CN1563087A - 治疗肥胖症的睫状神经营养因子衍生物多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗肥胖症的重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)衍生物－rhCNTF(1－185)，首次利用基因克隆技术实现了这种有生物活性的rhCNTF衍生物在大肠杆菌中的高效可溶表达，公开了制备纯化该衍生物的方法，以及该衍生物在治疗肥胖症及神经损伤相关疾病中的用途。

Description

治疗肥胖症的睫状神经营养因子衍生物多肽

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种用于治疗肥胖症的重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)衍生物——rhCNTF(1-185)，制备纯化该衍生物的方法，以及该衍生物在治疗肥胖症及神经损伤相关疾病中的用途。

技术背景

睫神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)分子量约为22.75kDa，包括200个氨基酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2，分子内含一个半胱氨酸，无二硫键，无糖基化，在体内以单体形式存在，等电点为5.78。CNTF基因位于人11号染色体长臂12区，无前体形式，无信号肽。目前认为CNTF属于远相关的成血细胞因子超家族的成员，与IL-6、LIF(白血病抑制因子)等结构类似，其二级结构富含α-螺旋结构，高级结构由四个α-螺旋束组成分子的骨架结构。α-螺旋结构为维持其生物活性所必需，而羧基端的结构对其生物活性贡献不大，α-螺旋中部D2区和A-B襻构成受体的结合部位，D1区则形成相对保守的构象。

CNTF受体(CNTF-Rα链)是目前发现的成血细胞因子受体超家族成员中最为保守的组合，是由372个氨基酸组成的糖蛋白。CNTF-Rα对CNTF只具有低亲和力，CNTF与CNTF-Rα形成的复合物先与gp130结合，再与LIF-Rβ结合，形成高亲和力受体，激活JaK-TyK，直接或间接使STAT 80/90磷酸化，激活tis-11、c-jun、c-fos等因子的转录。

CNTF可维持多种靶神经元的存活、分化及成体神经元的功能执行，其中对脑、脊髓的运动神经元的神经胶质细胞的分化起重要作用；还能改变多种神经肽的表达，对神经支配的骨骼肌有营养作用。

一些常见的中枢神经系统疾病，如Parkinson综合症、Alzheimer综合症、肌侧索硬化症等都与神经营养因子功能受干扰有密切关系，因此利用相应的神经营养因子治疗这些疾病已成为一个新的方向。但由于神经营养因子均为蛋白质，不易通过血脑屏障，故目前临床主要在脊髓和颅运动神经元或外周神经元疾病上进行。

现在发现CNTF还可用于肥胖症的治疗。CNTF与leptin有一条相同的信号传导途径，都将信号传递到下丘脑的海马神经，通过海马神经调节食欲，减少食物的摄取，因此CNTF也可使ob/ob肥胖小鼠体重下降。但CNTF还有另一条尚未研究清楚的信号传导途径，它对db/db突变小鼠(缺乏leptin受体)和由饲喂高脂肪食物产生的小鼠(DIO小鼠)都有减重的作用。所以CNTF有比leptin更广泛的应用前景。

肥胖是一种严重危害人体健康的慢性疾病。肥胖与多种疾病有关，如II型糖尿病、高血压(进而可导致心衰和中风)和高胆固醇(进而可导致动脉粥样硬化和冠状动脉疾病)，随着体重指数(BMI，一种评价体重的指标)的增加，患糖尿病、恶性脂肪瘤、某些癌症、睡眠窒息症和骨关节炎的机率也显著增加。

由于肥胖能引起多种代谢异常，是糖尿病与心血管病发病的主要危险因素之一，并与心血管疾患的发病率与死亡率增高有关。传统上基于饮食和运动对肥胖症的非药物治疗的长期疗效往往十分有限，促使临床医生不得不寻求药物以治疗肥胖症。

国内外对CNTF的研究主要集中在利用基因工程技术构建CNTF突变体的高表达菌株，以提高其生物学活性，但均以包涵体形式表达，必须进行变性和复性等过程，不适于大规模制备。

本发明的申请人发现了一种用于治疗肥胖症的重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)衍生物——rhCNTF(1-185)，与天然CNTF相比，仅去掉了C端15个氨基酸，保持了天然CNTF的稳定性，首次实现了可溶形式的表达，表达量高，稳定性好；纯化时无需变性和复性，并且在动物的药效试验中显示了良好的减重效果和安全性。

