将抗体片段化，并以与上文关于完整抗体所述相同的方式对片段筛选效用。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体来生成F(ab)₂片段。可以处理由此生成的F(ab)₂片段，以还原二硫键而生成Fab片段。本发明的抗体还意欲包括双重特异性嵌合分子，它具有由该抗体的至少一个CDR区赋予的对ELP蛋白质的亲和力。

针对ELP多肽或ELP变体的单克隆和多克隆抗体(Ab)以及抗体片段诸如Fab和F(ab)₂可用于阻断一种或多种ELP蛋白质的作用，并能够用于研究这些蛋白质在例如胚胎发生和/或不同组织维持中的作用。在一种相似方法中，可以将生成抗ELP单克隆抗体的杂交瘤或其中悬浮有抗ELP抗体的生物可降解凝胶植入意欲阻断ELP作用的区域内或其附近部位。这种性质的实验有助于阐述可能涉及生长调控的这种和其它因素的作用。抗体也非常适合于作为工具用于鉴定与ELP蛋白质有关的疾病或其素质的诊断测定法中，如通过检测ELP蛋白质表达的减弱或增强，通过检测ELP蛋白质的细胞错误定位，或者通过检测个体的组织或体液样品如血液中的异常ELP蛋白质来进行。所述异常形式的ELP蛋白质可能是例如不完全或不同剪接的结果，所生成的较短或较长的ELP蛋白质具有与野生型ELP蛋白质相比有所增强或减弱或不同的活性。此外，所述异常ELP蛋白质形式可以是嵌合蛋白，其中全长ELP蛋白质或其片段与另一种蛋白质或其片段融合。所述嵌合蛋白可以来自例如两种基因之间的删除，或者是基因组重排的结果。本领域熟炼技术人员知道使用抗体在组织和/或体液样品中检测蛋白质的合适方法。所述方法包括但不限于Western印迹、酶联免疫吸收测定法(ELISA)、基于细胞的ELISA、免疫沉淀、带或点印迹、放射免疫测定法、和荧光免疫测定法。

在另一个方面中，本发明涉及本发明的蛋白质和/或核酸(无论是全长或是期望片段)用于与ELP有关的过度增殖疾病的基因疗法的用途。本领域技术人员可以容易的选择用于投递的适当载体。可以容易的由多种来源获得基因治疗载体，包括例如腺伴随病毒(国际专利申请号PCT/US91/03440)、腺病毒载体(Ishibashi、Brown等人，1993；Kay、Landen等人，1994)、或其它病毒载体，如各种痘病毒、牛痘、等。用于插入期望基因如BAP-1并获得所编码蛋白质的体内表达的方法对于本领域技术人员而言是众所周知的。

本发明的蛋白质和/或核酸也适合于过度增殖疾病的治疗，如采取药物制剂的形式。如果需要，药物制剂可以与辅助性试剂混合，如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于调整渗透压的盐、缓冲剂、染料、香料和/或芳香剂等等不与活性化合物发生有害反应的物质。

可以通过注射(即皮下、静脉内、肌肉内、肿瘤内、腹膜内，优选肌肉内)、口服、吸入、经皮应用、局部施用、或直肠施用来施用蛋白质，优选注射、经皮或局部施用。根据施用路径，可以将制药学组合物中的肽包被在某种材料中以保护它们免于某些酶的作用。本领域熟练技术人员熟悉适合于将肽投递至特定部位的包被层。组合物中还可以包含有机物以延长肽的药理学作用。这些有机物的范例包括非抗原性明胶、羧甲基纤维素、藻酸的磺酸或磷酸酯、葡聚糖、聚乙二醇和其它乙二醇、植酸、聚谷氨酸、和鱼精蛋白。

出于治疗目的，同样可以以与适当载体分子的缀合物的形式施用活性ELP肽或其片段。载体分子能够增强细胞对ELP肽的摄取而进入细胞和/或将ELP肽投递至特定靶细胞如肿瘤细胞。合适的载体分子是例如转铁蛋白或病毒的细胞侵入蛋白。

本发明还涉及可用于下调ELP分子在细胞中的表达的反义分子。反义试剂可以是反义寡核苷酸(ODN)、尤其是具有来自天然核酸的化学修饰的合成ODN、或将这些反义分子表达成RNA的核酸构建物。反义序列与靶基因的mRNA互补，并抑制靶基因产物的表达。反义分子通过多种机制抑制基因表达，如通过降低可用于翻译的mRNA的量、通过激活RNA酶H、或者通过空间位阻。可以施用反义分子之一或组合，其中组合可以包含多种不同序列。

可以通过在适当载体中表达所有或部分靶基因序列来生成反义分子，其中转录起始的朝向使得将反义链生成RNA分子。或者，反义分子是合成寡核苷酸。反义寡核苷酸的长度一般是至少大约7个、常常是至少大约12个、更常见的是至少大约20个核苷酸，而且长度不超过大约500个、常常不超过大约50个、更常见的是不超过大约35个核苷酸，其中长度受到抑制效率、特异性(包括交叉反应性的缺乏)、等等的限制。已经发现长度为7-8个碱基的短寡核苷酸可以是基因表达的有效选择性抑制剂(参阅(Wagner、Matteucci等人，1996))。

本发明的另一个方面涉及通过RNA干扰(RNAi)手段使elp基因发生转录后沉默。RNAi是已经在植物、线虫、无脊椎动物生物体和哺乳动物细胞培养物中发现的由短双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默的一种形式(Ngo、Tschudi等人，1998；Vaucheret和Fagard，2001；Kennerdell和Carthew，1998；Caplen、Fleenor等人，2000；Elbashir、Harborth等人，2001；Timmons、Court等人，2001)。双链RNA(dsRNA)显示可诱导降解反应，其中与短dsRNA互补的单链RNA快速降解(Montgomery和Fire，1998；Montgomery、Xu等人，1998)。RNAi由此可用于降低基因表达，例如在完整生物体或者无脊椎动物和脊椎动物细胞系中的基因表达(Kennerdell和Carthew，1998；Caplen、Fleenor等人，2000；Clemens、Worby等人，2000；Elbashir、Harborth等人，2001)。可以由cDNA或基因组DNA模板生成ELP dsRNA，只要dsRNA中的大部分对应于外显子区域即可。通常，700-800碱基对的靶区域是活性最高的。然而，已知短至200碱基对和长至2000碱基对的dsRNA也具有有力的干扰活性。可以由每一端都包含例如T7、SP6、或T3启动子的PCR片段同时合成RNA的两条链。可以通过用包含例如T7聚合酶结合位点的2种引物扩增ELP cDNA或基因组DNA来生成这种PCR片段。然后可以用包含ELP序列的合适模板进行PCR反应。Taq聚合酶生成最高产量，但是也可以使用另一种聚合酶像Pfu。前10个循环应当包含40℃退火步骤，随后的35个循环包含55℃退火步骤。需要时，可以添加DMSO至终浓度5％。苯酚-氯仿抽提和NH₄OAc中的乙醇沉淀可用于将PCR模板与反应混合物分离，然而也可以使用其它商品化PCR纯化试剂盒。可以在含1μg PCR DNA模板的50μl体积中使用适当的RNA聚合酶进行RNA合成反应。购自Ambion的MEGAscript^TM试剂盒效果很好。RNA在合成反应过程中变成双链。可以用不含RNA酶的DNA酶除去DNA模板，并且可以通过酚-氯仿抽提和乙醇沉淀来纯化dsRNA。来自1μgDNA模板的常规RNA产量范围为80-120μg。dsRNA可以作为NaOAc/乙醇沉淀保存于-80℃直至使用。

可以通过在TBE中进行非变性琼脂糖凝胶电泳来监测dsRNA的质量。只能使用其中大部分RNA的电泳迁移率都转变成适当长度dsRNA的期望迁移率(非常接近双联体DNA迁移率)的制剂。为了降低哺乳动物细胞中的ELP表达，应当优先使用20-23mer的短dsRNA(Elbashir、Harborth等人，2001；Elbashir、Lendeckel等人，2001)。这些短dsRNA具有(Elbashir、Harborth等人，2001)中描述的3′突出，而且可以通过标准方法在体外合成。

