CN1570108A - 鼠源epor胞外区与人源nok胞内区嵌合受体及编码基因与应用 - Google Patents

鼠源epor胞外区与人源nok胞内区嵌合受体及编码基因与应用 Download PDF

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本发明的公开了一种鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体及编码基因与应用，其目的是提供一种鼠源EPOR(红细胞生成素受体)胞外区与人源NOK(带激酶功能域的新型癌基因)胞内区嵌合受体及编码基因与可表达该受体的细胞系。本发明所提供的鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体，是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体稳定表达细胞系BaF3－EPOR/NOK CGMCC№1144可作为细胞水平的模型工具用于筛选抗肿瘤生成与转移药物。

Description

鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体及编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体及编码基因与应用，特别涉及一种鼠源EPOR(红细胞生成素受体)胞外区与人源NOK(带激酶功能域的新型癌基因)胞内区嵌合受体及编码基因与可表达该受体的细胞系。
背景技术
蛋白酪氨酸激酶受体(PTKR)在各种细胞调控水平及肌体不同发育阶段中起着重要作用，比如参与细胞的增殖、分化及抗凋亡等过程。典型的PTKR结构表现为细胞脂质双分子层上的单跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区及胞内区。胞外区具有相应配体的特异性识别位点，在结合配体过程中起重要作用。胞内区含有酪氨酸激酶功能域，参与胞内的信号转导及受体、衔接蛋白的磷酸化过程，特别是有丝分裂原的信号转导。PTKR在细胞内的异常表达常会导致遗传疾病及肿瘤。因此，PTKR蛋白的表达在肌体内受到严格调控。目前为止，至少有18种PTKR与肿瘤转化有关，可作为癌基因。重要的实例包括：成纤维生长因子受体(FGFR)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板来源的生长因子受体(PDGFR)、胰岛素受体(InsR)和肝细胞生长因子受体(Met)等。
研究显示部分PTKR异常剪接变异体与肿瘤的发生相关。比如从人骨肉瘤及乳腺癌细胞可分离到缺少全部跨膜区的可溶性FGFR3分子。而在胃癌细胞中，一种符合蛋白编码的49氨基酸的缺失可导致Ron酪氨酸受体的组成性激活。最近从脑垂体肿瘤中人们分离到一种新型FGFR4剪接变异体，被称做ptd-FGFR4。这种剪接变异体缺少几乎全部的FGFR4受体胞外区，并且不包含信号肽，导致该成熟蛋白仅在胞浆表达。过量表达ptd-FGFR4可导致细胞转化。通过转基因方式在小鼠体内进行组织特异性表达可形成垂体瘤。另外，利用N端和C端特异性抗体，人们发现部分恶性肌骨骼瘤临床病人样品中也有N端缺失的Met受体表达。
红细胞生成素(EPO)及其受体(EPOR)在正常的骨髓红系祖细胞的增殖与分化过程中起关键作用。EPOR是一个典型的I类细胞因子受体超家族成员。这类分子胞外区的氨基端通常有四个半胱氨酸残基，而胞外区的的羧基端近跨膜区位置通常有一个色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基序(WSXWS motif)。该基序在特异性配体识别过程中起重要作用。该类受体胞内区近跨膜区常有保守的脯氨酸富含功能域，简称为Box1，而远跨膜区位置常有不保守的Box2功能域。EPOR的活化通常需要形成同源二聚体，并通过Boxl和Box2激活胞浆内的衔接蛋白如JAK2等，使STAT5等转录因子磷酸化，作用于靶基因启动子从而调控下游基因的表达。目前，人们在研究新型细胞因子受体的功能过程中，常把EPOR的胞外区与新型受体的胞内区进行融合。该嵌合受体的优势在于可以利用EPO配体及其受体的特异性作用来研究未知受体胞内的功能，特别是嵌合受体的活化可以激活哪些胞内信号通路。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体及其编码基因。
鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体名称为EPOR/NOK，它是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID№：2衍生的蛋白质。
序列表中SEQ ID №：2的蛋白质由650个氨基酸残基组成。在实际应用中，为了便于检测，其羧基端还带有FLAG标签，该带FLAG标签的EPOR/NOK的氨基酸序列如序列表中的序列4所示，序列4由658个氨基酸残基组成，自氨基端第651位-658位氨基酸残基为FLAG标签。
鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体EPOR/NOK编码基因，具有下列核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №：1由1953个碱基组成，其开放阅读框架为自5′端第1位-1953位碱基；自5′端第1位-750位碱基为鼠源EPOR胞外区编码序列；自5′端第751位-758位碱基为外源NotI酶切位点；自5′端第759位-1950位碱基为NOK基因跨膜区和胞内区的编码序列。
其中，人源带激酶功能域的新型癌基因NOK基因( Novel  Oncogene withKinase-domain，NOK)是由本发明人克隆得到的新基因，它是具有序列表中序列5所示的DNA序列。序列5由1269个碱基组成，其开放阅读框架为自5′端第1位-1269位碱基。
在实际应用中，为了便于检测，在其3′端还带有FLAG标签的编码基因，该带FLAG标签的编码基因的核苷酸序列如序列表中的序列3所示，序列3由1977个碱基组成，自5′端第1951位-1977位碱基为FLAG标签的编码基因。
含有鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体EPOR/NOK编码基因的载体和细胞系，如pcDNA3(EPOR/NOK-H)和于2004年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)、保藏号为CGMCC №1144的BaF3-EPOR/NOK细胞系，均属于本发明的保护范围。