发明内容

本发明的一个方面提供了一种用于治疗肥胖症的睫状神经营养因子(CNTF)衍生物多肽——rhCNTF(1-185)蛋白，该多肽是包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、类似物或衍生物。在一优选的实施方案中，rhCNTF(1-185)具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽。

本发明的另一个方面提供了一种编码睫状神经营养因子(CNTF)衍生物多肽的多核苷酸分子，其特征在于它是选自以下几种的任何一种：

(A)与SEQ ID NO：3有至少70％同源性的核苷酸序列；

(B)与SEQ ID NO：3的核苷酸序列杂交或互补的核苷酸序列；和

(C)(A)或(B)核苷酸序列的片段。

(D)与SEQ ID NO：4编码相同序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。

优选地，本发明的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；更优选地，本发明的多核苷酸分子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明进一步提供含有编码本发明rhCNTF(1-185)多核苷酸的表达载体、包含被任何所述载体转化的宿主细胞，以及由其衍生的新的株系或细胞系。在一优选实施方案中，本发明提供一种包含编码本发明rhCNTF(1-185)多核苷酸分子的重组原核表达载体pET-32a-CNTF，以及遗传工程菌pET-CNTF/BL21。

本发明进一步提供制备睫状神经营养因子衍生物rhCNTF(1-185)多肽的方法，其包括在适于表达多肽的条件下培养用重组表达载体转化的宿主细胞，再从细胞培养物中回收和纯化所表达的多肽。

本发明进一步提供含有本发明睫状神经营养因子(CNTF)衍生物多肽rhCNTF(1-185)为活性成分以及药学上可接受的载体的药物组合物，以及该药物组合物在治疗肥胖症，神经变性疾病和神经损伤以及治疗青光眼中的用途。

本文中提到的rhCNTF(1-185)多肽的“同源性”多肽是指，多肽本来具有rhCNTF(1-185)蛋白的氨基酸序列，但其中一个或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基保守地取代，并且所得到的多肽可用于实施本发明。保守氨基酸取代是本领域已知的。造成这样的取代的规则包含由Dayhof，M.D.(1978，国家生物医学研究基金，Washington，D.C.，第5卷，增刊3)等所述的取代规则。更具体地说，保守氨基酸取代发生在与其酸性、极性或侧链大小相关联的氨基酸家族内。一般可将遗传编码的氨基酸分为四组：(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电的极性氨基酸＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分类为芳香氨基酸。任何特定组内的一个或多个取代，例如用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、或用谷氨酸取代天冬氨酸、或用丝氨酸取代苏氨酸，或任何其他氨基酸残基结构上相关的氨基酸残基，例如有相似酸性、极性、侧链大小的，或在其某些组合方面有相似性的氨基酸残基取代，一般对多肽的功能或免疫原性不会有太大影响。

在本发明中，“SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的类似物”被定义为，与SEQ ID NO：4相比较，具有一个或几个氨基酸取代，删除，转换或增加的分子。“SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的衍生物”被定义为如下一种分子，它具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4类似物氨基酸序列，但是另外还具有化学修饰的一个或几个氨基酸侧链基团，α-碳原子，末端氨基，或者末端羧酸基。化学修饰包括增加部分化学结构，生成新键，和除去部分化学结构。对氨基酸侧链基团的修饰包括赖氨酸ε-氨基的酰基化，精氨酸，组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰氨基。末端氨基的修饰包括脱氨基，N-低级烷基修饰，N-二低级烷基修饰和N-酰基修饰。对末端羧基的修饰包括酰胺修饰，低级烷基酰胺修饰，二烷基酰胺修饰和低级烷基酯修饰。低级烷基是C₁-C₄烷基。并且，还可以用蛋白质化学的普通技术人员熟知的保护基，保护一个或几个侧链基团或末端基团。还可以使氨基酸的α-碳原子单甲基化或二甲基化。

本文所用的术语“多核苷酸分子”是指单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。

生产和操作本文公开的多核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等，1989， 分 子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989， 分子生物学当前技术，Greene Publishing Associates &Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989， 分子克隆，实验室 手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995， PCR策略，Academic Press，Inc.，San Diego；和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，New York)完成。