可以在文献中找到用于将dsRNA导入细胞的几种方法，而且所述方法对于本领域熟炼技术人员而言是知道的。

现在通过实施例的手段进一步例示本发明。

提供这些实施例只是作为本发明各个方面的例示，而不应当认为是以任何方式限制本发明。

实施例

为了鉴定特异性地参与细胞、组织和生物体水平上的生长的基因，发明人在果蝇中采用了遗传方法。他们在基因组范围内筛选阻碍或促进细胞生长且不影响细胞分化的隐性突变。这些筛选利用了生成遗传嵌合果蝇的组织特异性重组系统(Newsome、Asling等人，2000)。这些果蝇对于头部组织中的随机诱导突变而言是纯合的，但是对于身体和种系中的相同突变而言是杂合的。其产物选择性促进生长的基因(致癌基因)中的突变将生成小头果蝇，而其产物发挥生长抑制功能的基因(肿瘤抑制基因)中的突变将生成头比正常大的果蝇。

这种筛选的有效性通过鉴定编码雷帕霉素作用靶(TOR)的基因中引起小头表型的突变和编码肿瘤抑制基因PTEN的基因中引起大头表型的突变而得到例证(Huang、Potter等人，1999；Oldham、Montagne等人，2000)。

实施例1：针头筛选(pinhead screening)

胰岛素受体信号途径的成分中的突变以细胞自主方式削弱细胞生长(Bohni、Riesgo-Escovar等人，1999；Verdu、Buratovich等人，1999；Weinkove、Neufeld等人，1999；Brogiolo、Stocker等人，2001)。突变细胞的克隆具有严重的生长缺陷，而且与它们的野生型姐妹克隆相比显得较小。如果通过持续提供flp重组酶来促使有丝分裂重组的发生而且通过细胞致死突变的手段消除姐妹克隆，那么这些克隆可能覆盖整个器官的实质部分。在无眼调控序列的控制下驱动flp重组酶的表达导致只在眼成虫盘中形成组织特异性克隆。联合同源染色体上的细胞致死突变后，该系统能够生成主要由对于目的基因而言是纯合突变体的细胞组成的眼和头壳(Newsome、Asling等人，2000)。这些在眼成虫盘的后代中特异缺乏IRS同系物Chico或胰岛素受体(Inr)的功能的嵌合果蝇显示非常有特点的表型。尽管它们的身体是正常大小的，但是眼和头显著缩小(Bohni、Riesgo-Escovar等人，1999；Brogiolo、Stocker等人，2001)。为了根据相似表型鉴定生长调控基因中的突变，将在第3条染色体右臂基部附近携带flp重组酶靶位点的雄性果蝇(82FRT)进行EMS诱变并与引入以下四种元素的雌性果蝇进行杂交：重组酶(ey-flp)来源、对应位置的FRT位点、显性眼标记(w+)和细胞致死突变(c13R3)。在F1代的嵌合果蝇中，可以在头和眼中观察到在3R上最新诱导的突变的纯合性的结果。易于通过丧失色素标记w+而导致白眼组织来显现纯合突变组织的存在。

筛选嵌合果蝇

依照标准方案，用33mM EMS喂养第3条染色体右臂携带FRT位点的雄性果蝇(FRT82；Xu和Rubin，1993)，并与基因型y w ey-flp；FRT82w+c13R3/TM6B y+的雌性果蝇交配。c13R3是已经在FRT82 w+染色体上生成的隐性细胞致死突变(Newsome、Asling等人，2000)。半数F1后代的基因型是y w ey-flp/+或Y；FRT82^*/FRT82 w+c13R3，并对异常大小的眼和头进行评分。将阳性后代与y w ey-flp；FRT82 w+c13R3/TM6B y+回交以检查种系传递。筛选了大约50,000只嵌合果蝇以达到饱和，鉴定了引起大头表型的69种突变。

互补组分析

引起大头表型的69种突变中的52种归入9个互补组。互补组定义为一些(至少两个)等位基因，它们的任何成对组合都不能弥补与每个等位基因的纯合性有关的致死性。属于这些互补组中四个组的突变导致过度增殖表型：超额数小眼引起褶的形成，使眼产生肿瘤外观(图1，右图)。

减数分裂和SNP作图

显示过度增殖表型的四个互补组之一由四个等位基因组成。使用下面的遗传标记对一个代表性等位基因进行减数分裂作图：在细胞学位置87E携带P元件的微型w+、在90E携带P元件的w+、和在96E携带P元件的y+(Xu和Rubin，1993)。使用相同区域内的缺陷通过互补分析确认该粗略的作图定位并精制。通过评估等位基因与附近经标记P元件插入片段之间的重组频率来进行更高限制性的作图。用于作图的P元件是EP(3)0738(94A1-2)、1(3)j5B5(94A1-2)和1(3)L3560(94A5-7)。通过这种方式，能够将突变的遗传位置缩小至染色体位置94A，极其接近P元件插入点1(3)L3560。

遗传分析将突变位点定位于支架AE003738内大约120kb(第344000-464000位核苷酸)的300kb间隔中。为了明确测定突变的分子位点，使用SNP作为该特定区域内的分子标记对重组体作图。使用WAVE系统(Underhill，Jin等人，1996)通过变性HPLC分析来解析SNP。将突变位点缩小至30kb间隔。使用WAVE系统通过分析候选基因及随后的测序鉴定了突变的准确位置。

实施例2：ELP在黑腹果蝇中的表达

可以在果蝇中在整个生物体中、在特定器官中、或在特定细胞类型中在整个生命过程中或只在特定发育阶段以不同水平表达特定转基因。可以在(Brand，1993；Perrimon，1998；Perrimon，1998)中找到果蝇遗传学中所使用的标准方法的综述。作为推定的肿瘤抑制基因，预计野生型或突变型ELP蛋白质的过度表达会干扰生长。为了证明这个假设，将携带UAS转基因(编码野生型果蝇ELP蛋白质)的转基因果蝇与在不同组织特异性启动子控制下表达Gal4的果蝇交配(图6和表2)。Gal4驱动的构建物包括但不限于无眼-Gal4、残翅-Gal4(vestigal-Gal4)、MS1096-Gal4(Capdevila和Guerrero，1994)。通过相似方式，有可能测试具有氨基酸替代或内部删除的突变型蛋白质的功能。

	GMRGal4	eyGal4	C765Gal4	MS1096	apGal4	armGal4	daGal4
	GMRGal4	eyGal4	C765Gal4	MS1096	apGal4	armGal4	daGal4	X上的3.15	眼粗糙	vs eyeomm#↓	生育能力低下，+/-veins	生育能力低下，ru.wings	致死	no vis.ph.	致死
III上的3.24B	眼粗糙	vs eyeomm#↓	生育能力低下，+/-veins	生育能力低下，ru.wings	致死	no vis.ph.	致死	X上的3.15	眼粗糙	vs eyeomm#↓	生育能力低下，+/-veins	生育能力低下，ru.wings	致死	no vis.ph.	致死

表2：DELP在不同组织中的过度表达

将携带delp的两个独立插入片段的转基因果蝇分别与第一行所示Gal4来源交配，从而在各种组织中过度表达dELP。缩写：vs eye omm#↓：眼很小，复眼数目减少；+/-veins：翅脉增加或减少；ru.wings：残翅，很小；no vis.ph.：无可见表型。

根据通过过度表达野生型(见图6)或突变型ELP获得的可见表型，该系统可用于进行ELP蛋白质的结构/功能分析。这种表型还可用于筛选其它基因中导致表型抑制的功能突变的显性或隐性丧失。或者，可以使用增强子-启动子(EP)元件(Rorth，1996)筛选过度表达时抑制表型的基因。在这种情况中，随机基因的过度表达是通过将EP元件整合到该基因的5′端引起的。

实施例3：人同源物的克隆

通过使用程序Blastp( http：//www.ch.embnet.org/software/aBLAST.html)对公开的序列数据库搜索与dELP序列具有同源性的预测编码序列和表达序列标签(EST)，鉴定了人ELP(hELP)(SEQ IDNO：1、2、5)。dELP对染色体V上的预测基因和几个EST显示统计学上显著的相似性。由来自Resgen(编号AL529948克隆IDCD0DD005YJ09文库LTI NFL001 NBC4)的全长人cDNA克隆集合获得了hELP全长cDNA。这些cDNA集合衍生自使用寡聚dT引物和SuperscriptII逆转录酶构建的文库。装配过程之后，通过与基因组DNA序列和公开数据的交叉检查而确认了序列。

