CN1608077A - 蛋白质复性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及取代的咪唑鎓盐用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或用于增加其热稳定性的应用,以及用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或用于增加其热稳定性的方法,以及由根据本发明的方法制备的复性蛋白质。在根据本发明的方法中,使要处理的蛋白质与含有取代的咪唑鎓盐的液体复性基质接触。
Description
技术领域
本发明涉及取代的咪唑鎓盐用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或用于增加其热稳定性的应用,以及用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或用于增加其热稳定性的方法,以及由根据本发明的方法制备的复性蛋白质。
背景技术
在目前的情况下,蛋白质的复性可认为是生物学活性和/或高程度正确折叠的蛋白质的恢复或复原。蛋白质复性问题在生物技术中具有高度的重要性。由于在分子生物学的发展,可能以重组方式从蛋白质编码序列开始对其进行克隆并在宿主生物中产生所述的蛋白质。然而,在这些情形中,重组蛋白质常以生物学无活性的聚集体或包含体形式沉淀。在这些包含体中含有的蛋白质随后必须由体外复性转化为生物学活性形式。
所述的复性是非常复杂的结构生物学过程,且常常仅导致非常低产量的天然蛋白质。因此,复性的蛋白质产量中即使少许百分比的增加也将提供基本的改善和经济利益。
在包含体蛋白质的体外折叠中,已常观察到正确折叠和无效果的副反应如错折叠和聚集体之间的动力学竞争。聚集过程主要基于多肽链的疏水相互作用,所述的多肽链在很大程度上是未折叠或非天然的,部分地是折叠中间体。与其分子基础无关,这些聚集事件具有大于2的反应等级。随后,这些无效果的聚集反应的速率随未折叠的多肽链浓度的增加而增大。由于正确折叠事件主要由一级反应控制,所以这意味着如果变性的蛋白质浓度增加,那么聚集反应比正确折叠占优势。为此原因,体外折叠反应常常以非常低的蛋白质浓度进行。此外,物理参数如pH、离子强度、氧化还原系统和温度对于蛋白质复性必须是最适的。然而,在许多情形中,即使这些措施也未带来预期的成功率。
此外,长期以来已知以非变性浓度加入缓冲液如尿素或胍盐可对折叠效率具有积极影响。作为胍盐或尿素的替代,其他离液序列高的物质也已用于体外折叠过程中,如烷基脲或共溶剂如羧酸酰胺或烷基化的胺。
在来自大肠杆菌(E.coli)包含体的人类纤溶酶原激活物的复性情形中,已观察到体外折叠的产量可通过添加L-精氨酸而增强。进一步的研究已揭示L-精氨酸在其他蛋白质如抗体片段或免疫毒素的体外折叠中也可用于改善折叠效率。尽管精氨酸含有胍基,但它对结构的去稳定作用不如胍盐。因此,认为精氨酸可增加未折叠的多肽链或折叠中间体的溶解性,而不显著使天然蛋白质结构去稳定。增加体外这些效率的其他添加物为高度浓缩的Tris缓冲液、聚乙二醇或去污剂。也已用混合的微团(如Triton X 100和磷脂)实现了改善的折叠产量。所述的混合的微团含有可能通过与其相互作用而抑制折叠中间体聚集的极性和非极性基团。
2000年5月的Amersham Pharmacia Biotech(Data File:AffinityChromatography;HiTrap Chelating 1ml和5ml;18-1134-78 AB)出版物中第1-6页描述了His6-标记的蛋白质在Ni2+-NTA柱上的复性。复性缓冲液含有20mM咪唑。所述的咪唑浓度可防止蛋白质和柱基质之间非特异性的相互作用,但不导致任何复性。相反,咪唑已知是一种变性剂。
2000年Yeh等人的“细胞色素c的等级折叠(Hierachical folding ofcytochrome c)”(Nature Struct.Biol.7,第443-445页)描述了咪唑可加速细胞色素c的折叠动力学。蛋白质的His33与其共价结合的配体的分子内相互作用可由咪唑抑制。高浓度的咪唑基本具有对蛋白质的变性作用。
尽管在文献中提到了许多用于蛋白质复性的规程,但该技术的工业应用不是非常充分发展的。该事实的原因基于技术和生物化学两者的困难。由于即使在最适的条件下,蛋白质的复性也仅在非常低的蛋白质浓度存在时才可实现,所以工业生产需要非常高的复性体积的操作。此外,即使在最适的条件下,许多蛋白质的复性效率也是低的。
发明内容
因此,本发明的一个目的是鉴定可在体外增强蛋白质折叠效率的物质,并提供一种以迄今为止获得的较高产量进行有效蛋白质复性的方法。