实验证明，EPOR/NOK基因在BaF3细胞稳定表达导致该细胞发生转化，使BaF3细胞由白细胞介素3(IL-3)依赖性转化为非依赖性；EPOR/NOK稳定表达细胞系BaF3-EPOR/NOK皮下接种裸鼠后，可导致接种部位肿瘤生成及远处脏器转移，表现为恶性肿瘤特点。BaF3-EPOR/NOK接种裸鼠可作为研究肿瘤发生与转移机制，以及筛选抗肿瘤生成与转移药物的模型动物。BaF3-EPOR/NOK可作为细胞水平的模型工具用于筛选抗肿瘤生成与转移药物，将在抗肿瘤药物筛选及抗肿瘤药物的药效检测中发挥重要作用。
附图说明
图1为从扁桃体肿瘤总RNA中经RT-PCR扩增得到的NOK基因产物
图2为DAS跨膜区预测软件分析EPOR/NOK嵌合受体
图3为EPOR/NOK蛋白酪氨酸激酶功能域分析结果
图4为用鼠源FLAG抗体检测BaF3-p3及BaF3-EPOR/NOK稳定细胞中EPOR/NOK蛋白的表达
图5为在饥饿条件下BaF3-EPOR/NOK的增殖曲线
图6为BaF3-EPOR/NOK细胞在没有血清及WEHI-3B的半固体培养基中形成集落的照片
图7为BaF3-EPOR/NOK皮下接种裸鼠成瘤照片
图8BaF3-EPOR/NOK皮下接种裸鼠后，肿瘤细胞远处脏器转移的HE染色结果示意图
具体实施方式
实施例1、EPOR/NOK编码基因的获得
用引物5′-TATAGCGATATCATGGACAAACTCAGGGTGCC-3′和5′-TATAGCGCGGCCGCGAGAGGGTCCAGGTCGCTA-3′，以pMX-EPOR(pBabe-EPO-R)为模板(PNAS，Vol.93，p8324-8328，August 1996)，在如下的反应体系：50ng模板DNA，100pmol每种引物，1×扩增缓冲液，200μmol/L每种dNTP，1单位高保真Taq酶；循环程序下：94℃5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，35个循环，72℃10分钟延伸，扩增鼠红细胞生成素受体(EPOR)胞外区，将得到的片段利用EcoRV和NotI亚克隆到pcDNA3(购自Invitrogen公司)的EcoRV和NotI位点之间，得到质粒pcDNA3(EPOR)。
NOK全长cDNA从人扁桃体肿瘤总RNA中经RT-PCR获得，具体步骤如下：按常规方法提取人扁桃体肿瘤总RNA，然后以5′-TATAAAGCTTATGGGCATGATGACACGGATGCT-3′和5′-TATACTCGAG TCAGGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGTAAAGCATGCTATAGTTGTA-3′为引物(下划线为HA表达标签)，反应条件按照一步法RT-PCR的使用说明进行(Takara)，得到的PCR产物(图1)纯化后直接亚克隆到T载体(购自Promega公司)，酶切鉴定后再进行测序。将测序过的RT-PCR产物经HindIII和XhoI双酶切后亚克隆到pcDNA3(购自Invitrogen公司)上，构成pcDNA3(NOK-H)表达质粒。
以引物5′-TATAGCGGCCGCAGTGATTATCGTCCCAACTTT-3′和
5′-TATACCAGTGTGCTGGTCACTTGTCA TCGTCGTCCTTGTAGTCAAGCATGCTATAGTTGTAGA-3′以pcDNA3(NOK-H)为模板，在如下的反应体系：50ng模板DNA，100pmol每种引物，1×扩增缓冲液，200μmol/L每种dNTP，1单位高保真Taq酶；和循环程序下：94℃5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，35个循环，72℃10分钟延伸，扩增人NOK-H跨膜区及胞内区，将得到的片段利用NotI和BstXI亚克隆到pcDNA3(EPOR)的NotI和BstXI位点之间，筛选得到完整的融合基因表达载体pcDNA3(EPOR/NOK-H)，测序表明该融合基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。该融合基因C末端携带FLAG标签(序列表中序列3)，可被鼠M2抗体识别。
EPOR/NOK是具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质，DAS跨膜预测软件分析EPOR/NOK是单一跨膜分子，跨膜区位于自氨基端第249-277氨基酸残基(图2)。EPOR/NOK具有典型的酪氨酸激酶功能域(自氨基端第333-600氨基酸残基)(图3)
实施例2、BaF3-EPOR/NOK稳定细胞系的构建
离心收取1×106野生型BaF3细胞，重悬于0.5ml无血清RPMI-1640培养液。将3μg实施例1中得到的pcDNA3(EPOR/NOK-H)与BaF3细胞混合，冰浴10分钟后，用ECM399(BTX公司)电转仪进行电转。电转条件为200-230V，电流为25-35毫秒。电转染后的细胞在RPMI-1640全培养基中生长。在G418的筛选下获得稳定外源基因的表达。由于质粒pcDNA3携带新酶素抗性基因，稳定细胞在500μg/ml G418下进行筛选。每三天换一次液，连续培养三周后，在100mm培养皿中进行扩增，得到细胞系BaF3-EPOR/NOK CGMCC №1144。
实施例3、检测BaF3-EPOR/NOK稳定细胞系EPOR/NOK基因的表达
由于EPOR/NOK基因的羧基端融合了一个FLAG标签，阳性细胞克隆可通过蛋白印记杂交(Western Blot)进行检测。等蛋白量的BaF3-EPOR/NOK及BaF3-P3(pcDNA3.0空载体稳定转染的BaF3)对照的细胞裂解液经10％SDS/PAGE分离后转到硝酸纤维素膜上。以鼠源抗FLAG标签的单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)为一抗进行杂交，以荧光素标记的羊源抗鼠抗体(Amersham Biosciences UK Limited)为二抗，最后用ECL化学发光的底物进行杂交信号放大，结果如图4所示，表明细胞系BaF3-EPOR/NOK有特异性EPOR/NOK蛋白表达，分子量约为68kD。
实施例4、EPOR/NOK基因使BaF3细胞由白细胞介素3(IL-3)依赖性转化为非依赖性
BaF3细胞为小鼠前B细胞，需要有白细胞介素3的刺激下才能增殖。在没有血清及没有WEHI-3B的RPMI-1640(掺入的3H胸腺嘧啶脱氧核苷)培养液中在37℃培养3天，[3H]掺入检测细胞增殖结果如图5所示，表明在没有血清及没有WEHI-3B的RPMI-1640培养液中，BaF3-EPOR/NOK可显著增殖3天以上，而BaF3-P3(pcDNA3.0空载体稳定转染的BaF3)对照由于需要IL-3的刺激，因而细胞几乎没有增殖。说明在BaF3细胞中稳定表达EPOR/NOK基因，可以使BaF3-EPOR/NOK在没有WEHI-3B条件培养液(提供IL-3)的情况下也可以增殖。
