CN1615155B - 抗增殖的组合物 - Google Patents

Abstract

借助一种药物的或营养的组合物可以预防和治疗动物或人中细胞的非雌激素依赖的过度增殖，该组合物含有a)两种或两种以上的细胞周期G1/S期的抑制剂；和b)两种或两种以上的细胞周期G2/M期的抑制剂；和c)两种或两种以上的蛋白酪氨酸激酶抑制剂中的至少三个成分。特别地，组分a)包括选自黄酮类化合物、类胡萝卜素和异黄酮的两种和两种以上的化合物；组分b)包括选自黄酮类化合物、羟基化茋、异木黄酮和芹菜苷配基的两种和两种以上的化合物；组分c)包括选自黄酮类化合物和异黄酮的两种和两种以上的化合物。

Description

抗增殖的组合物

发明领域 

本发明涉及含有由细胞周期的不同阶段的抑制剂和蛋白酪氨酸激酶抑制剂的组合的组合物用于预防和治疗细胞过度增殖的用途。此外，本发明还涉及具有这些抗增殖特性的组合物。 

发明背景 

在很多情况下，细胞过度增殖是人类和动物中极其不期望的过程，它会导致种种严重、有时是致死的疾病。这些疾病中最突出的就是癌症。癌症占世界上人类所有死亡中的一个相当大部分。如在美国，每年有120万被确诊为侵入性癌症的新病例，并且每年大约50万人死于癌症。癌症是第二大致死性疾病，预期在21世纪初期会超过心脏病而位居各种疾病的首位。癌症可能通过直接扩张和经过血液、淋巴或浆膜表面来破坏性地侵入正常组织起致死作用。 

癌症包括一类特征为畸变细胞地不可控制地生长的疾病。细胞的这种不可控制的生长是由过度增殖引起。在正常一生中，哺乳动物的组织持续地遭受各种应激物(化学药品如苯或亚硝胺，化学损伤，物理因素如γ射线和紫外射线和生物试剂如EB病毒和肝炎病毒)，在一些情况下，这些应激物通过破坏或诱变细胞或细胞中的特定(主要)成分导致癌症发生。在健康机体中，一些机制会起作用并能够修复这些异常。当细胞不能被修复时，细胞将会以被控制方式死亡(凋亡)，而组织将会用健康的细胞替代被破坏的细胞。当被诱变或被破坏的细胞未能被识别为不期望的细胞，这些细胞对环境的控制变得不敏感或者它们能够快速分裂(快速的细胞增殖)时，就会形成肿瘤。

已知一些基因和因子与肿瘤的形成和生长有关。在这方面，广为知晓的是有丝分裂生长因子。这些生长因子提高蛋白酪氨酸激酶(PTK)的活性，蛋白酪氨酸激酶磷酸化一些调控细胞周期的重要蛋白，从而使细胞增殖。抑制PTK是公知的癌症治疗方案的目标，但是采用合成的PTK抑制剂进行治疗会导致一些相反的副作用。此外，一些内源基因被认为是造成不可控制的细胞生长的原因。一组这种基因称为癌基因。癌基因的前体，即原癌基因特定地将细胞外的信号中转给细胞核，在细胞指令和控制程序中作为生物化学开关。当被呈递的中间成员之一组成型地被致癌性的突变激活时，细胞外信号的渐进和被控制的转移就会被跨越。这导致不可控制的细胞分裂。 

除了正的生长信号的增强，细胞损失的下降以及细胞增殖的增加都可以是不控制的细胞生长的原因。尽管原癌基因是通过突变损伤后生成的功能而被识别，另一类称为抑癌基因的癌症基因通过突变损伤后的功能损失而导致不可控制的细胞生长。一般地，这些基因通过结合到特定基因并调节它们的表达来阻止受损基因的分裂。这导致对在细胞周期中作为检测点起作用的特定蛋白的表达的调控。当抑癌基因被诱变，这种调控作用下降或甚至完全缺失，导致细胞的不可控制增殖。 

细胞增殖发生在细胞周期中。一套既定的活动确保一个母细胞能够分裂成具有与该细胞相同遗传物质的两个子代细胞。这些子代细胞每个都能够进一步分裂成两个新的子代细胞。不分裂的细胞按定义处于所谓的G0期。间期(G1)发生在细胞进入所谓的“合成”(S)期之前，在合成期DNA被复制。在合成期后，在细胞进入有丝分裂期(M)之前可以观察到第二个间期(G2)，在有丝分裂期细胞核(和染色体)和细胞质发生分裂(胞质分离)。在M期可以观察到4个时期。 

因此，虽然在所有时期G1、S、G2和M中，染色体的复制和分离只发生在细胞周期的个别阶段，但细胞繁殖的第三主要成分——生长——则持续存在。在G1和G2中，细胞能够响应增殖和抗增殖的信号，如 生长因子和细胞因子，确定是否应当进行细胞分裂。 