该目的是根据本发明通过应用用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或用于增加其热稳定性的取代咪唑鎓盐实现的,以及是通过用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或用于增加其热稳定性的方法实现的,其中使要进行处理的蛋白质与含有取代咪唑鎓盐的液体基质接触。本发明也涉及应用根据本发明的方法制备的蛋白质。
根据本发明的优选应用是用于蛋白质的复性。
根据本发明,聚集的降低意指降低或甚至基本防止蛋白质的聚集,所述的蛋白质聚集通常在液体基质中延长的贮存期中发生并伴随着生物学功能性的丧失或减少。
根据本发明,热稳定性的增加指即使在大大高于室温的温度时,生物学活性或正确的蛋白质折叠各自在延长的时间段中得以维持。
根据本发明应用的咪唑鎓盐在室温时优选地是离子型液体。如果这些化合物在室温时不是液体,那么根据本发明的咪唑鎓盐在处理条件下至少应以液体形式存在和/或可溶于液体基质中。在本发明的背景中应用的咪唑鎓盐具有与环系统相关的有机成分的正电荷,所述的正电荷通常或优选地在咪唑鎓环中是离域的。
本方法是基于令人惊讶的发现,即取代咪唑鎓盐抑制蛋白质的聚集并增强复性效率。迄今为止,这些有机盐仅已用作有机合成和两相催化作用中的溶剂,然而它们对生物化学中结构形成过程的作用迄今尚未知晓。也已描述了其他使得能够进行更有效的蛋白质复性的有机盐,如3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯或盐酸胡芦巴碱(WO 99/18196)。这些物质例如在杂环系统中不具有离域的正电荷。在对它们对蛋白质的复性作用进行的直接比较中,本发明的咪唑鎓盐衍生物显示明显高的效率(也参见工作实施例以及图2和3连同图8和9)。
优选地是本发明咪唑鎓盐的咪唑鎓环由烷基、烯基、芳基和/或芳烷基取代,而这些基团自身可由功能基团如含有氮、硫和/或磷的基团取代,其中不同的氧化状态是可能的。根据本发明的这些功能基团的优选例子为:胺、羧基、羰基、醛、羟基、硫酸盐、磺酸盐和/或磷酸盐基团。
根据本发明,咪唑鎓环的一个或两个N原子可由相同或不同的取代基取代。优选地,咪唑鎓环的两个氮原子均由相同或不同的取代基取代。
根据本发明同样可能或优选的是咪唑鎓盐在咪唑鎓环的一个或多个碳原子进行加成性或排斥性取代。
优选用作取代基的是C1-C4烷基,如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和/或异丁基,特别优选的是乙基和/或甲基。同样优选的取代基为C2-C4烯基,如乙烯、正丙烯、异丙烯、正丁烯和/或异丁烯。具有这些C1-C4烷基和C2-C4烯基时,根据本发明的咪唑鎓盐化合物具有根据本发明特别有用的且随较长的烷基和烯基而降低的水溶性。然而,水溶性也可通过烷基或烯基链自身上的溶解促进取代基得到改善,如通过硫酸盐、磺酸盐、氨基或磷酸盐基团。根据本发明,也包含具有超过4个C原子的烷基和烯基取代基,如C5-C10烷基或烯基取代基也是优选的。这些C5-C10烷基或烯基如果在其烷基和/或烯基上具有一个或多个其他取代基,则进一步是优选的,所述的取代基如硫酸盐、磺酸盐、氨基或磷酸盐基团。
至于芳基取代基,根据本发明优选的是单-和/或二环芳基、苯基、联苯和/或萘,以及这些化合物带有羟基、磺酸盐、硫酸盐、氨基、醛、羰基和/或羧基的衍生物。优选的芳基取代基的例子是酚、联苯、二酚、萘、萘羧酸、萘磺酸、二苯酚基、联苯羧酸、酚、苯基磺酸盐和/或苯酚磺酸。
优选的芳烷基为苄基或取代的苄基。
特别优选的是咪唑鎓环在其至少一个N原子上具有甲基。
根据本发明应用的咪唑鎓盐优选地为液体,即它们优选地为室温(约25℃)时离子型的液体。然而,也可应用在室温非液体,但在复性条件下分别应以液体形式存在或应溶于液体基质的咪唑鎓盐。
咪唑鎓盐在性质上明显区别于咪唑。具体而言,咪唑鎓盐是亲水的,而咪唑是疏水的,且对蛋白质具有变性作用。
至于根据本发明取代的咪唑鎓环的阴离子抗衡离子,卤素和含有离子的卤素是尤其有用的。在这一方面特别优选的是氯化物和四氟硼酸根。进一步优选的是磷酸盐、硫酸盐和异氰酸盐。
根据本发明更优选应用的咪唑鎓盐是:1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓,1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓,1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓。
根据本发明,下面的蛋白质种类和/或蛋白质优选地可进行复性,其热稳定性可得到增强和/或其聚集可降低,或者下面的蛋白质和/或蛋白质种类优选地可分别应用于根据本发明的方法中:
蛋白酶,优选的为丝氨酸蛋白酶,具体而言为凝血酶、凝血因子Xa、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶如胃蛋白酶或凝乳酶、金属蛋白酶如嗜热菌蛋白酶;蛋白酶抑制剂,优选的为胃酶抑制剂、抗蛋白酶、化学抑制素、弹性蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、苯丁抑制素、抗凝血酶III;
DNA结合蛋白质,优选的为转录因子,具体而言为NFκB和jun、fos、krox、myc、E2F家族的成员、病毒T抗原;
病毒蛋白质,如病毒包膜蛋白、衣壳蛋白、病毒蛋白酶、聚合酶和/或T抗原;
磷酸酶;
蛋白激酶,优选的为酪氨酸激酶和/或丝氨酸激酶;
免疫球蛋白超家族的蛋白质,如抗体及其片段;生长因子,如表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子I和II(IGFI和IGFII)、白细胞介素-2(IL-2)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子β(TGF-β)和/或血小板生长因子(PDGF),
以及源自这些蛋白质的蛋白质和片段。
根据本发明,可分别使无二硫键的和二硫键桥联的蛋白质复性,和/或改善其热稳定性,和/或预防或降低其聚集。特别优选地,可对多结构域的蛋白质和复杂二硫键桥联的蛋白质进行处理,如溶菌酶、rPA(重组的纤溶酶原激活物,商品名为replase)、α葡糖苷酶、抗体及其片段和/或生长因子。这些蛋白质/蛋白质种类仅用作例子,然而,本发明不局限于所述的列举。
至于根据本发明在用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或增加其热稳定性的方法中的液体基质,优选地应用适合于要处理的蛋白质的缓冲液系统。Tris、Hepes、Mes、Mops、乙酸盐、甘氨酸和/或磷酸盐优选地用作缓冲液物质,液体基质中的缓冲液浓度优选地为10-1000mM,更优选地为5-200mM,同样优选地为10-200mM,且进一步优选地为10-50mM。缓冲液系统的pH优选地为4-11,进一步优选地为7.5-10.5。在溶菌酶的情形中,复性过程中的pH值优选地为约8,且对于rPA的复性,pH值优选地为约10.5。对于要复性的其他蛋白质,可单独使缓冲液组成参数适合和最适化以获得最大产量的变性蛋白质。
在根据本发明蛋白质复性的方法,要复性或要处理的蛋白质的接触优选地分别通过用液体基质对要处理的蛋白质的稀释、透析和/或渗滤进行。最重要的,为进行复性应确保变性的蛋白质向复性缓冲液中的缓冲液交换。
在接触过程中,具体而言为在复性过程中,要处理的蛋白质浓度优选地为5-500μg/ml,优选地为10-100μg/ml,更加优选地为约50-100μg/ml。这些值可由本领域技术人员考虑各个蛋白质的溶解性质,分别关于要进行复性或要进行处理的蛋白质进行调节。
根据本发明的方法可用于无二硫键或二硫键桥联的蛋白质的复性。关于无二硫键的蛋白质,优选地使其在还原剂存在时与含有取代的咪唑鎓盐的复性基质接触,所述的还原剂如DTT、DTE和/或半胱氨酸,优选地在1-10mM的浓度。
关于二硫键桥联的蛋白质,优选地使其在氧化还原系统存在时接触,所述的氧化还原系统包含还原和氧化的硫羟物质,如DTT、DTE、谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇,优选地在1-10mM的浓度。在这些情形中,还原的物质与氧化的物质的浓度比例(“还原的∶氧化的”)优选地为1∶10~20∶1,优选地为1∶5~10∶1,进一步优选地为1∶1~5∶1。
在接触过程中,具体而言为在复性过程中,取代的咪唑鎓盐浓度基于复性基质优选地为5-95体积%,进一步优选地为5-50体积%,进一步优选地为10-40体积%。同样在这些情形中,每一种蛋白质的最适浓度可由简单的实验进行确定。通常,以10-40体积%添加取代的咪唑鎓盐提供了最好的复性结果。然而如上文已提及的,所述的浓度依赖于各自所用的咪唑鎓盐化合物而可高达95体积%。
根据体积摩尔浓度,上述体积百分比10-40体积%相应于约0.5-3M:在1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓的情形中,这精确地指0.68-2.73M。因此,根据体积摩尔浓度,根据本发明优选的是取代的咪唑鎓盐的体积摩尔浓度基于复性基质为约0.25-5M,进一步优选地为0.25-3.5M,且最优选地为约0.5-3M。
通常,复性过程优选地为:0.1-100小时,进一步优选地为1-50小时,更加优选地为约2-20小时。
复性优选地在0-37℃的低温发生,优选地为5-15℃,这是因为在高温时,聚集反应增加。
