CN1628173A - 一种用来检测和定量核酸结合因子辅调节物的快速灵敏测定法 - Google Patents

Abstract

检测任何乃至所有核酸结合因子、蛋白质、细胞事件、核酸结合蛋白辅调节物、或其片段之活性的生物传感器和检测方法，其基础乃是建立在两个核酸成分之间交互作用的稳定性上，当两个核酸成分被一个核酸结合因子结合在一起时，会组成一个完整的核酸结合元件。优选将一个完整核酸结合元件的部分核酸或一个核酸成分，附上一个荧光供体，将同一个完整核酸结合元件的另一部分核酸或另一个核酸成分，附上一个荧光受体。或者，将一个含有结合元件其中一部分的核酸，附着到一个固体底物上，将含有同一个结合元件另一部分的核酸，附上一个可检测标记。核酸结合因子和核酸成分相结合时，会影响无热光或者和固体底物相结合之可检测标记的变化。这些生物传感器和检测方法，也可以用来检测具调节性质的核酸结合因子辅调节物、转译后修饰以及细胞事件，从而去诊断疾病和/或筛选能够调节核酸结合因子活性的药物或其它配体。

Description

一种用来检测和定量核酸结合因子辅调节物的快速灵敏测定法

相关申请的交叉参考

此项专利申请是2001年8月13日提交的待审美国专利申请编号09/928,385的后继部分，在此将其全文并入以供参考。

政府支持

此项研究工作获得美国健康和人道服务/国立健康研究院(U.S.Department ofHealth and Human Services/National Institutes of Health)的支持，补助金批准编号是GM50514。美国政府对这项发明具有一定的权利。

序列清单

一份书面拷贝的序列清单，和一份可供计算机阅读形式的相同序列清单，陈列在下以供参考。根据37C.F.R.1.821(f)，机读形式清单和笔写清单中所纪录的信息是完全相同的。

发明背景

1.发明领域

大体而言，这项发明是关于生物传导感应器，以及一套通过检测生色团标记密度的变化，或者通过检测一个可测性标记的方式来检测和定量特定蛋白质、因子、化学配体，尤其是序列特异性核酸结合因子和它们的辅调节物的方法。这项发明可以应用在任何需要决定核酸结合因子或辅调节蛋白质活性的地方。

2.相关技术的描述

检测和定量特定性化合物和化学原子团，特别是核酸特定结合因子及其辅调节物的能力，在基础研究和临床应用中非常重要。在生物医学研究和分子诊断中，测定特定的蛋白质或其他生物分子的浓度是最有用，同时也是最重要的实验程序之一。许多疾病都普遍使用特定蛋白质或辅因子在细胞中的浓度作为诊断标记。

蛋白质与核酸之间的相互作用，乃是在细胞中所发现的一种极其重要且与生理相关的生物大分子的相互接触的类型。许多在原核细胞、真核细胞、以及病毒的调节过程中扮演重要角色的蛋白质，具有与天然的特定核酸序列相结合的活性。这些蛋白质包括转录因子，染色质重塑因子以及脱氧核糖核酸(核酸)维持酶。核酸结合因子的综述，请参阅Benjamin Lewin， Genes VII，牛津大学出版社，New York，2000年，特此提出以供参考。

转录因子结合到特定同源核酸元件上，这些元件包括启动子，增强子和沉默元件。根据细胞内涵，这些转录因子可以是活化因子，抑制因子，或者两者兼是，它们的表达水平对基因表达的调控很重要。因此，这些蛋白质有许多对疾病的发展和诊断十分重要。例如，有几种转录因子，当它们超量表达或不正确的表达时，就是癌基因。这些癌基因转录因子包括myc，myb，fos，jun，rel和erb。而很多种癌症的发展，都涉及到另外一个和癌症有关的转录因子，p53。(Ko，L.L.和Prives，C.GenesDev.10，1054-1072，1996).

染色质重塑因子对基因表达的调控也很重要。一般而言，高度浓缩的染色质区域，即异染色质，其所含的基因没有转录活性，而松散或不浓缩的染色质区域，即常染色质，其所含的基因则有转录活性。在细胞分化，癌转化和正常生理上的稳定状态下，染色质可能被重塑。也就是说，染色质上的一些区域变得不易于转录因子和RNA聚合酶的接近，而另一些区域则变的更易于转录因子和核糖核酸(RNA)聚合酶的接近。有数种核酸结合因子参与了这个动力十足的过程，其中包括核小体蛋白质(如组蛋白)，组蛋白氨酰转移酶，组蛋白脱氨酰酶，氨基酸甲基转移酶，DNA甲基转移酶，核质素，HMG蛋白，抑制复合蛋白，polycomb-相关因子和trithorax-相关因子。

核酸维持酶乃是修复损伤核酸，忠实复制核酸，以及在重组过程中交换遗传信息不可或缺的核酸结合因子。好几种类型的癌症和其他疾病的症状都是由核酸维持酶的缺乏所导致的。例如，着色性干皮病，这是一种十分可怕的遗传病，它的患者易于罹患皮肤癌，而该病就是由于缺乏核甘-切除修复酶所导致的。遗传性的非息肉性结肠直肠癌(non-polyposis colorectal cancer)很大部分是由于欠缺错配修复酶所导致的。某些遗传性的乳腺癌则是由于欠缺同源重组酶所导致的。关于基因组的维持系统及它们在癌症上的作用，请参阅Hoeijmakers，J.H.J.，Nature 411，366-374，2001年，特此提出以供参考。因此，使用一套简便、准确的方法去检测、监视和/或量化核酸结合因子及其辅调节物的核酸结合活性，实乃具有非常重要的意义。

在检测蛋白质的序列特异性核酸结合能力的方法当中，最常用的方法是凝胶转移测定法和多种核酸印记测定法，(Fried，M.G.和Crothers，D.M.Nucleic AcidRes.9，6505，1981；Galas，D.J.和Schmitz，A.Nucleic Acid Res.5，3157-3170，1978)。这些方法不但很费力而且很费时，特别是它们还得使用既危险又昂贵的放射性元素。更重要的是，这些方法不能普遍的应用于高通量(high-throughput)的分析模式中。我们发展出数种不同的以生色团为基础的方法以检测和研究核酸结合因子，克服了凝胶转移测定法和多种核酸印记测定法所具有的缺陷。

与其他的检测方法相比，用生色团去检测分子有几个优点。生色团具有无可匹敌的检测敏感性，用生色团去检测单一的分子便可充分展示这一特点。(Weiss，S.Science 283，1676-1683，1999)。生色团的检测，生色团密度的变化或者发射光谱的变化，均可很轻易的通过选择特定的激发和发射波长来完成。由于生色团提供的是实时的信号，因此可以用显微镜来进行实时的过程监测和实时的细胞成像(参阅Lakowicz，J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy，Kluwer Academic/PlenumPress，New York，1999，特此提出以供参考)。另外，既有的非常完善的方法和仪器，可以完成高通量生色团信号的检测。

目前用生色团去检测溶液中核酸结合因子的方法，得依赖下列几个现象之一：(i)某种荧光染料(也叫荧光团或荧光探针或荧光标记)的荧光密度的变化，这种荧光染料可以出现在蛋白质里也可以出现在核酸中，这种改变是由探针对蛋白质-核酸复合物形式的微环境的干扰所引起的；(ii)该种荧光染料之荧光极性的变化，不论出现在蛋白质或核酸中，导致蛋白质-核酸复合物分子尺寸的增大，这是和未结合的核酸和蛋白质分子相对而言；以及(iii)核酸上荧光染料和蛋白质上荧光染料(或荧光抑制剂)之间的共振能量转移，这个现象是由在核酸-蛋白质复合物上的核酸和蛋白质彼此太接近所引起的。荧光信号检测方法的综述，请参阅Hill，.J.J.和Royer，C.A.Methods in Enzymol.278，390-416(1997)，特此提出以供参考。将荧光染料结合在核酸或蛋白质上，以应用荧光染料荧光密度的变化去检测蛋白质-核酸复合物的例子，请参阅下列技术文献：Sha.M.，Ferre-D’Amare，Burley，S.K.，Goss，D.J.J.Biol.Chem..270，19325-19329，1995；Reedstrom R.J.，Brown，M.P.，Grillo，A.，Rosen，D和Royer，C.A.J.Mol.Biol.273，572-585，1997；Erickson，G.H.和Daksis，J，WO 00/40753)。

第二种建立在荧光基础上的检测分析是荧光极化，它也常被用来检测蛋白质-核酸复合物形式(参阅Heyduk，T.和Lee，J.C.Proc.Natl.Acad.Sci USA 87，1774-1748，1990，特此提出以供参考)。这种方法的物理基础是，一个用荧光染料标记了的大分子，其荧光极化信号取决于该大分子的大小(Lakowicz，.R.Principles ofFluorecence Spectroscopy，Kluwer Academic/Plenum Press，New York，1999，特此提出以供参考)。因此，当蛋白质和核酸成分形成蛋白质-核酸复合物时，便形成了一个更大的分子整体，而其荧光信号也就随之改变了。使用荧光极化去检测蛋白质-核酸复合物的方法，在Royer中有所描述(1998，美国，Pat，No.5,756,292)，特此提出以供参考。

第三种建立在荧光基础上，用来检测蛋白质-核酸复合物形成的分析方法是共振能量转移(FRET)(Stryer，L..Ann.Rev.Biochem.47，819-849，1978，特此提出以供参考)。FRET的基础是，一个荧光染料(荧光供体)所发射的光能量可以转移到另一个接受分子(荧光受体)上，而接受分子也可以是另一个荧光染料。至于应用在核酸-蛋白质结合的检测上，FRET测定法的基础则是：当核酸与蛋白质结合时，同源核酸结合元件上的荧光染料与核酸结合蛋白上的荧光染料之间，变得更加接近。有好几篇已发表的论文，描述了对这种检测和研究蛋白质-核酸相互作用方法的应用(参阅Kane，S.A.，Fleener，C.A.，Zhang，Y.S.，Davis，L.J.Musselman，A.L.，Hunag，P.S.Anal.Biochem.278，29-39，2000，特此提出以供参考)。

综上所述，以冷光或荧光为基础的分析系统，乃是非常具有吸引力的用来检测核酸结合蛋白的工具。这项技术的发明人在此描述的是一个普遍性的、便宜的、简单的、多色或单色的荧光、冷光、X光线照相术的、重量分析的或比色分析的方法，用来检测序列特定性核酸结合因子或相关的辅调节物，此法并适用于高通量检测的形式。

发明概述

这项发明的基础概念是：一个核酸结合因子能稳定两个或多个核酸结合元件“半位点”或成分之间的相互作用，此处，两个或多个成分组合成一个完整的结合位点，从而可以与同源的核酸结合因子相结合。因此，这项发明可以作为生物传感器去评估一个样品中的核酸结合因子或核酸结合因子辅调节物的活性(例如检测其是否存在或为其定量)。若要检测样品中的核酸结合因子，只需将样品混合或加入核酸成分中便可。若要检测样品中的辅调节物，只需将样品混合或加入核酸成分和同源的核酸结合因子中便可，此处结合因子的活性乃是受到辅调节物的调节。辅调节物将会激活或抑制结合因子，从而间接地调节核酸成分使之形成一个完整的结合位点。可以使用各种不同的排列方式或实施方案去实际运作这项发明(图1)。

任何一种，以及所有已知的检测方法和可检测的标记，都可以用来检测核酸成分的结合与分离。虽然对熟练的技术人员而言，其实任何一种检测模式都应该能够有效的应用在这项发明的实际操作中，但是至少有四种主要的检测模式，是可以应用在这项发明的实际操作中的。第一种检测模式是一种以临近距离配对为基础的检测方法，这包括了诸如：荧光能量共振转移，荧光熄灭或者类似的方法(图1A，C和D)。第二种模式是一种以一致性xx为基础的检测方法，这包括了诸如：荧光交叉相关性分光镜或者类似的方法(图1B)。第三种模式是一种将可检测的标记物，捕获到一个固体支撑物上的检测方法，这包括了诸如：流式细胞仪(在此或是将核酸成分附上一个珠或是将被标记的核酸成分置于一个细胞里)，放射自显影或者类似的方法(图1E)。第四种模式是一种检测传感器表面物质浓度变化的检测方法，这包括了诸如：表面细胞质基因组共振检测或类似的方法(图1F)。

以下所描述的方法是，使用因距离缩短而产生无热光转移效应的临近距离配对法，去检测和定量核酸结合因子及其辅调节物。这项发明的其中一项实施方案是两个双链低聚核苷酸之间的结合或分离，亦即，当两个双链低聚核苷酸结合时，在低聚核苷酸的连接处可形成一个完整的核酸元件(见图1A)。核酸结合元件包含核酸结合因子的一个同源序列。将第一个低聚核苷酸附上一个荧光物标记，(在下文中我们将之称为荧光供体)，将第二个低聚核苷酸附上一个荧光熄灭分子标记，(在下文中我们将之称为荧光受体)。此处所谓的熄灭分子可以是激发波长比第一个荧光物低的另一个荧光物。将被附上荧光标记的低聚核苷酸，与含有或不含有核酸结合因子的样品相混合。混合时，如果含有核酸结合因子的话，核酸结合因子会与其同源核酸元件的两个成分结合，这会稳定两个成分之间的结合。当这两个成分非常接近时，第一个核酸成分的荧光供体，将其所发射的光能量，转移给第二个核酸成分的荧光受体，其结果是，荧光供体所发射的光被熄灭了。使用标准的分光光度计或荧光测定仪去测定荧光。荧光信号的熄灭和核酸结因子与同源核酸元件之间的结合是互相关联的。

如果准确、精确的针对荧光和荧光熄灭进行例行性测量的话，这项发明可以用来测量样品中某一核酸结合因子的特定活性或为其定量，测量某一核酸结合因子与其同源结合元件的解离常数或亲和性或者通过测量荧光波长或强度的变化，去检测样品中某一核酸结合因子的存在与否。

此发明的另一项实施方案是，将包含一个核酸结合元件並被附上标记的核酸成分(或低聚核苷酸“半位点”)置于溶液中，并可自由向各个方向扩散。另一项具体应用型式是，将核酸成分固定在固态底物上，例如多孔平板、微阵列载玻片、膜、微球体、光导尖端、光纤、传导材料或生物传感器设备。另一項具体应用型式是，将每一对或每一套配对的低聚核苷酸，通过连接分子连接起来，位于每一个低聚核苷酸末端的连接分子，将第一个低聚核苷酸和第二个低聚核苷酸连接起来，這个末端是每一个低聚核苷酸的核酸结合元件或荧光标记末端的末梢部位。被连接起来的低聚核苷酸配对(1)可以被固定在固态底物上，比如一个多孔平板、微阵列载玻片、膜、光导尖端、光纤、传导材料或生物传感器设备或微球体(2)可以在溶液中自由扩散，(3)可以被传递到一个细胞中，而此处的细胞可以是一个原核细胞或者一个真核细胞。