实施例5、BaF3-EPOR/NOK在‘饥饿’培养条件下具有锚定非依赖增长的特性
稳定细胞在半固体培养基中的生长是检测细胞转化特性的依据之一。将BaF3-EPOR/NOK细胞以1×105个细胞/ml培养基的浓度悬浮在60mm培养皿盛装的0.4％琼脂糖培养基中，铺在0.8％的琼脂糖培养基之上。琼脂糖培养基用RPMI-1640培养液制备，其中含有5％FBS及400μg/ml G418。以pcDNA3.0空载体稳定转染的BaF3(BaF3-p3)为阴性对照。在没有血清及没有WEHI-3B上清的条件下，置于含5％二氧化碳的37℃孵箱中培养。三周后，用倒置显微镜计算直径大于0.1mm的细胞集落数，结果如图6所示，表明BaF3-EPOR/NOK在‘饥饿’培养条件下有明显的集落生成。统计结果如表1所示，表明在BaF3细胞中稳定表达EPOR/NOK，可使BaF3细胞的增殖特性发生改变，具有肿瘤细胞的特点。
表1、BaF3稳定细胞系在半固体琼脂糖培养基中的集落生成试验
BaF3细胞系        细胞数        集落数(标准差)
BaF3-p3           1×105       0(0)
BaF3-EPOR/NOK     1×105       102(10)
注：集落数为三次平行实验的平均值±标准差
实施例6、BaF3-EPOR/NOK细胞具有肿瘤生成特性，皮下接种裸鼠可导致恶性肿瘤生成
体内成瘤实验的具体步骤是，将1×107BaF3-EPOR/NOK稳定细胞系皮下注射4-6周去胸腺Balb-c裸鼠，注射部位是裸鼠右前臂腋下皮肤。以稳定表达pcDNA3.0空载体的BaF3细胞(BaF3-p3)为阴性对照。每一种细胞注射六只裸鼠。每一实验组包括三只雌鼠(F1、F2、F3)及三只雄鼠(M1、M2、M3)。注射BaF3-EPOR/NOK细胞7-10天后可见接种部位皮下有明显肿瘤形成(图7)。对照组与试验组接种三周后的成瘤情况如图7所示。接种BaF3-EPOR/NOK细胞一个月后小鼠全身出现衰竭，行动迟缓，35-40天死亡。BaF3-EPOR/NOK细胞在裸鼠体内呈现恶性肿瘤生长趋势，在注射部位骨骼肌成侵润性生长，肝脏及脾脏明显增大，并导致远处脏器如肝脏、脾脏、肾脏和肺脏转移(图8及表2)。图8中，箭头指示为肿瘤转移灶。
表2、BaF3-NOK在裸鼠肿瘤生成情况
细胞系   性别  细胞数    时间(天)鼠名     肿瘤(克) 肝脏(克) 脾脏(克)
BaF3-p3  M     1.0×107 28      M-1      -        1.66     0.10M-2      -        1.37     0.12M-3      -        1.45     0.08F     1.0×107 28      F-1      -        1.24     0.10F-2      -        0.95     0.05F-3      -        1.11     0.08Averagea-        1.30     0.09±0.25   ±0.02BaF3-   M      1.0×107 28      M-1      1.81     2.00     0.20EPOR/NOK                         M-2      1.16     1.84     0.31M-3      2.55     2.79     0.27F      1.0×107 28      F-1      1.64     1.22     0.12F-2      1.20     1.21     0.10 F-31.49  1.55  0.19Averagea1.64     1.77     0.20±0.51   ±0.59   ±0.08
a代表裸鼠的平均值±标准差
                       序列表
<160>5
<210>1
<211>1953
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
atggacaaac tcagggtgcc cctctggcct cgggtaggcc ccctctgtct cctacttgct  60
ggggcagcct gggcaccttc acccagcctc ccggacccca agtttgagag caaagcggcc  120
ctgctggcat cccggggctc cgaagaactt ctgtgcttca cccaacgctt ggaagacttg  180
gtgtgtttct gggaggaagc ggcgagctcc gggatggact tcaactacag cttctcatac  240
cagctcgagg gtgagtcacg aaagtcatgt agcctgcacc aggctcccac cgtccgcggc  300
tccgtgcgtt tctggtgttc actgccaaca gcggacacat cgagttttgt gccgctggag  360
ctgcaggtga cggaggcgtc cggttctcct cgctatcacc gcatcatcca tatcaatgaa  420
gtagtgctcc tggacgcccc cgcggggctg ctggcgcgcc gggcagaaga gggcagccac  480
gtggtgctgc gctggctgcc acctcctgga gcacctatga ccacccacat ccgatatgaa  540
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ttacaagtac cagagttggt ggtacctgaa ctgtatgcag ctgtggccgg catcagagtg  1920
gagagcctct tctacaacta tagcatgctt tga                               1953
<210>2
<211>650
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Met Asp Lys Leu Arg Val Pro Leu Trp Pro Arg Val Gly Pro Leu Cys
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asp
            20                  25                  30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
