CN1562963A - 2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 - Google Patents

2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1562963A
CN1562963A CN 200410017270 CN200410017270A CN1562963A CN 1562963 A CN1562963 A CN 1562963A CN 200410017270 CN200410017270 CN 200410017270 CN 200410017270 A CN200410017270 A CN 200410017270A CN 1562963 A CN1562963 A CN 1562963A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chlorine
antigen
methyl
antibody
artificial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN 200410017270
Other languages
English (en)
Other versions
CN1258521C (zh
Inventor
程敬丽
吴慧明
施海燕
魏方林
朱国念
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN 200410017270 priority Critical patent/CN1258521C/zh
Publication of CN1562963A publication Critical patent/CN1562963A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1258521C publication Critical patent/CN1258521C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途。2甲4氯(2－甲基－4－氯苯氧羧酸)经氯化亚砜酰化后分别与氨基丁酸和氨基己酸反应，制备了半抗原4－(2－甲基－4－氯苯氧乙酰基)氨基丁酸和6－(2－甲基－4－氯苯氧乙酰基)氨基己酸(简称MB和MC)。2甲4氯(2－甲基－4－氯苯氧羧酸)本身也可作为半抗原(简称M)，半抗原M、MB和MC分别通过碳化二亚胺法和混合酸酐法与蛋白质偶联制备免疫抗原和包被抗原。将免疫抗原免疫动物产生对2甲4氯具有高亲合力的特异性抗体。这种抗体与其他化合物不易发生交叉反应。用该抗体建立的酶联免疫吸附分析法可用于快速、灵敏、方便、廉价地检测样本中痕量的2甲4氯残留物。

Description

2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途
                         技术领域
本发明涉及一种2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途。
                         背景技术
由于农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和对人类健康的慢性和长期效应日益受到人们关注和担忧，对农药残留的限制也因此越来越严格，对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准。对分子量小于1000道尔顿的小分子有毒化学品如农药及其代谢产物，传统的残留分析方法主要是依靠气相色谱(GC)，液相色谱(HPLC)或质谱(MS)等物化分析手段，传统的理化分析方法通常繁琐复杂，样品前处理过程复杂、工作量大、仪器昂贵、要求有熟练的技术人员及较长的分析周期，因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及价廉的检测技术能在野外和实验室内进行大批量的筛选试验。免疫分析法正具备这些优点，所以尽管免疫分析应用于农药残留分析的时间很短，但已很快用于环境样品和食品中农药残留的分析。
1958年Berson S.A和Yallow创立了放射免疫分析法(RIA)，并首先在生物医学和临床药物定量测定得到广泛应用。由于农药残留分析对象的复杂性，直到八十年代免疫分析才被逐渐应用于这一领域。
第一个农药免疫分析的报道是1967年Centen等人制备的农药马拉硫磷的抗血清，通过抗原抗体沉淀反应，证明了抗血清与马拉硫磷的可反应性。从1967年到70年代末的10余年间，由于技术上的局限，尽管已开发出了几个农药的免疫分析方法，但仍未受到普遍重视，发展相当缓慢。进入80年代以来，由于人们对分析方法的选择性和灵敏度的要求越来越高，同时对分析对象的种类和环境样品的数量要求也在不断增加，具有高度特异性、灵敏性、快速性的免疫检测技术在农药分析领域得到了较快的发展。进入90年代以来，农药的免疫检测技术发展迅速，到目前为止，已有60多种农药开发了免疫检测技术，其中除草剂和杀虫剂较多，杀菌剂较少。国内这方面的研究也渐渐起步，已有关于对硫磷、三唑酮、禾大壮、甲胺磷、莠去津均三氮苯类等农药的人工抗原和高亲合力的特异性抗体，用RIA法或ELISA法进行样品中痕量农药的分析。但总体来说，国内这方面的研究尚处于跟踪国外的发展。
2甲4氯(MCPA)是激素型的内吸性苯氧羧酸类除草剂。对植物有较强的生理活性，易为根部和叶部吸收和传导，在低浓度时，对作物有生长刺激作用，防止落花、落果，形成无籽果实，促进果实成熟及插枝生根等。高浓度时对双子叶植物有抑制生长作用，植物出现畸形，直至死亡。主要用于水稻、麦类、玉米等作物，防除幼嫩的鸭舌草、苋菜、野慈姑等阔叶杂草及莎草科杂草；对棉花、大豆、瓜类、果树等阔叶作物很敏感，对水稻秧苗亦敏感，容易产生药害。
检测2甲4氯残留量常规方法有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。这些方法的灵敏度受样品的净化，浓缩等步骤的影响很大，又需要大多数实验室所不具备的复杂仪器，且过程繁琐，需要衍生化处理，不适合大批量样品的检测与分析。免疫分析为2甲4氯残留研究提供了一个新的分析检测途径。