这个发明的另一项实施方案是，在一个单一的多聚核苷酸上的两处位点附上标记，第一个位点作为荧光供体，第二个位点作为荧光受体，而且两个标记之间的距离，要远到在没有转接核酸结合因子的情况下，荧光标记之间不会发生光谱相互干扰的情况。这项具体应用的其中一个层面是，核酸元件的一部分(成分)位于第一个位点附近，而这个核酸元件的其它部分(成分)则位于第二个位点附近。当核酸结合因子与上述核酸元件的两个部分相结合时，第一个位点会被带到第二个位点的附近，从而协助或稳定了荧光供体和荧光受体之间光谱的相互作用。这个具体应用型式的另一个层面是，第一个完整的核酸元件位于第一个位点上或其附近，第二个完整的核酸元件位于第二个位点上或其附近。当核酸结合因子或由核酸结合因子所组成的复合物(例如在一个增强复合体中)，结合到第一个和第二个元件上时，第一个位点会被带到第二个位点的附近，从而协助或稳定了荧光供体和荧光受体之间光谱的相互作用，这进而导致了一种由荧光能量的转移或熄灭所引起的可测量性的荧光变化。

任何建立在临近距离配对基础上或是建立在偶遇配对基础上的无热光检测方法，都可以应用到目前这项发明中。其具体应用型式包括但不仅限于荧光能量转移，无热光共振能量转移，荧光交叉相关分光镜，流式细胞仪，直接熄灭，基态复合物形成，化学发光能量转移，生物发光能量转移，以及激发态二聚体的形成。可以理解的是，对于熟练的技术人员而言，在他们考虑或者应用这项发明时，他们会发现这个领域中的其它检测方法也可以应用在这项发明中，因此那些检测方法也包括在这项发明的范畴内。

在这项发明中，任何荧光染料都可以被用来当作荧光供体或荧光受体，不过，优选受体的激发波长和供体的发射波长彼此相配。在另一项具体应用型式中，熄灭分子可以被用来当作荧光受体，而即使是受到激发它也不会发光。下列是一组荧光染料和熄灭分子的例子：Alexa Fluro350、Alexa Fluro430、Alexa Fluro488、Alexa Fluro532、Alexa Fluro546、Alexa Fluro568、Alexa Fluro594、AlexaFluro633、Alexa Fluro647、Alexa Fluro660、Alexa Fluro680、7-二乙酰胺香豆素-3-羧基酸、生色团、Oregon Green 488、Oregon Green 514、四甲基若丹明、若丹明X、德克萨斯红染料、QSY7、QSY33、丹磺酰、BODIPY FL、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、二烃基氨基香豆素、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、DTPA(Eu³⁺)-AMCA和TTHA(Eu³⁺)-AMCA。可以理解的是，熟练的技术人员会发现，任何可相容的荧光供体/受体配对都可适用于该发明中，而上述的荧光染料和熄灭分子只是一些范例，而非这项发明的范围限制。

在另一项实施方案中，除了使用以临近距离配对为基础的测定法之外，还可使用以流式细胞仪和比色酶为基础的分析方法，去检测核酸结合因子和其同源核酸元件的结合。在以荧光为辅助的细胞分类中，将一个核酸成分配上一粒珠或微球体，将另一个核酸成分配上无热光分子或荧光染料。

另一项具体应用是，将被附上标记的核酸成分置入一个含有核酸结合因子或其辅调节物的细胞内，细胞可以是原核细胞或真核细胞。这个细胞所发射的可检测信号的变化，可以指示核酸结合事件的发生。

另一项具体应用是，这项发明可以通过对病人诊断样品中各种核酸结合因子活性的测定，去诊断和记述疾病状态的特征。某些疾病涉及到核酸结合因子的错误表达。例如，有一些癌症涉及c-myc，c-fos，c-jun，rel或erbA(参阅Genes IV byLewin，p.890)等转录因子的超量表达。而另外一些癌症，例如某些乳腺癌和结肠直肠癌，则涉及到核酸修复酶的低量表达。在这个具体应用中，将活检样品与被附上标记的低聚核苷酸相结合，如上文所述，以便分析特定核酸结合因子的出现，缺席或特定活性。

在另一项实施方案中，这项发明使得一个检测和/或定量样品中细胞调节因子的方法得以产生，此处的细胞调节因子扮演辅调节物的角色，它协助或阻止核酸结合因子与同源核酸元件的结合。将一个可能含有调节因子的样品，与混合物或测试样品相混合，混合物或测试样品是由这项发明中被附上标记的低聚核苷酸或多聚核苷酸以及同源核酸结合因子所组成的，在此，核酸结合因子的核酸结合活性，完全或部分仰赖于前述辅调节物的存在与否。如果核酸结合因子需要上述辅调节物才能结合到同源核酸元件上的话，当样品中含有调节因子时，将会产生荧光能量转移或熄灭的现象。同样的，如果上述辅调节物干扰了核酸结合因子和其同源核酸元件的结合时，则不会产生荧光能量转移或熄灭的现象。

在另一项具体应用中，这个发明使得一种可以用来识别一些会影响核酸结合因子与核酸元件之间结合的试剂，药物，污染物或杂质的方法得以产生。这些试剂，药物，污染物或杂质也被视之为核酸结合因子的辅调节物。这个状况和检测和/或定量样品中细胞调节因子或辅调节物的方法类似(参阅前述)，所有可能的试剂，药物，污染物或杂质，与各种核酸结合因子以及被附上标记的低聚核苷酸配对，或者与由同源核酸元件所组成的核酸成分配对相混合。如果试剂，药物，污染物或杂质阻止或干扰核酸结合因子与完整核酸元件的结合，荧光的变化将不会被测量到。如果试剂，药物，污染物或杂质促进核酸结合因子与完整核酸元件的结合，增大的荧光能量转移或荧光的变化则会被测量到。

在另一项具体应用中，这项发明也使得一种阵列装置(array device)得以产生，这种阵列装置包含许多对被附上标记的低聚核苷酸，这些低聚核苷酸是以线性或多维式的模式，被附着在一个固体矩阵内或悬浮在溶液中。将被附上标记的核酸成分的同源配对，附着在固体底物的特定位点或悬浮在多孔平板的特定孔中，其中每个成分都含有完整核酸结合元件的一部分，这便是一个核酸结合因子的一个结合位点，而且第一个标记是一个荧光供体分子或者一个化学发光或比色底物，第二个标记则是荧光受体或者化学发光或比色底物的催化剂。固体底物可以是膜，例如硝化纤维，尼龙，聚偏二氟乙烯(PVDF)，也可以是多孔平板或者光导，光纤，传导材料，或生物传感器等它种适合此类用途的便利底物。这项具体应用的另一种方式是，通过将一个连接分子附着到每个低聚核苷酸末端所附着之标记末梢部分的方式，将每一个成分的同源配对彼此连结起来。将连结起来的低聚核苷酸配对，附着到一个特定阵列模式中的固体矩阵上，或将其置入一个多孔平板的特定孔中。另外，将含有数个核酸成分的阵列装置以行列的方式排列，其中每个多聚核苷酸含有一个或多个被附上标记的核酸结合元件，第一个标记是荧光供体分子或者化学发光或比色底物，第二个标记是荧光受体或者化学发光或比色底物的催化剂。同上述的低聚核苷酸配对一样，将每个特定的多聚核苷酸附着到一个固体底物的特定位点上或使其悬浮在一个多孔平板的特定孔中(参阅前述)。

这项发明使得运用生物传感器去检测核酸结合因子及其辅调节物得以成形，这项发明也使得运用以非临近距离配对为基础的检测法去检测核酸结合因子及其辅调节物的一些方法得以成形。按发明人的想法，只将一个核酸成分附上一个可检测的标记。这个标记可以是任何一种可检测的标记，例如荧光染料，载色体，酶，以及生物素、HRPO或放射性元素之类的连接分子。举例而言，如果可检测的标记是生色团的话，如上文所述，通过荧光的熄灭或极化可以检测到结合事件的发生。如果可检测的标记是生物素的话，使用一个抗生物素蛋白-过氧化物酶发展系统便可检测到结合事件的发生。这项具体应用的另一种方式是，将第一个核酸成分附着到一个固体底物上，例如：珠、玻璃载玻片、膜或多孔平板，将第二个核酸成分附上一个可检测的标记。当发生正结合时，被附上标记的核酸成分会结合到固体底物上，如此一来便可按照所使用的可检测标记种类，接着进行比色着色，荧光检测或放射能照像。

发明人更进一步认为，将第一个核酸成分附着到一个生物传感器的表面，结合因子与完整结合元件之间的结合，会导致传感器表面总质量的改变。从生物传感器表面所发射光线的变化，例如表面胞质基因共振(SRL)，可以检测出质量的变化。

上述总结只是简要地描述了这项发明首选的一些实施方案，并不是把这项发明限制在这些范围内。熟练的技术人员会发觉，这项发明还有其它可能的实施方案，而这些应用方式均是利用核酸结合因子协助两个核酸成分之间的结合，其中每个核酸成分都包含一个完整核酸结合元件的一部分，这个普遍性的原则。

附图简述

图1是核酸结合因子或辅调节物生物传感器的总体设计描述。1A所描述的基本双成分系统仰赖以临近距离配对为基础的检测测定法，其中第一个核酸成分和能量供体相结合，第二个核酸成分和能量受体相结合。1B所描述的基本双成分系统依赖以符合配对为基础的检测测定法。1C描述的是生物传感器的设计，其中两个核酸成分通过一个灵活的连接分子被连接在一起。1D描述的是一个经过修改的双成分相连接的生物传感器图像，其中相连接的成分被附着到一个固体底物上。1E描述了生物传感器的一种版本，其中第一个成分被附着到一个固体底物上，第二个成分被附上一个可检测的标记。1F描述的是生物传感器的一种版本，其中第一个成分被附着到一个表面上，这个检测方法依赖的是对表面质量变化的测量。

图2展示的是，根据图1所陈列的设计，在含有核酸结合因子的情况下，荧光信号在理论上的模拟变化。

图3描述的是使用序列编号从1到4(SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：4)被附上荧光染料标记的低聚核苷酸，去检测CAP蛋白。

图4展示的是图3中所陈列的核酸分子的荧光光谱。含有CAP和cAMP(B组，曲线2)，不含有CAP(A组)，含有CAP但不含有cAMP(C组)，含有Trp抑制蛋白质(D组)。

图5描述的是对照试验，在该试验中，一个含有CAP结合位点，未被附上标记的DNA片断，阻止了在含有CAP时可观察到的荧光信号的变化，而一个非特定性的DNA片断，不会影响荧光信号的变化。

图6描述的是荧光信号改变的程度对CAP蛋白浓度的依赖性。

图7描述的是当含有CAP时，荧光信号的变化与时间的关系。

图8显示的是使用7-二乙基香豆素-3-羧基酸去检测CAP蛋白。曲线1代表不含有CAP蛋白的情况，曲线2代表CAP蛋白浓度为100nM的情况。

图9描述的是在检测CAP蛋白时，针对不同波长所使用的荧光比率。曲线1-9代表CAP的增加量，分别从0到150nM。

图10描述的是核酸结合因子的辅调节物cAMP对CAP与CAP1/CAP4以及CAP2/CAP3 DNA双链结合所产生的影响。在不含有cAMP的情况下，没有发生可检测的结合。

图11显示的是一种测定法的设计，在这种测定法中，两个核酸分子通过灵活的长连接物被共价健连接起来，以排除此测定法对DNA浓度的依赖性，并缩短试验所需要的时间。B组描述的是间隔-18-氨基磷酸酯(spacer-18-phosphoramidate)原子团的其中一个单位。

图12描述的是使用图11中所陈列的共价连接设计，在含有CAP的情况下所观察到的荧光信号的变化。B组描述的是使用灵活-连接物的建构后，荧光熄灭的反应时间。

图13描述的是使用序列编号从12到15(SEQ ID NO：12-15)，被附上荧光染料标记的低聚核苷酸，去检测LacR蛋白。

图14描述的是因LacR蛋白与同源DNA序列相结合而引起的荧光熄灭。曲线1-7分别代表LacR蛋白逐渐增加的量，从0到200nM。

图15描述的是序列编号从16到19(SEQ ID NO：16-19)，含有部分TrpR蛋白的结合位点的核酸二聚物。

图16描述的是因TrpR蛋白与同源DNA序列相结合而引起的荧光熄灭。曲线1-5分别代表TrpR蛋白逐渐增加的量，从0到800nM。

图17描述的是同时使用两种颜色去检测两种蛋白质：CAP和TrpR。A组描述的是在433nm激发波长处所得到的荧光光谱，B组描述的是在490nm激发波长处所得到的荧光光谱。曲线1是两种蛋白都不含有的情况；曲线2是只含有CAP的情况；曲线3是只含有TrpR的情况；曲线4是两种蛋白都含有的情况。C组总结了A组和B组的结果。

图18描述的是含有部分p53蛋白核酸结合元件，序列编号从20到23(SEQ IDNO：20-23)的核酸二聚物。

图19描述的是因p53蛋白结合到同源核酸结合元件上所引起的荧光熄灭。曲线1-5分别代表p53蛋白逐渐增加的量，从0到130nM。

图20描述的是生物传感器的总体设计，使用一个受辅调节物调节的序列-特定性核酸结合因子，去决定一个核酸结合蛋白辅调节物的活性。

(A)一个蛋白质与辅调节物相结合，使得该蛋白质与DNA的结合活性为之提高的例子

(B)一个蛋白质与辅调节物相结合，使得该蛋白质与核酸的结合活性为之降低的例子

例(A)中，辅调节物与蛋白质的结合，增加了蛋白质对DNA的亲和力，从而使两个核酸成分(半定位点)得以在蛋白质的诱导下结合。这种结合增加了两个核酸成分中荧光探针之间的亲近度，进而导致出现很高的FRET信号，而这是以溶液中辅调节物的量相对而言。例(B)中，在不含有辅调节物的情况下，蛋白质展现了高度的核酸亲和力，这使得两个核酸成分(半定位点)得以在蛋白质的诱导下结合。这种结合使得在缺乏辅调节物的情况下，出现很高的FRET信号。核酸结合蛋白辅调节物与蛋白质的结合，降低了蛋白质对同源核酸元件的亲和力，这会造成蛋白质-核酸复合物的解离。而这又导致了两个核酸成分的解离，从而造成FRET信号的降低，这是以溶液中辅调节物的量相对而言。

图21显示的是对cAMP的检测。将浓度逐渐增加的cAMP加入混合物中，该混合物含有2nM被附上生色团标记的CAP-特定性第一个核酸成分，以及3nM被附上丹磺酰(dabcyl)标记的CAP-特定性第二个核酸成分。将混合物放在室温下恒温反应2小时，然后读取荧光密度读数。

图22显示的是对色氨基酸的检测。将浓度逐渐增加的色氨基酸加入混合物中，该混合物含有250nM被附上生色团标记的TrpR-特定性第一个核酸成分，以及300nM被附上丹磺酰(dabcyl)标记的Trp-特定性第二个核酸成分。将混合物放在室温下恒温反应2小时，然后读取荧光密度读数。

