CN1587979A - 生物全内反射式近场扫描显微镜 - Google Patents
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Abstract
一种生物全内反射式近场扫描显微镜,四部分构成:第一部分是激发部分,由激光器、准直和反射镜组成光学系统构成;第二部分是产生隐失波部分,由倒梯形棱镜及其顶面附着的待测样品构成;第三部分是信息的采集、存储和处理,由光纤探针、驱动扫描部分和第二光电探头以及计算机构成;第四部分是光纤探针高度控制,由光学信息收集部分和第一光电探测头及反馈控制线组成,其特征在于所述的光纤探针的针尖端一旁或尖端粘附一荧光染料大分子或生物酶或量子点。本发明不仅是一种可应用于生物细胞微结构和单分子探测的近场光学全内反射式扫描显微镜,而且根据本发明揭示的规律进行操作可以获得最有效的空间分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及近场扫描成像光学,特别是一种针对生物研究的生物全内反射式近场扫描显微镜。
背景技术
1928年E.H.Synge首次提出近场扫描成像的思想,开拓了一条超衍射极限分辨成像的新路。七十年代人们利用微波实现了最初的近场光学扫描成像,至今已经有30多年的历史。虽然近场扫描成像技术已经逐渐成熟,但是有关近场光学扫描显微术的分辨率问题一直没有定论,直至目前仍然在不断的改进。例如,与物体界面距离有关的空间相干性现象的揭示,为进一步改进分辨率提供了理论基础,而利用锁相放大器锁定探针振动频率,以便准确探测近场扫描显微镜的信息,这种实验技术的提出也进一步改进了这种成像方式的分辨率,因为这样的探测既计入了探针的扫描,也计入了探针的振动和材料的性质。虽然这些发展均提供了改进全内反射近场扫描显微术(SNOM)分辨率的新途径,但是这里仍然存在一些问题。例如:
(1)在SNOM成像中存在赝像。引起这种现象主要有四种原因:针尖构造的影响,近场扫描光学系统结构和样品性质的影响,扫描模式的影响及照明光偏振度的影响。
(2)缺乏普遍深入的公认的理论去描述成像过程和预期成像结果。目前已经存在一些理论模型,例如角谱理论,时域有限差分方法,以及偶极子自恰场理论。
角谱理论从光的空间谱的观点解释了SNOM能够获得超空间分辨的原因。但是该理论不能解释近场域光与物质的相互作用。时域有限差分方法使用了添加一定边界条件的Maxwell方程去计算光场在近场域的分布,该理论可以解释与光传输的现象,但是不能解释光的发射和吸收过程,以及在这些过程中会出现物质和光场相互作用的细节,而且该数值计算过程非常耗费时间。基于被矫正的严格的Huygens传输概念,利用时空偶极子的自恰场理论也可以近似解决近场传输问题。在该理论中,扫描探针和样品分别假设为偶极子小球,该场与物质的相互作用假设为场与小球间的相互作用。在这种简化了的模型中,解释了在近场域一些影响成像分辨率的因素。由于这种物理模型在概念上清晰简明,利用该模式进行运算中的节时性,已经成功的应用到近场扫描显微术中各种问题的模拟计算中,所得到的这些结果均对揭示近场光学扫描成像机制作出了重要的贡献,见文献:M.Xiao,S.Bozhevolnyi,O.Keller,Numericalstudy of configurational resonances in near-field optical microscopy with amesoscopic metallic probe,Appl.Phys.A,62(2),115-121(1996)。但是这些结果是零散的,无法综合给出影响近场扫描显微术分辨率的因素。也就是说,至今除了模拟计算以及实验测试的分辨率结果外,不存在一种有关分辨率的解析式或者经验公式。这种情况对于掌握近场扫描成像概念和技术,尤其对于最佳化扫描近场光学都增加了烦琐性和局部性。即不能从光波成像的角度综合地认识近场扫描成像概念。
