CN1588074A - 体外检测早期肾病的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的用于检测早期肾病的试剂盒,该试剂盒主要由下述组分组成:抗ALB抗原的酶标单克隆抗体、包被有ALB抗原的酶标板、酶底物液、标准品、样品稀释液、洗涤液、终止液及试剂盒使用说明书。本发明试剂盒具有稳定性高、检测快捷、成本低、特异性和敏感性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种疾病的体外检测试剂盒,尤其涉及一种体外检测肾病的试剂盒及其应用。
背景技术
正常人尿中白蛋白的含量小于20毫克/升。但人患糖尿病时,尿中总蛋白在正常范围内,而尿白蛋白排泄增加,微量白蛋白尿是肾病的早期症兆,其特征是尿白蛋白浓度为0~300毫克/24小时,或白蛋白/肌酐比率为0~300毫克/每克肌酐,此时尿液分析尿蛋白为阴性。早期检测尿微量白蛋白是防止肾脏病变的有效手段之一,特别对于糖尿病患者和高血压患者尤为重要,测定尿微量白蛋白可以预测糖尿病肾病和高血压病的进展。
糖尿病肾病是糖尿病的重要并发症,一旦临床确诊为糖尿病肾病,发展成肾衰是不可避免的,是糖尿病早期死亡的最重要原因。是不可逆病变。糖尿病肾脏病变主要是由于肾小球滤过增加、代谢改变导致高滤过率、基底膜改变、负电荷降低、肾小球内压力增高而造成。30%的I型糖尿病人病程15-20年会出现肾病,20%的II型糖尿病人在明确诊断时已有肾病,II型糖尿病人病程5年后肾脏并发症显著增高。
高血压患者的尿白蛋白排泄率明显高于正常人,而且与收缩压及舒张压均正相关,对有高血压的心血管患者是很灵敏的预报指标。高血压患者的尿白蛋白排泄率高,其原因是肾小球内压力上升、白蛋白的滤过失调、肾小球结构改变。无论糖尿病人和原发性高血压病人,抗高血压治疗后尿微量白蛋白均下降。
当前国内外主要采用夹心法酶联吸附试剂盒来检测尿中微量白蛋白的含量从而进行早期肾病的诊断。采用夹心法酶联吸附试剂盒进行早期肾病的诊断存在三个主要缺陷,即:一是该试剂盒的稳定期有限,通常只能保存6个月左右;二是检测耗时长,一般为4个小时;三是检测成本高,每一次检测的成本需耗费100元左右。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定性高、方便快捷和成本较低的体外检测早期肾病的试剂盒。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
本发明的体外检测早期肾病的试剂盒,主要由以下两种组分组成:包被在酶标板上的ALB抗原、抗ALB抗原的酶标单克隆抗体。
所述的标记单克隆抗体的酶为辣根过氧化物酶。
本发明的体外检测早期肾病的试剂盒还可包括下述组分:
标准品、洗涤液、稀释液、终止液、酶底物液。
本发明试剂盒各组分的制备方法为:
1)抗ALB抗原的单克隆抗体的制备及酶标标记:
首先用ALB抗原免疫动物,末次免疫后取免疫动物的脾细胞利用细胞融合技术制备单克隆抗体,将所制备的单克隆抗体经鉴定后进行酶标记后备用,
2)包被有ALB抗原的酶标板的制备:
用包被缓冲液将ALB抗原稀释后加入到酶标板的孔中,依次经第一次洗涤、封闭、第二次洗涤、保护、第三次洗涤、干燥等步骤后,将ALB抗原包被于酶标板上备用。
3)准备下述试剂盒组分:
标准品、洗涤液、稀释液、终止液、酶底物液。
4)将上述步骤中制备的包被有ALB抗原的酶标板、抗ALB抗原的酶标单克隆抗体、标准品、洗涤液、稀释液、终止液、酶底物液组装到一个试剂盒中并附上使用说明书即得本发明试剂盒。
上述制备方法中,其中步骤1)中所用的免疫动物为小鼠;标记抗ALB抗原的单克隆抗体所用的酶是辣根过氧化物酶,用辣根过氧化物酶按常规改良过碘酸钠法标记抗ALB单克隆抗体,标记完后加入多种二价金属离子,可显著提高酶标抗体的活性。所用到的ALB抗原购自美国Sigma公司。
步骤3)中所述的标准品购自美国Sigma公司,洗涤液、稀释液、终止液、底物A液和B液的制备可参考实施例所述的制备方法。
本发明采用酶联免疫竞争抑制原理检测尿液里面的微量白蛋白。包被在酶标板上的白蛋白和人尿液中的白蛋白与酶标抗人白蛋白抗体竞争结合,洗涤后,加入底物显色。显色的强度与样品中的白蛋白浓度成反比。然后加入终止液终止反应。用酶标仪在450nm处测酶标板各孔的吸光值,绘制标准曲线,然后通过标准曲线测定尿样中白蛋白的浓度。