图23显示的是使用荧光偏振法去检测TrpR。将浓度逐渐增加的色氨基酸加入含有4nM被附上生色团标记的25bp DNA双链体的混合物中，该混合物含有一致的TrpR结合位点。将混合物放在室温下恒温反应2小时，然后读取荧光密度读数。

图24描述的是用生物传感器去检测IPTG。将浓度逐渐增加的IPTG加入混合物中，该混合物含有50nM被附上生色团标记的LacR-特定性第一个核酸成分，60nM被附上丹磺酰标记的Lac-特定性第二个核酸成分。将混合物放在室温下恒温反应2小时，然后读取荧光密度读数。

发明详述

定义

任何类似于或相当于下列所描述的方法及材料，都可以用在此发明的测试或实际应用中，以下所描述的，只是我们较喜欢的方法及材料。特为这项发明，定义下列名词。

此处所谓的“标记”，“可检测的标记”或“探针”是指任何被附着到一个核苷，核苷聚合物，或核酸结合因子的化学原子团，其附着的方式可以是共价结合，也可以是非共价结合。优选使用可以被检测到的标记，如此上述所说的核苷或核苷聚合物才可以被此发明的实际操作者检测到。可检测的标记包括：无热光分子，化学发光分子，荧光染料，荧光熄灭试剂，有色分子，放射性同位素或闪烁材料。可检测的标记也包括任何有用的连接分子(例如生物素，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，HRPO，蛋白质A，蛋白质G，抗体或抗体片断，Grb2，磷酸化酶，Ni2+，FLAG标记，myc标记)，重金属，酶(如碱性磷酸化酶，过氧化酶，萤光素酶)，电子供体/受体，吖啶酯(arcidinium ester)，染料，以及比色底物。在发明人的思考中，质量的变化也可以视为一种可检测的标记，比方说表面胞质基因共振检测便是一例。熟练的技术人员很可能会发现其它种在上文中没有提及的有用可检测标记物，这些可检测标记物也很可能隶属于这项发明的操作范围。

“检测法”或“检测的方法”这个名词，指的是去预测一个核酸结合因子与一个完整核酸结合元件之间的结合事件。检测方法必然与所使用标记的原始状态有关。例如，如果第二个核酸成分被附上诸如³³P的放射性核种，第一个核酸成分被附上诸如尼龙膜的固体底物，可以使用通过放射能照像法或放射性闪烁照相法去检测贝塔粒子的检测方法。如果第一个核酸成分被附在多孔平板的孔内，第二个核酸成分被附上生物素的话，则可以使用抗生物素蛋白-过氧化物酶或抗生物素蛋白-碱性磷酸化酶的试剂盒(kit)去进行检测，这些试剂盒均可购得，亦很普遍。然后将多孔平板放入读卡机中进行比色分析。如果第一个核酸成分被附上荧光供体，第二个核酸成分被附上荧光受体的话，可以使用以临近距离配对为基础的分析方法去进行检测，例如FRET。检测方法也可能涉及到质量变化的检测，例如表面胞质基因共振(surface plasmon resonance)的例子。举例而言，若将一个或所有的核酸成分附在传感器芯片的表面，而核酸结合因子的结合引起了其表面质量的变化，这会导致传感器芯片表面光学共振的变化。表面胞质基因共振在Abery，J.，“检测结合分子的连结(Detecting Molecular Ties that bind)”Modern Drug Discovery 4：34-36(2001)一文中有所讨论，特此提出以供参考。上述的检测方法仅仅是范例，本发明并不仅限于这些检测方法。熟练的技术人员很可能会发现其它种在上文中没有提及的有用检测方法，这些检测方法也很可能隶属于这项发明的操作范围内。

此处所谓的“无热光”或“发无热光的”意思是指任何的发光过程，包括荧光，磷光，闪光，化学发光，以及生物发光。

此处所谓的“荧光染料”是指被激发时，其发射光的波长比激发光的波长更长的一个荧光复合物。所谓的“荧光供体”是指在这项发明所描述的测定法中，其所发射的光被测量的一个荧光染料。更确切的说法是，一个荧光供体发出的光被一个荧光受体吸收。所谓的“荧光受体”是指可以吸收荧光供体所发之光的第二个荧光染料或熄灭分子。第二个荧光染料吸收荧光供体发射的光，并且发射比荧光供体所发之光的波长更长的光。熄灭分子仅仅吸收荧光供体发射的光。

任何无热光分子，优选荧光染料和/或荧光熄灭剂，均可用在这项发明的实际操作中，这其中的例子包括Alexa Fluro350，Alexa Fluro430，Alexa Fluro488，Alexa Fluro532，Alexa Fluro546，Alexa Fluro568，Alexa Fluro594，AlexaFluro633，Alexa Fluro647，Alexa Fluro660，Alexa Fluro680，7-二乙酰胺香豆素-羧酸，生色团，Oregon Green 488，Oregon Green 514，四甲基若丹明，若丹明X，德克萨斯红染料，QSY7，QSY33，丹磺酰，BODIPY FL，BODIPY 630/650，BODIPY 650/665，BODIPY TMR-X，BODIPY TR-X，二烃基氨基香豆素，Cy5.5，Cy5，Cy3.5，Cy3，DTPA(Eu³⁺)-AMCA和TTHA(Eu³⁺)-AMCA。

此处所谓的“化学发光”，“化学发光的”或“化学发光底物”是指一个化学物质由于发生化学反应而导致发光。常用的化学发光底物包括：鲁米诺(5-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮)，洛粉碱(2，4，5-三苯基咪唑)，光泽精(二氮甲基-吖啶)，其它吖啶酯和生色团-萤光素酶。例如，在Amersham公司的识别ECL^TM检测系统中，吖啶底物被山葵过氧化酶氧化后，生成吖啶酯，在pH值为碱性时，与过剩的过氧化物反应，在430nm处产生可见的化学发光。

此处所谓的“比色的”或“比色底物”是指一个化学物质因化学反应而生成有色产物，其所产生之光的吸收性质的变化。在一个已知的例子中，p-硝基苯基硫磷酸盐在含有碱性磷酸化酶的情况下，水解生成p-硝基酚，在波长405nm处吸收光(黄色)。另一个例子是，p-苯基二胺加上苯磷二酚在含有过氧化酶和过氧化物的情况下会生成一种褐黑色的物质。

此处所谓的“核酸”是指低聚核苷酸或多聚核苷酸，它们可能被修饰过或者带有修饰碱基。低聚核苷酸是一条单链核苷酸聚合体，由2到60个核苷所组成。多聚核苷酸是由两个或两个以上的核苷所组成。多聚核苷酸可以是双链DNA，包括退火的低聚核苷酸，其中第二条链是一条具有和第一条低聚核苷酸反向互补序列的低聚核苷酸，也可以是含有脱氧胸腺嘧啶的单链核酸聚合物，单链RNA，双链RNA或RNA/DNA杂交双链。

此处所谓的“核酸成分”一般是指一对连结的，彼此互补的单链低聚核苷酸，它们各包含一个核酸结合元件的一部分，而当两个核酸成分彼此相结合时，就形成了一个完整的核酸结合成分。此处所谓的核酸成分也可以指一个多聚核苷酸包含了部分核酸结合元件的那个部分，当两个核酸成分相结合时，便形成一个完整的核酸结合成分。因此，单一的多聚核苷酸可能会含有第一个和第二个核酸成分。这里所谓的“一套核酸成分”是指成对的第一个核酸成分和第二个核酸成分，当这对第一个和第二个核酸成分彼此结合之后，便共同组成了一个完整的核酸结合成分。一套核酸成分也可能包含两个以上的成分，为检测DNA修复酶或RNA剪接因子而设计的生物传感器便是一例。

此处所谓的一个“完整的核酸结合元件”是指一个具有足够的长度和序列，去和核酸结合因子稳定结合的核酸序列。在这项发明的某些实施方案中，一个核酸成分可能只包含一个单一的完整核酸结合元件，而一套核酸成分则包含两个或两个以上，彼此在功能上互相合作的核酸结合元件。在这类的实施方案中，当含有转录因子或其他核酸结合因子时，核酸结合因子与一个或多个核酸元件的结合事件，就可以被检测到。数套核酸成分可以被组合在一起去检测多种不同的核酸结合因子。更甚者，数套核酸成分也可以被集合成一个矩阵，去监测多种不同的核酸结合因子或核酸结合蛋白的辅调节物。此处所谓的“核酸结合元件”或“核酸元件”是指一个与蛋白质或其它原子团相结合的核苷序列。更佳的定义是，核酸元件是一个与同源核酸结合蛋白或因子相结合的特定核苷序列。此处所谓的“同源”意指两个化学实体之间的特定识别，例如：一个配体与其同源受体，或是一个酶与其同源底物。核酸结合元件的例子包括：启动子，操纵基因，增强子和沉默子，以及它们的一部分。

此处所谓的“阵列”是指以线性，二维或三维格式排列的，具独特性的第一个核酸成分或成对的核酸成分。一个矩阵可能含有成分散格式排列，被附着到固体底物上的第一个核酸成分或数套核酸成分，其中“固体底物”是指固体的、半固体的或超低温液体表面的物质或矩阵。固体底物的例子包括：膜、多孔平板、玻璃载玻片或纤维，芯片，光导，光纤，导体，生物传感器设备或微球体。我们认为，一个阵列亦可含有数套，溶解在溶液中分散在一个多孔平板孔内的核酸成分。

此处所谓的“核酸结合因子”是指结合在核酸上的化学物质。在较佳的一项实施方案中，核酸结合因子可以是一个，与同源核酸结合元件相结合的蛋白质，多肽或多肽的片断，因此这里也将之称为“核酸结合蛋白”。在最好的一项实施方案中，核酸结合因子可以是一个，能够直接与特定的同源DNA序列相结合的序列-特定性核酸结合蛋白。在其它较佳的实施方案中，核酸结合蛋白或因子可以是一个，能够间接与核酸元件相结合或与其它核酸结合因子联合起来协助或阻止其它核酸结合因子之功能的蛋白质、多肽、多肽片断或其它化学结构。转录激活因子，转录抑制因子或者增强子的其它成分虽然并不直接与核酸相结合，但是由于它们可以与其它核酸结合因子相结合以影响基因的活性，因此它们也包括在此项定义的范围内。

另一项实施方案是，从某一个研究对象取得样品，样品中含有核酸结合因子和核酸结合蛋白辅调节物。这位研究对象最好是患有某种癌症或它种基因组不稳定性疾病的病人，而患者的疾病可能是由DNA修复酶活性的降低所引起的。研究对象也可以是动物，植物，微生物或一个细胞。样品最好是含有核酸结合因子的“细胞物质的提取物”，并且最好是完全不要对核酸结合元件有所干扰或竞争。

核酸结合因子可以包括：转录因子，染色质重塑因子，基因组维持酶等等。Benjamin Lewin在 Genes VII，牛津大学出版社，纽约，2000年发表的一篇论文中，列出了数种类型的核酸结合因子及其描述，特此提出以供参考。

转录因子与诸如启动子、增强子和沉默元件等特定同源核酸元件相结合，并且负责基因表达的调控。依细胞属性，转录因子可以是转录激活因子，转录抑制因子，或者两者皆是。转录因子包括p53，c-myc，c-jun，c-myb，c-fos，，c-rel，c-erbA，E2F，-联蛋白，cAMP受体蛋白(“CAP”)，Lac抑制子(“LacR”)，类固醇受体，同结构域蛋白质(homeodomain protein)，POU结构域蛋白质，螺旋-转角-螺旋转录因子，碱性螺旋-环-螺旋转录因子(bHLH)，碱性亮氨酸拉链转录因子(bZip)，锌指转录因子和核子激素受体。

增强子复合物是由一套转录因子的子集所组成的。此处所谓的“增强子复合物”是指一个由数个转录因子所组成的大型核蛋白质复合物，彼此之间相互结合到增强子中的数个结合位点上。增强子复合物的一个重要成分是HMG-1，这是一个和DNA双螺旋小沟结合，促进DNA弯曲的核酸结合因子。增强子复合物蛋白质包括：DNA-弯曲蛋白，含HMG框的蛋白，SRY，LEF-1，HMG-1，HMG-2，转录因子和基础转录因子。

此处所谓的“基础转录因子”是指RNA聚合酶II以及它的相关因子，这是此学术领域中普遍知悉的事。基础转录因子包括：RNA聚合酶II，TFIID，TFIIA，TATA-结合蛋白，TFIIB，TFIIF，TFIIE，TATA-结合蛋白相关因子，NTF-1和Sp1。

染色质-重塑因子参与了异染色质(或其它无转录活性的区域)和常染色质(或其它有转录活性的区域)的维持。它们并且参与了染色体伸展的全面休止以及基因组印迹等现象。染色质-重塑蛋白质包括：核小体蛋白质，(如组蛋白)，组蛋白氨酰转移酶(HATs)，组蛋白脱氨酰酶(HDACs)，氨基酸甲基转移酶(如精氨酸甲基转移酶)，DNA甲基转移酶，核胞浆素，高迁移率蛋白质组(HMG)，抑制复合蛋白质，polycomb-相关因子，trithorax-相关因子，SWI/SNF复合物的成分，Sin3抑制复合物的成分，RSC复合物的成分，NURF复合物的成分，PcG复合物的成分，trxG复合物的成分，CpG甲基化酶，MeCP1和MeCP2等等。

基因组-维持酶是对损伤DNA的修复、DNA的忠实复制、或在重组过程中对遗传信息的交换很有用的核酸结合因子和它种蛋白质。它们包括：DNA聚合酶，RNA聚合酶，碱基切除修复酶，核苷切除修复酶，同源重组酶，末端连接酶，错配修复酶，外切酶，内切酶，双链解对修复酶，单链解开修复酶，转录配对修复酶，连接酶，贯穿损害(translesion)合成酶，端粒代谢酶等等。在这项发明中，由于p53的角色是一个细胞的周期检验点基因产物，因此它既被视为是基因组维持酶，又被视为是转录因子。

此处所谓的“一个核酸结合因子的活性”是指样品中核酸结合因子的一个完整核酸结合元件的特定活性，量或亲和力，以及包含一对核酸成分或完整核酸结合元件的核酸成分配对之间的结合调节。

此处所谓的“连接子”或“连接分子”是指任何连接在一对核酸成分上的聚合物，这一对核酸成分包含一个完整的核酸结合元件，而连接方式可以是共价连结或非共价连结。连接子可以是氨基酸，核苷或类似的多聚物。连接分子优选具有通融性，而且不会干扰核酸结合因子和核酸成分配对之间的结合。连接分子优选由12个间18氨基磷酸酯的原子团所组成(Glen Research，Sterling，VA)，兹将其结构陈列在图11B中。

