CN105658661B - 疫苗 - Google Patents

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Abstract

本文涉及一种具有下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：NSSNYCCELCCNPACTGCY，其中所述突变体包含选自以下的突变：A14H、A14T和N12T。

Description

疫苗
发明领域
本发明涉及针对肠产毒性大肠杆菌(Escherichia coli) (ETEC)的疫苗。更具体地讲，本发明涉及适宜用作疫苗组分的ETEC耐热肠毒素的突变体。
发明背景
肠产毒性大肠杆菌(ETEC)是一种革兰氏阴性细菌，对每年介于2.8亿和4亿之间的腹泻发作和约38万例死亡负责(Taxt等, Infect Immun. 2010年5月;78(5):1824-31。电子版2010年3月15日)。大多数受害者是生活在发展中国家年龄小于5岁的儿童。另外，ETEC被视为旅行者腹泻的最常见的原因。
ETEC定居于小肠，通过粪便-口腔途径传播。细菌通过特有的定居因子(CF)粘附在肠上皮上。CF是存在于细菌表面的丝状蛋白-菌毛或纤丝。迄今为止，已鉴定出25种不同的ETEC CF(Rivera等, J Clin Microbiol. 2010年9月; 48(9): 3198-3203)。
在开发ETEC疫苗方面已作出了大量努力，但是未获得保护人免于ETEC腹泻的明显有效的疫苗。迄今为止，被杀死的完整细胞疫苗代表了最有前景的候选物(Jertborn等,Vaccine 1998;16:255-60；Sack等, Vaccine, 2007年5月30日;25(22):4392-400. 电子版2007年4月4日)。这包含与重组霍乱毒素B亚基(CT-B)共同给予的5个ETEC菌株。选择5个ETEC菌株以提供最常用的CF。
除CF以外，被称为耐热毒素(ST)和不耐热(LT)毒素的肠毒素是ETEC腹泻中的毒力决定因子。两种毒素通过刺激肠上皮细胞净分泌离子和水而起作用。这引起水性腹泻，其在最极端的情况下可导致霍乱样病况。
在1980年代早期，ST被鉴定为ETEC疫苗的靶标，尽管许多尝试，但都未开发出成功的基于ST的疫苗。
3个主要问题成为将ST用作疫苗组分困难的原因。首先，ST多肽是固有毒性的。其次，ST多肽呈其天然形式时是无免疫原性的。最后，ST密切地类似于内源多肽鸟苷蛋白（guanylin）和uroguanylin，这造成抗耐热毒素抗体可交叉反应的可能性，并在疫苗接种者中引起自身免疫病症。
已报告了几种ST突变体以降低毒性(Taxt, A.等, Infect. Immun.78, 1824-1831 (2010)和Liu, M.等 Toxins3, 1146-1162 (2011)。然而，因为ST是一种小的多肽，大多数毒性降低的突变体的免疫原性也降低。
提供显示降低的毒性和特定免疫原性两者耐热毒素突变体的问题仍然是重大挑战。尽管许多尝试，但仍未开发出诱导中和性和保护性免疫应答的成功的耐热毒素疫苗组分。
发明概述
本发明的一个目的在于提供可以用作ETEC疫苗组分的耐热毒素突变体。具体地说，预期提供显示无毒性或极低毒性且当与合适的载体偶联时能够诱导中和性、特异性免疫应答的耐热肠毒素(ST)的突变体。
为了克服这个问题，进行了所有361个可能的单一点突变型人ST (STh)的系统筛选。突变体与指导蛋白质从宿主细胞中分泌的信号序列一起表达，且表达使用大肠杆菌实验室菌株进行。此实验模型有效模拟天然ST通过ETEC的产生。
在GC-C受体细胞测定法中，使用经过滤的培养物上清液，评价ST突变体文库的毒性。
筛选抗原性作为免疫原性的替代。采用竞争性耐热毒素ELISA测量在兔中针对野生型耐热毒素产生的多克隆抗体与重组表达的耐热毒素突变体结合的程度，来评价抗原性。
采用此系统筛选方法，鉴定出用于ETEC疫苗的ST突变体。所述突变体显示毒性降低和抗原性保留/提高两者。
按照本发明的第一个方面，提供具有下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：
NSSNYCCELCCNPACTGCY
其中突变体包含选自表1或表2的突变。
突变型大肠杆菌耐热毒素(ST)可包含选自表1或表2的2个突变。
按照本发明的另一个方面，提供包含下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：
NSSNYCCELCCNPACTGCY
其中突变体包含选自以下的突变：A14H、A14T和N12T。
优选突变体包含A14H突变。
在另一个实施方案中，突变体具有2个突变，其中第1个突变是A14H，第2个突变选自N12K、N12V、N12T、N12E、N12R、N12S、N12G、N12A、N12W、N12Q、L9G、L9S、L9A、L9E、L9P、L9D、L9R、P13A、P13F、P13E、C11H、E8R和E8K。
在另一个实施方案中，突变体具有2个突变，其中第1个突变是A14H，第2个突变选自N12K、N12V、N12T、N12E、N12R、N12S、N12G、N12A、N12W和N12Q。
在另一个实施方案中，突变体具有2个突变，其中第1个突变是N12T，第2个突变选自A14H、A14Q、A14R、A14T、A14E、A14I、A14L、A14K、A14W、A14N、A14M、A14D、A14F、A14V、A14Y、A14C、L9G、L9S、L9A、L9E、L9P、L9D、L9R、P13A、P13F、P13E、C11H、E8R和E8K。
在另一个实施方案中，突变体具有2个突变，其中第1个突变是A14T，第2个突变选自N12K、N12V、N12T、N12E、N12R、N12S、N12G、N12A、N12W、N12Q、L9G、L9S、L9A、L9E、L9P、L9D、L9R、P13A、P13F、P13E、C11H、E8R和E8K。
在一个优选的实施方案中，突变体具有下列突变：A14H和N12K。
在另一个优选的实施方案中，突变体具有单个A14H点突变。
本发明的突变体可另包含T16A突变。
按照本发明的另一个方面，提供具有下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：
NSSNYCCELCCNPACTGCY
其中突变体包含在T16位的突变与在N12位和/或A14位的突变的组合。
突变体可具有T16A突变与选自以下的突变的组合：A14H、A14Q、A14R、A14T、A14E、A14I、A14L、A14K、A14W、A14N、A14M、A14D、A14F、A14V和A14Y。
在另一个实施方案中，突变体可具有T16A突变与选自以下的突变的组合：N12K、N12V、N12T、N12E、N12R、N12S、N12G、N12A、N12W和N12Q。
在另一个实施方案中，突变体可具有T16A突变与选自以下的突变的组合：N12K、N12V、N12T、N12E、N12R、N12S、N12G、N12A、N12W和N12Q，以及另外与选自以下的突变的组合：A14H、A14Q、A14R、A14T、A14E、A14I、A14L、A14K、A14W、A14N、A14M、A14D、A14F、A14V和A14Y。
在一个实施方案中，突变体具有下列突变：A14H和T16A。
在另一个实施方案中，突变体具有下列突变：N12K和T16A。
按照本发明的另一个方面，提供包含下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：