                         发明内容
本发明的目的是提供一种2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途。
2甲4氯(MCPA)人工半抗原，它的分子结构式为：
Figure A20041001727000051
其中n＝1～20；
或者分子结构式为：
化学名称为6-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基己酸(简称为MC)；
或者分子结构式为：
Figure A20041001727000061
化学名称为4-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基丁酸(简称为MB)。
如权利要求1所述的2甲4氯(MCPA)人工半抗原制备方法的步骤为：
1)将氯化亚砜和2甲4氯，回流反应1.5h，蒸馏除去剩余的氯化亚砜，即得产物2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯。
2)按投料比6-氨基己酸∶2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯＝1.2∶1～1.5∶1在三口烧瓶中投入6-氨基己酸或γ-氨基丁酸，冰浴下加入3～5ml 2～4mol/L的NaOH溶液，搅拌溶解，再加入2～5ml溶解于10～25ml二噁烷的2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯溶液，间隔5～10min，加入2～5ml上述溶液和每1～5mmol原料1～5ml 2～4mol/L的NaOH溶液，加毕，继续在0～4℃下反应2h。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用0.1mol/l稀盐酸3×25ml洗涤，再用1mol/l的NaHCO3溶液3×25ml提取，收集提取液置于冰浴中，用浓盐酸调节pH值至4.0左右，有白色固体析出，用布氏漏斗抽滤，烘干。经硅胶柱层析纯化得半抗原6-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基己酸(MC)或4-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基丁酸(MB)。
2甲4氯人工抗原，它的分子结构式为：
其中n＝1～20，
或它的分子结构式为：
2甲4氯特异性抗体是能与2甲4氯发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
它用于检测食品、农产品和环境样品(如土壤与水样)中2甲4氯的残留量。
本发明通过设计合成2甲4氯人工半抗原和人工抗原，经免疫动物产生特异性抗体，以抗原抗体特异性免疫学反应为基础，并引入标记物来放大显示这一反应，则可用于样本测定。其选择性取决于免疫学反应的特异性，其灵敏度取决于抗体的亲合性和标记物的可检性。因此，可快速准确地分析检测2甲4氯在样本中的残留量。这种方法灵敏度高、特异性强，样品前处理简单，便于进行现场监控，可以与常规方法互为补充。
                         具体实施方式
12甲4氯(MCPA)人工半抗原的合成
基于2甲4氯苯环侧链上本身就具有能与蛋白质结合的特征基团-COOH，可直接将其与蛋白质偶联免疫兔子得到抗体，所以本身是一个半抗原(简称M)。
为了让半抗原的结构特征充分暴露，可在-COOH位点上接上一个连接臂，据此以2甲4氯为起始原料，同时以氯化亚砜，氨基丁酸或氨基己酸等为原料，经过二步反应，合成了半抗原6-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基己酸(MC)和4-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基丁酸(MB)。产物MC和MB纯化后分别经质谱(ESI)和核磁共振氢谱(1H-NMR)鉴定，并与类似已知的化合物数据比较确证。
主要半抗原的结构如下：
Figure A20041001727000071
2人工抗原的合成
免疫原的合成采用碳二亚胺法。将半抗原M(或MC或MB)溶解N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清加入到10～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1～6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
包被抗原的合成利用混合酸酐法。将半抗原M(或MC或MB)溶解N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温下反应1～2小时，反应液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1～4小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
按照合成2甲4氯免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)分析。偶联物与半抗原M、MB、MC、BSA和OVA的吸收峰相比，发生了明显的变化，表明人工抗原M-BSA、M-OVA、MC-BSA、MC-OVA、MB-BSA和MB-OVA的合成是成功的。
经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：
M-BSA     4～20∶1    MC-BSA    10～50∶1       MB-BSA10～50∶1
M-OVA     2～10∶1    MC-OVA    3～15∶1        MB-OVA3～15∶1
3抗体的制备及2甲4氯酶联免疫分析方法的建立