为了确认果蝇与人ELP之间的功能同源性，将人和果蝇全长ELPcDNA克隆到果蝇表达载体中，像pUAS转化载体(Phelps和Brand，1998)。可以依照(Basler和Hafen，1988)中描述的方法生成转基因果蝇。转基因交配到对于两个elp突变型等位基因之任一而言为反式杂合的果蝇中，其中还包含能够普遍或组织和/或阶段特异表达UAS-转基因的Gal4转基因。该Gal4转基因包括但不限于肌动蛋白-Gal4、微管蛋白-Gal4、和热休克-Gal4。如表1所示，由幼虫晚期至蛹阶段，果蝇和人转基因的普遍表达确实至少部分挽救了与elp突变型等位基因的反式杂合性有关的致死性。这说明help基因是果蝇elp基因的功能同源物(见图6)。

基因型缩写	于25℃挽救	于18℃挽救
基因型缩写	于25℃挽救	于18℃挽救	5.20d/hsGal4；Delp^1U1/Delp^2w2	非Tb蛹	-
2.4a/armGal4；Delp^1U1/Delp^2w2	1非Tb蛹	无后代	5.20d/hsGal4；Delp^1U1/Delp^2w2	非Tb蛹	-
2.4a/armGal4；Delp^1U1/Delp^2w2	1非Tb蛹	无后代	2.4a/hsGal4；Delp^1G1/Delp^4K2	小的非Tb蛹	非Tb蛹
2.4a/Act5CGal4；Delp^1U1/Delp^2w2	很少后代	-	2.4a/hsGal4；Delp^1G1/Delp^4K2	小的非Tb蛹	非Tb蛹
2.4a/Act5CGal4；Delp^1U1/Delp^2w2	很少后代	-	5.20d/arm Gal4；Delp^1G1/Delp^4K2	小的非Tb蛹	-
5.20d/armGal4；Delp^1U1/Delp^2w2	小的非Tb蛹	小的非Tb蛹	5.20d/arm Gal4；Delp^1G1/Delp^4K2	小的非Tb蛹	-
5.20d/armGal4；Delp^1U1/Delp^2w2	小的非Tb蛹	小的非Tb蛹	5.20d/Act5CGal4；Delp^1G1/Delp^4K2	MKRS/elp y^-出现	MKRS/elp y^-出现

表1：通过普遍存在的ELP过度表达对delp等位基因的挽救分析

将UAS-Elp转基因用于在反式杂等位基因纯合突变的情况中过度表达Elp。所用UAS-Elp转基因：2.4a：UAS-hElp18aa；5.20d：UAS-DElp-ENTH。所用Elp等位基因：Delp^1G1：V266F突变；Delp^4K2：E27G突变；Delp^1U1：5′UTR转变；Delp^2W2：5′UTR转变。所用Gal4来源：armGal4：犰狳Gal4；hsGal4：热休克Gal4；Act5CGal4：肌动蛋白5C-Gal4。UAS转基因和Gal4株用w⁺标记。

或者，可以在包含微管蛋白启动子的转化载体的下列序列中插入果蝇和人全长cDNA：微管蛋白启动子-FRT-cDNA终止子-FRT-Gal4(缩写：tub：＞cDNA＞Gal4)。通过这种方式，挽救转基因受到微管蛋白启动子的直接控制，导致ELP表达的生理学水平低于或可能高于Gal4体系。另外，在ELP突变体背景中，可以通过在热休克诱导型启动子或组织特异性启动子的控制下表达FLP重组酶而在细胞克隆中切除elpcDNA。以这种方式生成的突变细胞可以通过UAS-GFP报道分子的手段得到识别，因为在这些细胞中Gal4是由微管蛋白启动子驱动的。Kramps等人(Cell，109：47-60，2002)最近描述了这种方法。

实施例4：ELP DNA作为杂交探针的用途

下面的方法描述了elp的非重复性核苷酸序列作为杂交探针的用途。该方法还可用于筛选ELP同系物。采用包含elp序列(如SEQ ID NO：1和3所示)的DNA作为探针，用于筛选同源DNA(诸如cDNA或基因组文库中所包含的)。

在标准的高严谨度条件(Sambrook、Fritsch等人，1989)下进行包含文库DNA的滤膜的杂交和清洗。阳性克隆可用于进一步筛选更大的cDNA文库平板。随后将代表性cDNA克隆克隆到pBluescript(pBS，Stratagene)或相似克隆载体中，并测序。

实施例5：elp作为杂交特征用于原位杂交的用途

可以如(Tautz和Pfeifle，1989)所述在胚胎中进行果蝇elp mRNA的原位杂交。然而，进行微小修改后，它还可用于在果蝇或脊椎动物组织切片中检测任何mRNA转录本。例如使用DIG RNA标记试剂盒(SP6/T7)(Boehringer Mannheim)或³²P标记法，遵循制造商的建议，可以由线性化elp cDNA或其片段制备经标记RNA探针。使用help作为杂交探针，可用类似方法筛选人组织(见图4和5)。

实施例6：ELP蛋白质在大肠杆菌中的表达

下面的方法描述了ELP在细菌细胞中的重组表达。或者，可以由昆虫和哺乳动物细胞生成并分离重组蛋白(Sambrook、Fritsch等人，1989)。将编码全长或截短ELP形式的DNA融合在诱导型细菌表达载体所包含的表位标签或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)cDNA和凝血酶切割位点的下游。这些表位标签包括聚组氨酸、S蛋白质、硫氧还蛋白、和免疫球蛋白标签。可以采用多种质粒，包括商品化的质粒，诸如pGEX-4T(Pharmacia)。

简而言之，通过常规方法将包含ELP序列(例如与GST序列融合)的细菌表达质粒转化到蛋白酶缺陷的大肠杆菌中，诸如BL21(如Stratagene)。然后将包含质粒的细菌菌落在选择培养基中扩增过夜以达到饱和。第二天上午，将此培养物1∶100稀释，并使细菌生长至光密度(OD600)为0.6。添加控制GST-ELP融合蛋白表达的启动子的诱导剂来启动蛋白质生成。根据所用表达载体可以采用多种诱导剂，包括IPTG。

然后可以纯化表达的GST标记-ELP，例如使用亲和珠或亲和层析，诸如谷胱甘肽珠(如购自Pharmacia)。如下通过裂解表达Lgs的细菌来制备提取物，即将细胞悬浮于超声处理缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA、1.5％肌氨酰、2％屈力通-X-100、1mMDTT和蛋白酶抑制剂)中，随后在冰上短暂超声处理(如3次，每次20秒，中等力度)，并离心。然后将澄清的上清液在温和旋转下例如与谷胱甘肽珠一起于4℃保温1小时。接着将珠用清洗缓冲液(20mMTris-HCl pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM MgCl₂、0.5％NP40)清洗几次，并最终保存于储存缓冲液(20mM Tris-HClpH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM MgCl₂、10％甘油、0.5％NP40、和蛋白酶抑制剂)中。或者，可以使用Ni²⁺螯合物亲和层析或者使用蛋白A或蛋白G柱层析而分别纯化组氨酸标记或IgG标记的ELP。

可以通过例如SDS凝胶电泳和银染或Western印迹来检查制剂的质量。

在必须切除所标记的表位的情况下，根据标记的表位与ELP蛋白质之间存在的切割位点可以使用几种方法。例如，有可能生成正好在ELP第一个氨基酸之前包含凝血酶切割位点的GST-ELP融合蛋白。简而言之，将谷胱甘肽亲和珠上的GST-ELP制剂用切割缓冲液(50mMTris-HCl pH7.0、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT)清洗几次。然后添加凝血酶，并将样品于室温保温超过16小时。然后收集上清液，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染或Western印迹分析对来自珠的ELP的成功切割。如(Harlw和Lane，1988)中所述，纯化的蛋白质可用于例如生成抗ELP抗体。