NTFYCCELCCNPACAGCY
其中突变体包含选自以下的突变：A13H、A13T和N11T。
优选突变体包含A13H突变。
在另一个实施方案中，突变体具有2个突变，其中第1个突变是A13H，第2个突变选自N11K、N11V、N11T、N11E、N11R、N11S、N11G、N11A、N11W、N11Q、L8G、L8S、L8A、L8E、L8P、L8D、L8R、P12A、P12F、P12E、C10H、E7R和E7K。
在另一个实施方案中，突变体具有2个突变，其中第1个突变是A13H，第2个突变选自N11K、N11V、N11T、N11A、N11R、N11S、N11G、N11A、N11W和N11Q。
在一个实施方案中，突变体具有2个突变，其中第1个突变是N11T，第2个突变选自A13H、A13Q、A13R、A13T、A13E、A13I、A13L、A13K、A13W、A13N、A13M、A13D、A13F、A13V、A13Y、A13C、L8G、L8S、L8A、L8E、L8P、L8D、L8R、P12A、P12F、P12E、C10H、E7R和E7K。
在另一个实施方案中，突变体具有2个突变，其中第1个突变是N11T，第2个突变选自A13H、A13Q、A13R、A13T、A13E、A13I、A13L、A13K、A13W、A13N、A13M、A13D、A13F、A13V和A13Y。
在另一个实施方案中，突变体具有2个突变，其中第1个突变是A13T，第2个突变选自N11K、N11V、N11T、N11A、N11R、N11S、N11G、N11A、N11W、N11Q、L8G、L8S、L8A、L8E、L8P、L8D、L8R、P12A、P12F、P12E、C10H、E7R和E7K。
在一个优选的实施方案中，突变体具有下列突变：A13H和N11K。
在另一个优选的实施方案中，突变体具有单个A13H点突变。
在一个非常优选的实施方案中，本发明的ST突变体与载体(例如牛血清白蛋白)偶联。
ST突变体可与载体蛋白质偶联以产生具有改良的免疫原性性质的分子。合适的载体蛋白质为本领域技术人员所熟知。与载体蛋白质的偶联可采用例如遗传和化学缀合方法实现。
按照本发明的另一个方面，提供编码本发明的ST突变体的分离核酸。
按照本发明的另一个方面，提供包含本发明的核酸的载体。
按照本发明的另一个方面，提供包含本发明的载体的宿主细胞。
本发明的宿主细胞包括原核和真核细胞。合适的原核宿主细胞包括细菌，例如大肠杆菌。合适的真核细胞包括酵母、昆虫细胞(例如Sf9细胞)和哺乳动物细胞系。
按照本发明的另一个方面，提供对ST突变体是免疫特异性的抗体。
按照本发明的另一个方面，提供包含本发明的ST突变体、核酸或载体和药学上可接受的载体或赋形剂的疫苗组合物。
按照本发明的另一个方面，提供本发明的ST突变体、核酸或载体用于治疗或预防大肠杆菌感染。
按照本发明的另一个方面，提供本发明的ST突变体、核酸或载体用于治疗或预防旅行者腹泻。
按照本发明的另一个方面，提供用于治疗或预防大肠杆菌感染的方法，所述方法包括将本发明的ST突变体、核酸或载体给予需要本发明的ST突变体、核酸或载体的患者。
按照本发明的另一个方面，提供包含下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：
NSSNYCCELCCNPACTGCY
其中突变体包含N12K突变与选自以下的突变的组合：A14H、A14Q、A14R、A14T、A14E、A14I、A14L、A14K、A14W、A14N、A14M、A14D、A14F、A14V、A14Y、A14C、L9G、L9S、L9A、L9E、L9P、L9D、L9R、P13A、P13F、P13E、C11H、E8R和E8K。
按照本发明的另一个方面，提供包含下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：
NSSNYCCELCCNPACTGCY
其中突变体包含N11K突变与选自以下的突变的组合：A13H、A13Q、A13R、A13T、A13E、A13I、A13L、A13K、A13W、A13N、A13M、A13D、A13F、A13V、A13Y、A13C、L8G、L8S、L8A、L8E、L8P、L8D、L8R、P12A、P12F、P12E、C10H、E7R和E7K。
附图描述
图1. STh的结构模型。氨基酸被标记，并从N端到C端着色灰度梯度。显示了结构彼此相对沿x轴旋转180°的2个示图。
图2. 与STh抗原性相比较的T84毒性。泡式图显示STh的各氨基酸位置的相对T84毒性值中位值(水平轴)对相对STh抗原性值中位值(垂直轴)作图。各轴以对数标度计。通过泡泡大小视觉化具有成功确定的T84毒性值和STh抗原性值两者的各位置的突变体的数目(n)。图中显示了219个突变体的总数。泡泡按照氨基酸位置从N端到C端颜色编码并标记。对角虚线表示类毒素性(toxoidicity)：黑色线表示1的类毒素性，至左边的灰色线表示2、10和100的类毒素性，至右边的灰色线表示-2、-10和-100的类毒素性。
图3. 与STh抗原性相比较的T84毒性。该图显示各STh突变体的相对T84毒性值(水平轴)对相对STh抗原性值(垂直轴)作图。各轴以对数标度计。成功确定具有T84毒性值和STh抗原性值两者的各位置的突变体的数目(n)为219。各点按照氨基酸位置从N端到C端标颜色编码并标记。对角虚线表示类毒素性：黑色线表示1的类毒素性，至左边的灰色线表示2、10和100的类毒素性，至右边的灰色线表示-2、-10和-100的类毒素性。
图4. 与STp抗原性相比较的STh抗原性。泡式图显示STh的各氨基酸位置的相对STp抗原性值中位值(水平轴)对相对STh抗原性值中位值(垂直轴)作图。各轴以对数标度计。具有成功确定的STh和STp抗原性值两者的各位置的突变体的数目(n)通过泡泡大小视觉化。该图中显示160个突变体的总数。泡泡按照氨基酸位置从N端到C端颜色编码并标记。对角虚线表示STh抗原性相对于STp抗原性：黑色线表示STh抗原性等于STp抗原性，至左边的灰色线表示2、10和100倍升高的STh抗原性，至右边的灰色线表示2、10和100升高的STp抗原性。
图5. 各长方形图显示竞争性STh、STp、ST:G8和克隆30 ELISA实验的结果。各长方形图显示3个独立实验的数据，其中一式三份测试了连续稀释的肽STh、STp、uroguanylin和鸟苷蛋白。各点表示所有3个实验的均值，垂直线条标出最大值和最小值。垂直轴表示肽竞争胜过抗体结合包被层的能力(B)，表示为最大竞争的百分比(Bmax)。水平轴表示肽浓度，以µM计。
图6. 与克隆30抗原性相比的ST:G8抗原性。将STh的各氨基酸位置的相对ST:G8抗原性中位值(垂直轴)对相对克隆30抗原性中位值(水平轴)作图。呈现了来自235个单独的STh突变体的数据。泡泡按照氨基酸位置从N端到C端做颜色编码并标记。对角线表示克隆30抗原性相对于ST:G8抗原性。
表1. STh类毒素候选物。显示具有100或更大类毒素性的所有类毒素候选物在二重线上方，在下面显示了最大类毒素性高于10的各位置的最佳类毒素候选物。毒性和抗原性两者与天然STh有关。1抗原性在测定法的定量范围之外，并保守地设置为2倍野生型水平。2在T84细胞GC-C受体测定法中不显示可检出毒性的突变体被设置为测定法的检出限，其为0.0014。
表2. 以类毒素性排序的所有STh突变体
发明详述
现将通过非限制性实施例描述本发明的各种优选特征和实施方案。