本发明提供了包含编码重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)衍生物多肽——rhCNTF(1-185)核苷酸序列的一种的多核苷酸分子，在进一步的优选实施方案中，本发明的编码rhCNTF(1-185)多肽的多核苷酸分子包含选自下列成员的核苷酸序列：(1)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列至少70％相同、优选至少80％相同、更优选至少90％相同、最优选95％相同的核苷酸序列；(3)在中等严谨杂交条件下(即在0.5M NaHPO₄、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃与结合于滤膜的DNA杂交，并在0.2xSSC/0.1％SDS中于42℃洗涤的条件；参见Ausubel等(编)，1989， 分子生物学当前技术，第1卷，Green PublishingAssocintes，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，NY，P.2.10.3)、优选高度严谨杂交条件(即在0.5M NaHPO₄、7％SDS、1mM EDTA中于65℃与结合于滤膜的DNA杂交，并在0.1xSSC/0.1％SDS中于68℃洗涤条件；参阅Ausubel等，1989，上述文献)下与具有SEQ ID NO：3或其互补序列的多核苷酸分子能杂交的核苷酸序列；或者(4)与SEQID NO：4编码相同序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。

可用于表达本发明的编码rhCNTF(1-185)多肽序列的各种表达载体是本领域已知的，其中包括含有特定编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA和粘粒DNA表达载体。可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型原核表达载体质粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad Laboratories，Richmond，CA)、pPL和pKK223(Pharmacia，Piscataway，NJ)、pQE50(Qiagen，Chatsworth，CA)和pGEM-T EASY(Promega，Madison，WI)等。可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型真核表达载体包括蜕皮激素诱导型哺乳动物表达系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)、基于巨细胞病毒启动子-增强子的系统(Promega，Madison，WI；Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen)，和基于杆状病毒的表达系统(Promega)等。

可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞。这样的已转化宿主细胞包括但不只限于微生物，例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌，或者用重组载体转化的酵母，或者是动物细胞，如用重组病毒载体如杆状病毒感染的昆虫细胞，或用重组病毒载体如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳动物细胞等。例如，可使用大肠杆菌菌株，如DH5α菌株。真核宿主细胞包括酵母细胞，但也可有效地利用小鼠、仓鼠、牛、猴或人细胞系等哺乳动物细胞。可用于表达本发明的重组蛋白质的真核宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH/3T3等。

含有本发明多肽的药物组合物可用于多种治疗目的，本发明的药物组合物不仅用于治疗肥胖症；还可以用于治疗神经变性性疾病，如视网膜变性、涉及运动神经元的疾病；还可以用于治疗外周神经障碍、Alzheimer、Parkinson、Huntington以及神经损伤等的治疗。优选的，本发明药物组合物用于治疗肥胖症和促进视网膜节细胞轴突再生，用于治疗由于青光眼引起的眼内高压造成的视神经的损伤。

本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉内给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽药物组合物制成合适的剂型，其中包含至少一种有效剂量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。

适当剂型的实例为片剂，胶囊，糖衣片剂，粒剂，口服溶液和糖浆，用于皮肤表面的油膏和药贴，气雾胶，鼻喷剂，以及可用于注射的无菌溶液等。

含有本发明多肽的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉末以用于胃肠外给药。在使用前可加入适当溶剂或其它可药用的载体将粉末重新配制。液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。

剂型中还可含有其它常规组分，如防腐剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲液、调节渗透压的盐、乳化剂、增甜剂、着色剂、调味剂等等。本发明药物组合物中使用的稳定剂优选柠檬酸钠、甘氨酸、甘露醇、神经节糖苷等。含有本发明药物组合物的注射水针或冻干粉针更优选的配方包括，rhCNTF(1-185)0.1-5mg，NaCl 8mg，柠檬酸钠3mg或磷酸盐2mg，神经节糖苷25-50mg或甘氨酸15-30mg或甘露醇15-20mg，注射用水1ml。

若有特殊治疗要求，本发明的药物组合物还可包含其他活性药理成分，这种相伴使用有利于治疗。

本发明的药物组合物中多肽的用量可以在一个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些已知的因素，诸如疾病的种类，病情严重程度，病人体重，剂型，所选用药途径很容易的加以确定。通常每日的用量为1-3μg/kg。

本发明的优点：

1.与天然CNTF相比，仅去掉了C端15个氨基酸，保持了稳定性。

2.首次实现了可溶形式的表达，表达量高，稳定性好。纯化时无需变性和复性，工艺简单，易于放大生产，成本低廉。

3.在动物的药效试验中显示了良好的减重效果和安全性。

4.未做点突变，有效避免了免疫原性的增强。

附图说明

图1：重组质粒pET-32a-CNTF构建

图2：实验大鼠0-9天体重变化。Control代表模型对照组；S8代表阳性对照组，盐酸西布曲明，8mg/kg；0.15代表rhCNTF 0.15mg/kg组；0.2代表rhCNTF 0.2mg/kg组；0.25代表rhCNTF 0.25mg/kg组；0.3代表rhCNTF 0.3mg/kg组。