目前，在治疗前通常侵入性地检查肿瘤来决定最佳的治疗策略。主要的癌症治疗方法包括手术治疗、放射治疗、化学治疗和生物治疗。手术治疗是最古老的方法，但是由于癌细胞的转移，单独采用该方法往往不彻底。放射治疗对于不能被切除的局部肿瘤或者倾向于扩散到预知的邻近部位的肿瘤是最有用的。化学治疗被用于系统地治疗任何癌症。通常由药物的组合构成。这些药物的组合需要被施用，来获得最大的成功率。当肿瘤细胞的特性在治疗过程中发生改变时，这些混合物的成分也应随之变化。最后，癌症的生物治疗处于研制的最初阶段。除了骨髓移植，生物治疗包括采用化合物如淋巴因子、单克隆抗体或试剂如引起肿瘤细胞分化为“无害”的细胞的维甲酸(retinoic acid)进行治疗。 

许多类型的癌症极其难以采用当前的治疗方法来进行治疗。这无疑包括非雌激素依赖的癌症如前列腺癌和结肠癌。尽管应用已有的治疗方法，患有这些癌症的患者在较长时期内存活的预后往往极差。在许多情况下，这是由于活性物质不能以足够量穿透肿瘤，或者肿瘤细胞已经对所用的药物产生了抗性的实际情况。此外，肿瘤治疗，特别是化学治疗导致严重的不可预期的副作用，在较短或较长时期内，阻断了患者的自身功能。这些可能的副作用包括恶心、疲劳、体重下降、功能失常、脱发、不育等。还已知癌症治疗会引起对粘膜层如口腔、咽喉和肠道粘膜层的破坏。此外，患者常常觉得缺少饥饿感。这导致极差的饮食习惯，甚至营养缺乏，进一步影响恢复过程和预后。 

虽然近些年来，主要癌症治疗的成功率已经提高，进行了大量的研究工作来揭示癌症发生的原因和开发更好的治疗方法。在肿瘤治疗中，重要的是以可选择的方式进行对肿瘤细胞增殖的抑制。理想地应当不阻碍其他正在快速分裂的细胞和代谢旺盛的细胞的增殖，如成纤维细胞、消化道、上皮细胞、骨髓和具有强大内分泌功能的细胞。在肿瘤生长过程中需要生成新的血管(血管发生)，来提高给肿瘤供应养分和氧气以及 从肿瘤中排除代谢产物的能力。因此，重要的是治疗性的制备物抑制肿瘤细胞以及与肿瘤诱导的血管发生有关的细胞的增殖。 

US5,912,265(Bombardelli等)公开了黄酮类化合物(Flavanolignan)对雌激素依赖的肿瘤的抗增殖活性，这些黄酮类化合物选自水飞蓟素(silymarin)、水飞蓟宾(silybin)、水飞蓟宁(silidianin)、水飞蓟亭(silicristin)和脱氢水飞蓟宾(dehydrosilybin)或其混合物或提取物。雌激素依赖的肿瘤的生长因较高的系统内的雌激素水平而提高。雌激素依赖的癌症的例子包括卵巢的、乳腺的、子宫颈的和子宫的癌症。黄酮类化合物或其成分被证明具有抵抗II型雌激素受体或β-受体的活性。尚无文献涉及这些黄酮类化合物或其成分抵抗来自非雌激素依赖的癌症的肿瘤细胞的增殖，这些癌症如在前列腺、结肠、肺、皮肤、膀胱等中的肿瘤。黄酮类化合物可以与抗肿瘤试剂如顺铂或阿霉素，以及与脂质一起组合。 

WO00/07607(Kosbab)公开了用于预防和治疗癌症和骨质疏松症，特别是女性癌症包括激素依赖的癌症的多组分组合物。该组合物包括抗氧化剂、新血管调节剂、胶原因子、矿物质、维生素、精氨酸及其它的氨基酸和更多组分。抗氧化剂由大量各种成分组成，包括维生素C和E、锌、钾和来自植物的生物类黄酮。这种生物类黄酮包括在许多其他抗氧化剂中提及的儿茶酚(catechins)、来自各种植物提取物的丹宁酸(tannins)，白藜芦醇(resveratrol)、水飞蓟素、姜黄色素(curcumin)、栎精(quercetin)、叶黄素(lutein)、β-胡罗卜素和谷胱甘肽。新血管调节剂包括硫酸软骨素、硫酸鱼精蛋白、异黄酮(isoflavones)(如染料木黄酮(genistein)、大豆黄素(daidzein))、匙羹藤(Gymnema sylvestra)等。胶原因子包括葡糖胺、硫酸软骨素、锰和一些氨基酸。例如，配方III中含有无色花色素(leucoanthocyanidins)、银杏叶(ginkgo biloba)、维生素C、E和A、柠檬油精(limonen)、类胡罗卜素(carotenoids)(或者番茄红素(lycopene))、茶多酚(tea polyphenols)、染料木黄酮、硫酸软骨素、锌、钙和镁、精氨酸和ω-3脂肪酸；配方IV中含有配方III的成分，另外含有硫酸鱼精蛋白、 维生素D3、支链氨基酸、栎醇、锯榈莓(saw palmetto)、维生素B复合物、钾、硒、硫辛酸、蒜素、水飞蓟素、姜黄色素、烟酰胺、亚油酸及其他更多。主要成分被施用的量范围从每天的几微克或几毫克到数百甚至上千毫克，但是对于上述的特定配方来说，没有给出任何一种成分的用量。 