除非另有说明，否则本发明的实施会应用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在本领域普通技术人员的能力范围内。在文献中阐述了所述技术。参见例如J. Sambrook, E. F. Fritsch和T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual（分子克隆：实验室指南）, 第二版, 第1-3卷, Cold Spring HarborLaboratory Press；Ausubel, F. M.等(1995和定期增补) Current Protocols inMolecular Biology（当前分子生物学方案）, 第9、13和16章, John Wiley & Sons, NewYork, NY；B. Roe, J. Crabtree和A. Kahn (1996) DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques（DNA分离和测序：基本技术）, John Wiley & Sons；J. M. Polak和James O’D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice（原位杂交：原则和实践）；Oxford University Press；M. J. Gait (编辑) (1984)Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach(寡核苷酸合成：实践方法), IRLPress；以及D. M. J. Lilley和J. E. Dahlberg (1992) Methods of Enzymology: DNAStructure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods inEnzymology（酶学的方法：DNA结构部分A：酶学中DNA方法的合成和生理学分析）, AcademicPress。这些普通教科书的每一个通过引用结合到本文中。
肠产毒性大肠杆菌(ETEC)毒素
ETEC分泌2种必需的毒力因子，不耐热毒素和/或耐热肠毒素。两种毒素通过刺激肠上皮细胞净分泌离子和水而起作用。这引起水性腹泻，其在最极端的情况下可导致霍乱样病况。
不耐热毒素
ETEC不耐热毒素为在结构和机制上与霍乱毒素有关的84 kDa寡毒素(oligotoxin)。它刺激肠上皮细胞中的cAMP浓度升高。这导致氯离子和水的净分泌，引起水性腹泻。
耐热毒素
已鉴定出2种不同的ETEC耐热毒素STa/STI和STb/STII。这些蛋白质在结构上、功能上和免疫学上不相关。STa/STI是本发明的主题，在本文称为ST。
流行病学研究强有力地表明，分泌ST的ETEC菌株比只产生LT的ETEC菌株对发展中国家儿童的腹泻疾病负荷起更大的作用。
可传递质粒带有编码ETEC ST蛋白的基因。ST蛋白表达为72个氨基酸的未成熟前肽原(pre-pro-peptide)。前肽原的残基1-19构成信号肽，其靶定该未成熟蛋白质通过Sec机制跨越内膜分泌。肽原然后被加工为成熟形式，跨越外膜转运。
成熟ST为约2 kDa多肽。已知2个ST变体：
1. STh (亦称为STIb和STaII)：自感染ETEC菌株的人中分离的19个氨基酸的多肽；
2. STp (亦称为STIa和STaI)：自感染ETEC菌株的人和动物中分离的18个氨基酸的多肽。
成熟STh多肽(相当于未成熟前肽原的残基54-72)具有以下氨基酸序列：
NSSNYCCELCCNPACTGCY
成熟STp多肽(相当于未成熟前肽原的残基55-72)具有以下氨基酸序列：
NTFYCCELCCNPACAGCY
对于本发明的目的，除非另有说明，否则ST氨基酸残基和突变体可按照相关的成熟多肽序列编号。
呈其天然形式的两种ST变体都是无免疫原性的。
成熟STh和STp含有以1-4/2-5/3-6方式排列的3个分子内二硫键(此处编号对应于成熟多肽中半胱氨酸残基的顺序)。周质二硫键异构酶(DsbA)是二硫键形成所必需的。
ST通过模拟内源配体，鸟苷蛋白和uroguanylin结合并激活鸟苷酸环化酶C (GC-C)受体。ST结合导致胞内信使环GMP (cGMP)的浓度提高。这引起钠离子和氯离子的吸收降低和碳酸氢盐离子和氯离子的分泌增加，这最终导致腹泻。
ETEC ST多肽在结构上与鸟苷蛋白和uroguanylin两者类似。鸟苷蛋白和uroguanylin两者只含有2个二硫键，并在两个不同的构象中互变。3个ST二硫键呈现将ST多肽锁定为类似于鸟苷蛋白和uroguanylin的活性构象的构象。与鸟苷蛋白和uroguanylin共有的2个ST二硫键是活性所必需的。相当于这些二硫键之一的任何ST半胱氨酸的突变消除毒性或显著降低毒性。
从第一个到最后一个半胱氨酸的ST部分称为毒性结构域。
ETEC耐热毒素突变体
本发明提供包含下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：
NSSNYCCELCCNPACTGCY
其中突变体包含表1或表2所示突变。
本发明促进具有下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：
NSSNYCCELCCNPACTGCY
其中突变体包含选自以下的突变：A14H、A14T和N12T。
优选突变体包含A14H突变。
突变型ST可包含不止一个突变。例如，突变体可具有含下列突变的突变体：A14H和N12K；或A14H和N12IT；或A14H和N12I。
本发明还提供具有下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：
NTFYCCELCCNPACAGCY
其中突变体包含选自以下的突变：A13H、A13T和N11T。
优选突变体包含：A13H突变。
突变型ST可包含不止一个突变。例如，突变体可具有下列突变：A13H和N11K；或A13H和N11IT；或A13H和N11I。
设想在本发明的突变体中可进行其它突变以产生例如双重或三重突变体。所述另外的突变可通过例如降低毒性和提高ST特异性免疫原性，进一步改进本发明的ST突变体的性质。
本发明的突变体可通过本领域众所周知的方法获得。肽的化学合成的各种技术通过Borgia和Fields，2000，TibTech 18：243-251综述，并详细描述于其中所包含的参考文献中。
缀合物/载体
本发明还提供缀合物，其中本发明的突变体与载体偶联。
本发明的载体可用于提高ST的免疫原性。多种载体是本领域已知的。
合适的载体包括但不限于免疫球蛋白G (IgG)、牛血清白蛋白(BSA)、不耐热肠毒素A亚基(LT-A)、不耐热肠毒素B亚基(LT-B)、霍乱毒素B亚基(CT-B)、外膜蛋白OmpC、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白质A的ZZ片段、大肠杆菌CS31A菌毛的主亚基ClpG、沙门氏菌(Salmonella)鞭毛蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)。
与某些载体(例如LT-B和CT-B)缀合可有利地提供针对ETEC ST和LT两者的免疫保护。
设想偶联可通过本领域已知的一系列技术进行，所述技术包括化学缀合、基因融合或直接蛋白质合成。
化学缀合方法包括通过使用交联剂将预先形成的蛋白质偶联。