本发明试剂盒的制备过程中,其中在包被有ALB抗原的酶标板的制备时,在封闭后加入一道保护工序,延长了试剂盒的保护期,从而提高了本发明试剂盒的稳定性;本发明试剂盒在检测肾病时,采用竞争抑制法,该方法可显著缩短检测时间,使检测更为方便、快捷;此外,本发明试剂盒只使用一个抗体进行检测,无需制备二抗,检测成本因而降低。
附图说明
图1拟合曲线图:Alb标准品浓度(ug/ml)的常用对数为横坐标,Alb标准品的吸光值为纵坐标
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果,应该理解的是,这些实施例仅用于例证的目的,决不限制本发明的保护范围。
[实施例]本发明试剂盒的制备
一、试剂盒各组分的制备
一)ALB抗原的单克隆抗体制备和标记
1、试验材料:
1)、ALB抗原:购自美国Sigma公司
2)、实验动物:六周龄BALB/c小鼠购自黑龙江省兽医研究所,体重30-40g。
3)、其它试剂:福氏完全佐剂:羊毛脂1份、石蜡油5份,每毫升加10mg卡介苗。
2、制备方法:
1)免疫动物:用50-100ugALB加福氏完全佐剂对小鼠进行皮下注射,间隔2-3周后,用同样剂量ALB加强免疫2-3次,末次免疫后第3-4天取脾细胞进行融合。
2)细胞融合:免疫小鼠脾细胞和Sp2/0细胞(购自上海生物制品研究所)按8∶1的比例混合,在50%PEG的作用下,进行融合,用Elisa间接法初步筛选出阳性克隆,再用中和抑制试验证实为阳性克隆后,经有限稀释法克隆2-3次,筛选出分泌抗体阳性的单个克隆,稳定传代3个月,制备腹水和液氮保存。
3)所筛选出的阳性单克隆抗体的鉴定
A杂交瘤细胞的染色体分析:取对数生长期的杂交瘤细胞用秋水仙素处理,经Giemsa染色,镜检计数。
BIg类及IgG亚类测定:用美国Sigma公司的抗鼠亚类抗血清与浓缩至原体积1/20的杂交瘤细胞培养上清做琼脂双向扩散
C单克隆抗体特异性的测定:将ALB进行电转移,而后用各株单抗分别进行Elisa染色
D单克隆抗体比活性测定:将各株单抗的蛋白进行定量,然后按不同稀释度测定各株的滴度。
E将所筛选到的合格单克隆抗体保存备用。
4)抗ALB抗原的单克隆抗体的酶标记
选用辣根过氧化物酶按常规改良过碘酸钠法标记抗ALB单克隆抗体,标记完后加入多种二价金属离子,以提高酶标抗体的活性。
二)、包被有ALB抗原的酶标板制备
1、试验材料
1)ALB抗原:购自美国Sigma公司
2)所用的试剂:
包被缓冲液:碳酸钠1.5g,碳酸氢钠2.9g,硫柳汞0.2g,加双蒸水至1000ml调PH9.6,灭菌备用。
保护液:氯化钠8.0g,磷酸二氢钾0.2g,磷酸氢二钠2.9g,氯化钾0.2g,硫柳汞0.1g,蔗糖40g,庆大霉素1g,氯化镁5mM,加双蒸水至1000ml,调PH7.4,灭菌备用。
2、操作方法:
包被:用包被缓冲液将ALB抗原稀释成2μg-10μg/ml工作浓度,每孔加入工作浓度抗原100μL,盖好酶标板,置于4℃冰箱中过夜;
洗涤:弃去包被液,用PBS-T洗涤液满孔洗涤5次,每次3分钟,最后一次在纸抹布上拍干;
封闭:用封闭液加满各反应孔,去除加样时产生的贴壁气泡,盖好酶标板,于37℃水浴箱中孵育60分钟。
洗涤:弃去包被液,用PBS-T洗涤液满孔洗涤5次,每次3分钟,最后一次在纸抹布上拍干。
保护:用保护液加满各反应孔,盖好酶标板,于4℃水浴箱中孵育过夜后弃去保护液,于37℃干燥20分钟,然后真空包装于铝箔袋中保存备用。
三)、封闭液:
氯化钠 8.0g,
磷酸二氢钾 0.2g,
磷酸氢二钠 2.9g,
氯化钾 0.2g,
硫柳汞 0.1g,
牛血清白蛋白 20g,
加双蒸水至1000ml,调PH7.4,高压灭菌即可
四)、终止液
20ml硫酸
加双蒸水至184ml
五)、标准品及酶标记物稀释液的配制
氯化钠 8.0g,
磷酸二氢钾 0.2g,
磷酸氢二钠 2.9g,
氯化钾 0.2g,
硫柳汞 0.1g,
加双蒸水至1000ml,调PH7.4,高压灭菌即可。
六)、酶底物液的制备
A液:
磷酸氢二钠 14.60g
柠檬酸 9.33g
0.75%过氧化氢尿素 10ml