图3：实验大鼠0-9天的摄食量变化率。Control代表模型对照组；S8代表阳性对照组，盐酸西布曲明，8mg/kg；0.15代表rhCNTF0.15mg/kg组；0.2代表rhCNTF 0.2mg/kg组；0.25代表rhCNTF0.25mg/kg组；0.3代表rhCNTF 0.3mg/kg组。计算时以各组0天时为0。

图4：实验大鼠0-9天的体重、体脂和肌肉重量变化。Control代表模型对照组；S8代表阳性对照组，盐酸西布曲明，8mg/kg；0.15代表rhCNTF 0.15mg/kg组；0.2代表rhCNTF 0.2mg/kg组；0.25代表rhCNTF 0.25mg/kg组；0.3代表rhCNTF 0.3mg/kg组。以模型对照组值为0进行计算。

实施例

实施例一表达载体的构建

我们采用PCR方法从人胎儿大脑组织的cDNA库(购自Clontech)中扩增CNTF的cDNA片段。根据CNTF基因序列设计的引物为：

5’引物：5’GA A GAT CTG GAC GAC GAC GAC AAG ATGGCT TTC ACA GAG CAT TC 3’

3’引物：5’G GA ATT CTT ACC CAG TCT GAT GAG AAG AAATG 3’

为了能将PCR产物直接插入表达载体，我们在5’引物中设计入Bgl II酶切位点，在3’引物中设计入EcoR I酶切位点。

PCR反应条件如下：

60.5μl   ddH₂O

10μl      10×扩增缓冲液

2μl       10μM dNTP

10μl      5’引物(10μM)

10μl      3’引物(10μM)

5μl       模板cDNA(～1ng)

2.5μl     Taq DNA polymerase(1U/μl)

PCR反应混合物在94℃变性5分钟后，按下列条件进行反应：

94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸30秒。反应30个循环。然后72℃再延伸12分钟。

PCR反应结束后，将约590pb大小的PCR产物插入表达载体pET-32a(+)(购自Novagen)；将连接构建好的质粒pET-32a(+)转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Stratagene)。通过筛选和测序，得到插入序列完全正确的重组表达质粒pET-32a-CNTF(见图1)，含有重组表达载体的工程菌为pET-CNTF/BL21，其表达率可占总菌体蛋白的20-40％，均以可溶形式存在。

实施例二rhCNTF(1-185)的纯化

经高密度发酵获得的工程菌菌体洗涤离心后用10mmol/L PB，50mmol/L咪唑，pH8.0的缓冲液重悬浮，高压匀质机破菌，离心(10000g×30min，4℃)得上清。上清液上用平衡缓冲液10mmol/LPB，50mmol/L咪唑，pH8.0平衡的Chelating Sepharose FF柱(购自Pharmacia)，而后用同样的缓冲液洗至基线，再用10mmol/L PB，200mmol/L咪唑，pH8.0缓冲液洗脱Thioredoxin-EK-CNTF融合蛋白，其纯度大于80％。

所得融合蛋白按1U∶10mg加入肠激酶rEK酶(购自Invitrogen)，25℃保温20小时。电泳检测酶解效率大于95％后，将酶解液上10mmol/L PB，pH8.0平衡的Chelating Sepharose FF柱，这时rhCNTF(1-185)不被吸附而直接穿透，绝大部分的杂蛋白、几乎所有的EK酶被Chelating Sepharose FF柱吸附。收集穿透峰上用10mmol/L PB，3mol/L NaCl，pH8.0缓冲液平衡的Phenyl Sepharose F.F.柱，用10mmol/L PB(pH7.0)洗脱，即为纯化的rhCNTF(1-185)纯品。

实施例三rhCNTF(1-185)的抗肥胖作用

1.高营养性肥胖(DIO)大鼠模型的制备

取若干只大鼠(断乳SD大鼠，雄性，体重85-105g，SPF级)，喂以高能饲料，造成DIO模型，正常对照组大鼠20只喂以普通饲料，以DIO组大鼠体重≥正常对照组大鼠体重的20％为模型成功，共造型6周。第1周饲料消耗量为15g/只，第3周为20g/只，第5-6周为23g/只。第6周末时，从正常大鼠中选出10只做为正常对照，从造型成功的大鼠中选出肥胖大鼠60只，每组10只，分别分为模型对照组、阳性对照组和rhCNTF 4个剂量的受试组。