实施例7：涉及ELP的蛋白质-蛋白质相互作用

体外免疫共沉淀测定法可用于寻找或确认ELP相互作用配偶体。例如，通过脂转染方法转化50％汇合的HEK293细胞。为此目的，遵循制造商的建议，将包含编码经标记的ELP和潜在相互作用配偶体的cDNA的哺乳动物表达载体与Lipofectamine转染试剂(Life Technologies公司)混合，并覆盖到细胞单层上。转染25小时后，在co-IP缓冲液(20mMTris-HCl pH7.5、140mM NaCl、1.5mM MgCl₂、1mM EDTA、1mM DTT、1％屈力通-X-100、10％甘油、1mM钒酸钠、50mM NaF、和蛋白酶抑制剂)中裂解细胞。在co-IP中使用与蛋白质G-琼脂糖(BoehringerMannhaim)缀合的抗标记抗体(如抗HA，克隆3F10，BoehringerMannheim)进行免疫沉淀。使用大鼠或小鼠IgG(Sigma-Aldrich)进行对照免疫沉淀。于4℃保温3小时后，将珠用清洗缓冲液(20mMTris-HCl pH7.5、140mM NaCl、1.5mM MgCl₂、1mM EDTA、1mM DTT、1％屈力通-X-100、1mM钒酸钠、50mM NaF)清洗4次，并重悬于25μlLaemmli缓冲液中。通过SDS-PAGE/免疫印迹测定法使用由本发明提供的抗ELP多克隆抗体或抗标签抗体及随后的与辣根过氧化物酶缀合的二抗(Amersham Pharmacia Biotech)分析免疫复合物。可以使用增强的化学发光检测方法(如ECL，Amersham Pharmacia Biotech)来进行检测。

可以进行GST融合蛋白体外结合测定法来例如对结合结构域作图、确认相互作用配偶体、或寻找额外的相互作用蛋白质。为此目的，遵循制造商提供的指示，使用包含[³⁵S]甲硫氨酸的网织红细胞裂解物(TNT-裂解物，Promega Corporation)在体外翻译(IVT)蛋白质。将如实施例6所述生成的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白固定在谷胱甘肽-Sepharose上并在结合缓冲液(20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、1mMEDTA、1mM DTT、1mM MgCl₂、10％甘油、0.5％NP40、0.05％BSA、和蛋白酶抑制剂)中封闭45分钟。然后将2μg固定化的GST蛋白质与0.5-4μl IVT蛋白质在结合缓冲液中一起保温1.5小时。将珠用清洗缓冲液(20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mMMgCl₂、0.5％NP40)清洗4次，并在Laemmli SDS样品缓冲液中煮沸。必须通过SDS-PAGE分析分别使用考马斯染色或放射自显影确认使用了等量的完整GST融合蛋白与cDNA的成功IVT。

可额外进行酵母双杂交测定法，以确认上文所述体外结合测定法的结果，或者用于对cDNA文库筛选新的相互作用配偶体(Fields和Sternglanz，1994)。为了确认特异结合或定位ELP与相互作用配偶体之间的结合区域，将期望cDNA亚克隆到将其连接Lex DNA结合结构域(如pLexA，Clontech)或酸激活结构域(如pGJ4-5，Clontech)的适当酵母表达载体中。然后通过醋酸锂-聚乙二醇法将适当的质粒对与报道质粒(如pSH18-34，Clontech)一起转化到适当酵母菌株(如EGY48)中并在选择性培养基上进行培养(Sambrook、Fritsch等人，1989)。如所用载体-报道质粒的制造商所述分析转化子的报道基因活性。为了确定重复性，在两个方向上都测试相互作用。

为了分离新的ELP结合蛋白(Bartel、Fields，《The Yeast two-HybridSystem》即《酵母双杂交系统》，Oxford UP，1997)，用β-半乳糖苷酶报道质粒、与LexA DNA结合结构域序列融合的包含ELP cDNA或其部分的酵母表达载体(“诱饵载体”)以及包含与cDNA序列集合融合的转录激活结构域的第二种酵母表达载体(“猎物载体”库，如RFLY10-12h胚胎文库，PNAS，93，3011及其后中所述)转化适当酵母菌株。然后将包含报道质粒以及诱饵和猎物载体的三重转化子在选择性培养基上进行培养，并选择营养缺陷型和β-半乳糖苷酶报道分子的相互作用依赖性激活。由选择的克隆再次分离各个猎物构建物，并通过检查不存在与无关诱饵构建物的相互作用来评估诱饵/猎物相互作用的特异性。最后，将经过确认的相互作用物测序，装配全长cDNA，并再次测试与诱饵的特异相互作用。

实施例8：免疫组织化学

可以使用本发明提供的抗ELP抗体在果蝇胚胎、成虫盘、成熟组织切片、脊椎动物肿瘤细胞系、或脊椎动物组织上进行ELP蛋白质的定位。例如，若使用经转化细胞系像HEK293细胞(ATCC)，则将细胞接种到用聚赖氨酸包被的8孔板(Nalge-Nunc国际公司)中，并于37℃培养过夜。第二天，将细胞用3.7％甲醛在PBS中固定10分钟，在0.5％屈力通-X-100中透化处理10分钟，并用1∶1000稀释的预免疫血清在2％BSA-PBS中于室温封闭1小时。然后将细胞与1∶2000稀释的由本发明提供的抗ELP多克隆兔免疫血清于室温保温2小时。将载玻片用PBS清洗3次，每次5分钟，并与1∶200稀释(v/v)的与TRITC缀合的猪抗兔免疫球蛋白(Dako公司)一起保温。重复清洗步骤后，使用Vectashield封装介质(Vector Laboratories公司)覆盖盖玻片。作为特异染色的阳性对照，可以通过例如脂转染法用ELP表达质粒诸如pcDNA3.1(Invitrogen)转染部分细胞。转染后两天，如上所述用抗ELP抗体将对照细胞染色。

实施例9：RNA干扰实验

RNA干扰(RNAi)是已经在植物、线虫、无脊椎动物生物体和哺乳动物细胞培养物中得到描述的、由短双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默的一种形式(Ngo、Tschudi等人，1998；Vaucheret和Fagard，2001；Kennerdell和Carthew，1998；Caplen、Fleenor等人，2000；Elbashir、Harborth等人，2001；Timmons、Court等人，2001)。dsRNA显示可诱导降解反应，其中与短dsRNA互补的单链RNA快速降解(Montgomery和Fire，1998；Montgomery、Xu等人，1998)。RNAi由此可用于降低基因表达，例如用于降低完整生物体或者无脊椎动物和脊椎动物细胞系中的基因表达(Kennerdell和Carthew，1998；Caplen、Fleenor等人，2000；Clemens、Worby等人，2000；Elbashir、Harborth等人，2001)。可以在文献中找到用于将dsRNA导入细胞的几种方法。作为范例，我们在本文中描述了用delp dsRNA处理果蝇细胞。

制备ELP dsRNA

可以由cDNA或基因组DNA模板生成ELP dsRNA，只要大部分dsRNA对应于外显子区域即可。通常，700-800碱基对的靶区域是活性最高的。然而，已知短至200碱基对和长至2000碱基对的dsRNA也具有有力的干扰活性。可以由每一端都包含例如T7、SP6、或T3启动子的PCR片段同时合成RNA的两条链。可以通过用包含例如T7聚合酶结合位点的2种引物扩增ELP cDNA或基因组DNA来生成这种PCR片段。引物互补序列的长度应当是20-24个核苷酸，22个核苷酸是最佳的，且Tm为60℃是最佳的。每种引物的5′端应当对应于例如27个核苷酸的T7启动子序列。然后可以用包含ELP序列的合适模板进行PCR反应。Taq聚合酶生成最高产量，但是也可以使用另一种聚合酶像Pfu。前10个循环应当包含40℃退火步骤，随后的35个循环包含55℃退火步骤。需要时，可以添加DMSO至终浓度5％。苯酚-氯仿抽提和NH₄OAc中的乙醇沉淀可用于将PCR模板与反应混合物分离，然而也可以使用其它商品化PCR纯化试剂盒。可以在含1μg PCR DNA模板的50μl体积中使用适当的RNA聚合酶进行RNA合成反应。购自Ambion的MEGAscript^TM试剂盒效果很好。RNA在合成反应过程中变成双链。可以用不含RNA酶的DNA酶除去DNA模板，并且可以通过酚-氯仿抽提和乙醇沉淀来纯化dsRNA。来自1μg DNA模板的常规RNA产量范围为80-120μg。dsRNA可以作为NaOAc/乙醇沉淀保存于-80℃直至使用。

可以通过TBE中的非变性琼脂糖凝胶电泳来监测dsRNA的质量。只能使用其中大部分RNA的电泳迁移率都转变成适当长度dsRNA的期望迁移率(非常接近双联体DNA迁移率)的制剂。

