CN1634922A

CN1634922A - 抗艾滋病化合物,其制备方法和以该类化合物为活性成分的药物组合物及其应用

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Publication number: CN1634922A
Application number: CN 200410040750
Authority: CN
Inventors: 李蓉涛; 孙汉董; 郑永唐; 王睿睿; 杨柳萌; 林中文; 赵勤实
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2004-09-24
Filing date: 2004-09-24
Publication date: 2005-07-06
Anticipated expiration: 2024-09-24
Also published as: CN100338067C

Abstract

提供式(I)所示的化合物，其制备方法，以该类化合物为活性成分的药物组合物，其中含有治疗艾滋病有效量的式(I)化合物五味子内酯素及可药用载体和/或赋形剂，以及它们在治疗艾滋病的药物和逆转录酶抑制剂药物中的应用。

Description

抗艾滋病化合物，其制备方法和以该类化合物为活性成分的药物组合物及其应用

技术领域：

本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及一类抗艾滋病化合物五味子内酯素B，C及其类似物，其制备方法和以该类化合物为活性成分的药物组合物及其在制备逆转录酶抑制剂药物中和在制备抗艾滋病药物中的应用。

技术背景：

自从1981年首例艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)报告以来，其流行迅速蔓延至世界各国，目前已有6000多万人被感染，2000多万人死亡，造成的经济及社会损失不可估量。我国艾滋病自95年以后进入快速发展期，每年以30％的速度增长。据卫生部最近公布的数据，我国大陆HIV感染者累计已超过100万，已死亡艾滋病病人24万人。如不能有效遏制，预计到2010年，全国HIV感染者将突破千万。因此艾滋病是21世纪人类面临的最重大的公共健康问题，其防治研究迫在眉睫。目前有十余种HIV疫苗正在临床试验，但尚无有确切疗效的HIV疫苗面市。因此，抗艾滋病药物的研究就显得特别重要，药物治疗成为目前防治艾滋病的焦点。高效抗逆转录病毒疗法(HAART，即鸡尾酒疗法)延长了HIV感染者寿命，取得了很好的效果，但仍然不能清除体内病毒，治愈病人。目前临床使用的25种抗HIV药物大都是基于病毒本身的蛋白为靶标，包括HIV逆转录酶和蛋白水解酶抑制剂，这些药物存在治疗价格昂贵、有毒副作用、服药繁琐、不能清除体内病毒和耐药病毒株的产生等缺陷，需要我们不断地创制出新的高效、低毒、价廉的抗HIV药物。从天然产物中寻找新的抗HIV药物，是国内外新药研制中非常活跃的领域，也是近期创制新药的一条捷径和制高点。至今已发现100多种天然化合物具有很好的抗HIV活性，其中活性较强的有：甘草甜素，金丝桃素，姜黄素，大豆皂甙，喜树碱，栗精胺，香菇多糖和天花粉蛋白等。抗HIV活性天然先导化合物的发现与研究是当前国内外艾滋病药物研究中的热点。例如，(+)-Calanolide为1992年从马来西亚热带雨林藤黄科Calophyllum lanigerium植物中分离鉴定的吡喃类香豆素化合物。美国国家肿瘤研究中心通过对该类化合物的抗HIV活性筛选，发现其具有抗HIV的活性，EC₅₀＝0.1μM，TI＝200，其作用机理为抑制逆转录酶。以此化合物为先导物进行了结构修饰和简化，发现简化类似物北美芹素(Pteryxin)和凯尔内酯也有较好的抗HIV活性，并通过结构修饰发现了一个具有更高抗HIV活性的Suksdorfin类似物(3’R，4’R)-3’，4’-二-氧-S-莰农酰基-5-甲基-(+)-顺式-凯尔内酯(CK)具有显著的抗HIV活性(EC₅₀＝0.0004μM，TI＝136719)，效价类似于第一个被美国FDA批准用于治疗艾滋病患者的核苷酸类药物AZT(EC₅₀＝0.15μM，TI＝12500)。目前此化合物正在进行临床疗效评价之中。