作为使复性最适化的参数,蛋白质的生物学活性和聚集行为优选地可在所述的过程中进行测量。
在根据本发明的方法的另一个实施方案中,蛋白质可在几个连续的时间以脉冲方式或以连续方式添加到复性缓冲液中。
总之,根据本发明的方法适合于以特别有利的方式用于蛋白质复性。在这一方面,进一步优选的是除取代的咪唑鎓盐之外,用于蛋白质复性的液体基质含有其他已知的复性物质或促进复性的物质,如尿素、胍盐、L-精氨酸、烷基脲、羧酸酰胺、烷基化的胺、Tris缓冲液、聚乙二醇和/或去污剂。
附图说明
下面,本发明将对工作实施例进行描述。在这一方面可参考下面的附图:
图1:显示以%表示的溶菌酶复性产量与1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的浓度之间的关系;
图2:显示rPA复性产量与1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的浓度之间的关系;
图3:显示rPA复性产量与1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓的浓度之间的关系;
图4:显示rPA复性产量与4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓之间的关系;
图5:显示rPA复性产量与1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的浓度之间的关系;
图6:是复性过程中rPA聚集的图示说明,如由光散射法所确定的,其中含有0%~5%的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓;
图7:显示在5%的1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓不存在和存在时溶解的nGLP1R的浓度;
图8:是rPA关于温度和对不同浓度的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的聚集行为的图示说明,如由光散射法所确定的;
图9:显示rPA复性产量与3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯的浓度之间的关系;
图10:显示rPA复性产量与盐酸胡芦巴碱的浓度之间的关系。
具体实施方式
实施例1:蛋白质的变性
使蛋白质浓度为0.5~20mg/ml的溶菌酶、rPA或包含体在0.1M pH8的Tris、6M盐酸胍、1mM EDTA、200mM DTT中变性,并在室温还原至少2小时。随后,通过添加HCl将pH值降低到约pH2。任选地,变性的蛋白质可对1000倍体积的6M pH2的盐酸胍进行透析。变性蛋白质的浓度通过Bradford测定(Bradford,1976)或分光光度法进行确定。为此目的,将e(1mg/ml,280nm,1cm)=1的消光系数用于rPA,而将e(1mg/ml,280nm,1cm)=2.37的消光系数用于溶菌酶。
实施例2:溶菌酶的复性
溶菌酶的复性通过将变性的且还原的蛋白质以1∶100稀释入复性缓冲液中进行,所述的复性缓冲液已预先平衡到10℃,其中蛋白质终浓度为200μg/ml。至于复性缓冲液,应用0.05M pH8的Tris、1mM EDTA、4mM GSSG(氧化的谷胱甘肽)和不同浓度的离子型液体1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓。将通过稀释变性样品而传送的2mM DTT用作还原剂。复性后,将样品对1000倍体积的0.05M pH8的Tris、1mM EDTA透析过夜。溶菌酶的酶活性用光度测定法测量,并关于标准曲线进行定量以提供对复性的测量。
图1显示溶菌酶复性产量与1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的浓度之间的关系。在10-15体积%的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在时,有定量的(即100%的)溶菌酶氧化复性,。
实施例3:应用1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的rPA复性