将半抗原M、MC和MB与蛋白质偶联制备得到的三种免疫原复合物按常规方法各免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次免疫时，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的效价分别为1∶25600、1∶12800、1∶12800；1∶25600、1∶12800、1∶51200；1∶51200、1∶51200和1∶102400。免疫血清合格后，进行采血，分离出抗血清。
利用2甲4氯抗原抗体免疫反应和酶促反应建立2甲4氯酶联免疫分析法。在检测分析食品、植物和环境土壤与水等样品中2甲4氯残留时具有很高的特异性和灵敏度，最低检测限可达到0.005ppm，准确度高，回收率可高达96.5％以上，同时操作方法简单快速，不需要复杂的前处理过程，一次可同时检测大批样品，成本低廉，对操作人员的要求低，便于进行现场监控，可以与常规方法互为补充。
实施例1：半抗原MC的合成
1)按氯化亚砜过量将SOCl2和2甲4氯装入三口烧瓶中，在磁力搅拌下，加热回流反应1.5h，蒸馏除去多余的SOCl2，即得产物2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯。
2)按投料比6-氨基己酸∶2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯＝1.2∶1称取6-氨基己酸放入三口烧瓶中，冰浴下加入3ml 4mol/L的NaOH溶液，磁力搅拌溶解，再加入2mL溶解于10mL二噁烷的2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯溶液，间隔5min，加入2ml上述溶液和每1mmol原料1ml 2mol/L的NaOH溶液，加毕，在0～4℃下搅拌反应2h。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用0.1mol/l稀盐酸3×25ml洗涤，再用1mol/l的NaHCO3溶液3×25ml提取，收集提取液置于冰浴中，用浓盐酸调节pH值至4.0左右，有白色固体析出，抽滤，烘干。经硅胶柱层析纯化得半抗原6-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基己酸(MC)。
取上述合成的产物分别经ESI和1H-NMRR测定其分子结构。该物质的ESI分子离子标准峰为331(M--1)，且该峰旁333有一同位素峰，其峰高为331峰的1/3强，由此可知该物质有1个Cl原子。1H-NMR(C3D6O)为：δ10.557(s，H，COOH)，7.371(s，H，NH)，6.880～7.191(q+m，3H，3ArH)，4.492(s，2H，CH2CON)，3.246～3.297(q，2H，CH2COO)，2.269～2.337(t，2H，NCH2)，2.195～2.217(t，3H，CH3)，1.293～1.601(t，6H，3CH2)。
从以上分析综合可知，所合成的产物为目标物。
实施例2：半抗原MB的合成
1)按氯化亚砜过量将SOCl2和2甲4氯装入三口烧瓶中，在磁力搅拌下，加热回流反应1.5h，蒸馏除去多余的SOCl2，即得产物2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯。
2)按投料比γ-氨基丁酸∶2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯＝1.5∶1称取γ-氨基丁酸放入三口烧瓶中，冰浴下加入5ml 4mol/L的NaOH溶液，磁力搅拌溶解，再加入5mL溶解于25mL二噁烷的2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯溶液，间隔10min，加入5ml上述溶液和每5mmol原料5ml 4mol/L的NaOH溶液，加毕，在0～4℃下搅拌反应2h。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用0.1mol/l稀盐酸3×25ml洗涤，再用1mol/l的NaHCO3溶液3×25ml提取，收集提取液置于冰浴中，用浓盐酸调节pH值至4.0左右，有白色固体析出，抽滤，烘干。经硅胶柱层析纯化得半抗原4-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基丁酸(MB)。
取上述合成的产物分别经ESI和1H-NMRR测定其分子结构。该物质的ESI分子离子标准峰为284(M--1)，且该峰旁286有一同位素峰，其峰高为284峰的1/3强，由此可知该物质有1个Cl原子。该产物1H-NMR(C3D6O)为：δ10.578(s，1H，COOH)，7.419(s，1H，NH)，6.858～7.152(q+q，3H，3ArH)，4.473(s，2H，CH2CON)，3.277～3.326(q，2H，CH2COO)，2.21～2.313(t，2H，NCH2)，2.173～2.203(t，3H，CH3)，1.750～1.858(q，2H，CH2)。
从以上分析综合可知，所合成的产物为目标物。
实施例3：人工抗原的合成
3.1免疫原的合成与纯化
免疫原的合成利用碳二亚胺法。将50微摩尔半抗原M，溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4mL10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
3.2包被抗原的合成与纯化
包被抗原的合成利用混合酸酐法。将50微摩尔半抗原M溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温下反应1～2小时，反应液100μL加入到5mL10mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1小时，然后装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
3.3人工抗原的鉴定
按照合成2甲4氯免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。
