CN1603406A - 小粒径窄分布青霉素酰化酶固定化载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小粒径窄分布青霉素酰化酶固定化载体的制备方法。包括以下步骤：将含有表面活性剂的有机分散相加入到含有乙烯基化合物的甲酰胺溶液中，在引发剂的作用下，在惰性气氛中聚合3－10小时，反应结束后，收集珠状载体，然后采用常规的方法进行纯化，即获得小粒径窄分布青霉素酰化酶固定化载体。采用本发明的方法制备的青霉素酰化酶固定化载体，粒度相对集中，载体固定青霉素酰化酶后，用以催化水解青霉素G钾盐制备6－APA，表观酶活可达798 U/g以上(以干重计)，且制备成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种青霉素酰化酶固定化载体的制备方法，具体地说涉及一种粒径分布窄且粒径小的珠状的含环氧基的青霉素酰化酶固定化载体的制备方法。
背景技术
β-内酰胺类抗生素(如半合成青霉素、半合成头孢霉素等)是目前广泛使用的半合成抗生素。6-氨基青霉烷酸(6-APA)是生产半合成青霉素的关键中间体。
目前，世界范围内有85％以上6-APA的生产是应用固定于天然及合成树脂载体上的青霉素酰化酶催化得到的。青霉素酰化酶(PA)是以固定化形式用于工业生产的极少数几种酶之一。尽管固定化PA在医药工业中的应用已有二十多年了，但新型专门应用于固定化PA的载体的合成研究仍具有一定的挑战性。提高固定化酶的催化效率及降低载体的成本仍是人们不断追求的目标。
美国专利(US 4,511,694)公开了一种以正庚烷-四氯乙烯混合物作为分散相，采用聚合物乳化剂作为分散剂，至少以两种以上的乙烯基化合物为聚合单体所制备的富含环氧基的珠状载体。
世界专利(WO 9,940,122)公开了一种采用反相悬浮技术制备含环氧基的珠状载体。具体来说是以环己烷为分散剂，以季胺盐共聚物作为保护剂，在65-75℃由甲基丙烯酸缩水甘油酯等多种乙烯基化合物进行交联共聚所获得的含环氧基的珠状载体，但制备成本较高。
中国专利(CN 1408859A)也公开了一种采用反相悬浮技术制备含环氧基的珠状载体的方法，使载体的制备成本有了明显的降低，但是也还存在着粒径大、分布宽的问题。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种小粒径窄分布青霉素酰化酶固定化载体的制备方法，以克服现有技术存在的不足。
本发明以表面活性剂作为分散剂，以乙烯基化合物为单体，采用反相悬浮技术进行交联聚合，以获得小粒径窄分布的珠状青霉素酰化酶固定化载体。制备方法包括以下步骤：
将含有表面活性剂的有机分散相加入到含有乙烯基化合物的甲酰胺溶液中，在引发剂的作用下，在惰性气氛中聚合3-10小时，反应温度为40-80℃，反应结束后，收集珠状载体，然后采用常规的方法进行纯化，即可获得小粒径窄分布的青霉素酰化酶固定化载体；
所说的分散相选自环己烷、正庚烷或四氯乙烯中的一种或一种以上；
所说的表面活性剂为司班-80、司班-60、硬脂酸钙、聚乙二醇、十二烷基苯磺酸钠中的一种或一种以上；
所采用的乙烯基化合物为丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺或N，N’-亚甲基双甲基丙烯酰胺中的两种或两种以上；
所说的引发剂选自偶氮类引发剂(如偶氮二异丁腈)或过氧化物类引发剂(如过氧化二酰)中的一种，引发剂的加入量为乙烯基化合物的1-10％；
所采用的常规纯化方法是用亲水性溶剂(如丙酮、乙醇、甲醇等)清洗固定化载体，再用疏水性溶剂(如正庚烷、苯等)清洗固定化载体；
有机分散相中表面活性剂的重量浓度为1～50％；
分散相的质量为乙烯基化合物的1-50倍，表面活性剂的质量为乙烯基化合物的1-20倍；
甲酰胺溶液中乙烯基化合物的重量浓度为10-90％；
研究发现，分散剂用量、相比、分散介质配比、引发剂用量、聚合反应温度对产物的粒径分布均有不同程度的影响。在一定范围内，增加硬脂酸钙用量、引发剂用量、提高反应温度、降低在分散相中正庚烷与四氯乙烯的配比，有利于得到小粒径的珠状聚合物。
在相同的条件下进行固定化实验，结果表明，不同聚合条件和聚合物载体粒径对制备的固定化酶活性均有不同程度的影响。
本发明公开的是采用反相悬浮技术制备粒度相对集中(窄分布)和颗粒较细的含环氧基的珠状共聚物载体的方法，这对于获得固定化酶活性均一和高活性的生物催化剂是十分必要的。
保持悬浮体系稳定并获得大小适当且均匀的聚合物颗粒是悬浮聚合的关键之一。
本发明可采用文献[Biochim.Biophys.Acta.，1972，276：250-256]所公开的对二甲胺苯甲醛(PDAB)法，测定制备的固定化青霉素酰化酶的表观活性。用标准筛网在干态下筛分共聚物，称重，对共聚物粒径分布进行测定。
采用本发明的方法制备青霉素酰化酶固定化载体，粒径细、粒度相对集中，合成成本低廉，用其制得的固定化酶活性高，易于控制反应速率和反应时间。如用本方法合成的载体固定青霉素酰化酶后，对于青霉素G钾盐催化水解制备6-APA反应，表观酶活可达798U/g以上(以干重计)。
具体实施方式
实施例1
将109毫升正庚烷与35毫升四氯乙烯混合后加入到装有温度计、导气管和搅拌机的四口烧瓶中，在搅拌、通氮条件下依次加入0.054克司班-60和8克硬脂酸钙，加热至55℃后，再加入4克N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、2.5克甲基丙烯酸缩水甘油酯、0.54克偶氮二异丁腈、17.5毫升甲酰胺，控制搅拌转速为400r/min，通氮聚合6小时。产物经过滤、丙酮洗涤抽提后，真空干燥至恒重。用标准筛网在干态下筛分共聚物载体，称重。合成样品的粒度在80～120目的珠体所占的重量百分比为5.9％，以60-80目的珠状共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾盐水解制6-APA反应，固定化酶的表观活性为325U/g。
实施例2