    50                  55                  60
Glu Glu Ala Ala Ser Ser Gly Met Asp Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Gln Leu Glu Gly Glu Ser Arg Lys Ser Cys Ser Leu His Gln Ala Pro
                85                  90                  95
Thr Val Arg Gly Ser Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp
            100                 105                 110
Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Gln Val Thr Glu Ala Ser Gly
        115                 120                 125
Ser Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu
    130                 135                 140
Asp Ala Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Glu Glu Gly Ser His
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Met Thr Thr His
                165                 170                 175
Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Arg Ala Gly Gly Thr
            180                 185                 190
Gln Arg Val Glu Val Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn
        195                 200                 205
Leu Arg Gly Gly Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala
    210                 215                 220
Glu Pro Ser Phe Ser Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser
225                 230                 235                 240
Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ala Ala Ala Val Ile Ile
                245                 250                 255
Val Pro Thr Leu Leu Val Thr Ile Phe Leu Ile Leu Leu Gly Val Ile
            260                 265                 270
Leu Trp Leu Phe Ile Arg Glu Gln Arg Thr Gln Gln Gln Arg Ser Gly
        275                 280                 285
Pro Gln Gly Ile Ala Pro Val Pro Pro Pro Arg Asp Leu Ser Trp Glu
    290                 295                 300
Ala Gly His Gly Gly Asn Val Ala Leu Pro Leu Lys Glu Thr Ser Val
305                 310                 315                 320
Glu Asn Phe Leu Gly Ala Thr Thr Pro Ala Leu Ala Lys Leu Gln Val
                325                 330                 335
Pro Arg Glu Gln Leu Ser Glu Val Leu Glu Gln Ile Cys Ser Gly Ser
            340                 345                 350
Cys Gly Pro Ile Phe Arg Ala Asn Met Asn Thr Gly Asp Pro Ser Lys
        355                 360                 365
Pro Lys Ser Val Ile Leu Lys Ala Leu Lys Glu Pro Ala Gly Leu His
    370                 375                 380
Glu Val Gln Asp Phe Leu Gly Arg Ile Gln Phe His Gln Tyr Leu Gly
385                 390                 395                 400
Lys His Lys Asn Leu Val Gln Leu Glu Gly Cys Cys Thr Glu Lys Leu
                405                 410                 415
Pro Leu Tyr Val Val Leu Glu Asp Val Ala Gln Gly Asp Leu Leu Ser
            420                 425                 430
Phe Leu Trp Thr Cys Arg Arg Asp Val Met Thr Met Asp Gly Leu Leu