此处所谓的“核酸结合蛋白辅调节物”一般是指小分子的调节复合物(配体)，药物，污染物，重金属，污杂质，毒素，任何化学原子团(可能是离子或分子复合物)，细胞事件，例如一个转录后修饰或氨基酸聚合物，基本上任何有能力调节核酸结合因子与核酸结合元件之间结合的物质都包括在内。核酸结合蛋白调节物也包括，但不仅限于，第二信使分子，例如：钙离子，cAMP，一氧化氮(NO)，和IP3。其它种核酸结合蛋白辅调节物的例子包括：抗生素以及其它药物，S-腺苷甲硫氨酸，类固醇，全反视黄酸复合物，甲状腺激素，维他命D，亚砷酸盐和转录辅调节物。若要进一步了解核酸结合蛋白调节物，请参考Clackson，T.，“Controlling mammaliangene expression with small molecules”(小分子对哺乳动物基因表达的控制)Curr.Opin.Chem.Biol.1：210-218(1997)，Mannervik等，“Transcriptional coregulatorsin development”(发育中的转录辅调节物)，Science 284：606-609(1999)和“GenesVII，”Benjamin Lewin，牛津大学出版社，特此提出以供参考。核酸结合蛋白辅调节物还包括诸如磷酸化，酯化，其它转录后修饰，与载体分子的结合和解离等细胞事件，以及影响或调解核酸结合因子与核酸元件之间结合的蛋白质水解事件。核酸结合蛋白辅调节物包括那些会影响细胞事件的酶和原子团。核酸结合蛋白辅调节物也包括任何调节核酸结合因子与核酸元件之间结合的药物，试剂，反应物，预期药物，预期试剂或预期反应物。“调节”或“调节结合”是指部分或完全干扰或协助核酸结合因子与同源核酸元件之间的结合。例如，如果一个所谓的辅调节因子(1)能够使核酸结合因子与其同源结合元件相结合，而当这个辅调节因子不存在时，结合因子便不会与其同源元件相结合；或(2)能够使核酸结合因子与其同源结合元件彼此解离，而当这个辅调节因子不存在时，结合因子与其同源元件彼此会结合，那么便可以说辅调节因子调节了核酸结合因子的活性或调节了核酸结合因子与其同源核酸元件之间的结合。

此处所谓的“核酸结合蛋白辅调节物的活性”包括样品中辅调节物的特定活性或量，这其中的活性又包括核酸结合因子与一个同源核酸结合元件之间亲和力的增加，协助核酸结合因子与其同源核酸结合元件之间的结合，核酸结合因子与一个同源核酸结合元件之间亲和力的降低或阻止核酸结合因子与其同源核酸结合元件之间的结合。

此处所谓的“生物传感器”或“生物传感测定法”是指使用任何以核酸、多肽、碳水化合物、脂类、类固醇等生物分子为基础的仪器或合成物，去检测、定量或决定核酸结合元件或其片断、核酸结合因子或核酸结合蛋白辅调节物的活性，其中包括会影响核酸结合因子活性的细胞事件和转录后的修饰在内。

本发明实施方案的描述

此处陈述的是一种崭新的，用来决定核酸结合因子和其辅调节物活性的生物传感器和方法。此处所描述的这种崭新的生物传感器和方法，较已有的技术明显优越和杰出。这些优点包括高敏感性、高信噪比率、适用于多种检测形式，因此这项发明的操作者，可以选择最适合他们所使用筛选系统的检测形式。这项发明的关键构思是，制备两个核酸分子，并将一个同源蛋白质结合位点的序列，分置于两个核酸分子上。这两个核酸分子(此处指核酸成分)可以包含两个短的补充用伸出臂，这样两个核酸成分就会产生一些结合的倾向，但是这种倾向必需设计的比较低，这样在没有蛋白质的情况下，这两个核酸分子便几乎不会发生结合的现象。两个核酸成分的结合，为蛋白质重新创造了同源结合位点，因此在蛋白质存在的情况下，蛋白质对其同源核酸结合位点的亲和力，会驱使两个核酸成分完成结合。核酸-蛋白质复合物形成的检测，乃是通过将两个核酸成分，分别附上无热光探针、荧光染料、化学发光底物、或比色底物这些标记来完成的。在一个核酸-蛋白质复合物中，两个核酸片段之间的临近距离，为荧光信号的变化，或因核酸-蛋白质复合物的形成而产生的比色/化学发光产物，提供了一个机制。而且，在单一的生物传感器中，尤其是应用这项发明去决定DNA修复酶的活性时，可以使用两个以上的核酸成分。

在此项发明的另一项实施方案中，可以将其中一个核酸成分附着到一个固体底物珠上(微球体)，将另一个核酸成分附上可检测标记，例如无热光或荧光探针。当一个同源核酸结合因子存在时，便会形成一个核酸-蛋白质复合物，这样珠或微球体就会被附上可检测标记了。可用已知的检测技术去检测被附上标记的珠或微球体，例如以荧光剂促动的细胞分类法或流式细胞计数仪。这项实施方案代表建立在偶遇配对基础上的无热光信号检测方法。

很显然，当熟练的技术人员实际应用这项发明时，他们会发现，可以将这些核酸成分放入原核或真核细胞中，其中一个或更多的核酸成分可以附上可检测标记。将核酸或其它生物分子导入细胞的方法，在这个学术领域中已经非常成熟，例如电穿孔法，聚阳离子脂质转染法等等。发明人的构想是，细胞可以自然表达，也可以将之修饰后去表达核酸结合因子或其辅调节物。而核酸结合事件则可以通过细胞发光的变化去加以检测。

任何建立在临近距离配对或偶遇配对基础上的无热光信号检测法，例如FRET(Stryer，L.Ann.Rev.Biochem.47，819-846，1978)，荧光交叉相关分光镜(FCCS)(Maiti等，Proc.Natl Acad Sci USA 94，11753-11757，1997)，流式细胞计数仪(Nolan和Sklar，Nature Biotechnology 16：633-638，1998)，闪光亲近测定法(“SPA”)(Hart and Greenwald，Molecular Immunology 16：265-267，1979；美国专利号4,658,649)，无热光共振能量转移(LRET)(Mathis，G.Clin.Chem.41，1391-1397，1995)，直接熄灭(Tyagi等，Nature Biotechnology 16，49-53，1998)，基态复合物的形成(Paekard，B.Z.，Toptygin，D.D.，Komoriya，A.和Brand，L.：Biophys.Chem.67，167-176，1997)，化学发光能量转移(CRET)(Campbell，A.K.和Patel.A.Biochem.J.216，185-194，1983)，生物发光共振能量转移(BRET)(Xu Y.，Piston D.W.，Johnson，Proc.Natl；.Acad.Sci.96，151-156，1999)，或激发态原子的形成(Lakowicz，J.R.，Principles of Fluorescence Spectroscopy，kluwer Academic/Plenum Press，NewYork，1999)都与这个分析的设计相兼容。再者，发明人认为，任何化学发光测定法或比色测定法，例如，识别碱性磷酸酶-NB/BCIP系统的技术，都可以应用在这项发明中。发明人更进一步认为，因为这项发明是建立在所有核酸结合蛋白的共性基础上，而非某一特定蛋白质的特性之上，所以它对任何核酸结合蛋白都适用。这项发明的信号检测模式和其所使用的荧光探针的性质，都具有很大的灵活性。这项发明并可进行多色检测。

根据上述对此项发明的介绍，当样品中的两个核酸成分，分别被附上具有不同发射波长的荧光染料标记时，可以使用荧光交叉相关分光镜法(FCCS)去测量荧光密度信号的波动。在同源核酸结合因子存在的情况下，通过检测两个荧光染料每个信号间的交叉相关性，可以测量两个被附上荧光染料标记的核酸成分之间的结合。使用荧光交叉相关分光镜法，去检测两个被附上不同荧光染料标记的大分子间结合的方法，在“用双色荧光交叉相关分光镜法去研究两个DNA双螺旋键同时与NtrC-增强子复合物的结合”一文中，有具体描述(Rippe，K.，“Simultaneous Binding of twoDNA duplexes to the NtrC-Enhancer complex Studied by Two-color FluorescenceCross-correlation Spectroscopy”，Biochemistry 39，2131-2139，2000)，特此提出以供参考。

根据上述对此项发明的介绍，也可以使用流式细胞计数仪，去检测被附上无热光或荧光标记的核酸成分与“目标”核酸成分之间的结合，其中“目标”核酸成分被固定在微球体的表面。在类似情况下使用流式细胞计数仪，可参考“流式细胞计数仪的出现，得以对分子间的相互作用进行高敏感性的实时测量”一文(Nolan，J.P.和Sklar，L.A.“The emergency of flow cytometry for sensitive，real-time measurementsof molecular interactions”Nature Biotechnology 16，633-638，1998)，特此提出以供参考。在其中一项实施方案中，一个核酸成分被固定在微球体上，这个核酸成分可以被附上或者不被附上一个荧光染料标记，此处的微球体其直径最好是几个微米。第二个核酸成分可以被附上一个荧光染料标记，如果被附在微球体上的核酸成分也被附上一个荧光染料标记的话，则这两个荧光染料的颜色必需不同。当同源核酸结合因子存在时，流式细胞计数仪可通过对微量荧光变化的测量，或两个不同颜色荧光比例的变化(如果两个核酸成分都被附上一个荧光染料标记的话)，去测量两个核酸成分之间的结合。

根据上述对此发明的介绍，发明人认为，闪烁亲近测定法(SPA)亦可用来决定核酸结合因子的活性。在其中一项具体应用中，一个核酸成分被附在含有固体闪烁体的微球体上，另一个核酸成分被附上放射性同位素标记，优选用氚。在同源核酸结合因子存在的情况下，放射性同位素标记会被带到与含有固体闪烁体的微球体非常接近的位置，从而诱导发光物发射光。SPA的使用方法请参考Hart和Greenwald，Molecular Immunology(分子免疫学)16：265-267，1979和美国专利号4,658,649，特此提出以供参考。

在这项发明的另一项实施方案中，这项发明提供了一套方法，可以快速的测定核酸-蛋白质复合物的物理参数，例如解离常数。这项发明还提供了一套，测定核酸结合因子与不同核酸结合元件之间亲和力的方法。在这项实施方案中，包含多种核酸结合元件的核酸，和核酸结合因子、被附上标记的同源核酸结合成分混合在一起。与对照组相比，这些不同的核酸结合元件通过对核酸结合因子的竞争，对发光信号会产生影响。

更进一步，假设许多蛋白质的核酸结合活性是通过其它分子或核酸结合蛋白辅调节物来调节的话，例如cAMP或IP3，那么这项发明可谓提供了一套，可以用来检测这些其它分子或核酸结合蛋白辅调节物的方法。同样的道理，这项发明可以作为一项平台技术，去识别新的试剂、它种核酸结合蛋白辅调节物和分子、或者调节核酸-蛋白质复合物之间交互作用的药物。这项发明并可进一步用来识别，包含一个增强子复合物或超数染色体结构的蛋白质，在这些结构中，蛋白质并不是直接结合在DNA上，而是直接或间接地结合在其它的核酸结合因子上。

图1A说明的是在上述这项发明中所描述的，检测序列-特定核酸结合因子的基本概念。较好的一种实施方案是，制备两个核酸成分，其中每个核酸成分都包含一个和蛋白质的同源结合位点相对应的部分核酸序列。熟练的技术人员在操作中很容易发现，这些核酸成分可以有好几种不同的可能设计。在其中一项实施方案中，两个核酸成分各含有一小段互补的突出端，以使这两个成分具有一些结合倾向。在另一项实施方案中，发明人认为，这项发明对检测那些可以有效地与一段短的DNA序列结合的蛋白质非常有用，比方说，10或10以下的碱基对(bp)，两个核酸成分相当于一个核酸复合物的两条单链成分。由于所伸出的“单链“突出端的长度，决定两个核酸成分在没有同源蛋白质存在时的结合倾向，因此所选择的突出端长度，需使在分析中所使用的核酸成分的浓度下，两个核酸成分之间会发生自发连接的效率非常低。因此，在同源蛋白质不存在的情况下，两个核酸分子几乎不发生结合。而在同源蛋白质存在的情况下，蛋白质对核酸的亲和力，会促使两个核酸成分结合，进而形成一个特定的核酸-蛋白质复合物。两个核酸成分的再结合，使得两个标记或荧光染料紧密接触，这种由蛋白质诱导的紧密接触，会造成无热光信号的变化或生成一种有色产物，这些都可以表示核酸-蛋白质复合物的形成。

这项发明较佳的实施方案的物理学基础，乃是建立在形成核酸-蛋白质复合物所需的自由能(G⁰)，和结合平衡常数(K)之间的关系上，结合平衡常数代表在任何一个既定的核酸和蛋白质浓度下，所形成的核酸-蛋白质复合物的量。

(公式1)G⁰＝-RTInK

假如将蛋白质结合到其同源核酸位点的自由能是G⁰，那么将同源结合位点分成两个“半位点”使其变成两个分开的核酸成分的话，就会使结合到每个半位点的自由能变成大约1/2 G⁰，请参考图1A的描述。由于自由能(G⁰)和结合平衡常数(K)之间是一种对数关系(公式1)，若将结合自由能减为一半，会使得结合常数降低好几级。因此，当一个蛋白质可以有效地与其同源全位点相结合时，可以被检测到的蛋白质与其半位点之间的结合应不会发生。蛋白质与全位点之间，以及蛋白质与半位点之间亲和力的巨大差别，是当蛋白质存在时，两个核酸半位点再连接的推动力。

鉴于这项发明并不受传统理论的束缚，以下的反应程式，描述的是图1所陈列之检测系统的作用：

                  K₁             Ko

(公式2)DNA-A+D-DNA·D-DNA-DNA-A+P·P-(D-DNA-DNA-A)

其中，DNA-A代表被附上受体标记的DNA半位点，DNA-D代表被附上供体标记的DNA半位点，P代表核酸结合因子，K₁代表连接DNA-A和D-DNA成分的结合平衡常数，Ko代表蛋白质P和其同源核酸结合位点的结合平衡常数，两个不同长度的补充性突出端的计算结果，陈列在图2中，突出端的长度决定K₁的值。这些模拟显示出，此处以及图1中所描述的有关这项发明的基本设计，是可行的，而且使用这项设计可以轻易测量到可检测信号的变化，不论信号变化来自荧光能量的转移，或是化学发光或有色物质的生成，只要使用一般用来观察核酸结合因子的一个范围宽广的平衡常数，便可检测到信号的变化。因此，这项发明之所以对任何核酸结合因子皆具有普遍的实用性，乃是因为它的基础是建立在所有核酸结合因子的普遍性特质上，这个普遍性的特质便是，结合到一个完整同源结合位点的高亲合性，以及交互作用所涉及的自由能和结合平衡常数之间的普遍性对数关系。