WO00/07607的组合物的一个缺陷在于体积大而且昂贵。此外，没有提出与该组合物的抗增殖特性相关的内容，也没有提出可以通过施用干扰细胞增殖中的多个阶段的各种成分来获得协同作用，也没有提及该制备物对肿瘤细胞的活性的特异性和去除极其不期望的副作用的内容。包含该组合物的成分显然是为了更多的其他效果(见WO00/07607中的表2)。WO00/07607的组合物的另一个缺点在于含有多个成分如精氨酸和一些粘多糖，它们具有对局部缺血和PMA诱导的血管发生的不期望的促进作用(见Murohara等(1998)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，这会促进肿瘤生长。WO00/07607没有提出根据碳水化合物、脂肪和蛋白质的性质，将多组分组合物与这些提供能量的物质结合的要求。 

WO01/26668(Schroder等)描述了具有抗前列腺癌活性的组合物，该组合物含有番茄红素、硒化合物和异黄酮(染料木黄酮、大豆黄素等)。其他成分植物甾醇类、儿茶酚、β-胡罗卜素、叶黄素和维生素E据说能增强该组合物的功效。异黄酮与番茄红素的优选比例为12∶1。分期施用(每天剂量地施用异黄酮和儿茶酚，而其他成分每天仅一次)是优选的。 

Zhou等(营养学杂志(J.Nutrition)129，(1999)1628)报道，大豆异黄酮(染料木黄酮、大豆黄素)以IC₅₀>50μM浓度抑制前列腺癌细胞的生长。Hsieh和Wu(试验细胞研究(Exp.Cell Res.)249(1999)109)描述高水平白藜芦醇对前列腺特异性抗原表达的抑制作用。Bhatia和Agarwall(前列腺(The Prostate)46，(2001)98)报道，100-200μM的水飞蓟素、染料木黄酮和表没食子酚儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)对前列腺癌细胞的作用。这些研究及其他的研究表明一些植物成分可以作为活性的抗增殖试剂，但是对于在增殖细胞的周期中各种成分的靶点以及哪 种组合可能提高治疗的总体效果，没有给普通技术人员任何教导。 

发明内容

令人惊奇地，现在已经发现含有多种在细胞周期的多个阶段起作用和能够抑制PTK和生长因子诱导的细胞增殖的成分的组合物，对更大范围的被诱变或未被诱变的细胞具有比现有技术中的组合物更高的抗增殖活性。因此，这种组合物不仅可以用于预防和治疗更大范围的癌症，特别是非雌激素诱导的癌症，而且还可以用于预防和控制或治疗特征为特定细胞过度增殖的其他疾病，如牛皮癣、非恶性细胞的过度生长以及一些特定阶段的慢性炎症性疾病，如在炎症性肠病(IBD)特别是溃疡性结肠炎中发生间质细胞过度增殖的阶段。已经发现，为使具有完全的抗增殖活性，组合物应当干扰所有上述的增殖机制，即第一间期(G1)、合成期(S)、第二间期(G2)和有丝分裂期(M)，在本文中指G1/S、G2/S和M三个阶段。一种有效的组合物应当总是能够对这三种机制起作用，并且每个机制应当被至少两种不同试剂作用以降低对治疗产生抗性的危险。 

具体实施方式

根据本发明发现，包括 

a)两种或两种以上的细胞周期G1/S期的抑制剂；和 

b)两种或两种以上的细胞周期G2/M期的抑制剂；和 

c)两种或两种以上的蛋白酪氨酸激酶抑制剂 

的组分的组合可以被用于制备预防和治疗哺乳动物或人类中的细胞过度增殖的组合物。 

组分a)包括两种或两种以上的细胞周期G1/S期的抑制剂。这些抑制剂可以是合成或天然来源的，而天然来源的化合物是优选的。优选地，细胞周期G1/S期的抑制剂包括化合物选自黄酮类化合物、番茄红素、大豆黄素和大豆苷(daidzin)或雌马酚(equol)或其功能性类似物，如糖苷、硫酸酯(sulphates)、酯类和内酯，也可以采用本领域已知的其他细胞周期G1/S期的抑制剂，以及细胞周期G1/S期的其他天然抑制剂，或它们的合成等价物。按照本发明的功能性类似物是食用后作为同一化合物存在于肠道中的化合物。 

组分a)包括以每日剂量为10-1400mg、优选20-500mg的量使用的黄酮类化合物。此外，其可以包括每日剂量为0.1-100mg、优选5-20mg的量的类胡萝卜素和/或每日剂量为5-1000mg、优选30-200mg的大豆黄素。 