        435                 440                 445
Tyr Asp Leu Thr Glu Lys Gln Val Tyr His Ile Gly Lys Gln Val Leu
    450                 455                 460
Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gln Glu Lys His Leu Phe His Gly Asp Val
465                 470                 475                 480
Ala Ala Arg Asn Ile Leu Met Gln Ser Asp Leu Thr Ala Lys Leu Cys
                485                 490                 495
Gly Leu Gly Leu Ala Tyr Glu Val Tyr Thr Arg Gly Ala Ile Ser Ser
            500                 505                 510
Thr Gln Thr Ile Pro Leu Lys Trp Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Leu
        515                 520                 525
Arg Pro Ala Arg Ile Arg Ala Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu
    530                 535                 540
Tyr Glu Met Val Thr Leu Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Glu Val Pro Pro
545                 550                 555                 560
Thr Ser Ile Leu Glu His Leu Gln Arg Arg Lys Ile Met Lys Arg Pro
                565                 570                 575
Ser Ser Cys Thr His Thr Met Tyr Ser Ile Met Lys Ser Cys Trp Arg
            580                 585                 590
Trp Arg Glu Ala Asp Arg Pro Ser Pro Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu
        595                 600                 605
Glu Ala Ala Ile Lys Thr Ala Asp Asp Glu Ala Val Leu Gln Val Pro
    610                 615                 620
Glu Leu Val Val Pro Glu Leu Tyr Ala Ala Val Ala Gly Ile Arg Val
625                 630                 635                 640
Glu Ser Leu Phe Tyr Asn Tyr Ser Met Leu
                645                 650
<210>3
<211>1977
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
atggacaaac tcagggtgcc cctctggcct cgggtaggcc ccctctgtct cctacttgct    60
ggggcagcct gggcaccttc acccagcctc ccggacccca agtttgagag caaagcggcc    120
ctgctggcat cccggggctc cgaagaactt ctgtgcttea cccaacgctt ggaagacttg    180
gtgtgtttct gggaggaagc ggcgagctcc gggatggact tcaactacag cttctcatac    240
cagetcgagg gtgagtcacg aaagtcatgt agcctgcacc aggctcccac cgtccgcggc    300
tccgtgcgtt tctggtgttc actgccaaca gcggacacat cgagttttgt gccgctggag    360
ctgcaggtga cggaggcgtc cggttctcct cgctatcacc gcatcatcca tatcaatgaa  420
gtagtgctcc tggacgcccc cgcggggctg ctggcgcgcc gggcagaaga gggcagccac  480
gtggtgctgc gctggctgcc acctcctgga gcacctatga ccacccacat ccgatatgaa  540
gtggacgtgt cggcaggcaa ccgggcagga gggacacaaa gggtggaggt cctggaaggc  600
cgcactgagt gtgttctgag caacctgcgg ggcgggacgc gctacacctt cgctgttcga  660
gcgcgcatgg ccgagccgag cttcagcgga ttctggagtg cctggtctga gcccgcgtca  720
ctactgaccg ctagcgacct ggaccctctc gcggccgcag tgattatcgt cccaactttg  780
ttggttacta tcttcctcat ccttcttggg gtcatcctgt ggctttttat cagagaacaa  840
agaactcaac agcagcgttc tggacctcaa ggcattgccc ctgttcctcc acctagggac  900
ctaagctggg aagcaggaca tggaggaaat gtggctttgc cacttaagga gacatccgtg  960