存在于6M pH2的胍盐中的rPA复性通过在不同浓度1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在时在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、2mM GSH(还原的谷胱甘肽)中的1∶100稀释进行。复性在10℃进行至少16小时。复性后,将样品对1000倍体积的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析过夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA测定(Roche Diagnostics)进行测量,并关于天然rPA的标准曲线进行定量以提供对复性的测量。
图2显示rPA复性产量与1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的浓度之间的关系。在20-30体积%的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在时,复性产量为23%。
实施例4:应用1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓的rPA复性
存在于6M pH2的胍盐中的rPA复性通过在不同浓度1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓存在时在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mM GSSG、2mM GSH中的1∶100稀释进行。复性在10℃进行至少16小时。复性后,将样品对1000倍体积的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析过夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA测定(Roche Diagnostics)进行测量,并关于天然rPA的标准曲线进行定量以提供对复性的测量。
图3显示以rPA复性产量与1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓的浓度之间的关系。在20-25体积%的1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓存在时,复性产量为26%。
实施例5:应用4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓的rPA复性(比较例)
存在于6M pH2的胍盐中的rPA复性通过在不同浓度4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓存在时在0.01M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mMGSSG、2mM GSH中的1∶100稀释进行。复性在10℃进行至少16小时。复性后,将样品对1000倍体积的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析过夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA测定(Roche Diagnostics)进行测量,并关于天然rPA的标准曲线进行定量以提供对复性的测量。
图4显示rPA复性产量与4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓的浓度之间的关系。复性产量随4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓增加的浓度而增加。在浓度为94%(v/v)的4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓时,rPA复性产量为13.5%。
实施例6:应用1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的rPA复性
存在于6M pH2的胍盐中的rPA复性通过在不同浓度1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在时在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mMGSSG、2mM GSH中的1∶100稀释进行。复性在10℃进行至少16小时。复性后,将样品对1000倍体积的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析过夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA测定(Roche Diagnostics)进行测量,并关于天然rPA的标准曲线进行定量以提供对复性的测量。