我们基于偶极子自恰场理论的样品间相互作用方程,研究了探针尺度对分辨率的影响及从探针尖到样品表面距离对扫描近场分辨率的影响。本发明是通过分析模拟计算的若干结果,总结发明了一种在P-偏振光照明下横向空间分辨率的经验表达式,根据该公式能够推算出近场光学横向空间分辨率的规律。
近场扫描光学显微镜可以用于生物微结构探测,但是信息一般很弱。虽然人们也在使用其他单分子或离子的增强作用来探测表面,但是难以得到较好的效果。这些技术都是在样品中掺杂或形成金属粒子,以便增强生物化学信号,见文献:J.MICHAELIS,C.HETTICH,J.MLYNEK&V.SANDOGHDAR;Optical microscopy using a single-molecule lightsource,Nature 405,325-328(2000)。而不是直接在探针上做文章。探测生物表面信息的困难很多,其一是因为生物的表面反射率低,所获得的信息本身很弱;其二因为生物表面是一个强散射体,这些散射光使得近场扫描显微镜获得图像的信噪比很低。随着21世纪生物时代的到来,为生物大分子研究设计一些探测手段是必要的。因而本发明设计了一套可应用于生物细胞微结构和单分子探测的近场光学全内反射式显微镜。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服上述已有技术的不足,提供一种生物全内反射式近场扫描显微镜,其不仅是一种可应用于生物细胞微结构和单分子探测的近场光学全内反射式显微镜,而且根据本发明揭示的规律进行操作可以获得最有效的空间分辨率。
本发明的技术解决方案如下:
一种生物全内反射式近场扫描显微镜,构成分为四部分,第一部分是激发部分,由激光器、准直和反射镜组成光学系统构成;;第二部分是产生隐失波部分,由倒梯形棱镜及其顶面附着的待测样品构成;第三部分是信息的采集、存储和处理,由光纤探针、驱动扫描部分和光电探头及计算机构成;第四部分是光纤探针高度控制,由光学信息收集部分和光电探测器及反馈控制线组成,其特征在于所述的光纤探针的针尖端一旁粘附荧光染料大分子。
所述的光纤探针的针尖端粘附荧光染料大分子。
所述的光纤探针的针尖端一旁粘附的是一种生物酶,或量子点。
所述的光纤探针的针尖端粘附的是一种生物酶,或量子点。
所述的待测样品是附着在一倒置的球面透镜的顶面。
本发明的技术效果,经实验和理论分析表明:本发明不仅是一种可应用于生物细胞微结构和单分子探测的近场光学全内反射式显微镜,而且根据本发明揭示的规律进行操作可以获得最有效的空间分辨率。
本发明的创新的基础叙述如下:
本发明的发明之一是根据模拟计算结果,归纳总结了在扫描近场光学显微术中横向空间分辨率表达式;其二是基于上述表达式,发明了荧光分子小探针近场光学显微镜。它尤其适用于生物单分子信息的探测。
一、扫描近场光学显微术的横向空间表达式
由于近场光学显微术的复杂性,我们把具有形状结构的探针和样品均假设为小球形。即一个为探测小球,两个为样品起伏小球。由于在近场域的探测中,探针和探测对象均在纳米级,把它们近似为小球的模型是合理的。参照图1所示的模型和参数,固定Z=35nm,探针沿X方向扫描,其光强IC将随探针位置X的变化而变化。图2中(a)、(b)、(c)、(d)分别对应着δ=10nm,20nm,30nm和50nm时探针小球C处扫描的光强。可以看出δ=10nm(两样品小球紧挨在一起)时,难以分辨出这两个小球,而其它几幅图中可清晰地分辨出两个小球。这说明系统存在一个最小分辨尺度。为了确定系统的分辨率,对两个小球的情况,采用探针小球处光强扫描曲线的中心光强I0(即X=0处的光强)与相应的最大光强Imax之比来讨论系统的分辨率。图3是I0/Imax随样品小球x的坐标值δ变化的曲线。可看出I0/Imax随δ增大而单调下降,当I0/Imax<0.78时,这两个小球即可分辨,此时2δ=28nm。这比单独一个小球的情况下的系统分辨率有所下降。如图2中(d)的情形,其单个峰的半高全宽度(FWHM)为22nm。其原因是两小球感生光场间的干涉影响了系统的分辨率,使之有所下降。由此可以看出:
1、对于实际被探测的物体,不同的微结构之间的光场干涉将影响系统对物体的最小分辨。
2、探针的大小对系统分辨率的影响。在近场光学显微镜中,探针的大小是决定系统分辨率的又一重要原因。图4是不同探针大小时的扫描光强曲线。计算过程中,两样品小球间的距离为40nm,即δ=20nm。探针的Z坐标值取为Z=Rc+2r+5nm,这样可使探针小球的最下端与样品小球的最上端的最短距离始终为5nm。可以画出探针沿X-轴方向扫描过程中探针小球所探测的归一化最大光强Imax与中心光强I0(X=0处的光强)的差随探针大小的变化曲线,见图5。从图中可以看出,当探针小球的半径增大时,所探测的光强差值与最大值的比值将随之减小,这说明随着探针尺寸的增大,系统分辨率将下降。
3、探针与样品间的距离对系统分辨率的影响。图6是对应于不同的Z值的扫描曲线(固定δ=20nm)。很明显地看出Z=45nm时系统已难于分辨出这两个小球。探针小球处的光强随Z值的增大也迅速减小。这说明系统的分辨率将随探针与样品间距离的增大而下降。所以在近场光学显微镜中扫描样品时应尽可能地接近样品表面,这样可以提高系统的分辨率,也能增大探针探测到的光强。
根据上述一系列数值模拟计算和实验结果,我们获得了近场扫描显微术分辨率的概念。它的横向空间分辨率与多种因素有关,例如它随着探针尺度的减小,探针和被测样品表面距离的减小而增加;又随着被测样品表面微结构起伏距离的增大而减小;考虑到入射光的相干性,该分辨率也会随着照明光束的波长变化和带宽的变化而变化;另外它强烈的依赖于照明光的偏振方向。从波动成像的观点,在以P-偏振光的照明或激发下,我们总结出下述分辨率的判断式:
δmin=0.4(rsph.zv)/[
δexp(r/
δ-1)] (1)
这里的rsph是探针小球的半径,zv,是从探针小球中心至样品表面的垂直距离。
δ是初估样品表面微结构起伏之间横向距离之半的统计平均值,或是待测样品半径的统计平均值。
该判断式成立的条件是探针尖的尺寸不能大于被测表面起伏的粒度尺寸,因为假如探针尖的尺度大于被测样品的尺度,则将测量不出样品的尺度,所以这种假设是合理的。根据式1可知对于一个探针小球半径为10纳米,它到样品表面垂直距离为35纳米,而样品表面粗糙度平均值为2
δ=20纳米时,可分辨的最小距离为28纳米,即为探针小球直径的1.4倍。从我们的数值计算的结果可知,在这个数据条件下我们从图3可以查到。此时系统可分辨的最小距离为探针小球直径的1.4倍。
表1给出了利用式(1)给出的不同情况下的分辨率预测。这些结果与计算模拟结果和实验结果相符合。
表1、近场光学扫描显微术的探针尖尺寸的选择对于分辨率的影响
r(nm) | δ(nm) | Zv(nm) | δmin(nm) |
6 | 10 | 35 | 12.54 |
7 | 10 | 35 | 13.24 |
8 | 10 | 35 | 13.83 |
9 | 10 | 35 | 14.00 |
10 | 10 | 35 | 14.00 |
表2、近场光学扫描显微术中探针尖与被测表面距离对分辨率的影响
r(nm) | δ(nm) | Zv(nm) | Smin(nm) |
10 | 10 | 20 | 8 |
10 | 10 | 30 | 12 |
10 | 10 | 40 | 16 |
10 | 10 | 50 | 20 |
表3、近场光学扫描显微术中被测表面起伏距离的变化对分辨率的影响
r(nm) | δ(nm) | Zv(nm) | Smin(nm) |
10 | 10 | 35 | 14.01 |
10 | 15 | 35 | 13.07 |
10 | 20 | 35 | 11.53 |
10 | 25 | 35 | 10.20 |