gaaaactttc tgggagctac cacacctgcc ctggctaagc tgcaggtgcc gcgggagcaa  1020
ctctctgaag ttctggagca gatttgcagc ggtagctgtg ggcccatctt tcgagccaat  1080
atgaacactg gggacccttc taagcccaag agtgttattc tcaaggcttt aaaagaacca  1140
gctgggctcc atgaggtaca agatttctta gggcgaatcc aattccatca atacctgggg  1200
aaacacaaaa acctggtgca gctggaaggc tgctgcactg aaaagctgcc actctatgtg  1260
gtgttggagg atgtggccca gggggacctg cttagctttc tctggacctg tcggcgggat  1320
gtgatgacta tggatggtct tctctatgat ctcacagaaa aacaagtata tcacatcgga  1380
aagcaggtcc ttttggcgct ggaattcctg caggagaagc atttgttcca tggggatgtg  1440
gcagccagga atattctgat gcaaagtgat ctcactgcta agctctgtgg attaggcctg  1500
gcttatgaag tttacacccg aggggccatc tcctctactc aaaccatacc tctcaagtgg  1560
cttgccccag aacggcttct cctgagacct gctcgcatca gagcagatgt ctggtctttt  1620
gggatcctgc tctatgagat ggtgactcta ggagcaccac cgtatcctga agtccctcct  1680
accagcatcc tagagcatct ccaaagaagg aaaatcatga agagacccag tagctgcaca  1740
cataccatgt acagtatcat gaagtcctgc tggcgctggc gtgaggctga ccgcccctca  1800
cctagagagc tgcgcttgcg cctagaagct gccattaaaa ctgcagatga cgaggctgtg  1860
ttacaagtac cagagttggt ggtacctgaa ctgtatgcag ctgtggccgg catcagagtg  1920
gagagcctct tctacaacta tagcatgctt gactacaagg acgacgatga caagtga     1977
<210>4
<211>658
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
Met Asp Lys Leu Arg Val Pro Leu Trp Pro Arg Val Gly Pro Leu Cys
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asp
            20                  25                  30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
    50                  55                  60
Glu Glu Ala Ala Ser Ser Gly Met Asp Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Gln Leu Glu Gly Glu Ser Arg Lys Ser Cys Ser Leu His Gln Ala Pro
                85                  90                  95
Thr Val Arg Gly Ser Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp
            100                 105                 110
Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Gln Val Thr Glu Ala Ser Gly
        115                 120                 125
Ser Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu
    130                 135                 140
Asp Ala Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Glu Glu Gly Ser His
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Met Thr Thr His
                165                 170                 175
Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Arg Ala Gly Gly Thr
            180                 185                 190
Gln Arg Val Glu Val Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn
        195                 200                 205
Leu Arg Gly Gly Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala
    210                 215                 220
Glu Pro Ser Phe Ser Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser
225                 230                 235                 240
Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ala Ala Ala Val Ile Ile