将ELP dsRNA转染到果蝇S2细胞中

在补充10％FCS的Schneider S2果蝇培养基(GIBCO)中扩增S2细胞。转染前一天，将1百万个细胞接种到6孔板中，并于25℃培养过夜。然后使用阳离子脂质CellFectine(GIBCO)使用制造商方案的改版转染细胞。简而言之，将合计5μg DNA和dsRNA与20μl CellFectine脂质混合物在1.2ml无血清生长培养基(如DES表达培养基，Invitrogen，卡尔斯巴德，美国)中复合。将复合物于室温保温15分钟，然后加到细胞中，并用1ml无血清培养基更换普通的生长培养基。4小时后，向细胞中加入1.2ml补充30％FCS的生长培养基。转染后一天，用含10％FCS的新鲜培养基更换培养基。转染后2天开始可以对细胞进行测定(如ELP蛋白质水平或Tcf转录活性)。

类似的，可以使用(Elbashir、Harborth等人，2001)中描述的方法降低哺乳动物的ELP表达。

实施例10：候选辅助剪接变体和嵌合est的鉴定和克隆

在公开的est数据库中找到了ELP的两种人est异构体：短和长的形式。短的那种缺乏接近C末端的54个碱基，可能是由于不同或不全的剪接(图3)。通过标准分子生物学技术使用基因特异引物和est/cDNA克隆(短：BE615647、BE61693、BG528377；长：cDNA克隆AL529948)克隆这两种异构体。

help位于在一些类型的癌症中频繁删除的染色体区域5q中(Genomics，2000年5月15日，66(1)：26-34)。推测与特定综合症有关的这个染色体区域中遗传材料的丢失提示肿瘤发生的隐性机制，而且删除的染色体条带包含肿瘤抑制基因。ELP的生长抑制活性指示ELP可能是该区域中的肿瘤抑制基因。

为了支持这种假说，发明人通过对由公开数据库订购的一种hELPest进行完整测序找到了由h-ELP的C端与AF156165融合而组成的一种嵌合est，即通过对5q染色体区域作图而发现的一种基因(Genomics，2000年5月15日，66(1)：26-34)。h-ELP和AF156165分别位于区域5q23与5q33之间和5q31与5q32之间。嵌合est可能来自这两种基因之间的删除，并生成缺乏ENTH结构域的不全ELP蛋白质。

实施例11：正常与肿瘤组织中的ELP RNA表达

将癌症表征阵列(BD Biosciences目录编号7841-1)膜与5′标记的hELP探针(第751-1951位核苷酸)进行杂交。杂交在68℃依照制造商的建议进行，最后一次清洗使用0.2x SSC和0.5％SDS在68℃进行15分钟。样品参考见BD Bioscience产品目录。图5中显示了一组正常与肿瘤组织中ELP RNA表达的斑点印迹，显示hELP转录本的表达，下文表3概述了ELP表达升高或降低的肿瘤的百分比。

癌症类型	样品数目	减少^*	相同^*	增加^*
癌症类型	样品数目	减少^*	相同^*	增加^*	乳房	50	36％	46％	18％
子宫	42	19％	62％	19％	乳房	50	36％	46％	18％
子宫	42	19％	62％	19％	结肠	35	37％	60％	3％
胃	27	52％	37％	11％	结肠	35	37％	60％	3％
胃	27	52％	37％	11％	卵巢	14	43％	36％	21％
肺	21	76％	24％	0％	卵巢	14	43％	36％	21％
肺	21	76％	24％	0％	肾	20	60％	35％	5％
直肠	18	16％	78％	5％	肾	20	60％	35％	5％
直肠	18	16％	78％	5％	甲状腺	6	33％	50％	17％
前列腺	4	0％	100％	0％	甲状腺	6	33％	50％	17％
前列腺	4	0％	100％	0％	胰	1	100％	0％	0％
子宫颈	1	0％	100％	0％	胰	1	100％	0％	0％
子宫颈	1	0％	100％	0％	小肠	2	50％	50％	0％

^*肿瘤与正常组织相比

表3：图5数据的概述

在大多数肺、肾、和胃癌样品中观察到help mRNA表达相对于它们各自正常组织显示降低。在所有肺癌的3/4左右和超过1/2的肾和胃癌样品中发现ELP RNA下调(指示潜在的肿瘤抑制功能：“肿瘤希望摆脱它”)。

尽管显示并描述了本发明的当前优选实施方案，需要清楚理解的是本发明不限于这些实施方案，而是可以在下列权利要求的范围内以其它方式多种多样的体现和实践本发明。

本文完整收录贯穿整篇说明书所引用的所有文献/发表物的公开内容作为参考。

参考文献

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序列表

<110> The Genetics Company

<120> 生长调控蛋白质

<130> 06259PC

<160> 5

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2096

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (76)..(1950)

<223>

<400> 1

ggcacgaggc ggaagtgttc cggggtccgt ggggagcagg agagggaggc ggcggaccgt 60

cccgcgcggg gcacg atg ttg aac atg tgg aag gtg cgc gag ctg gtg gac 111

Met Leu Asn Met Trp Lys Val Arg Glu Leu Val Asp

1 5 10

aaa gcc acc aat gtt gtt atg aat tat tca gag atc gag tct aag gtt 159

Lys Ala Thr Asn Val Val Met Asn Tyr Ser Glu Ile Glu Ser Lys Val

15 20 25

cga gag gca acg aac gat gat cct tgg gga cct tct ggg caa ctc atg 207

Arg Glu Ala Thr Asn Asp Asp Pro Trp Gly Pro Ser Gly Gln Leu Met

30 35 40

gga gag att gcc aag gct aca ttt atg tat gaa caa ttt cca gaa ctt 255

Gly Glu Ile Ala Lys Ala Thr Phe Met Tyr Glu Gln Phe Pro Glu Leu

45 50 55 60

atg aac atg ctt tgg tca cga atg tta aaa gac aac aaa aag aat tgg 303

Met Asn Met Leu Trp Ser Arg Met Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asn Trp

65 70 75

aga aga gtt tat aag tcg ttg ctg ctc cta gct tac ctc ata agg aat 351

Arg Arg Val Tyr Lys Ser Leu Leu Leu Leu Ala Tyr Leu Ile Arg Agn

80 85 90

gga tca gag cgt gtt gtt aca agt gcc aga gaa cac att tat gat tta 399

Gly Ser Glu Arg val Val Thr Ser Ala Arg Glu His Ile Tyr Asp Leu

95 100 105

cga tcc ctg gaa aat tac cac ttt gta gat gag cat ggt aag gat caa 447

Arg Ser Leu Glu Asn Tyr His Phe Val Asp Glu His Gly Lys Asp Gln

110 115 120

ggt ata aat att cga cag aag gtg aag gaa ttg gtt gaa ttt gcc cag 495

Gly Ile Asn Ile Arg Gln Lys Val Lys Glu Leu Val Glu Phe Ala Gln

125 130 135 140

gat gac gac agg ctt cgt gaa gag cga aag aaa gca aag aag aac aaa 543

Asp Asp Asp Arg Leu Arg Glu Glu Arg Lys Lys Ala Lys Lys Asn Lys

145 150 155

gac aag tat gtt ggg gtt tcc tca gac agt gtt gga gga ttc aga tac 591

Asp Lys Tyr Val Gly Val Ser Ser Asp Ser Val Gly Gly Phe Arg Tyr

160 165 170

agt gaa aga tat gat cct gag ccc aaa tca aaa tgg gat gag gag tgg 639

Ser Glu Arg Tyr Asp Pro Glu Pro Lys Ser Lys Trp Asp Glu Glu Trp

175 180 185

gat aaa aac aag agt gct ttt cca ttc agt gat aaa tta ggt gag ctg 687

Asp Lys Asn Lys Ser Ala Phe Pro Phe Ser Asp Lys Leu Gly Glu Leu

190 195 200

agt gat aaa att gga agc aca att gat gac acc atc agc aag ttc cgg 735

Ser Asp Lys Ile Gly Ser Thr Ile Asp Asp Thr Ile Ser Lys Phe Arg

205 210 215 220

agg aaa gat aga gaa gac tct cca gaa aga tgc agc gac agc gat gag 783

Arg Lys Asp Arg Glu Asp Ser Pro Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Glu