图5显示rPA复性产量与1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的浓度之间的关系。在20%(v/v)的1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在时,复性产量为8%。
实施例7:复性过程中rPA的聚集
存在于6M pH2的胍盐中的rPA复性通过在不同浓度1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在或不存在时在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mM GSSG、2mM GSH中的1∶100稀释进行。复性于10℃在搅动的荧光杯中进行。在该动力学过程中,蛋白质的聚集通过应用360nm的激发光和360nm的吸收光测量光散射而监控。
图6显示在不存在盐时(空心条)和在存在5体积%的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓时(实心条)复性rPA聚集测量的缓冲液校正的平稳值。在至少5体积%的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在时,要复性的rPA的聚集几乎完全受到抑制。
实施例8:GLP1受体(nGLP1R)N-末端结构域的溶解性
在5%的1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓存在时将天然的结构化的受体结构域以不同蛋白质浓度在0.4M pH6.3的磷酸钾、0.4M硫酸铵中于20℃温育过夜。随后于70,000rpm使蛋白质聚集体沉淀,并将可溶性蛋白质组分用吸收分光光度法在280nm进行定量。图7显示在每一种条件下可获得的可溶性蛋白质最大浓度的比较。
因此,本实施例显示由取代的咪唑鎓盐分别增加溶解性或降低聚集。
实施例9:rPA的热稳定性
在不同浓度的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在时,将以20μg/ml浓度存在于0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mM GSSG、2mM GSH中的天然rPA以约0.3℃/分钟的加热速率从20℃加热到90℃。在所述的过程中,蛋白质的聚集状态由光散射进行分析。为此目的,对样品的激发在360nm于荧光计中进行,且信号也在360nm进行探测。
图8显示在热变性过程中rPA的聚集行为(对于1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的体积%,实心圆为0体积%,实心三角形为5体积%,空心圆为12体积%,空心三角形为20体积%)。不存在1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓时rPA的聚集开始于55℃。存在5体积%的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓时,仅在高于80℃的温度可观察到增加的聚集,而在更高的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓浓度时,高达90℃时仍无可测量的聚集发生。
实施例10:应用3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯的rPA复性(比较例)
存在于6M pH2的胍盐中的rPA复性通过在不同浓度3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯存在时在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mM GSSG、2mM GSH中的1∶100稀释进行。复性在10℃进行至少16小时。复性后,将样品对1000倍体积的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析过夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA测定(Roche Diagnostics)进行测量,并关于天然rPA的标准曲线进行定量以提供对复性的测量。
图9显示rPA复性产量与3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯的浓度之间的关系。在30%(v/v)的3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯存在时,复性的最大产量为18%。