迄今为止，现有技术中没有本发明式I化合物结构新颖的高氧化度新骨架降三萜类化合物五味子内酯素B，C及其类似物的报道，也没有这类化合物作为有效成分在治疗疾病方面的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一类具有抗HIV-1病毒活性的新骨架降三萜类化合物五味子内酯素B，C及其类似物。

本发明的另一目的是提供一种从小花五味子植物中提取本发明化合物的方法。

本发明进一步目的是提供一种以本发明化合物为活性成分的药物组合物。

本发明的另一目的在提供上述化合物和组合物在药物中特别是在制备治疗艾滋病药物中和在制备逆转录酶抑制剂药物中的应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

结构式(I)所示的化合物

其中：

R₁，R₂，R₉，R₁₆＝-CH₃，-CH₂OH，-CHO，-COOH，-COOR(R为烷基或芳基)；

R₁₄＝-CH₃，＝CH₂，-CH₂OH，-CHO，-COOH，-COOR(R为烷基或芳基)；

R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，R₈，R₁₀，R₁₁，R₁₂，R₁₃，R₁₅＝-H，-OH，-OCOR(R为烷基或芳基)，-OR(R为烷基或芳基)，-C＝O，-X(卤素)，氨基(amino)，烃氨基(alkylamino)，芳氨基(arylamino)，酰氨基(acylmino)；

R₃R₄，R₄R₅，R₅R₆，R₆R₇，R₇R₈，R₈R₉，R₁₀R₁₁，R₁₁R₁₂，R₁₂R₁₃＝双键，氧桥，-OCH₂O-；以及

以上各化合物与盐酸，硫酸，硝酸，醋酸，磷酸和柠檬酸等所形成的盐。

优选的本发明的化合物是五味子内酯素B(1)(1，4-epoxy-9β，14α，15β，22α-tetrahydroxy-3，4：9，10-seco-28-nor-cycloartane-24-en-1，3：23，26-diolide)，是其中R₁＝R₁₄＝β-CH₃，R₂＝49＝α-CH₃，R₃，R₄，R₇，R₈，R₁₂＝H，R₅＝α-H，R₆＝R₁₁＝β-OH，R₁₀＝R₁₅＝α-OH时的化合物；以及五味子内酯素C(2)(1，4：14，15-diepoxy-9β，22α-dihydroxy-3，4：9，10-seco-28-nor-cycloartane-24-en-1，3：23，26-diolide)，是其中当R₁＝R₁₄＝β-CH₃，R₂＝R₉＝α-CH₃，R₃，R₄，R₇，R₈，R₁₂＝H，R₅＝α-H，R₆＝β-OH，R₁₅＝α-OH，R₁₀＝R₁₁＝β-O-(氧桥)时的化合物。

本发明同时提供了上述化合物的制备方法，该方法包括用常规溶剂浸提小花五味子茎和叶粗粉得到总浸膏，总浸膏用水分散后用有机溶剂萃取得到萃取物，萃取物经反复柱层析分离后得到。其中的溶剂可采用60％-100％的丙酮、乙醇、甲醇中的任意一种；浸提可采用冷浸或热回流；萃取的有机溶剂可采用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯中的任意一种。

本发明的用于治疗艾滋病的药物组合物含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。

本发明的化合物和组合物可用于逆转录酶抑制剂药物和抗艾滋病药物。

上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、以及和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其他辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊和注射剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％~99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％~95％的活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01~10mg/kg体重，优选0.1~5mg/kg体重。可以一次或多次施用。

附图说明：

图1为五味子内酯素B(1)的二维NMR相关图

——¹H-¹H COSY→HMBC；

图2为五味子内酯素B(1)的单晶X-衍射图；

图3为五味子内酯素C(2)的单晶X-衍射图，3-a.对C8166细胞的毒性实验3-b.对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用；