黄酮类化合物包括水飞蓟素、或者一种或多种其组分和类似物，如水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟亭、脱氢水飞蓟宾或其混合物。优选地，水飞蓟素用作一种黄酮类化合物。当水飞蓟素或一种以上其组分被使用，它们被视为G1/S期的抑制剂，因此在本发明的组合物中需要其他的G1/S期的抑制剂。参照下文的水飞蓟素，水飞蓟素可以被一种或多种其组分替代。黄酮类化合物以及特别是水飞蓟素已知可有效地治疗多种疾病如鹅膏中毒、肝炎和肝硬化。黄酮类化合物可以被合成，但是优选地从天然来源如乳蓟(milk thistle)(水飞蓟)纯化。黄酮类化合物被发现以高浓度存在于乳蓟果实部分的提取物中，但是该植物的其他部分如叶子或种子的提取物适合于作为获取黄酮类化合物的来源。用于分离和纯化黄酮类化合物的方法在本领域中是熟知的。其他木脂体(lignans)，如肠内酯(enterolactone)(2，3-二(3-羟基苯基)丁内酯也可以有效作为细胞周期G1/S期的抑制剂。 

类胡罗卜素是已知的在植物中起作用的化合物，推测在光子能的调控中起作用。按照本发明，类胡萝卜素和类维生素A优选从天然来源中获得。例子包括番茄红素、α-胡萝卜素、δ-胡萝卜素和维甲酸。它们优选地包括维甲酸和特别是番茄红素。番茄红素存在于成熟的果实中，如粉红葡萄柚中30-40ppm、西瓜(Citrullus lanatus)40-900ppm、斜纹亮丝 草(Aglaonema commutatum)、Arbarus unedo、番石榴、红辣椒(Capsicumannuum)、杏(Prunus armeniaca)、桃(Prunus persica)、苦瓜(Momordiacharantia)、胡萝卜(Daurus carota)80-140ppm、番木瓜(Carica papaya)和特别是西红柿(Lycopersicon esculentum)果实中1-35ppm、番茄酱中50-80ppm、调味蕃茄酱中80-120ppm。番茄红素也可以从其他表达番茄红素的生物合成的水果中获得。分离和纯化类胡萝卜素特别是番茄红素的方法在本领域是熟知的。 

细胞周期G1/S期的另一种优选的抑制剂包括大豆黄素及其功能性类似物如大豆苷。大豆黄素及其功能性类似物可以合成，但是优选从天然来源如大豆或红三叶草的提取物中获得。雌马酚(二氢大豆黄素)可以用作大豆黄素的功能性等价物。分离和纯化大豆黄素及其功能性类似物的方法在本领域是已知的。 

组分b)包括两种或两种以上的细胞周期G2/M期的抑制剂。这些抑制剂可以是合成的或天然来源的，而天然来源的化合物是优选的。优选地，细胞周期G2/M期的抑制剂包括化合物选自黄酮类化合物、羟基化茋、异黄酮如染料木黄酮及其功能性类似物如染料木黄酮(genestin)、醚化的、酯化的、糖基化的形式，以及可以使用本领域已知的细胞周期G2/M期的其他抑制剂，如芹菜苷配基(apigenin)和栎精。 

组分b)包括以日剂量为10-1400mg、优选20-500mg的量使用的黄酮类化合物和/或以日剂量为0.1-100mg、优选5-20mg的量使用的羟基化茋和/或以日剂量为5-1000mg、优选30-200mg的量使用的异黄酮，特别是染料木黄酮。 

按照本发明的羟基化茋优选包括白藜芦醇(3，5，4’-三羟基茋)，但是也可以使用本领域已知的其他羟基化茋及其功能性类似物如3，5-二羟基茋(银松素)的反式异构体、3，3’-二羟基茋、3，4’-二羟基茋和3，5，3’-三羟基茋及其糖基化形式。按照本发明的羟基化茋特别是白藜芦醇可以被合成或者从天然来源中分离得到。这种天然来源优选包括特别是蓼属 (Polygonum spp.)和葡萄属(Vitis spp.)的水溶液或乙醇的提取物。 

另一种优选的细胞周期G2/M期的抑制剂包括如染料木黄酮及其功能性类似物如染料木黄酮。染料木黄酮及其功能性类似物可以被合成，但是优选从天然来源如大豆提取物中获得。分离和纯化染料木黄酮及其功能性类似物的方法在本领域是已知的。 

组分c)包括两种或两种以上的蛋白酪氨酸激酶活性抑制剂。这些抑制剂可以是合成的或者天然来源的，而天然来源的化合物是优选的。优选地，蛋白酪氨酸激酶活性抑制剂包括化合物选自黄酮类似物、异黄酮及其功能性类似物如水飞蓟素和染料木黄酮，但是也可以使用本领域已知的其他蛋白酪氨酸激酶活性抑制剂，如在US5,216,023中公开的氨基酸的脂肪酸衍生物、芹菜苷配基和羟基化茋如白藜芦醇。 