基因融合包括使本发明的突变体通过各蛋白质的多肽骨架与载体连接以产生融合蛋白的方法。这可通过编码所述融合蛋白的基因的表达来实现。蛋白质可在蛋白质的N端或C端偶联。或者，可以两种蛋白质的结构和功能基本上不改变的如此方式，将一种蛋白质插入另一种蛋白质中，例如通过掺入到环区)。蛋白质可直接或通过多肽接头偶联。
最后，可通过活的疫苗载体(例如减毒志贺氏菌属(Shigella)菌株)表达突变体(Altboum等, Infect Immun. 2003 Mar;71(3):1352-60)。
肽变体、衍生物和片段
本发明还包括本文公开的突变型ST蛋白的变体和衍生物。
与本发明的氨基酸序列有关的术语“变体”或“衍生物”包括来往在序列间（fromor to the sequence）的一个(或多个)氨基酸的任何取代、变异、修饰、置换、缺失或添加，条件是所得氨基酸序列优选具有基本相同的治疗活性。
氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物以例如增加治疗性给予的多肽的血浆半寿期。
例如可按照下表进行保守取代。第二栏同一框和优选第三栏同一行的氨基酸可彼此置换。
Figure RE-890286DEST_PATH_IMAGE001
多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明还提供编码本发明的大肠杆菌耐热毒素突变体的多核苷酸。
本领域技术人员应了解，由于遗传密码的简并，许多不同的多核苷酸可编码相同的多肽。另外，应该理解，技术人员可采用常规技术进行不影响由本发明的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映其中待表达本发明多肽的任何具体宿主生物的密码子选择。
本发明的多核苷酸可包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们还可以是在其中包括合成或修饰核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架、在分子的3'和/或5'端加入吖啶或聚赖氨酸链。对于本发明的目的，要了解的是，本文所述多核苷酸可通过本发明领域可获得的任何方法修饰。
可进行所述修饰以提高多核苷酸的体内活性或寿命。
可将本发明的多核苷酸掺入重组可复制载体中。载体可用于在相容的宿主细胞中复制核酸。
优选载体中本发明的多核苷酸与控制序列有效连接，所述控制序列能够提供编码序列被宿主细胞表达，即载体是表达载体。术语“有效连接”意指所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。与编码序列“有效连接”的调节序列以使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式连接。
与编码本发明的突变体的序列有效连接的控制序列包括启动子/增强子和其它表达调节信号。这些控制序列可经选择与表达载体经设计以用于其中的宿主细胞相容。术语“启动子”是本领域众所周知的，包括从最小启动子到包括上游元件和增强子的启动子按大小和复杂性归类的核酸区。
本发明的载体可能转化或转染至合适的宿主细胞中，以便提供本发明的ST突变体的表达。该过程可包括将用上述表达载体转化的宿主细胞培养在提供由编码突变体的编码序列的载体表达的条件下，任选回收表达的蛋白质。
可将本发明的多核苷酸或载体给予受试者，使得体内表达突变型ST肽。这类载体的实例包括例如质粒和病毒载体。
病毒载体的实例包括反转录病毒载体、鼠白血病毒(MLV)载体、腺病毒载体、痘病毒载体和痘苗病毒载体。实例或反转录病毒载体包括鼠白血病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、埃布尔森鼠白血病病毒(A-MLV)、鸟髓细胞瘤病病毒-29 (MC29)和鸟成红细胞增多症病毒(AEV)和所有其它反转录病毒科(retroviridiae)包括慢病毒。反转录病毒的详细列表可参见Coffin等, 1997, “retroviruses（反转录病毒）”, ColdSpring Harbour Laboratory Press 编辑: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus 第758-763页。
抗体
本发明还提供对本文公开的ST突变体有免疫特异性的多克隆或单克隆抗体。
本文所用术语“抗体”是指基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一个或多个多肽组成的蛋白质。抗体可作为完整的免疫球蛋白或作为多个片段存在，包括用不同肽酶消化产生的那些充分表征的片段。虽然不同的抗体片段根据完整抗体的消化来定义，但是技术人员应认识到，抗体片段可以化学合成或采用重组DNA方法从头合成。因此，本文所用术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生的或采用重组DNA方法从头合成的对靶抗原保持其结合活性的抗体片段。使用术语“抗体”所包括的抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、F (ab')2、Fv、scFv、dsFv双抗体(antibody)和Fd片段。此外，抗体及其片段可为人源化抗体。
本发明的ST突变体可直接用作免疫原以产生抗血清和单克隆抗体。本发明因此提供诱导抗原特异性免疫球蛋白产生的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 用本发明的突变体对动物或人进行免疫；和
b) 从动物血清中回收对突变体的区域有特异性的免疫球蛋白。
用于抗体生产的动物可为正常用于该目的的任何动物，特别是哺乳动物。尤其指的是小鼠、大鼠、豚鼠和兔。
免疫按照已确立的技术进行(参见E. Harlow和D. Lane, “Antibodies, ALaboratory Manual（抗体，实验室指南）” (1988) Cold Spring Harbor, U.S.A.)。
更具体地讲，本发明的突变体可用来产生多克隆和单克隆抗体两者。
如果需要多克隆抗体，则使选择的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)免疫。收集已免疫动物的血清，并按照已知程序处理。如果血清含有抗其它抗原的多克隆抗体，多克隆抗体可通过免疫亲和层析纯化。用于产生和处理多克隆抗血清的技术是本领域已知的。
本领域的技术人员也可容易地产生用于本发明的定向抗抗原的单克隆抗体。通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。无限增殖产抗体细胞系可通过细胞融合产生，并且也可通过其它技术，例如B淋巴细胞用致癌DNA直接转化或用EB病毒转染产生。可针对不同的性质，例如针对同种型和表位亲和力，筛选针对抗原产生的单克隆抗体组。
备选技术包括筛选噬菌体展示文库，其中例如噬菌体在其具有各种各样的互补决定区(CDR)的外壳表面上表达scFv片段。该技术是本领域众所周知的。
定向抗抗原的单克隆和多克隆抗体两者特别可用于诊断，而且是中和性的那些可用于被动免疫疗法。单克隆抗体特别可于产生抗独特型抗体。抗独特型抗体是携带感染原(需要针对其进行保护)的抗原的“内影像”的免疫球蛋白。
用于产生抗独特型抗体的技术是本领域已知的。这些抗独特型抗体也可用于治疗，以及用于阐述抗原的免疫原性区域。
疫苗组合物
本发明还提供包含本发明的ST突变体或核酸和药学上可接受的载体或赋形剂的疫苗组合物。