图4为本发明化合物提取分离流程图。

具体实施方式：

下面结合附图用实施例使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：

五味子内酯素B(1)(1，4-epoxy-9β，14α，15β，22α-tetrahydroxy-3，4：9，10-seco-28-nor-cycloartane-24-en-1，3：23，26-diolide，1)(以下简称化合物1)的制备：

干燥小花五味子(Schisandra micrantha A.C.Smith)茎和叶6.8kg，粉碎后用丙酮水溶液室温浸泡3次(每次25升左右)，提取液合并，减压蒸馏除去丙酮后，静置过夜，滤除沉积的色素，滤液先用石油醚萃取2次，再用乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂后，得乙酸乙酯部分(170g)。乙酸乙酯部分用300g粗硅胶(80-100目)拌样，1.4kg硅胶(100-200目)以粗短型硅胶柱进行粗分离，氯仿∶丙酮(1∶0→6∶4)梯度洗脱，每1000ml为一个馏分，共300份。TLC监测合并相同的部分，得到8个主要部分。其中第15-18份(15g，部位3)用MCI-gel CHP 20P(50→90％MeOH-H₂O)处理后得3个主要部分：Fr.3a-c、3a-f。Fr.3b(60％MeOH，9g)以石油醚-乙酸乙酯-丙酮(10∶1∶1)为洗脱剂进行硅胶柱层析，每100ml为一个馏分，共185份，其中第121-135份经硅胶柱层析，以CHCl₃-MeOH(50∶1)为洗脱剂，重结晶后得化合物1(34mg)。

化合物1，无色柱状结晶，mp：172-173℃，[α]_D ^22.9：+30.99(c0.24，MeOH)。UV光谱在276(3.65)nm处有吸收，说明分子中存在共扼基团。IR光谱显示存在羟基(3443，br)，γ-内酯(1772cm^-1)和酯基(1717cm^-1)。EI MS谱给出失水的准分子离子峰为m/z 498([M-2H₂O])，结合高分辨正离子HRESI(m/z[M-2H₂O+H]⁺499.2692，calcd for 499.2695)和NMR谱提供的信息，确定其分子式为C₂₉H₄₂O₉，不饱和度为9。EI MS谱除了给出弱的准分子离子峰外，还给出了2个特征的碎片离子m/z 438[M-C₅H₄O₂]⁺，m/z 97[C₅H₅O₂]⁺，提示化合物1存在五元环α-甲基-α，β-不饱和-γ-内酯。¹³C NMR谱数据[Me-27(δ10.6)，C-24(δ149.9)，C-25(δ131.3)，C-26(δ177.0)]，也证实了不饱和五元内酯环的存在。

¹³C NMR谱显示出29个碳信号：5个甲基(δ10.6，18.2，18.1，23.5，30.0)，7个亚甲基(δ24.7，29.3，36.0，37.2，38.5，39.6，47.0)，8个次甲基(δ38.3，54.7，56.8，60.2，73.8，77.2，82.8，83.6)，1个三取代的双键(δ131.3，149.9)，5个季碳(δ46.3，73.3，86.2，87.6，101.3)和2个酯基(δ177.0，177.6)。提示化合物1为高度氧化的降三萜类化合物，有6个环。将化合物1的¹³C NMR谱与lancifodilactone A(3)进行比较，发现C-1(δ82.8)，C-2(δ37.2)，C-3(δ177.6)，C-4(δ86.2)，C-9(δ73.3)，C-10(δ101.3)，C-19(δ47.0)，Me-29(δ30.0)和Me-30(δ23.5)的化学位移值与化合物3非常相似，说明二者具有相同的A-C环结构片段。¹H NMR谱中特征的偕二甲基[Me-29(δ1.19)，Me-30(δ1.04)]，H-1和H2-2的ABX自旋系统[H-1(δ4.16，d，J＝4.5Hz)，H-2α(δ2.73，dd，J＝4.5，17.9Hz)，H-2β(δ2.37，d，J＝17.9Hz)]，H₂-19的AB双重峰(δ1.75，2.03，ABd，J＝15.9Hz)和H-5(2.29，dd，J＝3.8，15.1Hz)，也证实了上述结构片段的存在。