组分c)包括以日剂量为5-1000mg、优选5-50mg的量使用的黄酮类化合物和/或以日剂量为5-1000mg、优选40-200mg的量使用的异黄酮。 

异黄酮是一组称作为植物雌激素的化合物。它们主要存在豆科植物和植物种子特别是在大豆和红三叶草中。大豆中的主要异黄酮是染料木黄酮和大豆黄素。这些类型的异黄酮不含有糖基，称作为糖苷配基形式。但是含有糖基的糖原形式是植物中的异黄酮的主要形式。糖原的例子是染料木黄酮和大豆苷。异黄酮如雌马酚可以被用来替代或加入到异黄酮特别是大豆黄素中。在组分a)中使用的异黄酮优选包括大豆黄素或雌马酚。在组分b)和c)使用的异黄酮优选包括染料木黄酮。如上所述，对于染料木黄酮，异黄酮可以被合成，但是它们优选地从天然来源如大豆和红三叶草的提取物中获得。分离和纯化异黄酮及其类似物的方法在本领域是已知的。 

特别地，增殖的G1/S期和G2/M期抑制剂和蛋白酪氨酸激酶的抑制剂在下面表1中说明的浓度下具有活性。活性成分的抑制浓度由这些成分在后面的体外分析中的活性确定。

确定G1/S期和G2/M期抑制的细胞周期分析 

LNCaP细胞生长到分汇合，并用各种浓度的生物活性成分或用载体对照培养24小时。回收细胞，用溶解在PBS中的70％乙醇固定。然后将细胞沉淀物悬浮在含有碘化丙锭(50μg/ml)和无DNA酶的RNA酶(100μg/ml)的0.5mlPBS中。用FACS分析进行细胞周期的分析。有效的G1/S停滞通过G1曲线下的面积增加a>1.5倍来确定。类似地，G2/M停滞通过特定浓度下G2曲线下的面积增加a>2倍来确定。 

蛋白酪氨酸激酶的抑制分析 

在血清饥饿36小时后，70-80％汇合的Du-145细胞用各种浓度的生物活性成分或用载体对照培养2小时。在此预培养后，细胞用TNF α(50ng/ml)或PBS在37℃下处理15分钟。细胞在冰冷的缓冲液(10mMTris，pH7.4，150mMNaCl，1％TritonX-100，1mMEDTA，1mMEGTA，0.2mM钒酸钠，0.2mMPMSF，0.5％NP-40，0.2单位/ml抑酶肽)中溶解后，用抗-EGFR免疫沉淀erbBl，接着进行蛋白质印迹和用抗磷酸酪氨酸进行探测。蛋白酪氨酸激酶的抑制的IC₅₀值基于抗磷酸酪氨酸信号的降低。表1：增殖抑制剂的有效浓度 

  

有效浓度	G1/S细胞周期停滞	G2/M细胞周期停滞	抑制蛋白酪氨酸激酶活性
				必需的	<150μg	<150μg	<200μg
优选的	<80μg	<80μg	<100μg
				更优选的	<50μg	<50μg	<70μg
最优选的	<25μg	<25μg	<50μg

在一个优选实施方案中，组分a)包括黄酮类化合物、大豆黄素或雌马酚，和类胡萝卜素如番茄红素或维甲酸中的至少两种，组分b)包括黄酮类化合物、染料木黄酮、羟基化茋、芹菜苷配基和栎精中的至少两种， 和组分c)包括黄酮类化合物、染料木黄酮、白藜芦醇和芹菜苷配基中的至少两种。因此，作为一个优选实施例，组分a)含有水飞蓟素和类胡萝卜素或大豆黄素，组分b)含有水飞蓟素和白藜芦醇或染料木黄酮和组分c)含有水飞蓟素和染料木黄酮。这些组分被用于制备预防和治疗动物和人类中的细胞过度增殖的组合物。优选的组合是水飞蓟素+大豆黄素+染料木黄酮、水飞蓟素+大豆黄素+白藜芦醇、水飞蓟素+类胡萝卜素+染料木黄酮、水飞蓟素+类胡萝卜素+白藜芦醇、类胡萝卜素+大豆黄素+白藜芦醇和类胡萝卜素+大豆黄素+染料木黄酮，以及这些成分的四种或四种以上的组合。一种特别优选的组合物包括黄酮类化合物，特别是水飞蓟素、大豆提取物和番茄红素。 

在按照本发明的一种优选应用中，在动物和人类中，组分a)、b)和c)的所有日剂量的总和为在0.5-35mg/kg体重之间，或在约35-约2500mg/人/天之间，优选为在70-700mg/人/天之间。 