根据上述数据,可以预算出在近场光学显微术中为得到最佳分辨率选择的最佳参数匹配。第二在已知近场光学显微镜参数的情况下,可以预测系统的分辨率。第三可以预测在改变任何参数时,对于分辨率大体上的影响。总之,这些数据揭示了近场光学设计的内在规律。
第二发明点:根据上述表中的数据可以看出,根据判断式可以设计最优化的新系统。下面将根据生物微结构探测的难题,据此给出两种可用于生物微结构探测的全内反射式近场扫描光学显微镜。该显微镜可望能解决或进一步开拓近场扫描显微镜在生物领域的应用问题。
第一种类型:这是一种全内反射近场扫描显微镜,它的反馈控制可以借助于STM或AFM模式,也可以直接借助于光学反馈模式。其入射光产生全内反射的方式可以选择梯形或棱镜,也可以选择物镜直接照明。这里的发明点主要是在光纤尖旁边系缚上一个荧光染料大分子,或者一种生物酶,或者量子点(图7)。这种探针分子的尺寸选择得越小越好。工作距离在10纳米左右,或者小于10纳米。这样可以对生物探测获得最有效的空间分辨率。
第二种类型:在光纤探针上直接粘接上大分子染料或量子点(图8)。这样不仅保证了探针的小尺度,而且保证了信号强度。因为在近场隐失波的刺激下,荧光染料可以发射比从样品表面反射回来的光还要强的荧光信号,从而降低了背景,保证了信噪比。这种探针对于生物单分子探测具有特别重要的意义。
这些设计所达到的成像分辨率效果从上述列表中可以得知。另外它们的直接好处是提高了样品反射光的强度,降低了背景噪音,提高了图像的信噪比。
附图说明
图1内全反射照明近场光学显微镜示意图。
其中:①-探针小球,②-样品小球,③-样品表面。C:(X,0,-Z),A:(-δ,0,-r),B:(δ,0,-r)分别为它们的坐标。
图2是不同的δ值时,探针沿X方向扫描光强变化曲线,
其中:(a)δ=10nm;(b)δ=20nm;(c)δ=30nm;(d)δ=50nm。2δ为样品小球间的距离。
图3是相对强度I0/Imax随样品小球之间距离δ的变化曲线。
图4是探针与样品间距离变化时探针沿X方向扫描的光强变化曲线.
(a)Z=35nm (b)Z=40nm (c)Z=45nm (d)Z=50nm。
图5为不同尺寸的探针对应相对光强的分布曲线。
图6为探针尖尺度的变化对横向分辨率的影响。
其中:(a)Rn=8nm;(b)Rn=10nm;(c)Rn=15nm;(d)Rn=20nm在x-方向扫描时的情况。
图7为本发明生物全内反射式近场扫描显微镜实施例1的光路结构示意图。
图8为本发明生物全内反射式近场扫描显微镜实施例2的光路结构示意图。
其中:1-激光,2-光学系统,3-上面有样品的梯形棱镜,4-光纤探针,5-STM或AFM探针的驱动扫描部分,6-荧光染料分子,7-光学成像系统,8-第一光电探头,9-反馈控制线,10-第二光电探头,11-数据传输线,12-计算机。
具体实施方式
请参阅图7和图8,图7和图8分别示出本发明用于生物微结构探测的生物全内反射式近场扫描显微镜实施例1和实施例2的光路图。由图可见,本发明生物全内反射式近场扫描显微镜,构成分为四部分:第一部分是激发部分,由激光器1、准直和反射镜组成光学系统2构成;第二部分是产生隐失波部分,由倒梯形棱镜3及其顶面附着的待测样品构成;第三部分是信息的采集、存储和处理部分,由光纤探针4、驱动扫描部分5和光电探头10以及计算机12构成;第四部分是光纤探针4高度控制部分,由光学信息收集部分7和光电探测器8及反馈控制线9组成,其特征在于所述的光纤探针4的针尖端一旁粘附一荧光染料大分子6。如图7所示。
所述的光纤探针4的针尖端粘附荧光染料大分子6。如图8所示。
所述的光纤探针4的针尖端一旁粘附的是一种生物酶,或量子点。
所述的光纤探针4的针尖端粘附的是一种生物酶,或量子点。
所述的待测样品是附着在一倒置的球面透镜的顶面。
图7和图8分别示出利用梯形棱镜造成全内反射光路图,可以利用扫描电子隧道显微镜(STM)或原子力显微镜(AFM)方式控制扫描反馈。
本发明使用的具体操作过程:
第一步首先将染料分子6系在光纤探针4的针尖末端一旁,使光纤端尽量接近荧光染料大分子6;