这项发明对于各种无热光或比色探针的选择、这类探针在核酸分子中结合位点的选择、采用何种特殊的方法去产生信号和检测信号这些方面，提供了广泛的自由度和灵活性。许多商业界提供的试剂针，使我们可以在低聚核苷酸自动合成时，得以将各种各样的探针，结合到5’端、3’端或低聚核苷酸的内部位点上。因此，在合成时将探针结合到低聚核苷酸上，或者在合成后修饰低聚核苷酸带有氨基或硫醇基反应的衍生物时将探针结合到低聚核苷酸上，是可能的事情。目前这项发明对探针的本质和位点并没有限制，只要探针不影响蛋白质-核酸复合物的形成即可。被附上标记的核酸成分还有几种可能的实施方案。例如，有些蛋白质不能使用探针位于蛋白质结合位点内的设计，因为探针可能会对蛋白质的结合产生干扰。在这种情况下，可以选用探针位于蛋白质结合位点外面的设计。

在另一项实施方案中，低聚核苷酸基本上可以被附上任何可以与带氨基或硫醇基反应，并可发出任何光谱的无热光探针标记，如此，便可以根据应用时的特定需要，在分析过程中选择无热光或荧光信号的颜色。这种可能性，使得使用者可以在一次分析试验中，使用核酸成分或结构的混合物，同时检测两种或两种以上的蛋白质，混合物的设计需使其可以识别不同的蛋白质，并将其附上可展示出不同发射光谱的无热光探针。

用这项发明去检测核酸结合因子的检测敏感性，至少受到两个因素的影响：无热光信号的检测敏感性，以及蛋白质和其核酸结合位点之间的亲和力。这项发明的检测敏感性，不会受到信号检测敏感性的限制，尤其是使用荧光去进行检测时，因为已有的商业仪器设备，已经能够常规性的在皮摩荧光染料的浓度下，检测到荧光。此外，最近在信号检测方面的先进发展，使得敏感性已足够检测到单个荧光染料分子。因此，检测敏感性很可能取决于蛋白质对其核酸结合位点的亲和力。因此，核酸结合因子的检测范围是在核酸结合因子及其同源核酸结合位点之间亲合力的范围内，这个范围的蛋白质浓度通常是从较低的皮摩到较高的纳摩。

目前这项发明也为检测测定法中所使用的核酸分子的设计，提供了很大的灵活性。例如，由于核酸分子的长度不受限制，因此额外的元件可以被并入核酸分子中。在其中一项具体应用中，将第二个蛋白质的备用结合位点，并入其中一个核酸成分中，第二个蛋白质会与被分析的蛋白质彼此合作结合到核酸上。接下来在具有这第二个蛋白质的情况下进行分析，或者在具有和不具有这第二个蛋白质的情况下进行分析，以检测被研究的蛋白质，在受到第二个蛋白质诱导的情况下，所产生的不同活性。

在另一项实施方案中，分析中所使用的核酸成分，被附在固体底物上。将核酸附着到固体底物上的技术，在这个专业领域中已经非常成熟，并且在文献中有所描述(参阅Rogers，Y.H.等，Anal.Biochem.266，23-30，1999；Joos，B.等，Anal.Biochem.247，96-101，1997；Running JA和Urdea MS，BioTechniques，8：276-277，1990；特此提出以供参考)。通过监视固体底物表面所发射的信号，可以完成蛋白质的检测。在设计上可以识别不同蛋白质的数个DNA结构，被附着到固体表面排列成一个矩阵，以便同时检测许多核酸结合因子。固体底物可以是膜，例如：硝酸纤维，PVDF或尼龙，光导，光纤，导体或生物传感仪，塑料组织培养皿或多孔平板。

在另一项实施方案中，分析中所使用的核酸成分可由单一核酸分子所组成，其中每个核酸成分被一定长度的核酸分开，以便使整个核酸得以弯曲，进而使核酸成分之间可以紧密接触。这样的模式可以用来检测或识别，例如，涉及较高阶染色质结构或增强子复合物结构的核酸结合因子。

在另一项实施方案中，分析中所使用的核酸成分，可以通过一个灵活的连接分子被连接在一起。核酸成分之间的连接，将会协助蛋白质与其同源核酸结合位点之间的相互作用，并使相互作用在动力上变得更快。这个灵活的连接分子最好是间-18-氨基磷酸酯，兹叙述如下。

目前这项发明最大的特点是，它易于操作，只需将分析溶液和测试溶液混合在一起即可，其中分析溶液含有核酸成分，测试溶液含有核酸结合因子、核酸结合蛋白辅调节物或其它涉及染色质或增强子复合物结构的蛋白质成分。接下来进行短时间的温育和信号检测。通过磷光或闪光等已知方法，可以强化信号。

在另一项实施方案中，这项发明可以直接用于对患者或研究对象的疾病诊断，此处的疾病是指，由一个核酸结合因子或同源核酸结合位点的一个突变体所引起的。患者或研究对象可以是人类也可以是其他动物。这种疾病可能是由核酸结合因子的改变所引起的，例如：乳癌就是由核酸修复酶BRCA1或BRCA2活性的改变所引起的。其它疾病和它们分子基础的例子列在表1中(参阅Hoeijmakers，J.H.J.，Nature 411：366-374，2001，特此提出以供参考)。表1中所列出的疾病和症状iA只代表1H用此发明进行诊断的许多疾病中的一小部分。表1中的信息仅是一些例证，固切勿将之视为限制。

表格1：与异常的核酸结合因子有关的疾病

疾病或症状	影响的分子机制
		毛血管扩张性运动失调(AT)	双链断裂修复
AT-样紊乱	双链断裂修复
		Bloom综合征	同源修复
乳癌	同源重组
		抗放射治疗癌	p53(转录因子)
cockayne综合征	与转录相连的修复(TCR)
		遗传性非肉息性结肠直肠癌	错配修复
合成酶IV缺乏症	末端融合
		Nijmegen破损异常	双链断裂修复
Rothmund-Thomason综合症	同源修复
		毛发低硫营养不良	NER和TCR
Werner综合症	同源重组/贯穿修复
		着色性干皮病	核酸外切修复(NER)
变异型着色性干皮病	贯穿合成

可使用标准的提取方法，将蛋白质或其它核酸结合蛋白辅调节物，从患者的样品中提取出来，这些提取方法在这个学术领域里广为人知。样品可以是活检组织、血细胞、表皮细胞、毛发囊细胞、组织栓、取自口腔或其它组织来源的上皮细胞等等。样品也可以是植物组织、微生物或原核细胞的培养物。接着将提取的样品与上述此发明中的核酸成分混合在一起，并且分析核酸结合的活性，究竟是协助核酸结合的活性还是抑制核酸结合的活性。

这项发明也可以用来识别，会调节异常核酸结合因子与同源核酸元件，或正常核酸结合因子与异常核酸元件之间结合的试剂、药物、配体、污染物、杂质或其它核酸结合蛋白辅调节物。在另一项实施方案中，这项发明也可以用来识别，会干扰异常核酸结合因子与同源核酸元件，或正常核酸结合因子与异常核酸元件之间结合的试剂、药物、配体、污染物、杂质或其它核酸结合蛋白辅调节物。此处所谓的“异常”是指，在患者体内所发现的异常或突变的核酸或蛋白质形式，不能再以正常的生理方式，与它们各自的配对伙伴相结合。

在另一项实施方案中，这项发明可用来检测、定量或决定，样品中核酸结合因子或核酸结合蛋白辅调节物的活性，其中第一个核酸成分被附着在固体底物上，第二个核酸成分被附上可检测标记。固体底物的例子包括：光导，光纤，导体，生物传感器探针，玻璃浅盘，深盘，载玻片或珠；聚苯乙烯、丙烯酰胺、琼脂糖等任何类型的珠；聚偏二氟乙烯、尼龙膜、硝酸纤维等膜片；以及组织培养皿，多孔圆板等等。发明人构想是，将第一个核酸成分/固体底物部分，与被附上可检测标记的第二个核酸成分相混合，这第二个核酸成分或是(1)一个同源核酸结合因子和含有一个核酸结合蛋白辅调节物的样品；或是(2)含有一个核酸结合因子的样品。第一个和第二个核酸成分可组成一个完整的核酸结合元件，核酸结合因子与这两个核酸成分之间若发生积极的相互作用，可检测标记会被附着到固体底物上。固体底物上若出现可检测信号，显示核酸结合因子与核酸结合元件之间发生了积极的相互作用。在这项实施方案中，可检测信号不仅涉及以临近距离配对为基础的检测方法，例如上述的FRET，还涉及单一性可检测标记。

用来检测核酸结合蛋白辅调节物的生物传感器

除了使用上述以临近距离配对为基础的检测方法，去决定核酸结合蛋白辅调节物的活性外，这项发明还具有一项更广泛的实施方案，那便是使用生物传感器去检测核酸结合辅调节物，或影响核酸结合因子活性的细胞事件，例如：转录后的修饰和有效酶等等。用来检测核酸结合蛋白辅调节物的生物传感器，利用的是上文所描述的“分离的”核酸结合元件-加上-核酸结合因子的技术。然而，要检测这些辅调节物，不仅可以使用以临近距离配对为基础的检测方法，还可以使用任何以及所有的分子检测方法。

“分子检测方法”的例子包括：荧光，荧光极化，荧光熄灭，放射性检测，放射性闪烁照相法，磷光，电化学变化，氧化还原的可能变化，化学发光，比色底物检测以及其它已知的方法。分子检测方法在“生物系统中的非放射性检测法”一文中有所探讨(“Methods in Nonradioactive Detection in Biologic system”Gary.C.Howard，Appleton & Lange，1993，特此提出以供参考)。例如，最常见的应用方式是，只将一个核酸成分附上标记，标记可以是任何有用的可检测标记，例如：荧光分子，放射性核，任何有用的连接分子(如：生物素，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，蛋白质A，蛋白质G，抗体或其片断，Grb2，多聚组氨酸，HRPO，Ni²⁺，FLAG标记，myc标记)，重金属，酶(如：碱性磷酸化酶，超氧化酶和萤光素酶)，电子供体/受体，吖啶酯(arcidinium ester)以及比色底物。熟练的技术人员很容易发现，上文未提及但可用于这项发明实际操作中的有用可检测标记。

当一个核酸成分被附上可检测标记时，另一个核酸成分可以被附着到珠，膜，载玻片，浅盘，光导，光纤，导体材料，生物传感芯片，探针等固体底物上。然而，要成功地实际操作这项发明，其实并不需要将任何核酸附着到固体底物上。

为了决定样品中核酸结合蛋白辅调节物的活性，将样品和一个或多个核酸结合因子混合在一起，其中包括一个第一个核酸成分和一个第二个核酸成分。核酸结合因子与同源核酸结合元件的结合能力，应该受到核酸结合蛋白辅调节物的调控，此处所谓的“调控”是指，部分或完全干扰或协助核酸结合因子与同源核酸结合元件之间的结合。

在此情况下，当第一个核酸成分被附着到固体底物上，第二个核酸成分被附上可检测标记时，如果样品中含有一个可以直接或间接激活一个核酸结合因子的核酸结合蛋白辅调节物的话，被激活的核酸结合因子将可稳定每个核酸成分之间的相互作用。是以，被附上标记的核酸成分会被附着到固体底物上，可检测标记也会随之被附着到固体底物上，然后便可对其进行检测了。发明人并且构想，将核酸结合因子附着到固体底物上，不要将第一个和第二个核酸附着到固体底物上。在这项实施方案中，可将一个或两个核酸成分附上可检测标记。

在另一项实施方案中，不要将第一个核酸成分或核酸结合因子附着到固体底物上，将第二个核酸成分或核酸结合因子附上可检测标记(标记可以是荧光染料，见图1A，B，或C)。一个被激活的核酸结合因子和一个“完整”的同源核酸结合元件之间积极的相互作用，是一种可以被检测到的事件(例如：当可检测标记为荧光染料时，荧光极化或荧光熄灭的事件，是可以被检测到的)。

如上文所讨论的，许多核酸结合因子，在具有配体依赖性序列-特定性的核酸结合活性的真核细胞或原核细胞的调节细胞过程中，扮演核心角色。(此处所谓的“配体依赖性”与“辅调节物-依赖性”这个名词，彼此可以互换；此处所谓的“配体”与“辅调节物”这个名词，彼此在意义和目的上完全相等。)这些核酸结合因子有一个很重要的特征，那就是很多核酸结合因子已经进化到，可以针对它们所处环境中的特定化学物质，去调节其基因表达。最近发表的一篇论文，就有论证性的例子，(Bresler等，Applied and Environ.Microbiol.66：904-908，2000)它描述的是在生产可可因植物周围的土壤中，所发现的细菌菌株的发展，该细菌菌株可以代谢可可因。该菌株似乎发展了一套可以代谢可可因的蛋白质，这套蛋白质可能包括配体依赖性的核酸结合因子。因此，所有的分子，包括：毒素、药物、生物碱、污染物等等，都能作为核酸结合蛋白的辅调节物，并且可以用生物传感器进行及时检测。

用来决定核酸结合蛋白辅调节物活性的生物传感器和方法，都可以用来检测或定量，不具有天然的核酸结合因子辅调节物的辅调节分子。人工的或者经过工程改造的因子可以识别这种辅调节分子。发明人的构想是，通过工程改造，核酸结合因子可以被任何挑选出来的化学配体调节，例如，可以备制能够对任何生物传感器所具有的化学物质产生反应的核酸结合因子。因此，使用这项发明中的生物传感器和检测方法，可以检测任何目前尚没有已知天然受体的化学配体。熟练的技术人员不难发现，只要具有高水平的实验技能，就能成功地操作这项实施方案。例如，将修饰过的配体-结合区域与转录活性区域相互融合，便可以产生经工程改造过的配体-依赖性核酸结合因子。请参阅“被化学调控的锌指转录因子”一文(Beerli等，”Chemically regulated zinc finger trsnscription factors”J.Biol.Chem.275：32617-32627，2000年)，特此提出以供参考。也可以使用体外酶进化法，去产生经过工程改造的配体-依赖性核酸结合因子，然后筛选特定的配体结合活性。请参阅“体外酶进化法：自百万侯选者中筛选出一个的挑战”(Cohen等，”In vitro enzyme evolution：thescreening challenge of isolating the one in a million”TRENDS in Biotechnology，19：507-512，2001年)，特此提出以供参考。另外，既然细菌表现出对环境的卓越适应力，以及对环境中所出现的新化学物质的卓越处理能力，通过选择对目标配体具有抗性的细菌，也可以产生经过工程改造的配体-依赖性核酸结合因子。然后将配体-特定性的配体-依赖性核酸结合因子和其同源核酸结合元件，从那些抗-配体的菌株中分离出来，并应用在配体-特定性的生物传感器中。请参阅Bresler等，Applied andEviron.Microbiol.66：904-908(2000)。特此提出以供参考，该论文描述的是抗-可可因细菌的分离，这个细菌所产生的可可因受体，很可能是核酸结合因子。此处所谓的“配体”一词，在此发明中的意义，等同于核酸结合蛋白的“辅调节物”。