在按照本发明的应用的一个优选实施方案中，该组合物含有脂质成分，量为如2-800重量份，特别是在每个总计抑制剂a)、b)和c)的分量中占8-200重量份。该脂质成分存在组合物中来提高上述成分的生物可用性。脂质成分包括甘油三酯油、不完全甘油酯、表面活性剂和共表面活性剂。这些脂质成分优选地包括那些成分来支持自乳化过程，该过程在生物活性化合物吸收过程中发生在胃肠道中。因此，脂质成分优选包括甘油三酯油和磷脂。甘油三酯油的例子为橄榄油、向日葵油、玉米油和MCT(中链甘油三酯)油，以及含有较高含量饱和脂肪酸的脂质如椰子或棕榈核脂质。磷脂的例子包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸，以及溶血磷脂。大豆、油菜籽和鸡蛋的提取物是磷脂的优选来源。采用溶血磷脂对于加工用于局部施用的乳剂是有益的。当30％磷脂为卵磷脂，特别可以获得磷脂的表面活性剂活性。甘油可以被加入到本发明的产品中来支持自乳化过程和提高产品的口味。 

此外，每日剂量的组分a)、b)和c)的总重量与每日剂量的脂质的 重量的比例优选为在1∶300到2∶1之间。对于与常规食物协同使用的添加，在1∶6到2∶1之间，特别约1∶1的比例是优选的；对于单独使用的添加，a)+b)+c)与脂质的比例在1∶30到1∶6之间是优选的。在按照本发明的应用的另一个实施方案中，脂质可以被化学地连接到合成制备的化合物上，例如通过合成异黄酮的磷脂酯。 

在按照本发明的应用的一个实施方案中，该组合物还可以包括一种和多种有益的其他的草药提取物或其成分如包含贝加因(baicalein)或贝加林(baicalin)或甘草查尔酮的提取物、维生素如维生素C、E、A和D，微量元素如锌、硒，硒特别为富含硒的大蒜或酵母、矿物质、抗氧化剂和大量成分(macroingredient)(脂肪、碳水化合物和/或蛋白质)。这些化合物可以按照本领域已知的方法加入。此外，优选在按照本发明的组合物中包括在肠道中产生极大量的丁酸盐的纤维源。这种纤维源的例子是麦麸、菊粉或其成分、和抗性淀粉。该纤维源的量优选每日剂量超过1g。 

在按照本发明的应用中，组合物优选为食物的和/或药物的组合物。它们可作为完全食物或作为添加剂，其风味、口味和产品的稳定性都十分良好，稍微有或没有不期望的副作用。按照本发明的组合物，优选通过口服，以液体形式或干燥形式被施用给动物或人，如饮品、乳剂、果冻、布丁、冰激凌、汤、调味剂、棒(bars)、水溶性或油性的悬浮物、糖浆或药丹或干燥形式如片剂、锭剂、糖锭、可分散的粉末或颗粒、硬壳胶囊或软凝胶胶囊，或者以粉末或预混浓缩物被重组成液体形式。从影响感观的角度考虑，一个优选实施方案是棒状产品，特别是具有巧克力口味的棒。产品还适合于体表施用，如用于预防和治疗牛皮癣和疣。适合的应用形式是喷雾剂，如为可喷射的乳剂。 

按照本发明，组合物可用于预防和治疗动物和人中与过度增殖相关的疾病。其中特征为一些细胞过度增殖的疾病的例子特别是牛皮癣、非恶性细胞过度生长如疣，良性前列腺增殖和腺瘤状息肉和某些阶段的慢性炎症性肠道(IBD)疾病，特别是溃疡性结肠炎。

特别地，按照本发明的组合物被要求在各种发育阶段有效地抵抗极大范围内的被诱变细胞的不可控制增殖。更特别地，按照本发明的组合物被要求特别有效地抵抗肿瘤细胞的不可控制增殖，该肿瘤细胞的生长不是由雌激素促进的。这种疾病的例子特别是前列腺、肺、膀胱、皮肤、血细胞(霍奇金病(Hodgkin)、白血病)、胰腺、肝脏、肾脏、口腔、喉、食管、胃、脾、直肠、小肠和结肠。 

仅次于降低肿瘤生长速度和转移形成程度，按照本发明的组合物可以被用于维持肿瘤细胞的低增殖率，如在手术前肿瘤的个头还很小的期间。该组合物可以单独施用或者与当前适用于预防或治疗与过度增殖相关的疾病的方法组合使用，特别在癌症治疗中。 

本发明还涉及不会促进血管发生的组合物。已知会促进血管发生的试剂如精氨酸和粘多糖，不应当存在或者仅低水平地存在。在两个动物模型中，已经发现精氨酸刺激血管发生(见Murohara等(1998)J.Clin.Invest.101，2567-2578)，精氨酸提高了给肿瘤供应养分和氧气和从肿瘤中排除代谢产物的能力。因此，本发明的组合物优选包括： 

a)两种或两种以上的细胞周期G1/S期的抑制剂；和 

b)两种或两种以上的细胞周期G2/M期的抑制剂；和 

c)两种或两种以上的蛋白酪氨酸激酶抑制剂， 

其中组分a)、b)和c)的总和的重量与L-精氨酸的重量的比例大于1∶1，优选大于4∶1，L-精氨酸的含量产生每天<10mg的L-精氨酸剂量。优选地，按照本发明的组合物不含精氨酸。此外，优选地按照本发明的组合物只含低量硫酸葡糖胺和粘多糖，如硫酸软骨素和硫酸葡糖胺；特别地，这些化合物的含量比组分a)、b)和c)的总量的0.1倍、更优选为0.02倍还低，或者其绝对量为每天小于50mg、甚至小于10mg。 