2.rhCNTF(1-185)药效学实验方法

2.1分组及给药：

第1组：正常对照组，喂以普通饲料

第2组：模型对照组，喂以高营养饲料

第3组：阳性对照组，盐酸西布曲明，ig，8mg/kg，喂以高营养饲料)

第4组：rhCNTF 0.15mg/kg，sc，喂以高营养饲料

第5组：rhCNTF 0.2mg/kg，sc，喂以高营养饲料

第6组：rhCNTF 0.25mg/kg，sc，喂以高营养饲料

第7组：rhCNTF 0.3mg/kg，sc，喂以高营养饲料

阳性对照组大鼠用西布曲明灌胃，2ml/kg，1日1次，其余各组大鼠均用等体积生理盐水灌胃，1日1次。rhCNTF(1-185)各组大鼠每天sc注射不同浓度的受试药1次，每次1ml/kg。正常对照组、模型对照组和阳性对照组sc注射等体积赋形剂生理盐水溶液。

2.2测定指标：

(1)体重及摄食量：给药前(0天)、给药后1、2、3、4、5、7、9天定时记录体重及摄食量。

(2)血脂含量测定

(3)体脂重量及骨骼肌重量测定

3.结果

给药0天时，模型组大鼠体重较正常对照组增加20％，与正常对照组相比P＜0.01，说明DIO模型成立。在整个实验过程中，模型组大鼠体重持续增长，和实验前比较，体重增长率为7.33％。西布曲明组大鼠体重在用药第2天时达到最低(和给药前比，降低了3.91％)，随后缓慢回升，各时点体重与模型对照组相比P＜0.01，差别有显著性。rhCNTF(1-185)各组大鼠在用药期间，DIO大鼠的体重降低有明显量-效关系，其中rhCNTF 0.15mg/kg组降低了6.42％，0.2mg/kg组降低了8.58％，0.25mg/kg组降低了9.01％，0.3mg/kg组降低了12.73％，体重与模型对照组相比均P＜0.01)。各组大鼠0～9天体重变化见图2和表1。

给药0天时各组之间大鼠的摄食量无显著性差异，在整个实验过程中，模型组大鼠的摄食量一直稳定在一定范围内。西布曲明组大鼠摄食量在用药第1天后达到最低(与模型对照组相比P＜0.01)，随后缓慢回升，与模型对照组接近，差别无显著性。给药0～7天内，各rhCNTF剂量组大鼠的摄食量持续减少，有明显量-效关系。其中，0.15、0.2、0.25、0.3mg/kg剂量组大鼠摄食量在第7天时达到最低点，与模型对照组比均P＜0.01，各组大鼠摄食量变化见图3和表2。

西布曲明组可以显著降低DIO大鼠的血糖，对血脂其它指标无显著性影响。rhCNTF各组大鼠血清LDL-C值均有降低趋势，和模型对照组比，0.15mg/kg组差别有显著性；0.3mg/kg组血清TG含量降低且差别有显著性，而其它剂量组血清TG含量无显著性变化；rhCNTF各组大鼠血清CHO、HDL-C含量均无明显升高或降低，和模型对照组比较，差别亦无显著性，结果见表3。

给药9天后，曲美8mg/kg及rhCNTF各组DIO大鼠的体脂重量均明显降低，和模型对照组比，曲美8mg/kg组降低40.26％，rhCNTF各组分别降低了27.59％、23.09％、28.55％和32.49％，各用药组大鼠体脂重量与模型对照组比，rhCNTF 0.2mg/kg组P＜0.05，曲美8mg/kg及rhCNTF 0.15、0.25、0.3mg/kg组P＜0.01。曲美8mg/kg及rhCNTF 0.15～0.3mg/kg组DIO大鼠的右比目鱼肌重量明显降低，和模型对照组比，曲美8mg/kg组大鼠右比目鱼肌重量降低了8.40％，rhCNTF各组分别降低了10.26％、13.90％、14.83％、18.38％。各组右比目鱼肌重量与模型对照组比，曲美8mg/kg和rhCNTF 0.15mg/kg组P＜0.05，rhCNTF 0.2、0.25、0.3mg/kg组P＜0.01。各组大鼠相对于模型对照组大鼠的体重、体脂重量和右比目鱼肌重量变化见图4和表4。