使用以及时核酸结合因子为基础的生物传感器，去检测核酸结合蛋白辅调节物的一些较佳的方法，在例9和例10中有详细描述，这两个例子展示的是，将两个核酸成分都附上可检测标记，以临近距离配对为基础的荧光测定法；只将一个核酸成分附上荧光染料的荧光极化测定法；以及将第一个核酸成分附着到固体底物上，将第二个核酸成分附上一个有用的连接分子的比色测定法。

以上描述的仅是此项发明的几个较佳的实施方案，并非这项发明的范围限制。熟练的技术人员在操作的过程中，很可能会发现其它上文没有提及的实施方案。以下再通过一些例子，进一步说明此项发明。这些例子只是为了说明这项发明，并非限制这项发明的应用范围。

实施例1：检测E.coli中所具有的序列-特定性核酸结合蛋白-cAMP受体蛋白(CAP)

CAP是一种细菌转录激活因子，通过识别特定序列与DNA结合，结合常数是Kd＝～0.1nM(Busby，S.和Ebright，R.H.J.Mol.Biol.293，199-213，1999)。根据图1A所展示的方法去制备CAP分析试剂所需要的低聚核苷酸，该低聚核苷酸的设计基础是，一个相当于共通CAP结合位点的一段长38bp的DNA序列(Ebright，R.H.，Ebright，Y.W.& Gunasakera，A.Nucleic Acids Res.17，10295-10305，1989)。图3说明了该设计的细节。下列四个低聚核苷酸是使用标准氨基磷酯自动化低聚核苷酸合成仪合成的。(F＝dT-生色团；D＝dT-丹磺酰)：

5’-AACGCAATAAATGTGA            (CAP1；SEQ ID NO：1)

5’-AGFAGATCACATTTTAGGCACC 3’  (CAP2；SEQ ID NO：2)

5’-GGTGCCTAAAATGTGA            (CAP3；SEQ ID NO：3)

5’-TCDACTTCACATTTATTGCGTT      (CAP4；SEQ ID NO：4)

使用商业界提供的dT-生色团和dT-丹磺酰，将荧光供体(生色团)和荧光受体(丹磺酰)置入DNA片断(请参阅Glen Reseach，Sterling，VA)，其中dT代表脱氧胸腺嘧啶。使用反相层析法，将低聚核苷酸放在前述的RPC柱上(Pharmacia)加以纯化(Heyduk，E.和Heyduk.，T.Anal.Biochem.248，216-227，1997)。将含有低聚核苷酸的片断经过真空离心机干燥后，用50l的水溶解。将小部分储存液稀释到400l，然后测其紫外线-可见光(UV-VIS)的吸收光谱，以确定低聚核苷酸储存液的浓度。低聚核苷酸CAP1(SEQ ID NO：1)与低聚核苷酸CAP4(SEQ ID NO：4)杂交形成CAP1/CAP4双链。低聚核苷酸CAP2(SEQ ID NO：2)与低聚核苷酸CAP3(SEQ ID NO：3)杂交形成CAP2/CAP3双链。杂交时，将合适的低聚核苷酸配成浓度为10M的100l溶液，溶液中含有50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，在95℃中加热1分钟后，降温至25℃冷却1小时。随后所有的荧光测量都在25℃下进行，将含有50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM氯化钠(或50nM的氯化钠，根据指示而定)，1mM乙二胺四乙酸，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及200Mc AMP的测量溶液，放在200μl的石英试管中，使用Aminco-Bowman系列2的分光荧光计，去进行测量。激发光波长为490nm，发射光波长为500到650nm。

图4A显示的是在50nM CAP2/CAP3双链的光谱(曲线1)，以及当50nM CAP1/CAP4双链存在时，50nM CAP2/CAP3双链的光谱(曲线2)。当CAP1/CAP4双链存在时，CAP2/CAP3双链的光谱并没有发生很大的变化，这说明当CAP蛋白不存在时，CAP1/CAP4双链和CAP2/CAP3双链几乎不会发生结合。图4B显示的是加了CAP蛋白后，所观察到的荧光变化。曲线1记录的是50nM CAP1/CAP4双链和50nM CAP2/CAP3双链的荧光光谱。曲线2记录的是加入75nM CAP蛋白，温育15分钟，然后记录的荧光光谱读数。与对照组信号强度相比，所观察到的荧光熄灭度大约为50％。这个现象与下列的预测是一致的：CAP蛋白的存在，会促进CAP1/CAP4双链和CAP2/CAP3双链之间的结合，并且使CAP2/CAP3双链上的生色团(荧光供体)与CAP1/CAP4双链上的丹磺酰(荧光受体)之间的距离变得更接近，这使得生色团和丹磺酰之间会因共振能量转移而产生荧光熄灭的现象。

为了检验所观察到的荧光熄灭的特定性，在cAMP不存在的情况下，重复图4B中的实验。由于CAP的序列-特定结合需要cAMP的存在，因此当cAMP不存在时，只会观察到低亲合力的非-特定性核酸结合。当cAMP不存在时，加入CAP蛋白，荧光并没有出现变化(图4C)，这进一步证明了这个测定法的特定性。而且，当加入高浓度(400nM)不相关的核酸结合蛋白时，例如：Trp抑制因子(“TrpR”)，荧光也没有出现变化(图4D)。

图5中的实验是，测试加入未被附上标记的DNA双链时，对此测定法所产生的影响。使用下列低聚核苷酸制备两个未被附上标记的30bp长的DNA双链：

5’-CCTAAAATGTGATCTAGATCACATTTATTG-3’(SP1；SEQ ID NO：5)

5’-GCATCGGTCACTGCAGTCTCGACAGCTACG-3’(NSP1；SEQ ID NO：6)

为了制备长30bp的双链，将SP1和NSP1低聚核苷酸，分别与其互补的单链低聚核苷酸杂交，杂交方式和上述CAP低聚核苷酸一样。SP1 DNA(SEQ ID NO：5)含有CAP蛋白的共通结合位点，其中NSP1 DNA(SEQ ID NO：6)代表一段随机DNA序列。首先，在含有50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，50nM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及200McAMP的测量溶液中，测量50nM CAP2/CAP3双链荧光的光谱，以及加入50nM CAP时，50nM CAP2/CAP3双链荧光的光谱(曲线1；图5A和图5B)。逐渐增加SP1双链(图5A)或NSP1双链(图5B)的浓度，然后重复上述的测量。所使用的双链浓度如下：19.6nM(曲线2)，39.1nM(曲线3)，58.7nM(曲线4)，97.6nM(曲线5)和194.2nM(曲线6)。在每个条件下所观察到的荧光熄灭度，陈列在图5C中。含有CAP结合位点的DNA双链能有效的阻止CAP蛋白的检测，而含有随机序列的双链对CAP蛋白的检测则没有影响。因此，图5中的结果，不仅为CAP检测的特定性提供了另一个证明，同时也说明了这种竞争性测定法，很可能可以用来评估蛋白质与多种核酸分子之间，结合亲合力的大小。

图6显示的是在分析中逐渐增加CAP蛋白的量时，所观察到的荧光变化。这个试验的操作条件与图4所描述的试验操作条件是一样的。荧光熄灭度会随着CAP蛋白浓度的增加，成比例的增加，直到CAP蛋白浓度在～150nM时，才达到信号饱和。这个结果暗示：这个分析方法很可能可以用来确定样品中核酸结合蛋白的浓度。

我们也研究了CAP诱导荧光熄灭的动力学原理，以确定完成分析所需要的时间(图7)。在这个试验中，将激发波长设定为490nm，并在520nm监测50nM CAP2/CAP3双链随时间的变化。在图7中用箭头所标记的时间点，加入100nM的CAP蛋白，然后继续监测荧光信号。根据数据，反应大约在15分钟内完成，这表示这个分析方法只需要15-30分钟的温育时间便可完成。

实施例2：使用具有不同发射光谱和具有不同荧光信号检测模式的荧光染料的一些

实证

使用标准氨基磷酯自动化低聚核苷酸合成法，去合成下列的低聚核苷酸，这两条低聚核苷酸含有与CAP2和CAP4相同的序列，其中X代表氨基-脱氧胸腺嘧啶：

5’-AGXAGATCACATTTTAGGCACC-3’    (CAP5；SEQ ID NO：NO：7)

5’-TCXACTTCACATTTATTGCGTT-3’    (CAP6；SEQ ID NO：NO：8)

在前述CAP2和CAP4低聚核苷酸中纳入生色团-dT和丹磺酰-dT的相同位点上，纳入氨基-修饰分子C2 dT(Glen Research，Sterling，VA)。氨基-修饰分子C2 dT含有一个活性的脂肪氨基团，它能与任何有氨基-反应活性的荧光探针共价结合。用7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸，琥珀酸酯去修饰CAP5(SEQ ID NO：NO：7)和CAP6(SEQ ID NO：NO：8)低聚核苷酸。这个荧光物在433nm被激发，其最大的发射光出现在475nm，这使得操作者很可能可以使用不同的发光颜色，去进行测试分析。为了修饰荧光染料，将～20nM的低聚核苷酸溶解在50l的50mM NaHCO₃(pH值为8.3)中，加入50nM干燥的7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸，琥珀酸酯(分子探针，Eugene，OR)。将反应混合物放在室温下温育过夜。未结合的多余染料通过G-25旋转柱去除(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，通过前述的反相层析法，进一步纯化被附上标记的低聚核苷酸。用真空离心机干燥收集被附上荧光染料标记的低聚核苷酸片段，并将其溶解在50l的水中。将小部分储存液稀释到400l，然后测量其紫外线-可见光(UV-VIS)的吸收光谱，以确定低聚核苷酸储存液的浓度。被附上7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸标记的CAP5低聚核苷酸，与CAP3低聚核苷酸杂交形成CAP5/CAP3双链。被附上7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸标记的CAP6低聚核苷酸，与CAP1低聚核苷酸杂交形成CAP6/CAP1双链。杂交时，将适量的低聚核苷酸，与浓度为10M的100l溶液混合在一起，该溶液中含有50mMTris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃中加热1分钟后，降温至25℃冷却1小时。

在第一个实验中(图8)，用CAP测定法去检测CAP5/CAP3和CAP4/CAP1核酸双链配对。在这个被附在模式中，被附在CAP5/CAP3双链上的7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸标记，其功能是荧光供体，被附在CAP4/CAP1双链上的丹磺酰标记，其功能是荧光受体。实验在25℃下，在含有50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)以及200M cAMP的测量溶液中进行。图8曲线1显示的是当CAP蛋白不存在时，50nM CAP5/CAP3加上CAP4/CAP1溶液的荧光光谱。图8曲线2显示的是加入100nM CAP蛋白后，正如所料，荧光信号产生了急剧的(～70％)荧光熄灭反应。

在第二个实验中(图9)，用CAP测定法去检测CAP6/CAP1和CAP2/CAP3核酸双链配对。在这个分析模式中，被附在CAP6/CAP1双链上的7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸标记，其功能是荧光供体，被附在CAP2/CAP3双链上的生色团标记，其功能是荧光受体。在这个分析模式中，供体和受体都可产生荧光。实验在25℃下，在含有50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及200McAMP的测量溶液中进行。图9，曲线1显示的是50nM CAP6/CAP1加上CAP2/CAP3溶液的荧光光谱。激发光波长为433nm，在475nm可观察到主要发射峰，这是7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸的发射最大值。在520nm所观察到的肩角，是由荧光的残余发射所导致的，它在433nm并会出现小程度的激发。当加入0到150nM(曲线2-9)不同量的CAP蛋白时，在475nm会出现一个显著的熄灭峰，在520nm会出现一个显著的增强峰。生色团的发射最大值在520nm。这些数据显示，既可通过475nm的荧光熄灭反应，又可通过520nm的荧光增强反应，去检测CAP蛋白或任何同源核酸结合蛋白。而且，正如图9中插图所显示的，520nm和475nm的荧光强度比率，可用来确定核酸结合蛋白的浓度。这种测量比率的信号检测模式其实非常有用，因为它受微小误差(例如：移液误差，分析样品中不相关化合物所引起的熄灭等等)的影响比较小。总体来说，这个试验中的数据说明了，这项发明所提供的分析方法，为所使用的荧光探针的本质、探针的发射光谱，以及荧光信号的检测模式等方面，提供了很大的灵活性。

实施例3：cAMP等核酸结合蛋白辅调节物的检测方法

许多核酸结合蛋白的活性，是通过小分子、其它蛋白质或细胞事件(如磷酸化)来调节的。因此，这项发明可以用来识别或检测这些具有调节作用的小分子或细胞事件。

CAP蛋白与cAMP和cGMP两者，以微摩尔级的亲和力结合(Takahashi，M.，Blazy，B.，和Baudras，A.Biochemistry，9，5124-30)。因此，CAP蛋白本身，乃是一个很弱的检测cAMP的试剂。然而CAP与其同源核酸结合序列之间的高亲和力，却是选择性的依赖于cAMP，而非cGMP。由于只有cAMP与序列-特定性核酸以热力学的关系相结合，是以在含有一个CAP结合位点的DNA存在的情况下，CAP与cAMP之间的亲和力会增加1000倍左右，但与cGMP之间的亲和力则不会改变。因此，在含有一个CAP结合位点的DNA存在的情况下，CAP就成了对cAMP具有敏感性和选择性的传感器。

正如图4C中所展示的，当cAMP不存在时，CAP蛋白不会造成荧光信号强度的变化。为了证明可以使用CAP测定法去检测cAMP，我们在含有75nM CAP的测量溶液中，测量了50nM CAP1/CAP4加上CAP2/CAP3溶液在0-100McAMP浓度范围内的荧光强度，该测量溶液中含有：50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，以及0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。图10显示，所观察到的荧光熄灭程度与cAMP浓度成正比，这和我们的预期相同，大约到5μMcAMP时达到信号饱和。因此，这项发明可以作为一种敏感的检测器，用来检测cAMP或任何可加强核酸结合的试剂或事件。

这项发明最大的优点是，这种测定法在设计上具有相当的灵活性，这使得这种测定法的敏感性、荧光发射光的颜色，和/或荧光信号的检测模式得以优化。虽然这个例子示范了如何应用这项发明去检测cAMP，但是我们认为，这项发明并不是只能检测cAMP而已。任何分子，只要它的存在与DNA和一个核酸结合蛋白之间亲合力的变化有关联，都可以使用这项发明去加以检测。更广泛地讲，任何会影响一个核酸结合蛋白与DNA之间亲合力的过程，都能使用这项发明去进行分析。

实施例4：被一段灵活的长连接分子连接起来的DNA的变通性测定法

图1中所陈列的测定法，其性质视核酸成分的总浓度而定。使用一段灵活的长连接子共价连接两个DNA双链，例如分析液中的成分，在可以检测到荧光信号的范围内，以及在能够使蛋白质有效结合的浓度范围内，测定法变成对DNA浓度不具依赖性。图11显示的是CAP检测测定法的一种变通性设计。测定法中的核酸成分在合成低聚核苷酸时，通过导入12个间-18-氨基磷酸酯的原子团，彼此共价连接起来(Glen Research，Sterling，VA)，这个结构陈列在图11B中。加入12个单位的间-18后，被连接起来的低聚核苷酸之间的距离成为～270。备制下列低聚核苷酸(F＝dT-生色团，D＝dT-丹磺酰，X＝间-18)：