经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：
M-BSA    4～20∶1    M-OVA    2～10∶1
实施例4：人工抗原的合成
4.1免疫原的合成与纯化
免疫原的合成利用碳二亚胺法。将80微摩尔半抗原MC，溶解在2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液800μL缓慢加入到8mL20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
4.2包被抗原的合成与纯化
包被抗原的合成利用混合酸酐法。将100微摩尔半抗原MC溶解在2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温下反应1～2小时，反应液800μL加入到10mL20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应4小时，然后装入透析袋，先用蒸馏水透析4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
4.3人工抗原的鉴定
按照合成2甲4氯免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。
经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：
MC-BSA  10～50∶1    MC-OVA  3～15∶1
实施例5：人工抗原的合成
5.1免疫原的合成与纯化
免疫原的合成利用碳二亚胺法。将60微摩尔半抗原MB，溶解在1.5mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液500μL缓慢加入到6mL 15mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应5小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
5.2包被抗原的合成与纯化
包被抗原的合成利用混合酸酐法。将60微摩尔半抗原MB，溶解在1.5mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温下反应1.5小时，反应液600μL加入到6mL 15mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应2小时，然后装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
5.3人工抗原的鉴定
按照合成2甲4氯免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。
经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：
MB-BSA  10～50∶1    MB-OVA  3～15∶1
实施例6：抗体的制备
6.1免疫动物制备抗血清
实验选用半周岁左右，体重为2-3公斤，健康的雄性家兔。每种免疫原免疫三只兔子(由浙江省中医学院负责兔子的饲养工作)，分别编号为兔子1-6。
实验免疫剂量基础免疫为0.25～4.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～4.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量人工抗原复合物，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后，就进行采血。
本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，先待收集在三角烧瓶中的血液凝固后，然后用接种针沿三角烧瓶边缘将血块与玻璃脱离，放置于37℃温箱中半小时，再放到4℃冰箱中3～4小时，待血块收缩后，用吸管将血清吸入试管中，以3000rpm离心15分钟，分离出血清。
6.2抗血清效价测定
三种免疫原复合物按常规方法各免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次免疫时，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的效价分别为1∶25600、1∶12800、1∶12800；1∶25600、1∶12800、1∶51200；1∶51200、1∶51200和1∶102400。
6.3抗体的纯化与鉴定
一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。
实施例7：2甲4氯酶联免疫吸附测定方法建立与鉴定
7.12甲4氯ELISA测定方法的原理
采用间接竞争酶联免疫分析方法。它是将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上，制备成固相抗原，然后加入待测农药和相应抗体，固相抗原中的农药，待测农药，与抗体进行竞争结合反应，待测农药含量多，被结合在固相抗原上的抗体就少，反之结合在固相抗原的抗体多，反应后加入酶标二抗(只能与结合在固相抗原上的抗体相结合)，最后用底物进行显色加以测定，当抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，显色反应就减弱，抑制率增高，反之，则显色反应增强，抑制率减低，因而可根据已知量农药的标准线和待检样品的抑制率，推算出待测农药的浓度。
7.2最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定
选择包被抗原M-BSA、抗M-BSA抗体、抗MC-BSA抗体和抗MB-BSA抗体用方阵滴定法，同时稀释抗体和固相抗原包被液。
在同一包被液浓度下，随着抗体的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一抗体稀释浓度下，随着包被液浓度的下降，所得OD值也呈下降趋势。选择抗体8000倍稀释作为最适工作浓度，包被抗原浓度0.5μg.mL-1作为最佳包被浓度。