进一步分析化合物1的¹H-¹H COSY和HMQC数据，可知分子中存在着4个连接片段：片段a(C-1～C-2)，片段b(C-5～C-8)，片段c(C-11～C-12)，片段d(C-15～C-17，C-17/C-20/Me-21，C-20～C-24)(图-1)。HMBC谱中显示了三组相关：H₂-19与C-9和C-11，H-11α与C-8和C-9，H-7与C-9，从而片段b和c可以通过含氧季碳(C-9)相连。通过18位甲基(δ_H1.00，s)与相邻C-12，C-13，C-14和C-17的HMBC相关，将片段c和d通过13位季碳连接。HMBC谱上观察到的H-15和H-16对C-13的相关也证实了上述连接。H-7和C-14，H-8和C-16，以及H-16和C-14的HMBC相关，可知片段b和d通过14位的含氧季碳相连。此外，27位的甲基(Me-27，δ1.78，s)与三取代双键(C-24和C-25)及酯基(C-26)存在清晰的HMBC相关，提示α-甲基-α，β-不饱和-γ-内酯五元环H与片段d通过C-23直接相连。通过上述波谱数据的分析，化合物1的基本骨架得到确定。

通过与化合物3的比较，以及对ROESY谱和¹H NMR谱偶合常数的分析，初步确立了化合物1的相对立体化学。在ROESY谱中，H-1和Me-30，H-5和Me-29的相关说明H-1和Me-30均为α-取向，而H-5和Me-29同为β-取向。H-8和H-6α及Me-18的相关显示H-8α的存在。H-15和H-7α的相关点揭示H-15为α-取向。由于C-17和C-20之间的σ-键可以自由旋转，C-20、C-22和C-23的相对构型难以确定。此外，C-14为含氧季碳，其相对构型也不能通过ROESY得以确定。因此，又对化合物1进行了晶体X-衍射分析，最终证实了其结构(X-衍射分析结果如图2)。

基于以上分析，化合物1的结构最终被确定1，4-epoxy-9β，14α，15β，22α-tetrahydroxy-3，4；9，10-seco-28-nor-cycloartane-24-en-1，3：23，26-diolide，命名为五味子内酯素B。

五味子内酯素B(1)和lancifolilactone A(3)的结构如下：

表-1.五味子内酯素B(1)的NMR波谱数据(CD₃OD中测定).

No. δ_H(mult，J，Hz) δ_C HMBC(¹H-¹³C) ROESY(¹H-¹H)

1α 4.16(d，4.5) 82.8d 2，3，10，19 2α，2β，19α，30

2α 2.73(dd，4.5，17.9) 37.2t 1，3 1α，2β

2β 2.35(d，17.9)