加双蒸水至1000,调PH值5.5
B液:
TMB 30mg
DMSO 28ml
双蒸水 60ml
七)、洗涤液(PBS-T)的配制
氯化钠 8.0g,
磷酸二氢钾 0.2g
磷酸氢二钠 2.9g
氯化钾 0.2g
硫柳汞 0.1g
吐温20 0.5ml
加双蒸水至 1000ml,
调PH值7.4。
八)、标准品:购自美国Sigma公司。
二、本发明试剂盒的组成:抗ALB抗原的酶标单克隆抗体5ml;包被有ALB抗原的96孔酶标板;底物A液5ml、底物B液5ml;标准品5ug;10×样品稀释液10ml;20×洗涤液25ml;终止液5ml;试剂盒使用说明书一份。
三、本发明试剂盒保存及有效期
2-8℃、密闭、避光保存,有效期6~8个月。
[试验例]使用本发明试剂盒进行早期肾病的检测
一、试验材料
1、检测试剂盒:本发明实施例所制备
2待检样品的采集
取早晨第一次尿液的中段置于洁净的容器中,2-8℃,可保存48小时;若标本需更长时间保存,置于-20℃冰箱中,并放入防腐剂(万分之一的氯仿),可保存一个月。测定前取尿液100μl用试剂盒稀释液稀释到500μl。
3、试剂准备
1)将10×稀释液用前置于37℃水浴15分钟,然后用蒸馏水做10倍稀释;
2)将20×洗涤液用前置于37℃水浴15分钟,然后用蒸馏水做20倍稀释;
3)将5ug标准品用500ul稀释液准确复溶(10ug/ml)。取出200ul用稀释液作五次倍比稀释,得浓度:5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml、0.3125ug/ml六个标准点。
二、操作步骤
1、加样:每孔加酶标抗体50ul,同时分别加入标准品、待测样品或阴性对照各50ul,标准品做6个标准点。(阴性对照采用本试剂盒的稀释液)。标准品、待测样本以及阴性对照品均加复孔,每孔再加酶标抗体50ul,轻轻振荡混匀,37℃水浴40分钟;
2、洗板:弃去反应孔内液体,用洗涤液注满各孔,静置3分钟,甩干,反复3次后拍干;
3、显色:临用前把底物A、B溶液按体积比1∶1混合均匀。每孔加底物液100ul,37℃水浴15分钟;
4、终止比色:每孔加入50ul终止液,轻轻混匀30秒,在酶标仪450nm处,以底物空白孔调零,测各孔的吸光值。
三、数据处理
以Alb标准品浓度(ug/ml)的常用对数为横坐标,吸光值为纵坐标作图,并用4P方式拟合曲线(见图1)。待测标本Alb含量(ug/ml)可从标准曲线上算出,然后乘以稀释倍数即可。
四、评定标准
1)阴性: <20μg/ml。
2)阳性: >25μg/ml。
3)临界值: 20-25μg/ml,若检测结果为临界值,应进行重复实验,若仍为临界值判为阴性,重复实验以后者结果为准。
五、检测结果
使用本发明试剂盒对400例无肾疾患的人群进行测试,检测结果平均值为7.84±4.32ug/L,特异性为95%;对200例早期肾病检测,均值为45.36±20.48ug/L,灵敏性达到96%,说明本发明试剂盒对早期肾病的检测有良好的特异性和敏感性。
Claims (6)
1、一种体外检测早期肾病的试剂盒,其特征是:主要由包被在酶标板上的ALB抗原和抗ALB抗原的酶标单克隆抗体组成。
2、按照权利要求1所述的试剂盒,其特征是:所述的包被有ALB抗原的酶标板在其制备过程中加入了一道保护工序。
3、按照权利要求1所述的试剂盒,其特征是:所述的抗ALB抗原的酶标单克隆抗体在其制备步骤中,用酶标记单克隆抗体完成后再加入多种二价金属离子。
4、按照权利要求1所述的试剂盒,其特征是:所述的酶标板为96孔单条或双条可拆酶标板。
5、按照权利要求1所述的试剂盒,其特征是:所述的试剂盒还包括有标准品、洗涤液、稀释液、终止液和酶底物液。
6、权利要求1~5任意一项所述的试剂盒在检测早期肾病中的应用。
Priority Applications (1)
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CN 200410056969 CN1588074A (zh) | 2004-08-24 | 2004-08-24 | 体外检测早期肾病的试剂盒及其应用 |
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