司班-60用量为0.13克，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的粒度在80～120目的珠体所占的重量百分比为19.2％，以60-80目的珠状共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾盐水解制6-APA反应，固定化酶的表观活性为355U/g。
实施例3
硬脂酸钙用量为9.2克，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的粒度在80～120目的珠体所占的重量百分比为38.4％，以60-80目的珠状共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾盐水解制6-APA反应，固定化酶的表观活性为293U/g。
实施例4
控制搅拌转速为500r/min，其它合成条件与实施例1相同。合成样品的粒度在80～120目的珠体所占的重量百分比为23.6％，以60-80目的珠状共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾盐水解制6-APA反应，固定化酶的表观活性为324U/g。
实施例5
正庚烷用量为75毫升，四氯乙烯用量为24毫升，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的粒度在80～120目的珠体所占的重量百分比为30.8％，以60-80目的珠状共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾盐水解制6-APA反应，固定化酶的表观活性为332U/g。
实施例6
正庚烷用量为72毫升，四氯乙烯用量为72毫升，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的粒度在80～120目的珠体所占的重量百分比为72.4％，以60-80目的珠状共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾盐水解制6-APA反应，固定化酶的表观活性为356U/g。
实施例7
偶氮二异丁腈用量为0.41克，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的粒度在80～120目的珠体所占的重量百分比为11.2％，以60-80目的珠状共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾盐水解制6-APA反应，固定化酶的表观活性为315U/g。
实施例8
甲酰胺用量为25毫升，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的粒度在80～120目的珠体所占的重量百分比为15.2％，以不同粒径的珠状共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾盐水解制6-APA反应，固定化酶的表观活性如下表：
载体的粒径(目) 20～40 40～60 60～80 80～100 100～120
固定化酶的表观活性(U/g) 312 403 474 530 630
实施例9
聚合温度为65℃，其余条件与实施例1相同。合成样品的粒度在80～120目的珠体所占的重量百分比为27.1％，以60-80目的珠状共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾盐水解制6-APA反应，固定化酶的表观活性为263U/g。
实施例10
正庚烷用量为96毫升，四氯乙烯用量为96毫升，甲酰胺用量为25毫升，搅拌转速500rpm，其余条件与实施例2相同。合成样品的粒度在80～120目的珠体所占的重量百分比为77.6％，以100-120目的珠状共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾盐水解制6-APA反应，固定化酶的表观活性为798U/g。
Claims (8)
1.一种小粒径窄分布青霉素酰化酶固定化载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含有表面活性剂的有机分散相加入到含有乙烯基化合物的甲酰胺溶液中，在引发剂的作用下，在惰性气氛中聚合3-10小时，反应结束后，收集珠状载体，然后采用常规的方法进行纯化，即可获得小粒径窄分布青霉素酰化酶固定化载体；
所说的分散相选自环己烷、正庚烷或四氯乙烯中的一种或一种以上；
所说的表面活性剂选自司班-80、司班-60、硬脂酸钙、聚乙二醇、十二烷基苯磺酸钠中的一种或一种以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应温度为40-80℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所采用的乙烯基化合物为丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺或N，N’-亚甲基双甲基丙烯酰胺中的两种或两种以上。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的引发剂选自偶氮类引发剂或过氧化物类引发剂中的一种，引发剂的加入量为乙烯基化合物的1-10％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所采用的常规纯化方法是用亲水性溶剂清洗固定化载体，再用疏水性溶剂清洗固定化载体；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，有机分散相中表面活性剂的重量浓度为1～50％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分散相的质量为乙烯基化合物的1-50倍，表面活性剂的质量为乙烯基化合物的1-20倍。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，甲酰胺溶液中乙烯基化合物的重量浓度为10-90％。
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