含有免疫原性多肽/多核苷酸作为活性成分的疫苗的制备是本领域技术人员已知的。通常，所述疫苗作为注射剂，或作为液体溶液剂或混悬剂制备；还可制备固体形式，其适用于注射前在液体中的溶液剂或混悬剂。制剂也可乳化，或蛋白质包封在脂质体中。通常将活性免疫原性成分与药学上可接受的和与活性成分相容的赋形剂一起混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。
另外，如有需要，疫苗可含有少量的辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或提高疫苗疗效的佐剂。
佐剂是提高对抗原或过敏原的免疫应答的任何药理学上可接受的物质。因此，诱导Th1的佐剂提高Th1细胞对抗原或过敏原的应答。
可以是有效的佐剂的实例包括但不限于氢氧化铝、酪氨酸及其衍生物、N-乙酰基-胞壁酰基-l-苏氨酰基-d-异谷酰胺(Thr-MDP)、N-乙酰基-nor-胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷酰胺(CGP 11637，亦称nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺酰基-l-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP 19835A，亦称MTP-PE)和RIBI (其含有从细菌提取的3种组分)、单磷酰基脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和在2%角鲨烯/吐温 80乳液中的细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
佐剂和其它剂的其它实例包括磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、二氧化硅、高岭土、碳、油包水乳液、水包油乳液、胞壁酰二肽、细菌内毒素、脂质X、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum) (
疮疱丙酸杆菌(Propionobacterium acnes))、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、多聚核糖核苷酸、藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、皂苷、脂质体、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物或其它合成佐剂。所述佐剂可市购获自各种来源，例如，Merck佐剂65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.)或弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)。
通常使用例如Amphigen (水包油)、Alhydrogel (氢氧化铝)、Amphigen和Alhydrogel的混合物、酪氨酸及其衍生物和磷酸钙等佐剂。
可使用与吞噬细胞和细胞内含物和/或抗原递呈细胞上的toll样受体相互作用的佐剂，例如但不限于toll样受体2和/或4和/或9。这些佐剂的实例是但不限于诱导Th1的佐剂单磷酰基脂质A (MPL，参见美国专利号4,912,094和4,987,237)及其衍生物和合成类似物和CpG DNA基序及其衍生物和类似物。
免疫原和佐剂的比例可在大范围内改变，只要二者以有效量存在。例如，氢氧化铝可以约0.5%的量的疫苗混合物存在(Al2O3基础)。
可通过测量定向抗因给予疫苗(所述疫苗中还包含不同的佐剂)中的免疫原(immunogenic agent)所引起的所述免疫原的抗体的量，来确定佐剂的有效性。
按常规胃肠外通过例如皮内、皮下或肌内注射给予疫苗。适于其它给药方式的其它制剂包括栓剂和口服制剂。
对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯。
口服制剂包括诸如常用的赋形剂，例如药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸氢钠、碳酸镁等。这些组合物可呈溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂的形式，可含有例如10%-95%的活性成分，优选25%-70%。在将疫苗组合物冻干时，可在给药前将冻干材料复溶例如作为混悬剂。复溶优选在缓冲液中进行。
疫苗的剂量和给予
以与剂量配方相容的方式，并以将是在预防（prophylactically）和/或治疗上有效的量给予疫苗。
预防性疫苗是预防疾病的疫苗。待给予的量可取决于待治疗的受试者和受试者的免疫系统合成抗体的能力。
需要给予的活性成分的精确量可取决于从业人员的判断，并且对各受试者是特定的。
疫苗可以单剂量规程或多剂量规程给予。多剂量规程是这样的规程，其中接种的最初进程可为1-10个单独剂量，接着于保持和/或加强免疫应答需要的后续的时间间隔给予其它剂量，例如，在第一剂后2-4周，且如有需要，在几个月后给予后续剂量。剂量方案还可至少部分由个体的需要决定，并取决于从业人员的判断。
另外，含有抗原的疫苗可与其它免疫调节剂(例如免疫球蛋白)联合给予。
要认识到，本文所有提到的治疗包括治疗性、治标性和预防性治疗。特别优选哺乳动物的治疗。人和兽医学治疗两者均在本发明的范围内。
筛选突变体的方法
本发明还提供用于筛选毒性降低和特异性抗原性维持或提高的大肠杆菌耐热毒素的突变体且预期筛选一些免疫原性突变体的方法。
本发明的方法涉及针对类毒素性分析大肠杆菌耐热毒素的突变体文库。术语“类毒素”定义为当与合适的载体偶联时显示无毒性或极低毒性且能够诱导有效的ST特异性免疫应答的ST的突变体。
本发明的方法包括筛选存在于培养物滤液中的大肠杆菌耐热毒素的突变体的方法。在测量培养物滤液中的毒性时的一个挑战是它是固有毒性(毒性/摩尔)和ST突变体的浓度的积。对于抗原性也如此。因此，与天然ST相比，毒性或抗原性的降低可能是因较低的ST浓度、固有毒性/抗原性的降低或这两者的组合所致。准确测量培养物滤液的ST突变体浓度是富挑战性的。
规避测量固有毒性和抗原性的问题的第一步是测量相同上清液中ST突变体的毒性和抗原性并与天然ST比较。这使允许我们描述突变体培养物滤液中毒性和抗原性的改变。第二步是然后将各突变体的抗原性的改变除以毒性的改变。如果使用相同培养物滤液测量毒性和抗原性，则这允许我们排除浓度的作用。该测量定义为“类毒素性”：
Figure RE-807426DEST_PATH_IMAGE003
其中c为浓度，A r 为培养物滤液的相对抗原性，T r 为培养物滤液的相对毒性，A i 为固有抗原性，T i 为固有毒性。好的类毒素候选物可具有高的类毒素性。
在一个实施方案中，可通过本领域众所周知的任何方法产生掺入合适的表达载体中的ST基因的突变体文库。所述方法包括位点定向诱变、随机诱变和从头DNA合成。
由文库编码的蛋白质可通过如下产生：将载体掺入合适的宿主细胞中，在允许宿主细胞表达突变体的条件下培养宿主细胞并分离突变体蛋白质。如上所述，多种载体和宿主细胞是本领域已知的，技术人员可容易地选择合适的载体和宿主细胞。本发明优选的宿主细胞是原核宿主细胞，特别是大肠杆菌。构建突变体文库和以突变体蛋白质从宿主细胞分泌到培养基的方式进行表达是本发明的优选特征。这可通过例如掺入与表达载体中的基因有效连接的分泌信号序列来实现。