225 230 235

gaa aag aaa gcg aga aga ggc aga tct ccc aaa ggt gaa ttc aaa gat 831

Glu Lys Lys Ala Arg Arg Gly Arg Ser Pro Lys Gly Glu Phe Lys Asp

240 245 250

gaa gag gag act gtg acg aca aag cat att cat atc aca cag gcc aca 879

Glu Glu Glu Thr Val Thr Thr Lys His Ile His Ile Thr Gln Ala Thr

255 260 265

gag acc acc aca acc aga cac aag cgc aca gca aat cct tcc aaa acc 927

Glu Thr Thr Thr Thr Arg His Lys Arg Thr Ala Asn Pro Ser Lys Thr

270 275 280

att gat ctt gga gca gca gca cat tac aca ggg gac aaa gca agt cca 975

Ile Asp Leu Gly Ala Ala Ala His Tyr Thr Gly Asp Lys Ala Ser Pro

285 290 295 300

gat cag aat gct tca acc cac aca cct cag tct tca gtt aag act tca 1023

Asp Gln Asn Ala Ser Thr His Thr Pro Gln Ser Ser Val Lys Thr Ser

305 310 315

gtg cct agc agc aag tca tct ggt gac ctt gtt gat ctg ttt gat ggc 1071

Val Pro Ser Ser Lys Ser Ser Gly Asp Leu Val Asp Leu Phe Asp Gly

320 325 330

acc agc cag tca aca gga gga tca gct gat tta ttc gga gga ttt gct 1119

Thr Ser Gln Ser Thr Gly Gly Ser Ala Asp Leu Phe Gly Gly Phe Ala

335 340 345

gac ttt ggc tca gct gct gca tca ggc agt ttc cct tcc caa gta aca 1167

Asp Phe Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Ser Phe Pro Ser Gln Val Thr

350 355 360

gca aca agt ggg aat gga gac ttt ggt gac tgg agt gcc ttc aac caa 1215

Ala Thr Ser Gly Asn Gly Asp Phe Gly Asp Trp Ser Ala Phe Asn Gln

365 370 375 380

gcc cca tca ggc cct gtt gct tcc agt ggc gag ttc ttt ggc agt gcc 1263

Ala Pro Ser Gly Pro Val Ala Ser Ser Gly Glu Phe Phe Gly Ser Ala

385 390 395

tca cag cca gcg gta gaa ctt gtt agt ggc tca caa tca gct cta ggc 1311

Ser Gln Pro Ala Val Glu Leu Val Ser Gly Ser Gln Ser Ala Leu Gly

400 405 410

cca cct cct gct gcc tca aat tct tca gac ctg ttt gat ctt atg ggc 1359

Pro Pro Pro Ala Ala Ser Asn Ser Ser Asp Leu Phe Asp Leu Met Gly

415 420 425

tcg tcc cag gca acc atg aca tct tcc cag agt atg aat ttc tct atg 1407

Ser Ser Gln Ala Thr Met Thr Ser Ser Gln Ser Met Asn Phe Ser Met

430 435 440

atg agc act aac act gtg gga ctt ggt ttg cct atg tca aga tca cag 1455

Met Ser Thr Asn Thr Val Gly Leu Gly Leu Pro Met Ser Arg Ser Gln

445 450 455 460

aat aca gat atg gtc cag aaa tca gtc agc aaa acc ttg ccc tct act 1503

Asn Thr Asp Met Val Gln Lys Ser Val Ser Lys Thr Leu Pro Ser Thr

465 470 475

tgg tct gac ccc agt gta aac atc agc cta gac aac tta cta cct ggt 1551

Trp Ser Asp Pro Ser Val Asn Ile Ser Leu Asp Asn Leu Leu Pro Gly

480 485 490

atg cag cct tcc aaa ccc cag cag cca tca ctg aat aca atg att cag 1599

Met Gln Pro Ser Lys Pro Gln Gln Pro Ser Leu Asn Thr Met Ile Gln

495 500 505

caa cag aat atg cag cag cct atg aat gtg atg act caa agt ttt gga 1647

Gln Gln Asn Met Gln Gln Pro Met Asn Val Met Thr Gln Ser Phe Gly

510 515 520

gct gtg aac ctc agt tct cca tcg aac atg ctt cct gtc cgg ccc caa 1695

Ala Val Asn Leu Ser Ser Pro Ser Asn Met Leu Pro Val Arg Pro Gln

525 530 535 540

act aat gct ttg ata ggg gga ccc atg cct atg agc atg ccc aat gtg 1743

Thr Asn Ala Leu Ile Gly Gly Pro Met Pro Met Ser Met Pro Asn Val

545 550 555

atg act ggc acc atg gga atg gcc cct ctt gga aat act ccg atg atg 1791

Met Thr Gly Thr Met Gly Met Ala Pro Leu Gly Asn Thr Pro Met Met

560 565 570

aac cag agc atg atg ggc atg aac atg aac ata ggg atg tcc gct gct 1839

Asn Gln Ser Met Met Gly Met Asn Met Asn Ile Gly Met Ser Ala Ala

575 580 585

ggg atg ggc ttg aca ggc aca atg gga atg ggc atg ccc aac ata gcc 1887

Gly Met Gly Leu Thr Gly Thr Met Gly Met Gly Met Pro Asn Ile Ala

590 595 600

atg act tct gga act gtg caa ccc aag caa gat gcc ttt gca aat ttc 1935

Met Thr Ser Gly Thr Val Gln Pro Lys Gln Asp Ala Phe Ala Asn Phe

605 610 615 620

gcc aat ttt agc aaa taagagattg taaaagaagc agattgaatg aagaattttt 1990

Ala Asn Phe Ser Lys

625

agctgtgcag ataggtgatg ttgggatgga aaatgctaat caactaccct ttcttttatc 2050

aagtaattaa aataaatcta cataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2096

<210> 2

<211> 625

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Met Leu Asn Met Trp Lys Val Arg Glu Leu Val Asp Lys Ala Thr Asn

1 5 10 15

Val Val Met Asn Tyr Ser Glu Ile Glu Ser Lys Val Arg Glu Ala Thr

20 25 30

Asn Asp Asp Pro Trp Gly Pro Ser Gly Gln Leu Met Gly Glu Ile Ala

35 40 45

Lys Ala Thr Phe Met Tyr Glu Gln Phe Pro Glu Leu Met Asn Met Leu

50 55 60

Trp Ser Arg Met Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asn Trp Arg Arg Val Tyr

65 70 75 80

Lys Ser Leu Leu Leu Leu Ala Tyr Leu Ile Arg Asn Gly Ser Glu Arg

85 90 95

Val Val Thr Ser Ala Arg Glu His Ile Tyr Asp Leu Arg Ser Leu Glu

100 105 110

Asn Tyr His Phe val Asp Glu His Gly Lys Asp Gln Gly Ile Asn Ile

115 120 125

Arg Gln Lys Val Lys Glu Leu Val Glu Phe Ala Gln Asp Asp Asp Arg

130 135 140

Leu Arg Glu Glu Arg Lys Lys Ala Lys Lys Asn Lys Asp Lys Tyr Val

145 150 155 160

Gly Val Ser Ser Asp Ser Val Gly Gly Phe Arg Tyr Ser Glu Arg Tyr

165 170 175

Asp Pro Glu Pro Lys Ser Lys Trp Asp Glu Glu Trp Asp Lys Asn Lys

180 185 190

Ser Ala Phe Pro Phe Ser Asp Lys Leu Gly Glu Leu Ser Asp Lys Ile

195 200 205

Gly Ser Thr Ile Asp Asp Thr Ile Ser Lys Phe Arg Arg Lys Asp Arg

210 215 220

Glu Asp Ser Pro Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Glu Glu Lys Lys Ala