实施例11:应用盐酸胡芦巴碱的rPA复性(比较例)
存在于6M pH2的胍盐中的rPA复性通过在不同浓度盐酸胡芦巴碱存在时在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mM GSSG、2mM GSH中的1∶100稀释进行。复性在10℃进行至少16小时。复性后,将样品对1000倍体积的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析过夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA测定(Roche Diagnostics)进行测量,并关于天然rPA的标准曲线进行定量以提供对复性的测量。
图10显示rPA复性产量与盐酸胡芦巴碱的浓度之间的关系。在盐存在时未观察到改善的rPA复性。
Claims (36)
1.取代的咪唑鎓盐用于蛋白质复性、用于增加其热稳定性和/或用于降低其聚集的应用。
2.根据权利要求1的应用,其特征在于所述的咪唑鎓盐由烷基、烯基、芳基和/或芳烷基取代,而这些基团自身可由官能团取代,优选由含有氮、硫和/或磷的基团取代。
3.根据权利要求1或2的应用,其特征在于所述的咪唑鎓盐在咪唑鎓环的两个氮原子上进行取代。
4.根据权利要求1~3中一项或多项的应用,其特征在于所述的咪唑鎓盐在咪唑鎓环的一个或多个碳原子上进行取代。
5.根据前述权利要求中一项或多项的应用,其特征在于所述的咪唑鎓环具有C1-C4烷基,优选为甲基和/或乙基,C1-C4烯基和/或单或二环芳基作为取代基。
6.根据前述权利要求中一项或多项的应用,其特征在于所述的咪唑鎓环在至少一个N原子上具有甲基。
7.根据前述权利要求中一项或多项的应用,其特征在于所述的咪唑鎓环具有一个或多个下述取代基:酚、联苯、二酚、萘、萘羧酸、萘磺酸、联苯酚、联苯羧酸、酚、苯基磺酸酯、苯酚磺酸和/或取代的或未取代的苄基。
8.根据前述权利要求中一项或多项的应用,其特征在于所述的取代基进一步由一个或多个下述基团取代:胺、羧基、羰基、醛、羟基、硫酸根、磺酸根和/或磷酸根基团。
9.根据前述权利要求中一项或多项的应用,其特征在于所述的咪唑鎓盐在室温时是离子型液体。
10.根据前述权利要求中一项或多项的应用,其用于如下蛋白质的复性、增加其热稳定性和/或降低其聚集:
蛋白酶,优选的为丝氨酸蛋白酶,具体为凝血酶、凝血因子Xa、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶如胃蛋白酶或凝乳酶、金属蛋白酶如嗜热菌蛋白酶;
蛋白酶抑制剂,优选的为胃酶抑制剂、抗蛋白酶、化学抑制素、弹性蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、苯丁抑制素、抗凝血酶III;
DNA结合蛋白质,优选的为转录因子,具体为NFкB和jun、fos、krox、myc、E2F家族的成员,和/或病毒T抗原;
病毒蛋白质,如病毒包膜蛋白、衣壳蛋白、病毒蛋白酶、聚合酶和/或T抗原;
磷酸酶;
蛋白激酶,优选为酪氨酸激酶和/或丝氨酸激酶;
免疫球蛋白超家族的蛋白质,如抗体及其片段;
生长因子,优选地为表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子I和II(IGFI和IGFII)、白细胞介素-2(IL-2)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子β(TGF-β)和/或血小板生长因子(PDGF);
溶菌酶、rPA、α-葡糖苷酶,
以及源自这些蛋白质的蛋白质和片段。
11.一种用于蛋白质复性、用于增加其热稳定性和/或降低其聚集的方法,其特征在于使要处理的蛋白质与含有取代的咪唑鎓盐的液体基质接触。
12.根据权利要求11用于蛋白质复性的方法,其中将液体复性基质用作液体基质。
13.根据权利要求11或12的方法,其特征在于将适合于要处理的蛋白质的缓冲液系统用作液体基质。
14.根据权利要求11-13中一项或多项的方法,其特征在于将Tris、HEPES、Mes、Mops、乙酸盐、甘氨酸和/或磷酸盐用作缓冲液物质。
15.根据权利要求11-14中一项或多项的方法,其特征在于液体基质中的缓冲液浓度为10-1000mM,优选地为5-200mM,更加优选地为10-50mM。
16.根据权利要求11-15中一项或多项的方法,其特征在于缓冲液系统的pH值为4-11,优选地为7.5-10.5。
17.根据权利要求11-16中一项或多项的方法,其特征在于所述的咪唑鎓盐由烷基、烯基、芳基和/或芳烷基取代,而这些基团自身可由官能团取代,优选地由含有氮、硫和/或磷的基团取代。