可通过对突变体文库的表达的蛋白质进行毒性和抗原性测定法来确定显示毒性降低和特异性免疫原性升高的突变体(即类毒素候选物)。可通过计算如上定义的类毒素性，来鉴定类毒素候选物。
用于分析ST突变体的毒性的合适测定法包括GC-C受体细胞测定法(PMID:2892417；Guarino等，Am J Physiol. 1987年12月;253(6 Pt 1):G775-80)、乳小鼠测定法(PMID:780280; Giannella, Infect Immun. 1976年7月;14(1):95-9)和结扎的肠环测定法(ligated gut loop assay) (PMID:7030964; Klipstein等, Infect Immun. 1981年11月;34(2):637-9)。这些方法是本领域众所周知的。
直接测试突变体免疫原性会需要纯化所有可能的突变体，并将纯化的蛋白质与载体蛋白质单独偶联。这对于大型文库是不可行的。作为备选，有可能筛选抗原性作为免疫原性的替代。用于确定抗原性的合适测定法包括基于ELISA的方法，例如竞争性ELISA方法。在一个实施方案中，可采用竞争性耐热毒素ELISA测量针对野生型耐热毒素产生的抗体对重组表达的耐热毒素突变体的亲和力评价抗原性。
实施例
方法
ST突变体文库的产生和表达
将编码STh的来自肠产毒性大肠杆菌菌株H10407的sta3基因克隆至pBAD-TOPO载体(Invitrogen)中。所得pBAD-STh载体含有araBAD启动子，这通过引入0.000002%-0.2%阿拉伯糖允许可协调的表达。当细胞在高于0.002%的阿拉伯糖水平下被诱导时，成熟ST释放到培养物上清液中。用0.2%阿拉伯糖达到最佳表达。
使ST突变体文库在19个ST突变体(包括3个野生型ST培养物作为对照)的批次中表达。培养物上清液通过离心分离，然后过滤(0.2 μm过滤器)。将上清液保存在-80℃下。
竞争性ST ELISA
如前所述(PMID: 6520401; Lockwood和Robertson, J Immunol Methods. 1984年12月31日;75(2):295-307)，以少量修改进行竞争性STh ELISA。U型微量滴定板(Linbro，Fisher Scientific，Göteborg，Sweden)用稀释于ELISA缓冲液(NaCl 128 mM，KCl 2.68mM，KH2PO4 1.47 mM，Na2HPO4 8.10 mM；pH 7.0-7.2)中的STh-卵清蛋白缀合物包被。将板用板密封器盖上，在37℃下孵育过夜。通过倒置弃去各孔内容物。通过与稀释于ELISA缓冲液中的卵清蛋白1% (w/v) (Sigma-Aldrich)一起孵育，封闭其它蛋白质结合位点。在37℃下孵育1小时后，将孔倒空，用洗涤缓冲液(含有卵清蛋白0.05% (w/v)和Tween-20 0.05% (v/v)的ELISA缓冲液)洗涤3次。加入含有STh和75 µL稀的抗血清(蛋白质-A纯化的兔抗STa由John D. Clements友情提供；Department of Microbiology and Immunology（微生物学和免疫学系）, Tulane University, New Orleans, USA)的75 µL样品。在含有卵清蛋白0.05% (w/v)的ELISA缓冲液中进行两次稀释。通过棋盘滴定法确定试剂的合适稀释度和浓度。将板在旋转培养箱振荡器(Infors HT，Bottmingen/Basel Switzerland)中以180 rpm在37℃下孵育2小时。将孔倒空，用洗涤缓冲液洗涤3次。加入在含卵清蛋白0.05% (w/v)的ELISA缓冲液中1:400稀释的山羊中发展的100 µL抗兔IgG碱性磷酸酶缀合物(Sigma-Aldrich)，并在37℃下无振荡孵育1小时。将孔倒空，用洗涤缓冲液洗涤3次，接着加入100 µL含1 mg/mL 4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物的二乙醇胺缓冲液(二乙醇胺9.7% (v/v)，MgCl2 x 6H2O 0.49 mM；pH 9.8)。在孵育30分钟后，用50 µL 2N NaOH (VWRinternational)终止各孔中的反应。在自动读板仪中在405 nm (FLUOstar OPTIMA；BMGLabtech，Germany)下读取吸光度。一式三份测量所有样品。
GC-C受体T-84细胞测定法
将T-84细胞接种并培养在24孔板的各孔中。在除去Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM:F12 (1:1) Lonza Walkersville，Inc.)后，将细胞用0.5 mL DMEM洗涤3次。将细胞与0.25 mL含有1 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的DMEM一起在37℃下孵育10分钟。将0.1 mL样品(培养物滤液)加入各孔中，在37℃下孵育60分钟。在孵育后，吸出反应培养基，将细胞用0.1 mM HCl在室温下裂解20分钟。将裂解物以最高速度离心10分钟，并按照生产商说明书，用直接cGMP酶免疫测定试剂盒(Enzo Life Sciences，Inc.)，在对照和激动剂刺激的细胞中测量cGMP水平。
将各突变体的培养物滤液一式两份加入T-84细胞中，使用含重组表达的天然ST的连续稀释的培养物滤液生成标准曲线。
筛选毒性和抗原性
在培养物滤液中测量的毒性是固有毒性(毒性/mol)和ST突变体的浓度的积。对于抗原性也如此。因此，与天然ST相比，毒性或抗原性的降低可能是由于较低的浓度、固有毒性/抗原性的降低或两者的组合所致。因为我们没有精确测量培养物滤液中的ST (突变体)浓度的方法，我们不能够直接测量ST突变体的固有毒性和抗原性。
为了规避这个问题，我们测量了ST突变体相对于天然ST的毒性和抗原性。这允许我们描述突变体培养物滤液中毒性和抗原性的改变。接下来，我们将各突变体抗原性的改变除以毒性的改变。
如果使用相同的培养物滤液测量毒性和抗原性，则这允许我们排除浓度的作用。我们将该测量定义为类毒素性：
Figure RE-400213DEST_PATH_IMAGE005
其中c为浓度，A r 为培养物滤液的相对抗原性，T r 为培养物滤液的相对毒性，Ai为固有抗原性，T i 为固有毒性。好的类毒素候选物会具有高的类毒素性。
ST突变体的纯化
大肠杆菌BL21细胞用以下质粒转化：pUC19-STh [Zhang等；PMID: 19858307]、pUC19-STh-N12T、pUC19-STh-A14Q、pUC19-STh-A14T和pUC19-STh-T16M，并在4AA培养基(6l)中生长12小时。从通过离心接着通过自Dreyfus等[PMID:6358024]修改的方法超滤制备的粗品培养物上清液中纯化STh和STh突变体。简单来说，将粗品培养物上清液应用在Amberlite XAD-2柱中。将柱用蒸馏水洗涤，将ST依次用甲醇/三氟乙酸(TFA) (体积分别为99.9、0.1)和200 ml甲醇/水/TFA (体积分别为80、19.9、0.1)洗脱。合并洗脱液，通过蒸发减小体积至8-10 ml，随后应用至Bio-Gel P-6凝胶过滤柱中。将柱在4℃下用20 mMTrisHCl、200 mM NaCl (pH 7.5)缓冲液以25 ml/小时的流速洗脱。合并含有ST的流分，使其经历使用30-85%甲醇的梯度的C18反相HPLC。调节最终的样品至pH 7.2-7.4，并保存在-20℃下。