225 230 235 240

Arg Arg Gly Arg Ser Pro Lys Gly Glu Phe Lys Asp Glu Glu Glu Thr

245 250 255

Val Thr Thr Lys His Ile His Ile Thr Gln Ala Thr Glu Thr Thr Thr

260 265 270

Thr Arg His Lys Arg Thr Ala Asn Pro Ser Lys Thr Ile Asp Leu Gly

275 280 285

Ala Ala Ala His Tyr Thr Gly Asp Lys Ala Ser Pro Asp Gln Asn Ala

290 295 300

Ser Thr His Thr Pro Gln Ser Ser Val Lys Thr Ser Val Pro Ser Ser

305 310 315 320

Lys Ser Ser Gly Asp Leu Val Asp Leu Phe Asp Gly Thr Ser Gln Ser

325 330 335

Thr Gly Gly Ser Ala Asp Leu Phe Gly Gly Phe Ala Asp Phe Gly Ser

340 345 350

Ala Ala Ala Ser Gly Ser Phe Pro Ser Gln Val Thr Ala Thr Ser Gly

355 360 365

Asn Gly Asp Phe Gly Asp Trp Ser Ala Phe Asn Gln Ala Pro Ser Gly

370 375 380

Pro Val Ala Ser Ser Gly Glu Phe Phe Gly Ser Ala Ser Gln Pro Ala

385 390 395 400

Val Glu Leu Val Ser Gly Ser Gln Ser Ala Leu Gly Pro Pro Pro Ala

405 410 415

Ala Ser Asn Ser Ser Asp Leu Phe Asp Leu Met Gly Ser Ser Gln Ala

420 425 430

Thr Met Thr Ser Ser Gln Ser Met Asn Phe Ser Met Met Ser Thr Asn

435 440 445

Thr Val Gly Leu Gly Leu Pro Met Ser Arg Ser Gln Asn Thr Asp Met

450 455 460

Val Gln Lys Ser Val Ser Lys Thr Leu Pro Ser Thr Trp Ser Asp Pro

465 470 475 480

Ser Val Asn Ile Ser Leu Asp Asn Leu Leu Pro Gly Met Gln Pro Ser

485 490 495

Lys Pro Gln Gln Pro Ser Leu Asn Thr Met Ile Gln Gln Gln Asn Met

500 505 510

Gln Gln Pro Met Asn Val Met Thr Gln Ser Phe Gly Ala Val Asn Leu

515 520 525

Ser Ser Pro Ser Asn Met Leu Pro Val Arg Pro Gln Thr Asn Ala Leu

530 535 540

Ile Gly Gly Pro Met Pro Met Ser Met Pro Asn Val Met Thr Gly Thr

545 550 555 560

Met Gly Met Ala Pro Leu Gly Asn Thr Pro Met Met Asn Gln Ser Met

565 570 575

Met Gly Met Asn Met Asn Ile Gly Met Ser Ala Ala Gly Met Gly Leu

580 585 590

Thr Gly Thr Met Gly Met Gly Met Pro Asn Ile Ala Met Thr Ser Gly

595 600 605

Thr Val Gln Pro Lys Gln Asp Ala Phe Ala Asn Phe Ala Asn Phe Ser

610 615 620

Lys

625

<210> 3

<211> 2705

<212> DNA

<213> 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)

<220>

<221> CDS

<222> (262)..(2208)

<223>

<400> 3

ggacacgaca gctcaccaaa tattagctgc tgtgattttg ttttacaatt ttcgtttaaa 60

tttttacatt tttgtttgcg gaaagcgcgg gtgcgagaca ggtgcgccgt ttccatgcaa 120

aagtgcaaat cgtcagctgc aaaacagtca gaaaacggca cgccaagcga aaacgagttc 180

gacgtcttgt tgtagttgga ttttccagcc acttttcgac gagattgtgt gaaaaattcc 240

gtagcattca atagtctcaa a atg gtg gat aaa ttc atc agc atg tgg aaa 291

Met Val Asp Lys Phe Ile Ser Met Trp Lys

1 5 10

gtg cgc gaa ttg gcg gac aag gtc acc aat gtc gtg atg aat tac acg 339

Val Arg Glu Leu Ala Asp Lys Val Thr Asn Val Val Met Asn Tyr Thr

15 20 25

gaa acg gag ggc aag gtg cgg gag gcc acc aac gat gat cct tgg ggg 387

Glu Thr Glu Gly Lys Val Arg Glu Ala Thr Asn Asp Asp Pro Trp Gly

30 35 40

cct aca gga ccc ctc atg cag gaa ttg gcc tat tcc acc ttc tca tac 435

Pro Thr Gly Pro Leu Met Gln Glu Leu Ala Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr

45 50 55

gaa aca ttc ccg gag gtg atg tcc atg ctg tgg aag cgc atg ctg cag 483

Glu Thr Phe Pro Glu Val Met Ser Met Leu Trp Lys Arg Met Leu Gln

60 65 70

gac aat aaa acc aac tgg cga cgc acg tac aag agc ctc ctt ctg cta 531

Asp Asn Lys Thr Asn Trp Arg Arg Thr Tyr Lys Ser Leu Leu Leu Leu

75 80 85 90

aactat ttg gtg cga aac ggc tct gaa cgg gtg gta acc tcc tct cgg 579

Asn Tyr Leu Val Arg Asn Gly Ser Glu Arg Val Val Thr Ser Ser Arg

95 100 105

gag cac atc tac gat ctg cgc tcg ctg gag aac tat aca ttc acc gac 627

Glu His Ile Tyr Asp Leu Arg Ser Leu Glu Asn Tyr Thr Phe Thr Asp

110 115 120

gag ggc ggc aag gat cag ggt att aat gtt agg cat aag gta cga gag 675

Glu Gly Gly Lys Asp Gln Gly Ile Asn Val Arg His Lys Val Arg Glu

125 130 135

ctt ata gac ttt att cag gat gat gat cgt ttg cgc gag gag cgc aaa 723

Leu Ile Asp Phe Ile Gln Asp Asp Asp Arg Leu Arg Glu Glu Arg Lys

140 145 150

aag gcg aag aag aac aag gac aag tac atc ggc atg agc agc gac gcc 771

Lys Ala Lys Lys Asn Lys Asp Lys Tyr Ile Gly Met Ser Ser Asp Ala

155 160 165 170

atg ggc atg cga agc ggt ggc tac agc ggc tat agc ggt gga tct gga 819

Met Gly Met Arg Ser Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Gly

175 180 185

gga ggc ggc ggt ggc agc ggt ggc tac aat gat ggc gac tat cgc tct 867

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Asn Asp Gly Asp Tyr Arg Ser

190 195 200

agt cgt gga gac aat tgg tac tcc gac aaa agc gcc gac aag gat cgg 915

Ser Arg Gly Asp Asn Trp Tyr Ser Asp Lys Ser Ala Asp Lys Asp Arg

205 210 215

tat gag gat gat gat act cac tac gat gga gag cga gag gga tcc gat 963

Tyr Glu Asp Asp Asp Thr His Tyr Asp Gly Glu Arg Glu Gly Ser Asp

220 225 230

agc gac tca ccc agt cca aga cgt aac tat cga tac aat gac cgt gcg 1011

Ser Asp Ser Pro Ser Pro Arg Arg Asn Tyr Arg Tyr Asn Asp Arg Ala

235 240 245 250

agt cct gcc gaa gta gcc agc gag gcc aaa cct tcc agc ctc aac atg 1059

Ser Pro Ala Glu Val Ala Ser Glu Ala Lys Pro Ser Ser Leu Asn Met

255 260 265

aac att cgt tcg aag acc gtc agt tcc cct gtc tcc aag cag ccc act 1107

Asn Ile Arg Ser Lys Thr Val Ser Ser Pro Val Ser Lys Gln Pro Thr

270 275 280

tca acg gct tct gcc aag cca gcg ctg tcc cag aag aag atc gat ctg 1155

Ser Thr Ala Ser Ala Lys Pro Ala Leu Ser Gln Lys Lys Ile Asp Leu

285 290 295

ggt gcg gca gca aac ttt gga aag cca gct cct ggc ggt gct gct ggc 1203

Gly Ala Ala Ala Asn Phe Gly Lys Pro Ala Pro Gly Gly Ala Ala Gly

300 305 310

att cac tca cca act cac cgt gac act ccc acc agc gtg gac ttg atg 1251

Ile His Ser Pro Thr His Arg Asp Thr Pro Thr Ser Val Asp Leu Met

315 320 325 330

ggc ggc gct tcg cca tcg ccg tct act tcc aag gca aac aat aat acg 1299

Gly Gly Ala Ser Pro Ser Pro Ser Thr Ser Lys Ala Asn Asn Asn Thr

335 340 345

caa agc aat aac aac gat ctg ctg gac gat ctg ttc aag acc tgc tcg 1347

Gln Ser Asn Asn Asn Asp Leu Leu Asp Asp Leu Phe Lys Thr Cys Ser

350 355 360

cca ccg ccg ggg cag gag aag acg ctg aac agt gct gcc gtg att gtg 1395

Pro Pro Pro Gly Gln Glu Lys Thr Leu Asn Ser Ala Ala Val Ile Val

365 370 375

gat gac gat gat gac ttc aat ccg cgt gcc agc gat gct agc cag cag 1443

Asp Asp Asp Asp Asp Phe Asn Pro Arg Ala Ser Asp Ala Ser Gln Gln

380 385 390

gaa ttc ggc gac ttc gcc tct gct ttc ggg cag ccc tcg gcg gga tcg 1491

Glu Phe Gly Asp Phe Ala Ser Ala Phe Gly Gln Pro Ser Ala Gly Ser

395 400 405 410

acg atc agc gag cca cca tca acg ggc ctg gtt ccg gct gcg aac gat 1539

Thr Ile Ser Glu Pro Pro Ser Thr Gly Leu Val Pro Ala Ala Asn Asp

415 420 425

gag ttc gcc gac ttt gcg gcg ttc caa ggc tcg aca acg tcg aca tct 1587

Glu Phe Ala Asp Phe Ala Ala Phe Gln Gly Ser Thr Thr Ser Thr Ser

430 435 440

gcg ctg gac ggt aat ttg ctg aag act gcc acg ccg gcg aac gat tcg 1635

Ala Leu Asp Gly Asn Leu Leu Lys Thr Ala Thr Pro Ala Asn Asp Ser

445 450 455

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Phe Asp Leu Phe Asn Ser Ala Pro Thr Ser Thr Ala Ala Ala Thr Thr

