CN1588071A - 一种酶标记免疫电化学检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属电化学和临床化学分析领域，涉及一种酶标记免疫电化学检测方法，本发明利用磁性微球(珠)分离酶标记免疫反应结合物，在裸电极表面作用于酶的底物，测定电极表面电位或电流的改变，实现生物大分子物质或半抗原的定性与定量分析。本发明具有如下优点：结构简单，无需光学检测系统；裸电极从理论上无使用寿命限制；检测成本可明显降低；适于检测自动化；结合微电子和微电极技术，有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属电化学和临床化学分析领域，涉及一种酶标记免疫电化学检测方法，具体涉及一种检测过氧化物酶及其底物反应系统的电化学方法
背景技术
1971年Engvall等建立了酶联免疫吸附分析(ELISA)技术，用于检测生物标本中的抗体或抗原。利用过氧化物酶(HRP)作为标记物的ELISA的基本原理是，将HRP与抗体或抗原交联，得到酶结合物，它与待测物中的抗原或抗体结合，分离并弃除游离的酶结合物后，加入HRP的底物，经化学反应，形成有色的产物，用酸中止反应后，经光度计在一定波长下比色，根据吸光度的高低，与标准比较，计算待测物的量。上述技术后经不断改进和完善，现在已成为一项广泛应用的光学免疫测定技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏、稳定、结构简单、低消耗、适于自动化的酶标记免疫电化学检测方法。具体涉及一种检测过氧化物酶及其底物反应系统的电化学方法。
已知技术酶标记免疫原理，HRP作用于底物的反应过程是，
式中H2O2可以是过氧化氢，也可以是过氧化氢尿素、sodiumperborate等；AH2则是一类供氢体的通式，如邻苯二胺、四甲基联苯胺、5-氨基水杨酸、邻联苯甲胺、ABTS等。
本发明利用磁性微球(珠)分离酶标记免疫反应结合物，在裸电极表面作用于酶的底物，测定电极表面电位或电流的改变，实现生物大分子物质或半抗原的定性与定量分析。
本发明所述磁性微球(珠)为通用的磁珠试剂，所述底物为四甲基联苯胺(TMB)，参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为铂电极；电化学分析仪为上海辰华仪器公司生产的CHI 830电化学分析仪，使用3电极系统。测量时，反应液加在反应池内，参比电极和对电极插入液面下，分别连接至电化学分析仪，进行检测。
所述的反应池即电解池，采用聚苯乙烯材质制备，底部为矩形金片金电极1，经导线联至池外，是为工作电极2，反应池底面粘固铁片3，磁铁4可在需要时吸附其上，而无须另行固定。
本发明电化学检测法借助于磁性微珠将过氧化物酶(HRP)-过氧化氢(H2O2)-供氢体(H2A)反应体系浓聚于裸电极表面进行电化学检测。具有如下优点：结构简单，无需光学检测系统；裸电极从理论上无使用寿命限制；检测成本可明显降低；适于检测自动化；结合微电子和微电极技术，有广阔的应用前景。
附图说明
图1.电解池结构示意图，
其中，1金电极，2工作电极，3铁片，4磁铁。
图2.差分脉冲伏安法扫描图
其中，a、b、c、d为标准品标号。
图3.循环伏安法扫描图
其中，a、b、c、d为标准品标号。
具体实施方式
实施例1 磁珠分离的ELISA在裸电极表面的电化学测定
采用瑞士ROCHE公司的“Enzymum-TestCA 72-4”试剂盒(内附标准品，由低到高共4瓶，标号分别为a、b、c、d)和“Elecsys”试剂盒中通用的磁珠(包被有链霉亲和素)试剂，和上海科华实业有限公司的肝炎标志物检测试剂盒中底物(“SUBSTRATE A”和“SUBSTRATE B”，临用前等量混合后应用)。
电化学分析仪为上海辰华仪器公司生产的CHI 830电化学分析仪，使用3电极系统。
测量时，反应液加在反应池内，参比电极和对电极插入液面下约2mm，分别连接至电化学分析仪。
参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为铂丝电极；电解池采用材质为厚约1mm的聚苯乙烯，底部为约0.2mm厚的矩形金片，经导线联至池外，为工作电极，反应池底下面粘固一铁片，柱形磁铁在需要时吸附其上，而无须另行固定。
取
酶结合物工作液 0.700ml
标准品 0.035ml
磁珠悬液 0.100ml
混匀，室温下反应60分钟，其间混匀1-2次。
将试管置于磁性板上，使磁珠沉积，倾去上清液，并用吸水纸吸去管口残余液滴，用含0.05％TWEEN 20的生理盐水同法洗涤磁珠5次，后用生理盐水悬浮。
用滴管将悬浮的磁珠移入电解池，将柱形磁铁置于电解池下，使磁珠沉积，吸弃生理盐水，加入底物应用液0.500ml，立即将参比电极和对电极插入液面，开始扫描测定。
测试所用的标准品浓度是：a.2.1U/ml；b.20.3U/ml；c.51.8U/ml；d.94.9U/ml。用差分脉冲伏安法和循环伏安法均可明确加以检测和区分。
实验结果表明，本发明方法能实现磁珠分离的ELISA在裸电极表面的电化学测定。
Claims (6)
1、一种酶标记免疫电化学检测方法，其特征是利用磁性微球(珠)分离酶标记免疫反应结合物，在裸电极表面作用于酶的底物，测定电极表面电位或电流的改变，实现生物大分子物质或半抗原的定性与定量分析。
2、根据权利要求1所述的酶标记免疫电化学检测方法，其特征是所述的方法包括下述步骤，
1)取酶结合物工作液，标准品，磁珠悬液置试管，混匀，室温下反应60分钟，
2)将试管置于磁性板上，使磁珠沉积，去上清，用含0.05％TWEEN20的生理盐水洗涤磁珠，后用生理盐水悬浮，
3)将悬浮的磁珠移入电解池，将柱形磁铁置于电解池下，使磁珠沉积，吸弃生理盐水，加入底物应用液，参比电极和对电极插入液面，分别连接至电化学分析仪，扫描测定。
3、根据权利要求1或2所述的酶标记免疫电化学检测方法，其特征是所述的所述磁性微球(珠)为通用的磁珠试剂。
4、根据权利要求1或2所述的酶标记免疫电化学检测方法，其特征是所述的底物为四甲基联苯胺。
5、根据权利要求1或2所述的酶标记免疫电化学检测方法，其特征是所述的参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为铂电极。
6、根据权利要求2所述的酶标记免疫电化学检测方法，其特征是所述的电解池采用聚苯乙烯材质制备，底部为矩形金片金电极，经导线联至池外，为工作电极，池底面粘固铁片，磁铁可吸附其上，无须另行固定。
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