CN1597693A - 一种副鸡嗜血杆菌的抗原模拟表位肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种副鸡嗜血杆菌的抗原模拟表位肽及其用途。该抗原模拟表位肽的氨基酸序列具有以下通式：CSWYFPX1X2C，其中C代表半胱氨酸残基；S代表丝氨酸残基或苏氨酸残基；W代表色氨酸残基；Y代表酪氨酸残基或苯丙氨酸残基；F代表苯丙氨酸残基或酪氨酸残基；P代表脯氨酸残基；X1X2分别代表任意氨基酸残基。本发明还公开了副鸡嗜血杆菌抗原模拟表位肽作为有效成分，在制备鸡传染性鼻炎的诊断试剂和疫苗中的用途。利用本发明的短肽，可以提供一种新型、快速、易于操作的鸡传染性鼻炎的血清型鉴别诊断方法，并为进一步研制新型安全高效疫苗奠定了基础，具有良好的经济效益和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及模拟副鸡嗜血杆菌抗原表位的短肽，具体说涉及一组能模拟C型副鸡嗜血杆菌的血清型抗原表位的短肽，以及该组短肽在制备鸡传染性鼻炎鉴别诊断及预防药物中的应用。
技术背景
副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum，Hpg)是引起鸡传染性鼻炎的致病菌。它可以分为A、B、C三种血清型，A和C型为主要致病菌。鸡传染性鼻炎是一种急性呼吸道疾病，在早期文献中，其临诊症状被描述为鸡瘟，接触性传染，或传染性卡他和无并发症鼻炎。由于具有传染性并主要感染鼻道，所以被命名为传染性鼻炎。它的主要危害是造成蛋鸡产蛋量下降及育成鸡生长不良。有文献报道，由Hpg引起的传染性鼻炎可使产蛋量下降40％，经济损失严重。
对Hpg的鉴别主要有表型鉴定，血清型鉴定及PCR等方法。这些方法在实际推广应用中都受到一定的限制：由于Hpg生长缓慢，培养条件苛刻，普通实验室很难通过表型对其进行分离鉴定；血清型鉴定是常用的方法，它的经典方法是根据Page使用的平板凝集试验将分离到的Hpg分型；也有通过血清型单抗阻断酶联免疫反应进行血清分型的报道。由于迄今尚没有商品供应的血清型特异的单抗，因此无法推广应用。近来有文献报道，通过合成特异的寡核苷酸探针，采用PCR法对Hpg进行快速鉴别。但该法较易出现假阳性，且需要特殊的仪器设备，因而不利于在基层推广使用。
目前对鸡传染性鼻炎的防治主要采用接种疫苗—减毒活菌苗的方法。因为缺少方便快捷适于基层推广的血清型鉴别方法，所以通常都是混合接种A和C型减毒活菌苗。随之而来的问题是：Hpg是革兰氏阴性菌，含有内毒素，大量接种也会影响蛋鸡的产蛋及育成鸡的生长。若能针对疫情分型接种将减少内毒素的影响，从而减少经济损失。因此，建立一种简便有效的Hpg血清型鉴别诊断方法及研制不含内毒素的新型多肽疫苗将具有重要意义。
发明内容
为了解决Hpg的鉴别诊断的技术难题，本发明公开了一种能模拟Hpg C的血清型抗原表位的短肽，还公开了该短肽在制备鸡传染性鼻炎鉴别诊断及预防药物中的应用。
本发明的发明人以Hpg C的一株血清型单抗为靶蛋白，从噬菌体展示的构象约束型随机环七肽库(New England Biolabs公司)中筛选到与之结合的短肽。所筛选到的短肽具有9个氨基酸残基，其氨基酸序列两端为半胱氨酸残基，中间的7个氨基酸残基中含有SWYFP序列。本发明的短肽可以用公式CSWYFPX1X2C表示，其中C代表半胱氨酸残基；S代表丝氨酸残基或苏氨酸残基，优选代表丝氨酸残基；W代表色氨酸残基；Y代表酪氨酸残基或苯丙氨酸残基，优选代表酪氨酸残基；F代表苯丙氨酸残基或酪氨酸残基，优选代表苯丙氨酸残基；P代表脯氨酸残基；X1X2分别代表任意氨基酸残基。
本发明公开了上述序列之一的最优选序列为CSWYFPSHC，其中C代表半胱氨酸残基，S代表丝氨酸残基，W代表色氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，P代表脯氨酸残基，S代表丝氨酸残基，H代表组氨酸残基。
本发明的短肽可通过本发明技术领域中的常规技术如化学合成等方法制备。将本发明公开的序列与GeneBank中已公布的Hpg的蛋白序列进行比较，未发现有同源性，这些短肽可抑制天然抗原与单抗的结合，说明它们在结构上能模拟天然抗原表位，为一种新的抗原模拟表位序列。
Hpg的血清型抗原成分迄今尚不清楚。本发明的目的是以这类短肽作为替代血清型抗原，用于对Hpg的鉴别诊断及新型疫苗的研制。将含有上述保守序列的短肽与GST融合表达作为替代抗原，包被到96孔酶联板，ELISA试验结果表明：该融合肽可特异地与C型单抗及C型Hpg接种后鸡的多抗血清结合，而不与A型单抗及A型Hpg接种后鸡的多抗血清反应。
本发明的申请人将上述序列展示在细菌鞭毛硫氧还蛋白的袢环区，该区位于细菌鞭毛上，外源片段不仅具有一定的构象约束性，而且可以实现高拷贝表达。将此重组菌做为免疫原，免疫接种雄性昆明鼠，获得了特异识别插入序列和天然抗原的抗体，说明该表位肽构成免疫原后可以诱导机体免疫系统产生针对C型Hpg的抗体。
利用本发明的短肽，可以提供一种新型，快速，易于操作的鸡的传染性鼻炎的血清型鉴别诊断方法，并为进一步研制安全高效新型疫苗奠定了工作基础，具有良好的经济效益和市场前景。
附图说明
图1为模拟表位融合肽与单抗的结合示意图
图2为模拟表位融合肽与多抗血清的结合示意图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但所述实施例不以任何形式限制本发明。