3 177.6s

4 86.2s

5β 2.29(dd，3.8，15.1) 60.2d 4，6，7，10，19，29，30 7β，29

6α 1.28(overlap) 29.3t 4，5，8 6β，7α

6β 1.74(overlap) 5，8 5β，7α

7α 2.14(m) 24.7t 5，6，8，9，14 6β，8α，15α

7β 1.60(m) 5，6，8，9 5β，7α，15α

8α 1.60(overap) 56.8d 7 6α，18

9 73.3s

10 101.3s

11α 1.58(m) 38.5t 11B，19α

11β 1.28(m) 13 12β，19β

12α 1.41(m) 39.6t 13 12β，18

12β 1.98(overlap) 13 12α

13 46.3s

14 87.6s

15α 3.73(d，3.5) 77.2d 13，14，17 7α，16α，16β

16α 1.88(m) 36.0t 13，20 15α，16β

16β 1.58(overlap) 13，17

17β 1.94(m) 54.7d 20 16β

18 1.00(s) 18.2q 12，13，14，17 8，12α

19α 2.03(ABd，15.9) 47.0t 1，8，11 1α，8α，11α，19β

19β 1.75(ABd，15.9) 1，5，10，11 11β，19α

20 1.98(m) 38.3d 17，21，22，23 16β，21，22，23

21 0.98(d，4.5) 18.1q 17，20，22 20，23

22 3.63(dd，2，6.8) 73.8d 20，21，23，24， 20，21，23

23 5.04(d，1.8) 83.6，d 22，24，25 16β，20，21，22

24 7.08(d，1.8) 149.9d 23，25，26，27 23，27

25 131.3s

26 177.0s

27 1.78(s) 10.6q 24，25，26

29 1.19(s) 30.0q 4，5，30 5

30 1.04(s) 23.5，q 4，5，29 1，19α

实施例2：

五味子内酯素C(2)

(1，4：14，15-diepoxy-9β，22α-dihydroxy-3，4：9，10-seco-28-nor-cycloartane-24-en-1，3：23，26-diolide，2)(以下简称化合物2)的制备：

干燥小花五味子(Schisandra micrantha A.C.Smith)茎和叶6.8kg，粉碎后用丙酮水溶液室温浸泡3次(每次25升左右)，提取液合并，减压蒸馏除去丙酮后，静置过夜，滤除沉积的色素，滤液用乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂后，得乙酸乙酯部分(170g)。乙酸乙酯部分用300g粗硅胶(80-100目)拌样，1.4kg硅胶(100-200目)以粗短型硅胶柱进行粗分离，氯仿∶丙酮(1∶0→6∶4)梯度洗脱，每1000ml为一个馏分，共300份。TLC监测合并相同的部分，得到8个主要部分。其中第15-18份(15g，部位3)用MCI-gel CHP 20P(50→90％MeOH-H₂O)处理后得3个主要部分：Fr.3a-C。Fr.3b(60％MeOH，9g)以石油醚-乙酸乙酯-丙酮(10∶1∶1)为洗脱剂进行硅胶柱层析，每100ml为一个馏分，共185份，其中第121-135份经硅胶柱层析，以CHCl₃-MeOH(50∶1)为洗脱剂，重结晶后得化合物1(34mg)。第105-120份经硅胶柱层析，以CHCl₃-MeOH(50∶1)为洗脱剂，共收集105份馏分(每份100ml)，第54-60份再以石油醚-乙酸乙酯(3∶1)为洗脱剂进行硅胶柱层析，经反复纯化和重结晶后得化合物2(11mg)。

化合物2，无色柱状结晶。综合分析EI MS([M]⁺，m/z 516)、HRESI MS([M+Na]⁺，m/z 539.2634)和NMR数据得其分子式为C₂₉H₄₀O₈，不饱和度为10。EI MS给出弱的分子离子峰m/z 516，另外还有2个较强的碎片离子m/z 498([M-H₂O]⁺)和480([M-2H₂O]⁺)，说明分子中存在羟基。化合物2的¹³C NMR谱和DEPT谱显示出29个碳信号：5个甲基(δ10.6，14.6，15.3，23.0，29.4)，7个亚甲基(δ24.0，27.0，31.4，31.9，36.5，38.5，46.3)，8个次甲基(δ39.9，44.7，45.9，54.7，59.2，72.8，82.0，82.1)，1个三取代的双键(δ130.2，148.8)，5个季碳(δ41.7，72.7，73.8，84.8，99.3)和2个酯基(δ174.9，175.4)。

将化合物2和1的¹³C NMR数据(表-2)进行认真地比较，发现二者在A～C环和F环的化学位移值非常接近，而在C-8和C-12～C-17区域的化学位移值有所差别。结合HMQC谱分析，化学位移在δ_H3.36(1H，br s)，δ_C54.7(d)和δ_C72.7(s)的信号，显示出三取代三元氧环的存在。HMBC谱中H-7β，H-12α和Me-18与C-14的明显相关，以及H-8和C-15的相关信号，将该三元氧环定位于C-14和C-15之间。