通过上述实验可以知道，rhCNTF(1-185)可使DIO大鼠的摄食量和体重明显减少，并有明显的量-效关系，给药结束后，rhCNTF(1-185)各组DIO大鼠的体脂重量经测定均明显降低，此外还可降低LDC-C含量，但不影响血清HDL-C含量，此作用对肥胖患者十分有利。另外，rhCNTF(1-185)不影响大鼠活动、外观及行为，不引起大鼠兴奋和抑制，对大鼠血红细胞计数、血红蛋白含量、网织红细胞计数、白细胞计数及分类、血小板计数无明显有病理意义的影响，不影响大鼠肝、肾功能。

实施例四制备以rhCNTF(1-185)为活性组份的注射剂

配方：rhCNTF(1-185)    100mg

      NaCl             8g

      Na₂HPO₄       1.6g

      NaH₂PO₄       0.55g

      甘氨酸          20g

      甘露醇          15g

      注射用水        1000ml

      pH值            7.0

无菌过滤后分装成1ml/支的注射水针剂或冻干，制成冻干粉针。

实施例五制备治疗视神经变性损伤的滴眼剂

配方：rhCNTF(1-185)   100mg

      透明质酸        2.5g

      维生素B6        2.5g

      牛磺酸          2.0g

      苯扎溴氨        0.1g

      甘露醇          15g

      注射用水        1000ml

      pH值            6.5

无菌过滤后分装成10ml/支，4℃保存。

通过上述具体的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例描述，而不用来限制本发明的范围。

参考文献

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[27]Noack R，Two-year study of orlistat in the treatment of obesity.Program of the79th Annual Meeting of The Endocrine Society，Minneapolis，MN，1997(Abstract 442)

[28]Finer N，James WPT，Kopelman PG，Lean MEJ，Williams G 2000 One-yeartreatment of obesity：a randomized，double-blind placebo-controlled，multi-center study of orlistat(Xenical)，a gastrointestinal lipase inhibitor.Int J Obes23：1-8

[29]Van Gaal LF，Broom JI，Enzi G，Toplak H 1998 Efficacy and tolerability oforlistat in the treatment of obesity-a 6-month dose-ranging study.Eur J ClinPharmacol 54：125-132

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            表1.rhCNTF用药0天、9天时大鼠的体重及体重增长率

              剂量           0d体重           9d体重           9d体重

组别

              mg/kg          /g               /g               增长率/％

正常对照      -              338.9±20.9^Δ      374.4±42.3^Δ     10.475

模型对照      -              405.3±14.6      435.0±14.7      7.327905

曲美          8              404.4±11.3      406.6±13.0^Δ     0.544016

rhCNTF        0.15           404.7±14.3      378.7±17.5^Δ     -6.42451

rhCNTF        0.2            405.8±15.5      371.0±19.4^Δ     -8.57565

rhCNTF        0.25           404.1±14.0      367.7±11.0^Δ     -9.00767

rhCNTF        0.3            406.0±11.3      354.3±12.4^Δ     -12.734

与模型对照组比，^*P＜0.05，^ΔP＜0.01

                  表2.rhCNTF用药0天、5天及9天时大鼠的摄食量(g)

              剂量           0d摄食量         5d摄食量         9d摄食量

组别

              mg/kg          g                g                g

正常对照      -              30.28±5.95      30.00±5.54^*   31.88±7.57

模型对照      -              27.51±2.70      25.91±1.56      27.03±4.63

曲美          8              25.32±3.23      20.91±2.61^Δ     22.46±5.43

rhCNTF        0.15           26.23±1.52      18.05±2.60^Δ     24.62±3.76

rhCNTF        0.2            26.28±3.14      17.59±3.42^Δ     25.95±5.26

rhCNTF        0.25           24.87±5.17      16.84±2.11^Δ     26.29±3.36

rhCNTF        0.3            26.06±2.80      15.29±3.82^Δ     27.00±2.78

与模型对照组比，^*P＜0.05，^ΔP＜0.01

                           表3.给药9天时各组大鼠的血脂及血糖含量

组别          剂量          GLU         HDL-C       LDL-C        CHO       TG

              mg/kg         mmol/L      mmol/L      mmol/L       mmol/L    mmol/L

正常对        -             8.01±              0.44±             1.92±                2.49±          0.66±

照                          1.30        0.06        0.31         0.35      1.92

模型对        -             9.04±              0.47±             1.95±                2.55±          0.63±