                245                 250                 255
Val Pro Thr Leu Leu Val Thr Ile Phe Leu Ile Leu Leu Gly Val Ile
            260                 265                 270
Leu Trp Leu Phe Ile Arg Glu Gln Arg Thr Gln Gln Gln Arg Ser Gly
        275                 280                 285
Pro Gln Gly Ile Ala Pro Val Pro Pro Pro Arg Asp Leu Ser Trp Glu
    290                 295                 300
Ala Gly His Gly Gly Asn Val Ala Leu Pro Leu Lys Glu Thr Ser Val
305                 310                 315                 320
Glu Asn Phe Leu Gly Ala Thr Thr Pro Ala Leu Ala Lys Leu Gln Val
                325                 330                 335
Pro Arg Glu Gln Leu Ser Glu Val Leu Glu Gln Ile Cys Ser Gly Ser
            340                 345                 350
Cys Gly Pro Ile Phe Arg Ala Asn Met Asn Thr Gly Asp Pro Ser Lys
        355                 360                 365
Pro Lys Ser Val Ile Leu Lys Ala Leu Lys Glu Pro Ala Gly Leu His
    370                 375                 380
Glu Val Gln Asp Phe Leu Gly Arg Ile Gln Phe His Gln Tyr Leu Gly
385                 390                 395                 400
Lys His Lys Asn Leu Val Gln Leu Glu Gly Cys Cys Thr Glu Lys Leu
                405                 410                 415
Pro Leu Tyr Val Val Leu Glu Asp Val Ala Gln Gly Asp Leu Leu Ser
            420                 425                 430
Phe Leu Trp Thr Cys Arg Arg Asp Val Met Thr Met Asp Gly Leu Leu
        435                 440                 445
Tyr Asp Leu Thr Glu Lys Gln Val Tyr His Ile Gly Lys Gln Val Leu
    450                 455                 460
Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gln Glu Lys His Leu Phe His Gly Asp Val
465                 470                 475                 480
Ala Ala Arg Asn Ile Leu Met Gln Ser Asp Leu Thr Ala Lys Leu Cys
                485                 490                 495
Gly Leu Gly Leu Ala Tyr Glu Val Tyr Thr Arg Gly Ala Ile Ser Ser
            500                 505                 510
Thr Gln Thr Ile Pro Leu Lys Trp Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Leu
        5l5                 520                 525
Arg Pro Ala Arg Ile Arg Ala Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu
    530                 535                 540
Tyr Glu Met Val Thr Leu Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Glu Val Pro Pro
545                 550                 555                 560
Thr Ser Ile Leu Glu His Leu Gln Arg Arg Lys Ile Met Lys Arg Pro
                565                 570                 575
Ser Ser Cys Thr His Thr Met Tyr Ser Ile Met Lys Ser Cys Trp Arg
            580                 585                 590
Trp Arg Glu Ala Asp Arg Pro Ser Pro Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu
        595                 600                 605
Glu Ala Ala Ile Lys Thr Ala Asp Asp Glu Ala Val Leu Gln Val Pro
    610                 615                 620