CFA GAT CAC ATT TTA GGC ACC XXX XXX XXX XXX AAC GCA ATA

AAT GTG   AT                                (CAP7；序列编

号：9)

CDA GAT CAC ATT TAT TGC GTT                 (CAP8；序列编号：10)

GGT GCC TAA AAT GTG AT                      (CAP9；序列编号：11)

用前述的方法(Heyduk，E.和Heyduk.，T.Anal.Biochem.248，216-227，1997)，在RPC柱上(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，使用反相层析法纯化低聚核苷酸。用真空离心机干燥收集含有低聚核苷酸的片断，并将之溶解在50l的水中。将小部分储存液稀释到400l，然后测其紫外线-可见光(UV-VIS)的吸收光谱，以确定低聚核苷酸储存液的浓度。为了形成CAP7/CAP8/CAP9双链(图11A)，将CAP7，CAP8和CAP9(序列编号分别为9，10，11)低聚核苷酸，与浓度为10M的100l的测量溶液相混合，溶液中含有：50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃中加热1分钟后，降温至25℃冷却1小时。

这项实施方案的另一个优点是，产生信号所需要的温育时间缩短了，因为如图11A所示，当核酸成分被连接起来以后，由于每个成分之间的距离相对而言变得比较近了，因而核酸成分之间的结合反应速度也就变快了。如果核酸成分需要被附着到固体底物上的话，那么以上这项发明的变通性方法将是较好的选择。我们认为，连接子可以包含一个具反应性的氨基团，以使整个核酸架构附着到固体底物上。

图12显示的是图11中所描述的有关这项发明的一种改进的变通性设计。图12A中的曲线1代表50nM CAP7/CAP8/CAP9架构，在包含50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，50mM氯化钠，1mM 乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及200McAMP测量溶液中的光谱。加入75nM CAP蛋白后，会引起大约70％的荧光信号熄灭，这说明使用这种分析模式，很容易检测到一个核酸结合蛋白。我们也研究了CAP蛋白诱导荧光熄灭的动力学，以确定完成分析所需要的温育时间(图12B)。在这个实验中，将发射光波长设定为490nm，在520nm监测50nM CAP7/CAP8/CAP9架构的荧光强度变化与时间的关系。在图12B中箭头标示的时间点，加入75nM的CAP蛋白，然后继续监测荧光信号。在加入CAP蛋白所需的时间内(大约20秒内)，反应基本上已经完成了。因此核酸成分之间的连接，使得荧光信号发生变化所需要的时间大为减短。

实施例5：Lac抑制蛋白质(LacR)的检测方法。

为了证明这项发明具有检测、识别或定量任何核酸结合蛋白的普遍性，合成下列含有Lac抑制结合元件的低聚核苷酸(F＝dT-生色团，D＝dT-丹磺酰)：

GGTGTGTGGAATTGTGA           (Lac1；SEQ ID NO：12)

GCGFATAACAATTTCACACAGG      (Lac2；SEQ ID NO：13)

CTTGTGTGAAATTGTT            (Lac3；SEQ ID NO：14)

ADACGCTCACAATTCCACACACC     (Lac4；SEQ ID NO：15)

用前述的方法(Heyduk，E.和Heyduk.，T.Anal.Biochem.248，216-227，1997)，在RPC柱上使用反相层析法纯化低聚核苷酸(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。用真空离心机干燥收集含有低聚核苷酸的片段，并将之溶解在50l的水中。将小部分储存液稀释到400l，然后测其紫外线-可见光(UV-VIS)的吸收光谱，以确定低聚核苷酸储存液的浓度。低聚核苷酸Lac1(SEQ ID NO：12)与低聚核苷酸Lac4(SEQ ID NO：15)杂交形成Lac1/Lac4架构，低聚核苷酸Lac2(SEQ ID NO：13)与低聚核苷酸Lac3(SEQ ID NO：14)杂交形成Lac2/Lac3架构。为了进行杂交，将适量的低聚核苷酸，与浓度为10M的100l测量溶液相混合，该测量溶液中含有：50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃中加热1分钟后，降温至25℃冷却1小时。随后所有的荧光测量都在25℃下，在含有50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，以及0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的测量溶液中进行。通过杂交所获得的双链核酸架构陈列在图13中。双链含有一个LacR结合位点(下面划线的序列)，这个LacR结合位点源自于，被分裂到两个双链架构中每个链上的Lac操纵子序列。

图14曲线1记录的是，当LacR不存在时，50nM Lac1/Lac4加上Lac2/Lac3的荧光光谱，图14曲线2-7记录的是，加入0-200nM范围内不同量的LacR时的荧光光谱。荧光信号熄灭的程度，与加入反应混合物中LacR的量成正比，大约在150nM LacR时，会达到信号饱和(图14中插图)。在分析混合物中加入5mM的IPTG，可以验证LacR检测法的特定性，其中IPTG只选择性地与LacR结合，并且还降低了LacR的核酸结合活性。

实施例6：Trp抑制蛋白质(TrpR)的检测方法。

为了进一步证明这项发明具有检测、识别或定量任何核酸结合蛋白的普遍性，合成下列含有Trp抑制子结合元件的低聚核苷酸(F＝dT-生色团，D＝dT-丹磺酰)：

GAG ATC TAT CGA ACT A          (Trp1；SEQ ID NO：16)

GFA AAC TAG TAC GAA ACT AGA G  (Trp2；SEQ ID NO：17)

CTC TAG TTT CGT ACT A          (Trp3；SEQ ID NO：18)

GDT TAC TAG TTC GAT AGA TCT C  (Trp4；SEQ ID NO：19)

用前述的方法(Heyduk，E.和Heyduk.，T.Anal.Biochem.248，216-227，1997)，在RPC柱上使用反相层析法纯化低聚核苷酸(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。用真空离心机干燥收集含有低聚核苷酸的片段，并将之溶解在50l的水中。将小部分储存液稀释到400l，然后测其紫外线-可见光(UV-VIS)的吸收光谱，以确定低聚核苷酸储存液的浓度。低聚核苷酸Trp1(SEQ ID NO：16)与低聚核苷酸Trp4(SEQ ID NO：19)杂交形成Trp1/Trp4架构，低聚核苷酸Trp2(SEQ ID NO：17)与低聚核苷酸Trp3(SEQ ID NO：18)杂交形成Trp2/Trp3架构。为了进行杂交，将适量的低聚核苷酸，与浓度为10M的100l测量溶液相混合，溶液中含有：50mMTris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃中加热1分钟后，降温至25℃冷却1小时。随后所有的荧光测量都在15℃下，在包含10mM的钾磷酸盐(pH值为7.6)，50mM的氯化钠(NaCl)，0.1mM的乙二胺四乙酸，4mM的色氨酸，10％的丙三醇，0.01％的叠氮钠，以及1.0mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的测量溶液中进行。通过杂交所获得的双链核酸架构陈列在图15中。这个双链含有一个TrpR结合位点(下面划线的序列)，这个结合位点被分裂到两个双链架构中的每个链上。

图16A曲线1记录的是，当TrpR不存在时，溶液中含有250nM Trp1/Trp4和300nM Trp2/Trp3的荧光光谱，图16曲线2-5记录的是，加入0-800nM范围内不同量的TrpR的荧光光谱。荧光信号熄灭的程度，与加入反应混合物中TrpR的量成正比，大约在150nM TrpR时，达到信号饱和(图16B)。在一种含有用来检测LacR蛋白之核酸成分的反应混合物中加入TrpR，可以验证TrpR检测法的特定性(图16A，插图，曲线1和2)。

实施例7：使用双色检测法同时检测两个蛋白质。

由于这项发明中所描述的分析方法，能够兼容可以发射不同波长的各种探针，因此通过不同的实验设计，可以同时检测两种或两种以上的蛋白质。将每个待检测的蛋白质所对应的特定核酸架构，附上具有不同发射光波长的探针。在这个例子中，反应混合物中含有被附上7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸标记，用来检测CAP蛋白的核酸架构(参见例2)，以及被附上生色团标记，用来检测Trp抑制蛋白质的核酸架构(参见例6)。更确切的描述是，混合物中还含有100nM CAP5/CAP3，120nMCAP1/CAP4，100nM Trp2/Trp3和120nM Trp1/Trp4双链。

图17显示的是证明这种兼容性的实验结果。所有的测量都是在15℃下，在含有10mM的钾磷酸盐(pH值为7.6)，50mM的氯化钠(NaCl)，0.1mM的乙二胺四乙酸，4mM的色氨酸，200McAMP，10％的丙三醇，0.01％的叠氮化钠，以及1.0mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的测量溶液中进行。以下的记录是，在433nm激发光处(7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸激发光，图17A)和490nm激发光处(生色团激发光，图17B)，当蛋白质不存在时(曲线1)，当只有CAP存在时(曲线2)，当只有TrpR存在时(曲线3)，当CAP和TrpR都存在时(曲线4)的荧光光谱。当只有CAP存在时，荧光信号不发生变化(图17B，曲线2)，但会观察到大约60％的7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸信号发生熄灭(图17A，曲线2)。当只有TrpR存在时，7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸信号不发生变化(图17A，曲线3)，但会观察到大约60％的荧光信号发生熄灭(图17B，曲线3)。最后，当CAP和TrpR都存在时，两个发射光谱的熄灭反应都会被观察到(图17A & B，曲线4)。图17C用条状格式总结了这些结果，其中黑色条状代表检测CAP时所观察到的荧光颜色的熄灭，灰色条状代表检测TrpR时所观察到的荧光颜色的熄灭。这个例子的数据证明了，这项发明所描述的分析方法，可以同时使用数种颜色去检测两个或两个以上的核酸结合蛋白辅调节物。

实施例8：p53蛋白的检测法。

p53蛋白的突变，对许多种类型的肿瘤发展十分重要，因为绝大多数的肿瘤中含有p53蛋白的突变形式(Ko，L.L.和Prives，C.，Gene Dev.10，1054-1072，1996)。另外，缺少p53蛋白功能的肿瘤，对放射治疗非常顽抗。p53蛋白通过序列特定的方式，结合到双链DNA上，它的核酸结合活性对它的功能十分重要。从人体肿瘤中分离出来的绝大多数突变p53，都缺乏核酸结合活性。因此，针对p53的存在与否和其特定活性进行检测的功能性分析方法，将会为癌症的识别和治疗，提供一个非常重要的诊断工具。

为了证明这个分析方法具有检测p53蛋白的功能，合成下列含有同源p53结合元件的低聚核苷酸(F＝dT-生色团，D＝dT-丹磺酰)：

GCA TCG GTC ACA GAC A                 (P1；SEQ ID NO：20)

TGC CFA GAC ATG CCT TGC AGT CTC GA    (P2；SEQ ID NO：21)

TCG AGA CTG CAA GGC A                 (P3；SEQ ID NO：22)

TGT CDA GGC ATG TCT GTG ACC GAT GC    (P4；SEQ ID NO：23)

用前述的方法(Heyduk，E.和Heyduk.，T.Anal.Biochem.248，216-227，1997)，在RPC柱上使用反相层析法纯化低聚核苷酸(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。用真空离心机干燥收集含有低聚核苷酸的片段，并将其溶解在50l的水中。将小部分储存液稀释到400l，然后测其紫外线-可见光(UV-VIS)的吸收光谱，以确定低聚核苷酸储存液的浓度。低聚核苷酸P1(SEQ ID NO：20)与低聚核苷酸P4(SEQID NO：23)杂交形成P1/P4架构。低聚核苷酸P2(SEQ ID NO：21)与低聚核苷酸P3(SEQ ID NO：22)杂交形成P2/P3架构。为了进行杂交，将适量的低聚核苷酸与浓度为10M的100l测量溶液相混合，溶液中含有50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃中加热1分钟后，降温至25℃冷却1小时。随后所有的荧光测量都在25℃下，在含有50mM的钾磷酸盐(pH值为7.5)，50mM的氯化钠(NaCl)，0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及100nM的非特定性30-bp DNA双链的测量溶液中进行。通过杂交所获得的DNA双链陈列在图18中。DNA双链含有10bp的重复序列：PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy(SEQID NO：24)，这段序列被分裂在两个DNA双链上。而这段序列(SEQ ID NO：24)已经被确认为是一个p53识别序列的共通序列(El-Deiry，W.S.，Kern.，S.E，Pietenpol，J.A.，Kinzler，K.W.和Vogelstein，B.Nature Genetics，1，45-49，1992)。这个分析方法中所使用的p53蛋白，是一个在细菌中表达的人体重组全长蛋白质(Dr.KathleenS.Matthews致赠；Nichols，N.M和Matthews，K.S.Biochemistry 40，3847-3858，2001，特此提出以供参考)。

图19A曲线1记录的是，当p53蛋白不存在时，25nM P1/P4加上30nM P2/P3的荧光光谱，图19A曲线2-6记录的是，当p53的量介于0-130nM之间时，不同量p53的荧光光谱。所观察到的荧光信号熄灭度，与加入分析混合物中的p53蛋白的量成正比(图19B)。将p53蛋白加入含有CAP1/CAP4加上CAP2/CAP3核酸架构的反应混合物中，并没有发生荧光熄灭(图19A，插图，曲线1代表p53不存在时所观察到的信号，曲线4-5代表加入1-90nM的p53后所观察到的信号)，这个实验结果验证了p53检测测定法的特定性。总结而言，这个例子证明了目前这项发明可以普遍的应用在任何以及所有的核酸结合蛋白上，包括重要的哺乳类肿瘤抑制蛋白质，例如p53。

实施例9：使用以临近距离配对为基础和不以临近距离配对为基础的方法，去检测核酸结合蛋白的辅调节物。

现存的有机体中，有大量的序列-特定性核酸结合因子已经进化了，以便对环境刺激做出反应时，调控其基因表达。许多这些因子的核酸结合活性，乃是通过核酸结合因子与一个小辅调节物或翻译后修饰之间直接或间接的交互作用，来进行调节的。由于许多这些辅调节物在环境科学(公共污染)，林业科学和毒素学的研究中扮演重要角色，因此针对它们所进行的研究很热门。这些辅调节物有许多是细胞代谢物，或者是在细胞中扮演信号或调节角色的分子。因此针对它们所进行的检测，在临床化学和医学诊断上十分受重视。