照                          1.09        0.05        0.21         0.28      0.22

曲美          8             7.92±              0.44±             1.81±                2.38±          0.60±

                            0.97^*      0.07        0.31         0.37      0.14

rhCNTF        0.15          9.92±              0.44±             1.77±                2.36±          0.72±

                            1.15        0.06        0.22         0.30      0.27

rhCNTF        0.2           9.01±              0.44±             1.72±                2.29±          0.62±

                            1.08        0.07        0.27         0.31      0.22

rhCNTF        0.25          9.65±              0.44±             1.76±                2.32±          0.62±

                            0.73        0.08        0.31         0.15      0.20

rhCNTF        0.3           9.22±              0.49±             1.75±                2.53±          0.43±

                            1.56        0.09        0.45         0.51      0.19^*

与模型对照组比，^*P＜0.05

             表4.给药9天时各组大鼠的体重、体脂重量及骨骼肌重量

组别             剂量            体重             体脂重量          右比目鱼肌重

                 mg/kg           /g               /g                量

                                                                    /g

正常对照         -               406.0±52.0^Δ     10.78±4.09^Δ        1.14±0.15

模型对照         -               459.1±41.5      17.76±2.31       1.07±0.09

曲美             8               418.8±21.7^Δ     10.61±3.59^Δ         0.98±0.10^*

rhCNTF           0.15            404.4±29.1^Δ     12.86±2.45^Δ         0.96±0.09^*

rhCNTF           0.2             398.3±44.1^Δ     13.66±4.28^*     0.92±0.09^Δ

rhCNTF           0.25            396.5±33.8^Δ     12.69±3.14^Δ         0.91±0.08^Δ

rhCNTF           0.3             390.7±22.0^Δ     11.99±2.36^Δ         0.88±0.01^Δ

与模型对照组比，^*P＜0.05，^ΔP＜0.01。

                           序  列  表

<110>西南生物工程产业化中试基地有限公司

<120>治疗肥胖症的睫状神经营养因子衍生物多肽

<160>4

<170>Patent In Version 3.0

<210>1

<211>600

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<400>1

ATGGCTTTCA CAGAGCATTC ACCGCTGACC CCTCACCGTC GGGACCTCTG TAGCCGCTCT    60

ATCTGGCTAG CAAGGAAGAT TCGTTCAGAC CTGACTGCTC TTACGGAATC CTATGTGAAG   120

CATCAGGGCC TGAACAAGAA CATCAACCTG GACTCTGCGG ATGGGATGCC AGTGGCAAGC   180

ACTGATCAGT GGAGTGAGCT GACCGAGGCA GAGCGACTCC AAGAGAACCT TCAAGCTTAT   240

CGTACCTTCC ATGTTTTGTT GGCCAGGCTC TTAGAAGACC AGCAGGTGCA TTTTACCCCA   300

ACCGAAGGTG ACTTCCATCA AGCTATACAT ACCCTTCTTC TCCAAGTCGC TGCCTTTGCA   360

TACCAGATAG AGGAGTTAAT GATACTCCTG GAATACAAGA TCCCCCGCAA TGAGGCTGAT   420

GGGATGCCTA TTAATGTTGG AGATGGTGGT CTCTTTGAGA AGAAGCTGTG GGGCCATAAG   480

GTGCTGCAGG AGCTTTCACA GTGGACAGTA AGGTCCATCC ATGACCTTCG TTTCATTTCT   540

TCTCATCAGA CTGGGATCCC AGCACGTGGG AGCCATTATA TTGCTAACAA CAAGAAAATG   600

<210>2

<211>200

<212>PRT

<213>智人(homo sapiens)

<400>2

Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu Cys Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu The Ala Leu Thr Glu