第二步使激光器1发出的激光通过光学系统2,从倒置的梯形棱镜3一边入射,在梯形棱镜3上面放置样品,入射光在从棱镜3进入到样品时形成全内反射式,产生隐失波;
第三步被样品6反射的隐失光照在染料大分子6上或与被测样品接触的生物酶大分子上会激发荧光;
第四步通过驱动器5的三维扫描,由位于样品上方的光纤探针4收集该荧光,并传送到第二光电探头10,被转变为数字信号;
第五步该数字信号传输到计算机12内存中,被计算机12存储和处理。
图7与图8的区别在于图7中染料或酶的大分子是系在光纤探针4头旁的,这是因为某些酶蛋白在与特定生物组织接触并有激发光照射时才会激发出荧光。这与染料大分子它与生物组织接触时,才会发出荧光的道理是一样的,只不过他们都有自己的特异性。而图8的染料或酶的大分子是粘接在光纤探针4的端面,与样品是不接触的。其生物信息发射的微弱的隐失波场光照射在它上面会激发出荧光,增加信号强度。增加图像的反衬度。
本发明的生物全内反射式近场扫描显微镜,采用P-偏振照明。与普通近场扫描光学显微镜相比较,主要的区别在探针设计和采样方式上。具体而言,若直接采用图8中的模式,分子探针尺度为10纳米,处于样品表面上20纳米处,假如被测表面起伏的统计值为10纳米的话,则该系统在P偏振光照明下,其横向空间分辨率近似为16纳米。
目前GFP绿色蛋白染料尺度大约为4纳米左右,它是一种常用染料大分子。利用图8的工作方式,其空间横向分辨率将为3.2纳米。但是已经有人发现了一些生物酶与其他生物物质接触时在激发光存在时,可以使接触物发射多个荧光光子。这些生物酶的尺度只有GFP二十分之一。可想而知,若利用这些生物分子为探针,可大大提高近场光学扫描显微镜的空间横向分辨率。
例如,把大肠干菌中的半乳糖苷酸酶粘接在近场光学探针上,可以探测阻截物在DNA上的时间。酶的催化效率高,荧光效率高,主要是尺寸小,又容易与光钎等粘接。这样的生物酶探针对于探测单分子生物信息有着特殊的作用。
本发明通过模拟计算总结了近场扫描光学显微镜的成像规律,给出了一种简明的空间分辨率表达式。通过该公式可以设计最佳参数的近场扫描光学显微镜。例如,从表达式预测结果来看,探针的尺寸越小越好。采用生物大分子作为探针或辅助探针,不仅可以保证尺度小,而且生物分子之间的键合可以保证它有一定的坚固性。此发明是可行的。例如在本发明技术效果各种表格中所给出的数据,都说明了在不同的显微镜参数下,可以获得的空间横向分辨率。这种利用本发明总结表达式来设计和评估的工作量,相对于做相关的实验和理论模拟计算而言,是大大减小了。第三根据本发明的分辨率表达式所设计发明的生物上用的荧光全内反射显微镜具有良好的应用前景和重要的现实意义。
Claims (5)
1、一种生物全内反射式近场扫描显微镜,四部分构成:第一部分是激发部分,由激光器(1)、准直和反射镜组成光学系统(2)构成;第二部分是产生隐失波部分,由倒梯形棱镜(3)及其顶面附着的待测样品构成;第三部分是信息的采集、存储和处理,由光纤探针(4)、驱动扫描部分(5)和第二光电探头(10)以及计算机(12)构成;第四部分是光纤探针(4)高度控制,由光学信息收集部分(7)和第一光电探测头(8)及反馈控制线(9)组成,其特征在于所述的光纤探针(4)的针尖端一旁粘附一荧光染料大分子(6)。
2、根据权利要求1所述的生物全内反射式近场扫描显微镜,其特征在于所述的光纤探针(4)的针尖端粘附荧光染料大分子(6)。
3、根据权利要求1所述的生物全内反射式近场扫描显微镜,其特征在于所述的光纤探针(4)的针尖端一旁粘附的是一种生物酶,或量子点。
4、根据权利要求2所述的生物全内反射式近场扫描显微镜,其特征在于所述的光纤探针(4)的针尖端粘附的是一种生物酶,或量子点。
5、根据权利要求1-4任一项所述的生物全内反射式近场扫描显微镜,其特征在于所述的待测样品是附着在一倒置的球面透镜的顶面。
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