18.根据权利要求11-17中一项或多项的方法,其特征在于所述的咪唑鎓盐在咪唑鎓环的两个氮原子上进行取代。
19.根据权利要求11-18中一项或多项的方法,其特征在于所述的咪唑鎓盐在咪唑鎓环的一个或多个碳原子上进行取代。
20.根据权利要求11-19中一项或多项的方法,其特征在于所述的咪唑鎓环具有C1-C4烷基,优选地为甲基和/或乙基,C1-C4烯基和/或单或二环芳基作为取代基。
21.根据权利要求11-20中一项或多项的方法,其特征在于所述的咪唑鎓环在至少一个N原子上具有甲基。
22.根据权利要求11-21中一项或多项的方法,其特征在于所述的咪唑鎓环具有一个或多个下述取代基:酚、联苯、二酚、萘、萘羧酸、萘磺酸、联苯酚、联苯羧酸、酚、苯基磺酸盐、苯酚磺酸和/或取代的或未取代的苄基。
23.根据权利要求11-22中一项或多项的方法,其特征在于所述的取代基进一步由一个或多个下述基团取代:胺、羧基、羰基、醛、羟基、硫酸根、磺酸根和/或磷酸根基团。
24.根据权利要求11-23中一项或多项的方法,其特征在于所述的咪唑鎓盐在室温时是离子型液体。
25.根据权利要求11-24中一项或多项的方法,其特征在于所述接触通过用液体基质对要处理的蛋白质的稀释、透析和/或渗滤进行。
26.根据权利要求11-25中一项或多项的方法,其特征在于在接触过程中,要处理的蛋白质浓度为5-500μg/ml,优选地为10-200μg/ml,更加优选地为约50-100μg/ml。
27.根据权利要求11-26中一项或多项的方法,其特征在于取代的咪唑鎓盐浓度基于液体基质为5-95体积%,优选地为5-50体积%,最优选地为10-40体积%。
28.根据权利要求11-27中一项或多项的方法,其特征在于取代的咪唑鎓盐的体积摩尔浓度基于液体基质为0.25-5M,优选地为0.25-3.5M,且最优选地为0.5-3M。
29.根据权利要求11-28中一项或多项的方法,其特征在于所述的方法通过将要复性的蛋白质在几个连续的时间或以连续方式添加到复性基质中而进行。
30.根据权利要求11-29中一项或多项的方法,其特征在于要复性的蛋白质与复性基质的接触进行0.1-100小时,优选地为1-50小时,更加优选地为约2-20小时。
31.根据权利要求11-30中一项或多项的方法,其用于如下蛋白质的复性、增加其热稳定性和/或降低其聚集:
蛋白酶,优选的为丝氨酸蛋白酶,具体而言为凝血酶、凝血因子Xa、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶如胃蛋白酶或凝乳酶、金属蛋白酶如嗜热菌蛋白酶;
蛋白酶抑制剂,优选的为胃酶抑制剂、抗蛋白酶、化学抑制素、弹性蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、苯丁抑制素、抗凝血酶III;
DNA结合蛋白质,优选的为转录因子,具体而言为NFкB和jun、fos、krox、myc、E2F家族的成员,病毒T抗原;
病毒蛋白质,如病毒包膜蛋白、衣壳蛋白、病毒蛋白酶、聚合酶和/或T抗原;
磷酸酶;
蛋白激酶,优选的为酪氨酸激酶和/或丝氨酸激酶;
免疫球蛋白超家族的蛋白质,如抗体及其片段;
生长因子,优选地为表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子I和II(IGFI和IGFII)、白细胞介素-2(IL-2)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子β(TGF-β)和/或血小板生长因子(PDGF);
溶菌酶、rPA、α-葡糖苷酶,
以及源自这些蛋白质的蛋白质和片段。
32.根据权利要求11-31中一项或多项的方法,其特征在于对无二硫键的蛋白质复性,其中所述的无二硫键的蛋白质与复性基质的接触在还原剂存在时进行,所述的还原剂优选地为DTT、DTE和/或半胱氨酸。
33.根据权利要求11-32中一项或多项的方法,其特征在于对二硫键桥联的蛋白质复性,其中所述的二硫键桥联的蛋白质与复性基质的接触在氧化还原系统存在时进行,所述的氧化还原系统包含还原和氧化的硫醇物质,如DTT、DTE、谷胱甘肽、半胱氨酸和/或巯基乙醇。
34.根据权利要求32或33的方法,其特征在于还原的物质与氧化的物质的浓度比例为1∶10~20∶1,优选地为1∶5~10∶1,进一步优选地为1∶1~5∶1。
35.根据权利要求11-34中一项或多项的方法,其特征在于用于蛋白质复性的液体基质含有其他复性物质,优选地为尿素、胍盐、L-精氨酸、烷基脲、羧酸酰胺、烷基化的胺、Tris缓冲液、聚乙二醇和/或去污剂。
36.根据权利要求11-35的方法制备的复性蛋白质。
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