CN1559254A

CN1559254A - 富硒蛋白质和富硒氨基酸及其制备方法和用途

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Publication number: CN1559254A
Application number: CNA2004100128317A
Authority: CN
Inventors: 琼刘; 刘琼; 胡德聪; 徐辉碧; 韩定献; 杨祥良
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2004-03-10
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2024-03-10
Also published as: CN1225183C

Abstract

以富硒蚕蛹为原料制得的一种富硒蛋白质和富硒氨基酸及其制备方法；以及以这种富硒蛋白质和富硒氨基酸作为有预防癌症和功能的食品。本发明的方法是：将硒含量为1～5mg Se/kg富硒鲜蚕蛹制干，脱脂，稀碱抽提蛋白质，调节溶液酸度使富硒蛋白质析出，离心，沉淀冷冻干燥，得到富硒蛋白质粉；对富硒蛋白质粉进一步水解制得富硒氨基酸。将富硒蛋白质粉和富硒氨基酸制成一定的剂型，如压片、填充胶囊和口服液等，用于在补充人体必需氨基酸的同时补充微量元素硒，具有营养保健、预防肿瘤的功能。

Description

富硒蛋白质和富硒氨基酸及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种以富硒蚕蛹为原料制得的富硒蛋白质和富硒氨基酸及其制备方法；以及以富硒蛋白质和富硒氨基酸制备具有补硒和预防癌症功能的保健食品。

背景技术

硒是生物必需的微量元素。硒在体内具有增强免疫力、抗衰老和防治肿瘤的作用。缺硒导致机体免疫功能和抗氧化能力降低，并与多种疾病的发生相关联，补充适量硒能提高机体免疫力、预防多种疾病，因此受到广泛重视。根据中国营养学会于1988年提出的，成人每日膳食硒供给量(RDA)为50μg。而在补硒抗癌等干预实验中，每天补硒剂量为200μg，所用的硒为Na₂SeO₃和硒酵母。硒在体内主要通过硒酶和硒蛋白发挥生物功能。含硒蛋白质和含硒氨基酸，具有高生物利用度。

目前用于补硒的化合物主要为无机硒化合物如Na₂SeO₃等。无机硒化合物相比于有机硒毒性较大，而有机硒的生产条件苛刻、价格昂贵，目前得到有机硒的方法通常为利用一些对硒高适应性和高转化率的植物、高等真菌的自身转化，使无机硒转化为有机硒，然后再提取有机硒。显然，该方法的生产周期长、成本高，而且硒的利用度较低。

蚕蛹自古就作为滋补强身、和脾胃、长肌肉的食物和药物。研究证实蚕蛹营养价值极高，富含人体必需氨基酸，具有提高免疫、保护肝脏及抗肿瘤等功能，是补充人体必需氨基酸的极好来源。

将富硒蚕蛹通过食物链将无机硒转化为具有活性的含硒蛋白、含硒多肽和含硒氨基酸，它们除具有普通氨基酸的营养保健功能、还有预防癌症和抗肿瘤的药用价值。例如将紫阳县富硒蚕蛹通过本发明制备成富硒蛋白质和富硒氨基酸，其中蛋白质和氨基酸的硒含量分别高于10mgSe/kg蛋白质和1μg Se/mL氨基酸溶液。(陕西紫阳县是中国第二大富硒区，境内动植物产品以及人体硒水平比中国普通地区高出几十倍到几百倍。)所制备的富硒氨基酸加入到体外培养的肝癌细胞SMMC-7721培养基中，发现它能抑制人肝癌细胞的生长，其对肝癌细胞的抑制明显强于相同硒浓度的亚硒酸钠。硒浓度为2.5μmol/L的富硒氨基酸对肝癌细胞的存活率为48.5％，而亚硒酸钠对肝癌细胞的存活率为84.3％，而普通地区蚕蛹中的氨基酸却促进肝癌细胞的生长，存活率超过100％。因此富硒氨基酸是一种潜在的抗肝癌药物。

目前还没有见到有从富硒蚕蛹中的富硒蛋白质和富硒氨基酸的制备方法和制剂的专利报导。已有的涉及蚕蛹氨基酸、植物硒蛋白和硒制剂的报导有：CN 86101511《用有机溶剂提取无蛹臭蛋白质的方法》；CN1071199《一种复合酶解蚕蛹蛋白的方法》；CN1161338《快速生物整合法制取天然硒蛋白》；CN 1388094《富硒氨基酸及其生产方法》；CN1230433《提取天然有机硒的方法及其系列制品》和CN 1437841《生物硒制品的培植方法》等专利。现有提取有机硒的方法通常为利用一些对硒高适应性和高转化率的植物、高等真菌的自身转化，使无机硒转化为有机硒，然后再提取有机硒。显然，该方法的生产周期长、成本高，而且硒的利用度较低。该方法对于从富硒蚕蛹中得到富硒蛋白质和富硒氨基酸以及制剂上不完全适用。这是因为含硒蛋白和含硒氨基酸是特殊的蛋白质和氨基酸，其中所含活性硒在不适当的操作中会损失或失去活性。同时，由于蚕蛹不是植物，其生物组成差异较大，因此有关植物硒蛋白和富硒氨基酸的制备方法不能照搬到蚕蛹上。

富硒蚕蛹资源丰富，比如在陕西紫阳县的富硒蚕蛹，过去缫丝后的蚕蛹都是作为动物饲料进行处理、价格低廉，因此充分利用富硒蚕蛹资源制备富硒蛋白质和富硒氨基酸，将具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于针对目前市场还没有从富硒蚕蛹中得到富硒蛋白质和富硒氨基酸的保健产品以及有机硒的产品在市场上也不多见。本发明提供一种以硒含量为1～5mg Se/kg富硒鲜蛹为原料制备富硒蛋白质和富硒氨基酸及其制备方法和保健制剂。用于在补充人必需氨基酸的同时补充硒，使其具有营养保健、预防肿瘤的功能。而且硒在体内作为一种抗氧化剂，还有抗衰老的作用。