7.3标准曲线和检测灵敏度
7.3.1标准曲线的制备，其基本的操作步骤如下：
7.3.1.1包被
1)包被抗原溶液的配制
从低温冰箱中取出M-OVA偶联复合物，使之完全解冻后，稀释成相应工作浓度。
2)微量反应板的包被
96孔聚苯乙烯微量反应板用PBST洗涤后，每孔加入上面所配的抗原包被液100μL，于37℃温箱中温育2h。
7.3.1.2封闭
取出包被好的微量反应板，甩掉包被液，用PBST洗涤后，每孔加入2.0％的脱脂奶200μL，于37℃温箱中温育0.5h。
7.3.1.3点板
1)配制2甲4氯的标准溶液
取2甲4氯标样配制100ppm的标准溶液，从中取出200μL，待溶剂丙酮挥发后，加入2mLPBS溶液，使之成10ppm溶液，稀释成若干(5～8)个浓度。
2)2甲4氯抗体稀释液的配制
从冰箱中取出已经配制成适当浓度的抗体(抗M-BSA抗体、抗MC-BSA抗体或抗MB-BSA抗体)，用PBS稀释成工作浓度。
3)点板
取出经封闭的板，经200ul PBST洗涤3次后，每孔加入系列浓度的2甲4氯标准液50μL，再加入抗体稀释液50μL，对照孔加入PBS50μL和抗体稀释液50μL。放入37℃温箱中温育1h，弃去孔内液体，用200ul PBST溶液洗涤3次。
7.3.1.4加酶标二抗
每孔加入经1∶1000稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶PBS溶液100μL，放入37℃温箱中1小时，用PBST溶液洗涤3次，甩干。
7.3.1.5显色
每孔加入底物OPD-过氧化氢溶液100μL，37℃温箱中温育15min，用50μL 2MH2SO4终止反应。在酶联仪上测定490nm波长下的吸光值。根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：
式中：ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。
由上述公式计算得2甲4氯各浓度的抑制率，作图。用抗M-BSA抗体测定时，抑制率为50％时2甲4氯的浓度为1.0ppm，最低检测限(以抑制率为10％的浓度表示)为0.01ppm；用抗MC-BSA抗体测定时，抑制率为50％时2甲4氯的浓度为0.63ppm，最低检测限为0.005ppm；用抗MB-BSA抗体测定时，抑制率为50％时2甲4氯的浓度为0.82ppm，最低检测限同样也为0.005ppm。2甲4氯在0.005ppm～10.00ppm范围内，抑制率与2甲4氯浓度的对数值呈显著的线性关系，抗M-BSA抗体的相关系数为r＝0.9912，抗MC-BSA抗体的相关系数为r＝0.9896，抗MB-BSA抗体的相关系数为r＝0.9862。
7.4抗体的特异性
抗血清的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗血清的特异性则越好。
将2甲4氯及其类似物做系列稀释，分别与同一种抗体竞争反应，按制4.3的方法制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50％的剂量和类似物抑制率50％时的用量，然后计算出各类似物的交叉反应率。
抗M-BSA抗体对一些苯氧羧酸类农药交叉反应率：2，4-D为37.8％，2，4-D丙酸为0.63％，2，4，5-T为2.9％。
抗MC-BSA抗体对一些苯氧羧酸类农药交叉反应率：2，4-D为30.8％，2，4-D丙酸为0.5％，2，4，5-T为4.3％。
抗MB-BSA抗体对一些苯氧羧酸类农药交叉反应率：2，4-D为24.6％，2，4-D丙酸为0.4％，2，4，5-T为2.3％。
从而可知，所制备的三种抗体的特异性均较强。

Claims (5)

1.一种2甲4氯(MCPA)人工半抗原，其特征在于它的分子结构式为：
Figure A2004100172700002C1
其中n＝1～20
或者分子结构式为：
Figure A2004100172700002C2
或者分子结构式为：
2.一种如权利要求1所述的2甲4氯(MCPA)人工半抗原制备方法，其特征在于方法的步骤为：
1)将氯化亚砜和2甲4氯，回流反应1.5h，蒸馏除去剩余的氯化亚砜，即得产物2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯。
2)按投料比6-氨基己酸∶2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯＝1.2∶1～1.5∶1在三口烧瓶中投入6-氨基己酸或γ-氨基丁酸，冰浴下加入3～5ml 2～4mol/L的NaOH溶液，搅拌溶解，再加入2～5ml溶解于10～25ml二噁烷的2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯溶液，间隔5～10min，加入2～5ml上述溶液和每1～5mmol原料1～5ml 2～4mol/L的NaOH溶液，加毕，继续在0～4℃下反应2h。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用0.1mol/l稀盐酸3×25ml洗涤，再用1mol/l的NaHCO3溶液3×25ml提取，收集提取液置于冰浴中，用浓盐酸调节pH值至4.0左右，有白色固体析出，用布氏漏斗抽滤，烘干。经硅胶柱层析纯化得半抗原6-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基己酸(MC)或4-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基丁酸(MB)。
3.一种2甲4氯人工抗原，其特征在于它的分子结构式为：
其中n＝1～20。
或它的分子结构式为：
Figure A2004100172700003C2
4.一种2甲4氯特异性抗体，其特征在于它是能与2甲4氯发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
5.一种2甲4氯特异性抗体的用途，其特征在于：它用于检测食品、农产品和环境样品(如土壤与水样)中2甲4氯的残留量。