STh (突变体)与牛血清白蛋白的化学缀合
如所述，使用戊二醛将STh (突变体)与牛血清白蛋白(BSA)化学偶联[Lockwood &Robertson；PMID:6520401]。
小鼠的免疫
用等体积弗氏完全佐剂中的200 ng STh (突变体)缀合物使小鼠腹膜内免疫(初免)，以相同剂量(但用弗氏不完全佐剂)两周一次加强免疫。用STh (突变体)缀合物免疫的小鼠发展出抗STh抗体，但对照小鼠无。
抗ST抗体滴定
对免疫小鼠血清中的抗ST IgG抗体进行滴定。将含10 ng ST-卵清蛋白缀合物的100 µl STa ELISA缓冲液(Zhang等，2010)加入Costar板的各孔(Corning Inc.，Corning，NY)中，在37℃下孵育1小时，接着在4℃下孵育过夜。在用PBST洗涤2次后，用脱脂奶(在PBST中)在37℃下封闭1小时，将板洗涤，将100 µl血清(1:25稀释于1%牛奶-PBST中)加入各孔中，在37℃下孵育1小时。在洗涤后，将100 µl HRP缀合的山羊-抗小鼠IgG抗体加入各孔中，在37℃下孵育1小时；接着洗涤，与100 µl TMB过氧化物酶底物(KPL)一起孵育20分钟。测量光密度(OD)，计算抗体效价。
中和测定法
用cGMP EIA试剂盒(Assay Design，Ann Arbor，MI)和T84-细胞测试由抗STh小鼠血清引起的STh的中和。如上所述培养T-84细胞。将2 ng STh毒素(稀释于150 μl DMEM/F12培养基中)与30 μl抗血清(从免疫组小鼠中合并；稀释于120 μl DMEM/F12培养基，一式三份)一起在室温下孵育。在1小时孵育后，将混合物(150 μl STh毒素稀释液和150 μl稀的抗血清)加入具有培养在700 μl培养基中的T-84细胞的各孔中，将板再在37℃下在5% CO2中孵育2小时。在另一次洗涤后，将细胞用0.1M 11 HCl (200 μl/孔)裂解，然后用0.1 M NaOH中和。在室温下以660 × g离心10分钟收集细胞裂解物。按照生产商的方案，测试所得上清液的胞内cGMP水平。
抗ST单克隆抗体
抗STh mAb ST:G8由S. Visweswariah友情提供[Garrett和Visweswariah；PMID:8950201]。抗STp mAb克隆29、克隆30和克隆31获自Fitzgerald IndustriesInternational。
使用单克隆抗ST抗体的竞争性STh ELISA
将ELISA板(Nunc Amino Immobilizer)用每孔体积100µl的含STh-OvA缀合物的PBS (与OvA缀合的合成STh：对于ST:G8为0.04µl/孔，对于克隆29和克隆30为0.01µl/孔)包被。将板在4℃下孵育过夜。随后，将板倒空，在180rpm振荡的同时，用PBS-T 1% OvA在20℃下封闭1小时。在洗涤(3x，用PBS-T)后，将60µl体积的样品和60µl第一抗体稀释液加入孔中。mAb的最终稀释度如下：ST:G8 1:6500、克隆29 1:16000、克隆30 1：30000。以180rpm在20℃下进行竞争性孵育90分钟。然后将板用3x200µl PBS-T洗涤，与稀释于PBS-T 100 µl/孔的第二抗体(对于ST:G8 ELISA抗小鼠稀释度1:400，对于克隆29和克隆30 ELISA抗小鼠稀释度1:2000)一起在室温下孵育1小时。在用3x200µl PBS-T更新洗涤后，将板用100µl显色缓冲液显色15-20分钟。通过将50µl NaOH 2M加入各孔终止显色，用Fluostar Optima读板仪在405nm下读取OD。
对于克隆31 mAb，开发了略微不同的方案。按照生产商说明书，将ELISA板(NuncCovaLink)用合成STp包被。简单来说，将50µl含STp的PBS加入所有孔中。随后通过将1.84mgBS3加入含5mg EDC的10ml PBS中制备碳二亚胺/EDC溶液，将50µl的该溶液加入所有孔中。包被溶液中STp的终浓度为0.5 µM。将板在20℃下孵育过夜。然后用上述洗涤步骤、封闭步骤和显色，进行ELISA。在竞争性孵育步骤前，将样品和抗体溶液在不吸收的微量滴定板中预混合，随后用多道移液管转移到包被板中，从而使时间减到最小，使包被板干燥。克隆31第一抗体的终浓度为1:16000，第二抗体为1:500。
结果
ST的所有361个突变型变体在大肠杆菌TOP10背景下表达，采用GC-C T-84细胞测定法分析培养物滤液的毒性，并采用STh和STp竞争性ELISA测定法分析抗原性。
所述测定法具有不同的检出限：STp ELISA的检出限是稀的野生型ST培养物滤液的~50-60倍，STh ELISA检出限为~400，而野生型ST培养物滤液可稀释~700-750倍，且在T-84细胞测定法中仍可检出。
为了有助于解释该结果，图1显示了STh的结构模型。所谓的STh的毒性结构域由残基6-18组成，并与STp残基5-17相同，除了STh T16，其在STp中被A15置换。STh和STp还共有位于毒性结构域两侧的2个酪氨酸(STh：Y05，Y19；STp：Y04，Y18)，但在N端不同(STh：NSSN，STp：NTF)。已经提出与鸟苷蛋白环化酶C受体相互作用的STh的残基为N12、P13和A14，这对应于STp残基N11、P12和A13。
ST类毒素候选物的鉴定
对STh的各氨基酸位置的T84毒性和STh抗原性的中位值效应(median effect)见图2。注意，不具有任何可检测毒性的突变体的毒性被设置为检出限(0.0014)以确保对毒性的作用的保守评价。
在N端位置N01、S02、S03、N04和Y05中，对毒性和抗原性两者的中位值效应都小。相比之下，毒性结构域位置(16-18)和Y19显示对毒性、抗原性任一个或两者更显著的作用。
对于位置C06、E08、T16、G17和Y19，类毒素性中位值是负的，范围为-2 (G17)至-10.5 (E08)。这表明了这些位置(G17除外)可形成一个或多个被抗STh抗血清识别的表位。注意残基E08和T16位于所谓的受体相互作用残基N12、P13和A14的对边(图1)。Y19位实际上对抗原性具有最显著的作用(仅3个具有可检测的抗原性)，对毒性几乎无作用，这就表明它是关键的抗原决定簇。总之，这些结果表明，将毒性和抗原性分隔开来实际上是可能的。
从疫苗前景看，最引人关注的残基是具有正的类毒素性的那些。对于L08、C11、N12、P13和A14就是这种情况，其类毒素性中位值范围为3 (C11)-92 (A14)。只有2个位置具有大于10的类毒素性中位值，即N12 (14)和A14 (92)，且平均而言，似乎是疫苗中靶定的最有吸引力的位置。两者为受体相互作用残基。
C07、C10、C15和C18的突变对毒性和抗原性两者具有深远的不可计量的作用，因此不在图中或表中出现。
图3显示具有可检测的STh抗原性的所有各个219个突变体的T84毒性和STh抗原性结果。
表1列出具有100或以上类毒素性的类毒素候选物和其中最大类毒素性高于10的位置的最佳类毒素候选物。
与STp抗原性相比较的STh抗原性
还用STp ELISA进行了筛选。与STh ELISA筛选结果的比较见图4。在S03、N12、P13和Y19位上，与STp ELISA相比，抗原性中位值在STh ELISA中升高1.4-4.5倍。