由于大自然中存在着大量受辅调节物调控的核酸结合因子，因此用来检测各个辅调节物活性的工具和方法，实有其需求性。这些辅调节物，以及和它们相对应而核酸结合活性受这些辅调节物调节的核酸结合因子包括：cAMP和cAMP受体蛋白(Busby，S.和Ebright，R.H.，J.Mol.Bio.293，199-213，1999)，S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和MetJ蛋白(Phillips，K.和Phillips，S.E.V.，Structure 2，309-316，1994)，或亚砷酸盐和ArsR蛋白(Wu，J.和Rosen，B.P.，J.Biol.Chem.268，52-58，1992)。cAMP是真核细胞中的一个中枢信号分子。有20种以上的荷尔蒙可以激活或抑制腺苷酸环化酶，从而影响cAMP的细胞水平。由于cAMP在细胞信号传达中扮演中枢角色，因此检测cAMP在细胞和组织中的水平，一直十分受重视。SAM是细胞中甲基团的一个供体，它的功能是向各种目标物提供甲基团，这些目标物包括：DNA，磷酸酯和蛋白质。由于SAM在组织功能中十分重要，因此检测它在细胞和组织中的水平，也一直十分受重视。亚砷酸盐是一种常见的有毒污染物，因此检测它在水、土壤、食物中的水平非常重要。上述这些例子只代表在细菌和其它微生物中所发现的，受辅调节物调节的核酸结合因子中的一小部分而已。已知的受辅调节物调节的核酸结合因子有数百种之多，还有数百种有待发现。

发明者在下面描述的是一种，以受辅调节物调节的核酸结合因子为基础的生物传感器。这种生物传感器的总体设计陈列在图20中。由于这项设计可以使用任何受辅调节物调节的核酸结合因子，因此它为在操作上涉及许多变换的生物传感器，提供了一个通用的平台技术。通过测量核酸-蛋白质复合物，受目标辅调节物分子诱导所造成的增减，可以完成对目标核酸结合蛋白辅调节物的检测。虽然所有检测核酸-蛋白质复合物形成的方法都可以使用，但是最好的方法乃是最近才发展出来的，使用可检测标记去检测序列-特定核酸结合因子的方法(Heyduk.T.和Heyduk.E.Nature Biotechnology.未出版，2002)。使用可检测标记，可使目标分子(例如：核酸结合因子或辅调节物)的存在与否，通过荧光密度或其它可检测标记的变化显示出来。因此，这种分析方法的操作步骤不槿非常少，而且它和大量分析(highthroughput)模式彼此兼容。图20所陈列的分析成分，也可以被附着到固体表面上(例如：光导或光纤)以形成一种固态整合的生物传感器。

下列是生物传感器识别cAMP、IPTG和色氨酸的例子，藉此示范生物传感器的设计和通性。这三个分子是下列三个与之相对应的核酸结合因子的辅调节物：CRP，Lac抑制子，Trp抑制子。图21显示的是一个检测cAMP的模拟生物传感器在cAMP的量增加后的反应。测试溶液由包含CAP标记(Heyduk.T.和Heyduk.E.Nature Biotechnology，未出版，2002)和CAP蛋白的两个核酸成分所组成。当测试混合物中cAMP的浓度，足够诱导CAP蛋白与其同源核酸结合元件结合时，便可观察到大量的荧光信号变化。信号变化的程度和cAMP的量成正比(图21)。用来检测色氨酸的一种类似的生物传感器设计，也呈现相似的结果(图22)。这种特殊的生物传感器，是由TrpR蛋白和与TrpR同源核酸元件相对应的两个核酸成分所组成的混合物构成的(Heyduk.T.和Heyduk.E.Nature Biotechnology.未出版，2002)。和cAMP的例子一样，在特定的色氨酸浓度范围内，如果诱导TrpR与其同源核酸元件相结合的话，会引起大量的荧光信号变化，而荧光信号的变化和所加入的色氨酸的量成正比。

为了证明不同检测核酸-蛋白质复合物形成的检测方法，能够适用于图20所陈列的生物传感器设计，制备一个检测色氨酸的生物传感器，并且只将一个核酸成分附上可检测标记。在此发明的这项特殊的实施方案中，使用荧光极化去检测，含有一个TrpR同源结合位点并被附上荧光染料标记的DNA成分，受色氨酸诱导的一个TrpR-核酸复合物的形成(图23)。所观察到的荧光极化信号的改变程度，与色氨酸的浓度成正比，这说明，凡使用图20的设计以及荧光极化(或任何可检测的单一标记)作为一种信号，去检测辅调节物的任何以及所有检测核酸结合蛋白辅调节物的生物传感器，均隶属这项发明的范畴。

图24显示的是一种使用一个核酸结合因子的生物传感器的设计，其中辅调节物会使该核酸结合因子和一个特定核酸元件之间的亲和力为之减弱。在这种情况下，辅调节物会诱导蛋白质-核酸复合物之间解离，因此通过蛋白质-核酸复合物所依赖的辅调节物的消失，可以完成对辅调节物的检测。这个试验中的生物传感器，是由LacR蛋白和包含LacR同源结合元件的两个核酸成分所组成的混合物构成的(Heyduk.T.和Heyduk.E.Nature Biotechnology，未出版，2002)。当IPTG(LacR的一种辅调节物)不存在时，LacR蛋白会与其被附上标记的同源核酸元件相结合，进而导致荧光信号的熄灭。而当IPTG的浓度增加时，所观察到的依赖于IPTG的荧光信号会增强。

实施例10：将第一个成分附着到固体底物上(多孔平板)，将第二个成分附上可检测标记(生物素)的变化测定法。

为了证明这项发明在检测模式上具有相当大的灵活性，按照图1E中的设计进行试验。合成下列低聚核苷酸序列(X＝氨基-dT，B＝生物素)，当这些序列被全部结合在一起时，会形成一个完整的CAP核酸结合元件：

XAACGCAATAAATGTG            (CAP10；SEQ ID NO：25)

ATCTACTTCACATTTATTGCGTT     (CAP11；SEQ ID NO：26)

AAGTAGATCACATTTTAGGCACCB    (CAP12；SEQ ID NO：27)

GGTGCCTAAAATGTG             (CAP13；SEQ ID NO：28)

CAP10低聚核苷酸与CAP11低聚核苷酸杂交形成第一个核酸成分，CAP12低聚核苷酸与CAP13低聚核苷酸杂交形成第二个核酸成分。为了进行杂交，将适量的低聚核苷酸与(1)浓度为10M的100l测量溶液相混合(CAP10/CAP11低聚核苷酸的测量溶液为500mM Na₂HPO₄，pH值为8.6，1mM乙二胺四乙酸；CAP12/CAP13低聚核苷酸的测量溶液为20mM氨基甲烷，pH值为8.0，100mM氯化钠，10M乙二胺四乙酸)，(2)在95℃中加热1分钟，(3)然后降温至25℃冷却1小时。将第一个核酸成分(CAP10/CAP11半位点双链)共价附着到一个被N-氧化琥珀酰氨-激活的96孔-多孔平板的孔内(DNA-BIND，Corning，Acton，MA)，将200l含有第一个核酸成分(浓度为100nM)的缓冲液(缓冲液中还含有500mM Na₂HPO₄(pH值为8.6)，1mM 乙二胺四乙酸)，放在每个孔内培育一小时，然后用含有50mM氨基甲烷(pH值为8.0)，100mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，0.1mg/ml牛血清白蛋白的溶液进行洗脱。在含有附着了第一个核酸成分的孔内，加入10nM或20nM含有第二个核酸成分(CAP12/CAP13半位点双链)的溶液，随后再加入250nM CAP和200μM cAMP。在室温中培育1小时，将孔用缓冲液润洗两次，然后按照产商建议的稀释度，加入由链霉抗生物素蛋白连接的山葵过氧化酶(Pierce，Rockford，II)。培育30分钟后，将孔用缓冲液润洗两次，然后加入100μl的Turbo-TMB^TM过氧化酶底物溶液(Pierce，Rockford，II)。反应可以继续进行15分钟，然后加入100μl的1M H₂SO₄使反应停止。控制孔除了不加CAP和cAMP外，其它的处理方式完全一样。使用标准多孔平板读数机读取样品和控制孔在450nm的光吸收度。表格2总结了这个实验的结果。以10nM的CAP12/CAP13而言，CAP/cAMP存在时的吸收信号，比CAP/cAMP不存在控制孔中时的吸收信号，增强了大约3倍，这证明了以一个多孔平板和酶为基础的检测方式的有效性。

表2：

CAP12/CAP13浓度(nM)	光吸收度(450nm)，无CAP	光吸收度(450nm)，有CAP
			10	0.2575	0.7308
20	0.4066	0.8584

很显然的，这个领域中熟练的技术人员通过前述的启示，很可能会发现许多种，不脱离这项发明之精神或实质范畴的修改性，变化性，和取代性的实施方案。这项发明的范畴，并不仅限于前述的实施方案，下列声明所涵盖的范畴，才是这项发明的真正范畴。

Claims (26)

1.一种用来检测核酸结合蛋白辅调节物活性的生物传感器测定法，所述核酸结合蛋白辅调节物包含一个第一个核酸成分，一个第二个核酸成分和一个核酸结合因子，其特征在于，

(a)第一个核酸成分包含核酸结合元件的一部分，第二个核酸成分包含核酸结合元件的另一部分，当第一个和第二个核酸成分结合在一起时就组成了一个完整的核酸结合元件，

(b)核酸结合因子与完整核酸结合元件的结合受核酸结合蛋白辅调节物的介导，

(c)将一个可检测标记附在第一个核酸成分、第二个核酸成分或核酸结合因子上。

2.如权利要求1所述的生物传感器测定法，其特征在于，将第一个核酸成分附着到固体底物上，将第二个核酸成分附上一个可检测标记。

3.如权利要求2所述的生物传感器测定法，其特征在于，(a)固体底物选自多孔平板、微阵列载玻片、膜、微球体、光导、光纤、传导材料和胞质基因共振芯片表面，和(b)可检测标记选自荧光染料、生色团、酶、连接分子、生物素、电子供体、电子受体、染料、金属和放射性核素。

4.如权利要求1所述的生物传感器测定法，其特征在于，所述可检测标记选自荧光染料、生色团、酶、连接分子、生物素、电子供体、电子受体、染料、金属和放射性核素。

5.如权利要求4所述的生物传感器测定法，其特征在于，将第一个核酸成分附上一个荧光供体，将第二个核酸成分附上一个荧光受体。

6.如权利要求5所述的生物传感器测定法，其特征在于，所述核酸结合因子是一个选自p53、TrpR、cAMP受体蛋白和Lac阻抑物的转录因子。

7.如权利要求1所述的生物传感器测定法，其特征在于，核酸结合因子被附着到固体矩阵上。

8.如权利要求3所述的生物传感器测定法，其特征在于，所述固体底物是一个多孔平板，可检测标记是生物素。

9.一种检测样品中核酸结合蛋白辅调节物活性的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)将第一个核酸成分，第二个核酸成分以及核酸结合因子与样品结合，其中：

(i)第一个核酸成分包含核酸结合元件的一部分，第二个核酸成分包含核酸结合元件的另一部分，当第一个和第二个核酸成分结合在一起时就组成了一个完整的核酸结合元件，

(ii)核酸结合因子与完整核酸结合元件的结合受核酸结合蛋白辅调节物的介导，

(iii)将一个可检测标记附在第一个核酸成分、第二个核酸成分或核酸结合因子上；和

(b)通过一种检测方法来检测核酸结合因子与完整核酸结合元件之间的结合，从而推测核酸结合蛋白辅调节物的活性。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，将第一个核酸成分附着到固体底物上，将第二个核酸成分附上可检测标记。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，(a)固体底物选自多孔平板、微阵列载玻片、膜、微球体、光导、光纤、传导材料和胞质基因共振芯片表面，(b)可检测标记选自荧光染料、生色团、酶、连接分子、生物素、电子供体、电子受体、染料、金属和放射性核素。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述可检测标记选自荧光染料、生色团、酶、连接分子、生物素、电子供体、电子受体、染料、金属和放射性核素。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，将第一个核酸成分附上荧光供体，将第二个核酸成分附上荧光受体，所用的检测方法是荧光共振能量转移法。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述核酸结合因子是一个选自p53、TrpR、cAMP受体蛋白和Lac阻抑物的转录因子。

15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，将核酸结合因子附着到一个固体矩阵上。

16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述可检测标记是生物素，固体底物是一个多孔平板。

17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述检测方法是荧光偏振法。

18.一种用来检测核酸结合蛋白辅调节物活性的生物传感器阵列，至少由两个生物传感器所组成，其中每个生物传感器都包含一个第一个核酸成分，一个第二个核酸成分和一个核酸结合因子，其中

(a)第一个核酸成分包含核酸结合元件的一部分，第二个核酸成分包含核酸结合元件的另一部分，当第一个和第二个核酸成分结合在一起时就组成了一个完整的核酸结合元件，

(b)核酸结合因子与完整核酸结合元件的结合受核酸结合蛋白辅调节物的介导，

(c)将第一个核酸成分附着到固体底物上，将第二个核酸成分附上可检测标记。

19.如权利要求18所述的阵列，其特征在于，(a)固体底物选自多孔平板、微阵列载玻片、膜和胞质基因共振芯片表面，(b)可检测标记选自荧光染料、生色团、酶、连接分子、生物素、电子供体、电子受体、染料、金属和放射性核素。

20.一种用来检测核酸结合因子活性的生物传感器测定法，包含一个第一个核酸成分和一个第二个核酸成分，其特征在于，

(a)第一个核酸成分含有核酸结合元件的一部分，第二个核酸成分含有核酸结合元件的另一部分，当第一个和第二个核酸成分结合在一起时就组成了一个完整的核酸结合元件，

(b)将可检测标记附在第一个核酸成分或第二个核酸成分上。

21.如权利要求20所述的生物传感器测定法，其特征在于，将第一个核酸成分附着到固体底物上，将第二个核酸成分附上可检测标记。

22.如权利要求21所述的生物传感器测定法，其特征在于，(a)固体底物选自多孔平板、微阵列载玻片、膜、微球体、光导、光纤、传导材料和胞质基因共振芯片表面，(b)可检测标记选自荧光染料、生色团、酶、连接分子、生物素、电子供体、电子受体、染料、金属和放射性核素。

23.如权利要求22所述的生物传感器测定法，其特征在于，所述可检测标记是生物素，固体底物是多孔平板。

24.一种用来检测核酸结合因子活性的生物传感器阵列，至少包含两个生物传感器，其中

(a)每个生物传感器都包含一个第一个核酸成分，一个第二个核酸成分，

(b)第一个核酸成分含有核酸结合元件的一部分，第二个核酸成分含有核酸结合元件的另一部分，当第一个和第二个核酸成分结合在一起时就组成了一个完整的核酸结合元件，和

(c)将第一个核酸成分附着到一个固体底物上，将第二个核酸成分附上一个可检测标记。

25.如权利要求24所述的阵列，其特征在于，

(a)所述固体底物选自多孔平板、微阵列载玻片、膜和胞质基因共振芯片表面；和

(b)所述可检测标记选自荧光染料、生色团、酶、连接分子、生物素、电子供体、电子受体、染料、金属和放射性核素。

26.如权利要求25所述的阵列，其特征在于，所述固体底物是多孔平板，可检测标记是生物素。

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