化合物2的相对立体化学可由对ROESY谱的分析得到。C-1～C-10结构片段的相对构型与化合物1完全一致。H-15与H-7α，H-8和H-16α的ROESY相关，表明H-15为α-取代，因此三元氧环应位于E环的上方，为β-取向。H-17和H-12β的NOE相关将H-17定位于β-取向。

综上所述，化合物2的结构被确定为1，4：14，15-diepoxy-9β，22α-dihydroxy-3，4：9，10-seco-28-nor-cycloartane-24-en-1，3：23，26-diolide，命名为五味子内酯素C。其结构最终由单晶X-衍射得到证实(图3)。

五味子内酯素C(2)的结构式如下：

表-2.五味子内酯素C(2)的NMR波谱数据(CD₃OD中测定).

Position. δ_H(mult，J，Hz) δ_C	Position. δ_H(mult，J，Hz) δ_C
Position. δ_H(mult，J，Hz) δ_C	Position. δ_H(mult，J，Hz) δ_C	1 4.28(d，4.8) 82.1d2α 2.98(dd，4.8，17.7) 36.5t2β 2.74(d，17.7) -3 - 174.9s4 - 84.8s5 2.52(dd，3.7，13.3) 59.2d6α 1.33(m) 27.0t6β 1.59(m) -7α 1.37(m) 24.0t7β 1.95(m) -8 2.19(overlap) 44.7d9 - 73.8s10 - 99.3s11α 1.87(m) 38.5t11β 1.70(m) -12α 1.74(m) 31.4t12β 2.26(m) -13 - 41.7s	14 - 72.7s15 3.36(br s) 54.7d16α 1.48(m) 31.9t16β 2.19(m) -17 1.78(m) 45.9d18 0.94(s) 15.3q19 2.08(s) 46.3t20 2.11(m) 39.9d21 1.26(d，4.8) 14.6q22 4.00(br s) 72.8d23 5.14(br s) 82.0d24 7.21(br s) 148.8d25 - 130.2s26 - 175.4s27 1.81(s) 10.6q29 1.25(s) 29.4q30 1.12(s) 23.0q22-OH 6.62(d，6.1)

实施例3：

以实施例1或2为活性天然先导化合物，进行结构修饰，得到式(1)所示的其他衍生物，作为本发明药物活性成分。

实施例4：

片剂：活性成分10mg 乳糖180mg 淀粉55mg 硬脂酸镁5mg

制备方法：将活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，活性成分含量为10mg。

实施例5：

安瓿剂：活性成分2mg 氯化钠10mg

制备方法：将活性成分和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例6：

胶囊剂：活性成分10mg 乳糖187mg 硬脂酸镁3mg

制备方法：将活性成分与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

实施例7：

体外抗艾滋病的试验：

经体外抗HIV-1活性实验，化合物1对C8166细胞的毒性较小，CC₅₀大于200μg/ml；对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制的EC₅₀为26.22μg/ml，选择指数(S.I.值)＞7.63；对HIV-感染MT-4细胞死亡的保护作用较明显，选择指数(SI值)大于212.8倍。实验结果显示，化合物1的细胞毒性较低，具有显著的体外抗HIV-1活性，可作为治疗艾滋病药物的活性先导化合物。

体外抗HIV-1活性实验方法：

1、病毒感染性的滴定

HIV-1按Johnson & Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下：将HIV-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，每孔加入C8166细胞50μl(3×10⁵/ml)，每孔终体积200μl，37℃，5％CO₂培养。第三天补加新鲜RPMI-1640培养基100μl.第七天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1致细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞体的形成进行判断；按Reed & Muench方法计算病毒的TCID₅₀(50％Tissue CultureInfection Dose)，即引起细胞出现CPE的病毒上清稀释度。