    20                  25                  30                  35

Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp

                40                  45                  50

Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg

    55                  60                  65                  70

Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu

            75                  80                  85

Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala

90                   95                 100                 105

Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu

        110                 115                 120                 125

Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile

                130                 135                 140

Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu

    145                 150                 155                 160

Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser

            165                 170                 175

Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr Ile Ala Asn Asn Lys

180                 185                 190                 195

Lys Met

    200

<210>3

<211>555

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<400>3

ATGGCTTTCA CAGAGCATTC ACCGCTGACC CCTCACCGTC GGGACCTCTG TAGCCGCTCT    60

ATCTGGCTAG CAAGGAAGAT TCGTTCAGAC CTGACTGCTC TTACGGAATC CTATGTGAAG    120

CATCAGGGCC TGAACAAGAA CATCAACCTG GACTCTGCGG ATGGGATGCC AGTGGCAAGC    180

ACTGATCAGT GGAGTGAGCT GACCGAGGCA GAGCGACTCC AAGAGAACCT TCAAGCTTAT    240

CGTACCTTCC ATGTTTTGTT GGCCAGGCTC TTAGAAGACC AGCAGGTGCA TTTTACCCCA    300

ACCGAAGGTG ACTTCCATCA AGCTATACAT ACCCTTCTTC TCCAAGTCGC TGCCTTTGCA    360

TACCAGATAG AGGAGTTAAT GATACTCCTG GAATACAAGA TCCCCCGCAA TGAGGCTGAT    420

GGGATGCCTA TTAATGTTGG AGATGGTGGT CTCTTTGAGA AGAAGCTGTG GGGCCATAAG    480

GTGCTGCAGG AGCTTTCACA GTGGACAGTA AGGTCCATCC ATGACCTTCG TTTCATTTCT    540

TCTCATCAGA CTGGG                                                     555

<210>4

<211>185

<212>PRT

<213>智人(homo sapiens)

<400>4

Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu Cys Ser

1                5                  10                  15

Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu The Ala Leu Thr Glu

    20                  25                  30                  35

Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp

            40                  45                  50

Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg

55                  60                  65                  70

Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu

        75                  80                  85                  90

Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala

            95                      100                 105

Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu

    110                 115                 120                 125

Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile

            130                 135                 140

Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu

145                 150                 155                 160

Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser

        165                 170                 175                 180

Ser His Gln Thr Gly

                185

Claims (21)

1.一种用于治疗肥胖症的睫状神经营养因子衍生物多肽，其特征在于该多肽是包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、类似物或衍生物。

2.根据权利要求1的多肽，其特征在于该多肽是具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽。

3.根据权利要求1或2的多肽，其特征在于这里指的肥胖症包括饮食诱导的肥胖症和糖尿病等疾病相关的肥胖症。

4.一种编码权利要求1或2多肽的多核苷酸分子，其特征在于它是选自以下几种的任何一种：

(A)与SEQ ID NO：3有至少70％同源性的核苷酸序列；

(B)与SEQ ID NO：3的核苷酸序列杂交或互补的核苷酸序列；

(C)(A)或(B)核苷酸序列的片段；和

(D)与SEQ ID NO：4编码相同序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。

5.根据权利要求4的多核苷酸分子，其特征在于该多核苷酸分子包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的多核苷酸分子，其特征在于具有SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列。

7.含有权利要求4-6任一多核苷酸分子的重组表达载体。

8.根据权利要求7的表达载体，该重组表达载体是原核表达载体。

9.根据权利要求8的表达载体，该原核表达载体是pET-32a-CNTF。

10.含有权利要求7-10任一表达载体的遗传工程宿主细胞。

11.根据权利要求10的宿主细胞，该宿主细胞是大肠杆菌细胞。

12.根据权利要求11的宿主细胞，该大肠杆菌宿主细胞是pET-CNTF/BL21。

13.制备权利要求1或2多肽的方法，其特征在于该方法包括在适于表达多肽的条件下培养用重组表达载体转化的宿主细胞，再从细胞培养物中回收和纯化所表达多肽的步骤。

14.纯化权利要求1或2多肽的方法，其特征在于含有重组原核表达载体的宿主菌经发酵、离心和匀浆破碎，上清液用亲和层析纯化，经肠激酶酶切后，再分别用亲和层析和疏水层析纯化。

15.根据权利要求14的方法，其特征在于亲和层析柱是CheletingSepharose Fast Flow亲和层柱。

16.根据权利要求14或15的方法，其特征在于疏水层析柱是PhenylSepharose F.F.柱。

17.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物中含有作为活性成分的权利要求1或2的多肽以及药学上可接受的载体。

18.根据权利要求17的药物组合物，该药物组合物是通过包括静脉内，皮下，肌肉，鞘内，鼻腔粘膜，口腔粘膜等药物传递途径的方式给药。

19.权利要求1或2的多肽在制备治疗肥胖症的药物组合物中的用途。

20.权利要求1或2的多肽在制备治疗青光眼的药物组合物中的用途。

21.权利要求1或2的多肽在制备治疗神经变性性疾病如视网膜变性，以及运动神经元疾病、外周神经障碍、Alzheimer、Parkinson、Huntington等神经系统疾病和神经损伤的药物组合物中的用途。