试验部分 

细胞增殖作为施用本发明的成分的功能

材料与方法 

试验成分 

异黄酮(染料木黄酮、大豆黄素、雌马酚)从Indofine ChemicalCompany，Inc.(新泽西，美国)购买得到。水飞蓟素、得自水飞蓟(silybummarianum)的果实的黄酮类化合物的混合物购自Sigma-Aldrich Chemie(Zwijndrecht，荷兰)。番茄红素由Roche Diagnostics(曼海姆，德国)提供。如下制备母液：染料木黄酮和水飞蓟素溶解在乙醇中。大豆黄素和雌马酚溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。番茄红素溶解在0.02M HCl中。 

细胞培养 

PC3细胞系(美国典型培养物保藏中心，Mannassas，美国)是一种来源于骨病变转移的高抗性的前列腺癌细胞系，以单层培养维持在添加5％FCS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco，Lifetechnologies BV，Breda，荷兰)中。细胞在无菌条件下生长在塑料的组织培养瓶中(Falcon，Micronic，Lelystas，荷兰)。培养在5％CO2的湿润空气中、37℃温度下进行。每2-3天更换培养液一次，以周为间隔，用0.05％酪氨酸和0.01％EDTA对细胞进行传代培养。 

暴露于试验成分 

将PC3细胞以16000细胞/孔的浓度植入平底的96-孔组织培养处理平板(Falcon，Micronic，Lelystad，荷兰)。在培养24小时后，将载体对照、试验成分或试验成分的组合加入到培养基中(在孔内的200μl培养基中加入20μl)，组合地试验这些成分来确定添加的和协同的效果。PC3细胞被处理4天。 

增殖分析 

通过测定DNA合成中的5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的转化和活细胞 中线粒体脱氢酶对四唑盐(WST-1)的裂解来量化细胞增殖。比色BrdU(免疫分析)和比色WST-1分析按照生产商的推荐进行(RocheDiagnostics，曼海姆，德国)。简而言之，BrdU分析：在处理后，细胞用BrdU标记的溶液处理3小时。在标记后，细胞用PBS洗涤，固定30分钟，再用PBS洗涤。在用抗BrdU-POD工作溶液培养90分钟后，洗涤细胞3次。在加入底物后，用硫酸终止反应。在450nm下用650nm的比对波长测定吸收值。WST1分析：在处理后，用PBS洗涤细胞，用溶解在培养基中的WST-1(1∶10)处理。在培养3小时后，在450nm下测定吸收值，用595nm作为比对。 

抑制效果的分类 

不同成分组合的协同作用为对增殖的抑制显著大于单独一种成分的组合的值。添加的效果为，增殖不会显著大于单独一种成分的组合的值，但是对增殖的抑制显著大于单独一种成分的值。 

结果 

染料木黄酮、雌马酚、番茄红素和水飞蓟素对人前列腺癌细胞系PC3的组合效果 

染料木黄酮(27μg/ml)和雌马酚(26μg/ml)单独地分别产生20.2±4.6％和30.1±4.4％(平均数±s.e.)的对人前列腺癌细胞系PC3的抑制作用。单独使用水飞蓟素(25μg/ml)、大豆黄素(25μg/ml)和番茄红素(53μg/ml)不会显著抑制PC3细胞系的生长(分别为9.5±4％，10.0±6％和7.3±2.7％)。水飞蓟素与任何的染料木黄酮、大豆黄素、雌马酚或番茄红素的组合分别以52.3±3.7％、381.1％、64.4±1.1％和46.0±3.4％额外地抑制生长。染料木黄酮与大豆黄素、雌马酚和番茄红素以43±4％、73±0.7％和91.5±4.1％额外地抑制生长，番茄红素与雌马酚以91.6±3.3％加入地抑制生长。三种或三种以上地成分的组合以超过99％额外地 抑制生长。 

实施例1 

治疗前列腺癌的组合物 

混合如下成分： 

成分                              每天的量(mg) 

大豆异黄酮                         100.0 

番茄红素                           15.0 

水飞蓟素                           160.0 

抗氧化剂 

维生素C                            225.0 

维生素E                            75.0 

类胡萝卜素                         3.0 

类黄酮                             19.0 

泛醇(Ubiquinol)                   4.0 

硒                                 0.128 

锌                                 18.0 

铜                                 2.7 

镁                                 5.0 

核黄素                             2.5 

维生素B6                           3.3 

维生素B12                          0.0033 

叶酸                               0.4 

N-乙酰-半胱氨酸                    500 

实施例2 

治疗结肠癌的组合物

混合如下成分： 

成分　　　　　　　　　　　每天的量(mg) 