2、细胞毒性检测

4×10⁵/ml C8166细胞悬液100ul与不同浓度的药物溶液混合，同时设置阳性药物AZT对照孔、不含药物的对照孔和空白对照孔，37℃，5％CO₂培养3天，采用MTT法(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide)检测细胞存活率。ELx800 ELISA Reader测定OD_595/630nm值。计算CC₅₀值(50％Cytotoxic Concentration)，即50％细胞存活时的药物浓度。

3、对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制试验

4×10⁵/ml C8166细胞悬液50ul与不同浓度的药物溶液混合，加入50μlHIV-1稀释上清50μl，M.O.I.为0.025，同时设置不含药物的对照孔及阴性对照孔，设置阳性药物AZT对照.37℃，5％CO2培养三天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体个数。计算EC50值(50％Effective Concentration)即抑制合胞体形成50％时的药物浓度。

4、化合物对HIV-1感染MT-4细胞死亡的保护作用试验

8×10⁵/ml MT-4细胞悬液50μl与100μl不同浓度的药物溶液混合，培养板的一半孔加入50μl培养基，另一半孔加入50μl HIV-1稀释上清，M.O.I.为0.5，同时设置不含药物的未感染或感染HIV-1的细胞对照孔及空白对照孔，设置阳性药物AZT对照，37℃，5％CO₂培养5天，采用MTT法检测细胞存活率。EL×800 ELISA Reader测定OD_595/630nm值。计算药物对正常细胞的存活率和HIV-1感染细胞的保护率。

表3 化合物1体外抗HIV-1活性实验

毒性实验CC50(μg/ml) ＞200

毒性与合胞体实

合胞体抑制EC50(μg/ml) 26.22

验

选择指数(SI)(CC50/EC50) ＞7.63

CC50(μg/ml) ＞200

MTT保护试验 EC50(μg/ml) 0.94

选择指数(SI) ＞212.8

Claims

1、下述结构式(I)所示的化合物

其中：

R₃R₄，R₄R₅，R₅R₆，R₆R₇，R₇R₈，R₈R₉，R₁₀R₁₁，R₁₁R₁₂，R₁₂R₁₃＝双键，氧桥，-OCH₂O-；

以及

2、按照权利要求1所述化合物，其中当R₁＝R₁₄＝β-CH₃，R₂＝R₉＝α-CH₃，R₃，R₄，R₇，R₈，R₁₂＝H，R₅＝α-H，R₆＝R₁₁＝β-OH，R₁₀＝R₁₅＝α-OH时，化合物为1，4-epoxy-9β，14α，15β，22α-tetrahydroxy-3，4:9，10-seco-28-nor-cycloartane-24-en-1，3:23，26-diolide，即五味子内酯素B(1)。

3、按照权利要求1所述化合物，其中当R₁＝R₁₄＝β-CH₃，R₂＝R₉＝α-CH₃，R₃，R₄，R₇，R₈，R₁₂＝H，R₅＝α-H，R₆＝β-OH，R₁₅＝α-OH，R₁₀＝R₁₁＝β-O-(氧桥)时，化合物为1，4:14，15-diepoxy-9β，22α-dihydroxy-3，4:9，10-seco-28-nor-eycloartane-24-en-1，3:23，26-diolide，即五味子内酯素C(2)。

4、权利要求1化合物的制备方法，该方法包括用常规溶剂浸提小花五味子茎和叶粗粉得到总浸膏，总浸膏用水分散后用有机溶剂萃取得到萃取物，萃取物经反复柱层析分离后得到。

5、按照权利要求4的方法，溶剂可采用60％-100％的丙酮、乙醇、甲醇中的任意一种；浸提可采用冷浸或热回流；萃取的有机溶剂可采用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯中的任意一种。

6、用于治疗艾滋病的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。

7、权利要求1化合物在制备逆转录酶抑制剂药物中的应用。

8、权利要求1化合物在制备抗艾滋病药物中的应用。