460 465 470

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Ala Thr Asp Leu Leu Ala Gly Leu Gly Asp Leu Ser Ile His Gln Ser

475 480 485 490

atg ccc atg gac aat atg atg cct ccc att ccc gcc gtc acg ggc aat 1779

Met Pro Met Asp Asn Met Met Pro Pro Ile Pro Ala Val Thr Gly Asn

495 500 505

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Asn Leu Leu Gln Pro Met Ser Val Thr Asn Asn Asn Asn Asn Thr Asn

510 515 520

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Gly Gly Ala Val Pro Ala Ala Ala Ser Val Gln Ser Thr Ala Val Gly

525 530 535

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Ala Thr Trp Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly Lys Met Asn Ile Asp Leu

540 545 550

gac aat ctg ctg atg agc aag tcg ggc aag ccc agt gcc ccg gcc cct 1971

Asp Asn Leu Leu Met Ser Lys Ser Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ala Pro

555 560 565 570

tcg atg aat gcc ctg aag acc aac agt ccg gca aag gcg cca ctg aat 2019

Ser Met Asn Ala Leu Lys Thr Asn Ser Pro Ala Lys Ala Pro Leu Asn

575 580 585

gtg cag acg ggt ggc gga ttc cct gga ctg tcg cca atg acc agt ccg 2067

Val Gln Thr Gly Gly Gly Phe Pro Gly Leu Ser Pro Met Thr Ser Pro

590 595 600

aac att ttt ggg gct ccg gca ccg cag caa agc att cca caa aac caa 2115

Asn Ile Phe Gly Ala Pro Ala Pro Gln Gln Ser Ile Pro Gln Asn Gln

605 610 615

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Ser Ala Phe Ala Asn Phe Gly Ala Phe Gln Gln Gln Gln Gln Asn His

620 625 630

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Ser Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ser Ser Ala Phe Asp Leu Phe Gln

635 640 645

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<210> 4

<211> 649

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<213> 黑腹果蝇

<400> 4

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1 5 10 15

Lys Val Thr Asn Val Val Met Asn Tyr Thr Glu Thr Glu Gly Lys Val

20 25 30

Arg Glu Ala Thr Asn Asp Asp Pro Trp Gly Pro Thr Gly Pro Leu Met

35 40 45

Gln Glu Leu Ala Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Glu Thr Phe Pro Glu Val

50 55 60

Met Ser Met Leu Trp Lys Arg Met Leu Gln Asp Asn Lys Thr Asn Trp

65 70 75 80

Arg Arg Thr Tyr Lys Ser Leu Leu Leu Leu Asn Tyr Leu Val Arg Asn

85 90 95

Gly Ser Glu Arg Val Val Thr Ser Ser Arg Glu His Ile Tyr Asp Leu

100 105 110

Arg Ser Leu Glu Asn Tyr Thr Phe Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp Gln

115 120 125

Gly Ile Asn Val Arg His Lys Val Arg Glu Leu Ile Asp Phe Ile Gln

130 135 140

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145 150 155 160

Asp Lys Tyr Ile Gly Met Ser Ser Asp Ala Met Gly Met Arg Ser Gly

165 170 175

Gly Tyr Ser Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

180 185 190

Gly Gly Tyr Asn Asp Gly Asp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Asp Asn Trp

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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<210> 5

<211> 643

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<400> 5

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130 135 140

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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Asn Leu Ser Ser Pro Ser Asn Met Leu Pro Val Arg Pro Gln Thr Asn

545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

Ser Met Met Gly Met Asn Met Asn Ile Gly Met Ser Ala Ala Gly Met

595 600 605

Gly Leu Thr Gly Thr Met Gly Met Gly Met Pro Asn Ile Ala Met Thr

610 615 620

Ser Gly Thr Val Gln Pro Lys Gln Asp Ala Phe Ala Asn Phe Ala Asn

625 630 635 640

Phe Ser Lys

Claims

1.包含ENTH结构域且具有生长抑制活性的分离蛋白质。

2.权利要求1的蛋白质，其中所述蛋白质缺乏与Eps15相互作用的NPF结构域，且缺乏结合网格蛋白接头AP2的DPW结构域。

3.权利要求1或2的蛋白质，其中所述蛋白质具有与SEQ ID NO：2、4和5所列氨基酸序列之一至少40％、优选50％、更优选70％、甚至更优选80％且最优选90％相同的氨基酸序列。

4.权利要求1-3任一项的蛋白质，其中所述蛋白质具有与SEQID NO：2、4或5的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

5.编码权利要求1-4任一项的蛋白质的分离核酸，优选SEQ IDNO：1或3所列核酸序列。

6.包含权利要求5中定义的核酸的载体。

7.包含权利要求6的载体的宿主细胞。

8.权利要求7的宿主细胞，其中所述细胞是真核细胞。

9.用于鉴定过度增殖病(特别是良性和恶性肿瘤)或其遗传素质的方法，包括：对受试者的体液或组织样品检测编码ELP蛋白质的核酸序列的表达水平的变化和/或其中至少一处突变或者检测基因组elp基因座中的重排。

10.权利要求9的方法，其中所述突变位于编码ENTH结构域的DNA区域、5′非翻译区、编码进化保守氨基酸的密码子、启动子或剪接位点内。

11.权利要求9-10任一项的方法，其中所述突变导致无功能ELP蛋白质、蛋白质表达降低或没有蛋白质、或者融合蛋白。

12.权利要求9-11任一项的方法，其中所述核酸序列是SEQ IDNO：1的核酸序列。

13.权利要求9-12任一项的方法，其中疾病是肺癌。

14.权利要求9-12任一项的方法，其中疾病是肾癌。

15.权利要求9-12任一项的方法，其中疾病是胃癌。

16.用于生成ELP蛋白质的方法，包括：用处于表达构建物中的编码权利要求1的蛋白质的核酸转化合适宿主细胞，在容许所述蛋白质表达的条件下培养所述细胞，并分离生成的蛋白质。

17.能够特异结合权利要求1的蛋白质的表位的抗体。

18.权利要求17的抗体在用于鉴定过度增殖病或其遗传素质的方法中的用途。

19.权利要求5的核酸用于与ELP蛋白质有关的过度增殖病的基因疗法的用途。

20.用于治疗过度增殖病(特别是良性和恶性肿瘤)的制药学组合物，包括：权利要求1-4任一项的蛋白质和/或权利要求5的核酸。

21.权利要求20的制药学组合物，其中过度增殖病是肺癌。

22.权利要求20的制药学组合物，其中过度增殖病是肾癌。

23.权利要求20的制药学组合物，其中过度增殖病是胃癌。

24.用于下调基因表达的寡核苷酸，它与编码epsin样蛋白质的mRNA中的区域特异杂交。

25.权利要求24的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含化学修饰。

26.用于基因沉默的双链RNA(dsRNA)，其中所述RNA具有与编码ELP蛋白质的基因的外显子区互补的核苷酸序列。

27.权利要求26的dsRNA，它具有大约200-2000个碱基对、优选700-800个碱基对的长度。

28.权利要求21的dsRNA，它具有大约18-25个碱基对、优选20-22个碱基对的长度。

29.权利要求26的dsRNA，其中所述epsin样蛋白质是人ELP。

30.权利要求24-29任一项的寡核苷酸或dsRNA用于治疗过度增殖病和/或特征为细胞分化不正确的疾病的用途。