CN 200410017270 2004-03-25 2004-03-25 2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 Expired - Fee Related CN1258521C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200410017270 CN1258521C (zh) 2004-03-25 2004-03-25 2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200410017270 CN1258521C (zh) 2004-03-25 2004-03-25 2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1562963A true CN1562963A (zh) 2005-01-12
CN1258521C CN1258521C (zh) 2006-06-07

Family

ID=34478879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200410017270 Expired - Fee Related CN1258521C (zh) 2004-03-25 2004-03-25 2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1258521C (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101982773A (zh) * 2010-09-15 2011-03-02 江南大学 庆大霉素液相芯片探针的制备方法
CN106290903A (zh) * 2016-08-03 2017-01-04 北京德奥平生物技术有限公司 一种不对称二甲基精氨酸免疫法测定试剂及检测方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101982773A (zh) * 2010-09-15 2011-03-02 江南大学 庆大霉素液相芯片探针的制备方法
CN101982773B (zh) * 2010-09-15 2013-10-30 江南大学 庆大霉素液相芯片探针的制备方法
CN106290903A (zh) * 2016-08-03 2017-01-04 北京德奥平生物技术有限公司 一种不对称二甲基精氨酸免疫法测定试剂及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1258521C (zh) 2006-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20180246086A1 (en) Time-resolved fluorescent immunochromatographic assay rapid test kit for type i pyrethroid
CN111978304B (zh) 苯醚甲环唑半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN101245032A (zh) 隐孔雀石绿半抗原及制备得到的抗体和抗体的应用
CN1240685C (zh) 二氯喹啉酸人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途
CN1766630A (zh) 一种检测动物源性食品中莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒
CN101100456A (zh) 氟虫腈人工半抗原及合成方法、抗原和抗体及用途
CN1680407A (zh) 三唑磷人工半抗原、抗原、抗体的制备方法
CN1179966C (zh) 毒死蜱人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途
Wang et al. Detection of triclabendazole and three metabolites in bovine muscle samples with a gold nanoparticle-based lateral flow immunoassay
CN1677107A (zh) 一种用于检测聚醚类抗生素残留的免疫抗体及其应用
CN1569840A (zh) 吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途
CN100340567C (zh) 三唑磷人工半抗原、抗原、特异性抗体及其用途
CN100340543C (zh) 氰戊菊酯半抗原化合物、合成方法及其用途
CN101135683B (zh) 联苯菊酯抗原、抗体及其应用
CN1766625A (zh) 检测阿维菌素类药物的酶联免疫试剂盒及方法
CN1258521C (zh) 2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途
CN1365387A (zh) 用于单端孢菌毒素真菌毒素检测的方法和试剂
CN1696698A (zh) Pat蛋白的亲和层析－酶联免疫检测方法及其专用试剂盒
CN1680405A (zh) 毒死蜱人工半抗原、抗原、抗体及用途、半抗原合成方法
CN1700001A (zh) 有机氯农药硫丹人工抗原和抗体及其制备方法与应用
CN101412673A (zh) 溴氰菊酯抗原、抗体及其应用
CN1793108A (zh) 一种克伦特罗半抗原化合物、合成方法及其用途
CN1904613A (zh) 用于磺胺类多种残留免疫分析的人工抗原和抗体及其制备
CN1900086A (zh) 乙基对硫磷人工半抗原、人工抗原、抗体制备法及其用途
CN101100457A (zh) 氟虫腈半抗原化合物、合成方法及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20060607