N01、S02、N04、Y05、C06、E08、L09、A14和G17位显示相反作用，其STp抗原性升高1.1-7.7倍。T16位观察到最显著的差异，该位显示STp抗原性的52倍相对增加。这最可能是由于STh和STp在此位置上不同所致。STp具有丙氨酸残基而非STh的苏氨酸残基。实际上，T16A突变体显示STp抗原性19倍的增加，表明了16位是被抗STp抗体识别的表位的一部分。STh ELISA中抗原性显著的平均降低表明T16同样也是STh表位的一部分。
可观察到的一个普遍趋势是该突变体似乎影响STh抗原性超过STp抗原性。这个观察结果以及STh ELISA的几乎10倍较高的灵敏度，表明抗STh抗体比抗STp抗体对STh具有显著较高的亲和力(注意，抗STh血清是蛋白质A纯化的，与抗STp血清不同。这可也可能对灵敏度的差异产生影响)。对此的一个可能解释是STh和STp 16位的差异。
可以观察到的另一个普遍趋势是所谓的毒性结构域(残基6-19)的突变比N端尾的突变(1-5)对STh和STp抗原性两者具有更显著的作用。虽然可以排除所观察到的差异是因表达水平的差异所致的可能性，但是它可表明N端不是被两种血清识别的表位的一部分。
ST突变体在小鼠中诱导中和抗体
成功纯化出4个STh突变体，并用戊二醛与牛血清白蛋白(BSA)化学缀合：N12T、A14Q、A14T和T16M。按照筛选(表1)，A14Q是第二最佳类毒素候选物，A14T是第4个。N12T是候选物列表(表2)中的第11个，并且是第三最佳的N12候选物。T16M是次等的类毒素候选物，作为除天然STh以外的对照包括在内。
使用5个缀合物构建体的每一个使5只小鼠免疫。所有构建体诱导天然STh特异性抗体。为了测试中和活性，合并产生于相同缀合物的血清，用于T84细胞测定法。在该测定法中，所有5种所测试的构建体能够中和2 ng天然STh (即证实足以在T-84细胞中刺激cGMP)。
抗STh抗体与uroguanylin交叉反应
为了鉴定ST同内源肽鸟苷蛋白和uroguanylin之间可能共有表位，针对对于STh和STp产生的多克隆和单克隆抗体两者，对内源肽进行了测试。除STh和STp以外，多克隆和单克隆抗STh抗体两者与uroguanylin (但不与鸟苷蛋白)结合(图5)。这证实了交叉反应对于ST疫苗开发是一个实在的顾虑，且应在ST疫苗设计中积极克服。令人关注的是，所测试的抗STp抗体(1个多克隆和3个单克隆)无一显示任何交叉反应。这可表明ST疫苗应基于STp而不是STh。然而，流行病学数据表明，产生STh的ETEC比只产生STp和/或LT的ETEC对疾病更重要[Steinsland等；PMID：12447759]，并且是ST疫苗以STh而非以STp为基础的论据。
抗ST mAb的表位作图表明STh突变以回避交叉反应
我们使用突变体文库对以下2个中和mAb的表位作图：抗STh ST:G8 mAb和抗STpmAb克隆30。通过分析对于两个mAb的所有非半胱氨酸残基的所有突变的抗原性的单独作用，我们能够鉴定出2个截然不同的表位(图6)。L9、N12和T16的突变降低与ST:G8结合，而P13、G17和Y19的突变降低被抗STp mAb识别。2组残基形成2个结构确定的片(patch)，其与是结构表位的存在的部分一致。令人关注的是，A14似乎不是任一个表位的一部分，因为A14的19个突变型变体无一显示对mAb的亲和力显著降低。这是令人鼓舞的，因为A14突变显示毒性最突出的降低。
与ST:G8 mAb不同，抗STp mAb不与uroguanylin交叉反应。这为表位作图带来新的维度。它证实了产生不与(uro)guanylin肽交叉反应的抗ST表位的中和抗体的确是可能的。所有4种基于STp的抗体的共同点是它们中和ST，但不与(uro)guanylin交叉反应。在毒性结构域(其是类似于(uro)guanylin肽的区域)中，STh和STp之间的唯一差异是STh T16位，其是STp中的A (A15)。T16突变体无一显示任何对克隆30结合的突出作用，强烈表明了同源STp残基A15不是克隆30表位的一部分。因此，这些数据表明基于STh的疫苗应含有T16A突变以克服交叉反应。
结论
筛选结果表明，在尝试制备STh类毒素突变的2个明显最有引人注意的位置为N12和A14。这些的类毒素性中位值分别为14和92。
意想不到的是，4个N12突变体显然具有高于天然STh的抗原性(N12V、N12H、N12T和N12I)。这些突变体中的2种相对于天然STh具有低的毒性，即N12T (0.03)和N12V (0.01)，并且是类毒素候选物。
A14位中19个突变中的17个导致无可测量的毒性(2个例外是A14G和A14S)。对相对抗原性的作用从0.02到0.7变化。A14位的最佳类毒素候选物具有接近天然STh的抗原性的事实是十分令人鼓舞的。
3个其它位置似乎为是适度良好的类毒素候选物的宿主突变体，即P13、L09和E08(表1)。P13和L09的类毒素性中位值(分别为3和7.9)表明，这些位置对于产生STh类毒素是有适度引入注意的。另一方面，对于E08的-10.5毒性中位值，表明E08是用于产生STh类毒素的差的位置。然而，当评价单独的E08突变体时，出现2个引人注意的候选物，即E08R和E08K。令人关注的是，所有E08突变体影响相对抗原性至类似程度，范围从0.008到0.08 (10倍)，而相对毒性变化更多大，范围从低于0.0014到1.2 (至少857倍)。用E08位的突变体得到的结果表明，筛选所有可能的单一氨基酸突变的文库而非例如丙氨酸突变扫描的强度。
此外，我们的数据表明，基于STh的疫苗可含有T16A突变以规避交叉反应。
上面的说明书中提及的所有出版物通过引用结合到本文中。在不偏离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述方法和系统的各种修改和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。虽然结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应了解，所要求保护的本发明不应过度局限于所述具体的实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显然的实施本发明的所述方式的各种修改意图在随附权利要求书的范围内。
表1.
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表2：通过由类毒素性排序的STh突变体
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Claims (8)

1.一种由下列序列组成的大肠杆菌耐热毒素ST的突变体：
NSSNYCCELCCNPTCTGCY；或
NSSNYCCESCCNPTCTGCY；或
NSSNYCCEACCNPTCTGCY。
2.由下列序列组成的大肠杆菌耐热毒素ST的突变体：
NTFYCCELCCNPTCAGCY；或
NTFYCCESCCNPTCAGCY；或
NTFYCCEACCNPTCAGCY。
3.与载体偶联的大肠杆菌耐热毒素ST的突变体，其中所述突变体如权利要求1或2所定义。
4.分离的核酸，其编码权利要求1或2的突变体或权利要求3的与载体偶联的突变体。
5.表达载体，其包含权利要求4的核酸。
6.宿主细胞，其包含权利要求5的表达载体。
7.疫苗组合物，其包含权利要求1或2的突变体或权利要求3的与载体偶联的突变体和药学上可接受的载体或赋形剂。
8.权利要求1或2的突变体、权利要求3的与载体偶联的突变体、权利要求4的核酸或权利要求5的表达载体在制备用于治疗或预防大肠杆菌感染的药物中的用途。
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