实施例一 模拟表位融合肽在鉴别诊断中的应用
一、实验方法
人工合成编码模拟表位肽CSWYFPSHC的寡核苷酸序列(其中C代表胱氨酸残基，S代表丝氨酸残基，W代表色氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，P代表脯氨酸残基，S代表丝氨酸残基，H代表组氨酸残基)，并在两端加上EcoR I和HindIII内切酶识别的粘末端序列。将PGEX-KG表达载体(含有编码GST蛋白的核酸序列，Promega公司产品)以上述EcoR I和HindIII内切酶酶切，低熔点胶回收大片段，然后按合成片段与载体片段5∶1的比例以T4连接酶16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌。将经过酶切及测序鉴定的重组菌按1∶100接种于氨苄抗性的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.8，加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG诱导表达4h。4℃离心培养液，收集菌体，并按诱导表达菌液的1/10体积重悬于PBS中，超声破碎，离心后收集上清。经Gluthine sepharose 4B亲合树脂(Sigma公司)纯化，得到高纯度的GST模拟表位融合肽。将此融合肽作为抗原包被96孔酶联板，用ELISA方法对A型和C型单抗及接种Hpg A和Hpg C后产生的鸡多抗血清(北京市农林科学院畜牧兽医研究所提供)分别进行检测。采用TMB显色系统显色，测定OD450。
二、实验结果
ELISA结果显示模拟表位的GST融合肽能特异结合Hpg C型单抗及其多抗血清，而不与HpgA型单抗及其多抗血清结合，两者有显著性差异(p＜0.01)，结果见图1和图2；单纯GST与A型和C型单抗均不反应。因此该方法能方便快捷地区分疫区致病菌的血清型，为按血清型进行免疫接种提供鉴别依据。
实施例二 模拟表位在细菌鞭毛上的展示及免疫小鼠后特异抗体的检测
一、实验方法
按照Invitrogen公司的产品FliTrx系统说明书推荐的操作方法，将人工合成的编码模拟表位肽SWYFPSH的寡核苷酸序列插入FliTrx载体的多克隆位点BstX I和Xho I之间。模拟表位肽将在细菌鞭毛硫氧还蛋白的袢环区呈CSWYFPSHC展示。经酶切和测序检验插入正确后，重组质粒电转GI826宿主菌。重组菌于25℃ IMC培养基中培养过夜，色氨酸诱导表达6h。取体重20±2g雄性昆明鼠20只，随机分为4组，每组5只。实验组按108个细菌/只的剂量进行腹腔注射，实验组1加适量不完全福氏佐剂；实验组2不加；对照组1腹腔注射等量盐水；对照组2腹腔注射等量载体菌。三周后加强免疫，加强后一周取血，用ELISA检测血清中的抗体。
二、实验结果
酶联96孔板包被C型Hpg超声破碎液(1×108/100μl/孔)，4℃过夜；10％脱脂奶粉封闭后对1∶200稀释的免疫小鼠血清进行ELISA检测。结果显示实验组OD值明显高于对照组，统计学分析有显著性差异(p＜0.01)(表1)，表明免疫接种的小鼠体内已产生特异识别C血清型抗原的抗体。提示该表位肽可以作为构建C血清型Hpg免疫原的表位。
表1 ELISA法检测小鼠血清抗体
组别 OD450
对照组1 0.089±0.028
对照组2 0.124±0.043
实验组1 0.393±0.056
实验组2 0.354±0.078
Claims (6)
1、一种副鸡嗜血杆菌抗原模拟表位肽，其特征在于具有氨基酸序列CSWYFPX1X2C，其中C代表半胱氨酸残基；S代表丝氨酸残基或苏氨酸残基；W代表色氨酸残基；Y代表酪氨酸残基或苯丙氨酸残基；F代表苯丙氨酸残基或酪氨酸残基；P代表脯氨酸残基；X1X2分别代表任意氨基酸残基。
2、根据权利要求1所述的副鸡嗜血杆菌抗原模拟表位肽，其特征在于S代表丝氨酸残基；Y代表酪氨酸残基；F代表苯丙氨酸残基。
3、根据权利要求2所述的副鸡嗜血杆菌抗原模拟表位肽，其特征在于X1代表丝氨酸残基，X2代表组氨酸残基。
4、权利要求1或2或3所述的副鸡嗜血杆菌抗原模拟表位肽在制备鸡传染性鼻炎诊断试剂和疫苗中的用途。
5、根据权利要求4所述的用途，其特征在于所说的诊断试剂为C型副鸡嗜血杆菌血清抗原的诊断试剂。
6、根据权利要求4所述的用途，其特征在于所说的疫苗为C型副鸡嗜血杆菌疫苗。
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| CN 03157110 CN1597693A (zh) | 2003-09-15 | 2003-09-15 | 一种副鸡嗜血杆菌的抗原模拟表位肽及其用途 |
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| CN112094354B (zh) * | 2020-11-05 | 2021-02-02 | 苏州世诺生物技术有限公司 | 副鸡禽杆菌基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 |
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