大豆异黄酮　　　　　　　  25.0 

番茄红素                  2.0 

水飞蓟素                  50.0 

纤维混合物                15000 

钙                        1500 

益生菌 

鼠李糖乳杆菌(Lb.rhamnosus)+嗜醇乳杆菌(Lb.acidophilus) 

                               2-41010CFU 

抗氧化剂 

维生素C                        150.0 

维生素E                        37.5 

类胡萝卜素                     1.5 

类黄酮                         10.0 

泛醇(Ubiquinol)               2.0 

硒                             0.085 

锌                             9.0 

铜                             1.4 

镁                             2.5 

核黄素                         1.3 

维生素B6                       1.3 

维生素B12                      1.6 

叶酸                           0.4 

绿茶提取物                     300.0 

姜黄色素                       60.0

实施例3 

45g常规巧克力棒。成分为：糖浆、奶粉、巧克力块、可可油、大豆卵磷脂和风味剂，其中1g糖浆用甘油替代，1.5g巧克力块用50mg乳蓟、20mg芹菜苷配基和20mg番茄红素替代。 

实施例4 

热食物的每100g干物质中含有的调味剂 

乳蓟提取物                           50mg(或者42mg水飞蓟素) 

西红柿浓缩物                         20g(或者2mg番茄红素) 

胡萝卜粉                             2g(或者7mg番茄红素) 

全脂大豆粉                           40g(或者大豆黄素和染料木黄 

                                         酮，产生8.2g脂质，其中0.8g 

                                         磷脂) 

大蒜                                 1g(可以用酵母替代) 

改性淀粉                             5g 

风味剂(百里香、迷迭香)               1g 

蔬菜浓缩物                           20g 

氯化钠                               10g 

实施例5 

用于治疗良性前列腺增殖(BPH)和预防前列腺癌的组合物 

混合下列成分： 

成分                                       每天的量(mg) 

大豆异黄酮                                  30 

产生染料木黄酮                              10 

番茄红素                                    5 

水飞蓟                                      50

Serence repens(锯榈莓)                     320 

亲脂提取物                                  272 

硒                                          0.1 

锌                                          15 

铜                                          2 

非洲李属                                    50 

产生甾酮(12％)                              6 

大豆油                                      500 

大豆卵磷脂                                  200 

其他成分：胶囊壳：胶质、甘油，天然染料：亚硫酸氨焦糖、二氧化钛；防粘结剂：二氧化硅。 

实施例6 

局部应用于皮肤的乳霜。制备如下的预混料： 

A：矿物油                                    10％ 

角鲨烷                                       5％ 

二甲基硅油                                   3％ 

PEG-30多羟基硬脂酸盐                         3％ 

B：甘油                                      6％ 

七水硫酸镁                                   0.7％ 

水加到                                       100％ 

C：防腐剂                                    0.5％ 

香精                                         0.5％ 

本发明的活性成分                             2％ 

C中的活性成分如下： 

白藜芦醇(得自葡萄籽)                         20mg

番茄红素(得自西红柿)                           40mg 

芹菜苷配基                                     20mg 

肠内酯                                         10mg 

通过加热A和B到75℃，并将B加到A中，同时搅拌，匀化1分钟，同时搅拌冷却到40℃，加入C同时搅拌冷却到室温来制备乳霜。

Claims (13)

1.选自水飞蓟素、染料木黄酮、大豆黄素、雌马酚和番茄红素中的三种或三种以上组分的组合在制备用于预防和治疗动物或人类中的前列腺癌的组合物中的用途。

2.按照权利要求1的用途，其中所述组合含有每日剂量为10-1400mg的量的水飞蓟素。

3.按照权利要求2的用途，其中所述组合含有每日剂量为20-500mg的量的水飞蓟素。

4.按照权利要求1的用途，其中所述组合含有每日剂量为0.1-100mg的量的番茄红素。

5.按照权利要求4的用途，其中所述组合含有每日剂量为5-20mg的量的番茄红素。

6.按照权利要求1的用途，其中所述组合含有每日剂量为5-1000mg的量的大豆黄素。

7.按照权利要求6的用途，其中所述组合含有每日剂量为30-200mg的量的大豆黄素。

8.按照权利要求1的用途，其中所述组合含有每日剂量为5-1000mg的量的染料木黄酮。

9.按照权利要求8的用途，其中所述组合含有每日剂量为30-200mg的量的染料木黄酮。

10.按照权利要求1至9中任一项的用途，其中在动物和人类中所述组分的每日剂量的总和在0.5-35mg/kg体重之间。

11.按照权利要求1至9中任一项的用途，其中该组合物包括脂质成分。

12.按照权利要求11的用途，其中所述脂质成分包括磷脂。

13.按照权利要求11的用途，其中所述组分的总和的每日剂量的重量与脂质成分的每日剂量的重量的比例在1∶300到2∶1之间。