Glu Leu Val Val Pro Glu Leu Tyr Ala Ala Val Ala Gly Ile Arg Val
625                 630                 635                 640
Glu Ser Leu Phe Tyr Asn Tyr Ser Met Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
                645                 650                 655
Asp Lys
    658
<210>5
<211>1269
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
atgggcatga cacggatgct cctggaatgc agtctcagtg acaagttgtg tgtcatccag    60
gagaagcagt atgaagtgat tatcgtccca actttgttgg ttactatctt cctcatcctt    120
cttggggtca tcctgtggct ttttatcaga gaacaaagaa ctcaacagca gcgttctgga    180
cctcaaggca ttgcccctgt tcctccacct agggacctaa gctgggaagc aggacatgga    240
ggaaatgtgg ctttgccact taaggagaca tccgtggaaa actttctggg agctaccaca    300
cctgccctgg ctaagctgca ggtgccgcgg gagcaactct ctgaagttct ggagcagatt    360
tgcagcggta gctgtgggcc catctttcga gccaatatga acactgggga cccttctaag    420
cccaagagtg ttattctcaa ggctttaaaa gaaccagctg ggctccatga ggtacaagat    480
ttcttagggc gaatccaatt ccatcaatac ctggggaaac acaaaaacct ggtgcagctg    540
gaaggctgct gcactgaaaa gctgccactc tatgtggtgt tggaggatgt ggcccagggg    600
gacctgctta gctttctctg gacctgtcgg cgggatgtga tgactatgga tggtcttctc    660
tatgatctca cagaaaaaca agtatatcac atcggaaagc aggtcctttt ggcgctggaa    720
ttcctgcagg agaagcattt gttccatggg gatgtggcag ccaggaatat tctgatgcaa    780
agtgatctca ctgctaagct ctgtggatta ggcctggctt atgaagttta cacccgaggg    840
gccatctcct ctactcaaac catacctctc aagtggcttg ccccagaacg gcttctcctg    900
agacctgctc gcatcagagc agatgtctgg tcttttggga tcctgctcta tgagatggtg    960
actctaggag caccaccgta tcctgaagtc cctcctacca gcatcctaga gcatctccaa    1020
agaaggaaaa tcatgaagag acccagtagc tgcacacata ccatgtacag tatcatgaag    1080
tcctgctggc gctggcgtga ggctgaccgc ccctcaccta gagagctgcg cttgcgccta    1140
gaagctgcca ttaaaactgc agatgacgag gctgtgttac aagtaccaga gttggtggta    1200
cctgaactgt atgcagctgt ggccggcatc agagtggaga gcctcttcta caactatagc    1260
atgctttga                                                            1269

Claims (10)

1、一种鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体，是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。
2、根据权利要求1所述的嵌合受体，其特征在于：所述鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。
3、根据权利要求2所述的嵌合受体，其特征在于：所述鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体的羧基端还带有FLAG标签，所述带有FLAG标签的嵌合受体具有序列表中序列4的氨基酸序列。
4、鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体编码基因，具有下列核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5、根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体编码基因是具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列。
6、根据权利要求5所述的基因，其特征在于：所述鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体编码基因的3′端还带有FLAG标签的编码基因，所述带FLAG标签编码基因的嵌合受体编码基因具有序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列。
7、含有权利要求4所述基因的表达载体。
8、根据权利要求7所述的载体，其特征在于：所述表达载体为pcDNA3(EPOR/NOK-H)。
9、含有权利要求4所述基因的细胞系。
10、根据权利要求9所述的细胞系，其特征在于：所述细胞系为BaF3-EPOR/NOKCGMCC №1144。
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