本发明制备富硒蛋白质和富硒氨基酸的方法是：将硒含量为1～5mgSe/kg富硒鲜蚕蛹(不是富硒的鲜蚕蛹，硒含量仅为0.025～0.1mg Se/kg鲜蛹)自然晒干或烘干至八成干得到富硒干蚕蛹，再用石油醚脱脂，稀碱抽提蛋白质，脱色除臭，过滤后调节酸度使富硒蛋白质析出。

这种富硒蛋白质是从富硒蚕蛹中提取的天然含硒蛋白质，其中硒以硒代半胱氨酸及其衍生物、硒代蛋氨酸及其衍生物或一定的分子间作用力与蛋白质或氨基酸结合的有机硒。可溶性无机硒和小分子有机硒在提取蛋白质的分离过程中被除掉。此富硒蛋白质的硒含量为10～20mgSe/kg蛋白质；

再将富硒蚕蛹蛋白质和富硒氨基酸制成一定的剂型，如压片、填充胶囊和口服液等。

1.富硒蛋白质的制备方法：

①将硒含量为1～5mg Se/kg的富硒鲜蚕蛹(例如，采用陕西省紫阳县蚕蛹)冲洗干净，自然晒干或烘干至八成干的干蛹，用粉碎机粉碎，再用石油醚进行索氏抽提，干蛹与石油醚的比例为1g∶10～12mL，得到脱脂蚕蛹；

②加浓度为0.25～5％氢氧化钠溶液25～40℃搅拌溶解蚕蛹蛋白质8～12小时进行蛋白质抽提，脱脂蚕蛹与该浓度范围的氢氧化钠溶液的比例为1g∶10～15mL；然后用涤纶布过滤，残渣用少量水洗涤，收集滤液；

③上述滤液用活性碳进行脱色和除臭处理4～8小时，蛋白质与活性碳的重量比例为1∶0.02～0.1(蛋白质含量采用考马斯亮兰G-250法测定，下同)；

④用6mol/L HCl调节滤液pH为3～5，4℃静置过夜，次日蛋白质析出，用离心机于2500～5000转/分离心，沉淀冷冻干燥即得硒含量为10～20mg Se/kg富硒蛋白质粉。

质量检测结果：干蚕蛹中的蛋白质产率为35～50％、蛋白质的硒含量为10～20mg Se/kg蛋白质。

2.富硒氨基酸的制备方法如下：

①加水溶解采用上述制备富硒蛋白质的方法得到的富硒蛋白质粉，富硒蛋白质与水的重量比为1∶10～15；

②向该溶液中同时加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶与富硒蛋白质的重量比为0.5～1.5∶1.5～2.5∶100(胰蛋白酶活力为11600单位/mg，木瓜蛋白酶活力为0.5～2单位/mg)，在25～45℃搅拌的条件下水解8～12小时，酶解反应液的pH为6～8；

③离心机2500～4000转/分离心过滤，残渣再用采用①和②同样的方法进行水解；

重复上述过程直至富硒蛋白质全部溶解，即得硒含量为1～2mg Se/mL富硒氨基酸溶液；喷雾干燥(≤60℃)即得氨基酸粉末。

应用富硒蛋白质制备具有补硒功能的食品

a.用于正常人群补硒：制成重量为0.5克，含硒量为片剂4～8μgSe/片或胶囊4～8μg Se/粒的制剂；其中含有富硒蛋白粉40～65％；淀粉10％～50％；羧甲基纤维素钠(崩解剂)0％～15％；苯甲酸钠(防腐剂)0％～1％，混匀后压片或填充胶囊。口服每日3次，成人每次2片或2粒，儿童(4～8岁)每次1片或1粒。

b.用于补硒抗癌的人群：制成重量为0.5克，含硒量为片剂25～35μg Se/片或胶囊25～35μg Se/粒的制剂；其中含有富硒蛋白粉40～65％；淀粉10％～50％；羧甲基纤维素钠0％～15％；苯甲酸钠0％～1％；Na₂SeO₃0.004～0.0065％，混匀后压片或填充胶囊。口服每日3次，成人每次2片或2粒。

应用富硒氨基酸制备具有补硒功能的食品

a.用于正常人群补硒：取富硒氨基酸溶液，每毫升富硒氨基酸溶液中加羧甲基纤维素钠1～5μg，薄荷(调味剂)0.5～2μg，砂糖(调味剂)1～10μg，醋酸(调味剂)1～5μg，灭菌后装瓶制成含硒量为7.5～15μg Se/瓶，15mL/瓶的口服液，口服每日3次，每次1瓶。

b.取喷雾干燥的富硒氨基酸粉末，制成重量为0.5克，含硒量为片剂4～8μg Se/片或胶囊4～8μg Se/粒的制剂；其中含有富硒氨基酸粉末40％～65％；淀粉10％～50％；羧甲基纤维素钠0％～15％；苯甲酸钠0％～1％，混匀后压片或填充胶囊。口服每日3次，成人每次2片或2粒，儿童(4～8岁)每次1片或1粒。

c.用于补硒抗癌的人群：取富硒氨基酸溶液，每毫升富硒氨基酸溶液中加Na₂SeO₃ 0.005～1mg，再加羧甲基纤维素钠1～5μg，薄荷0.5～2μg，砂糖1～10μg，醋酸1～5μg，灭菌后装瓶制成含硒量为40～80μg Se/瓶，15mL/瓶的口服液，口服每日3次，每次1瓶。

d.取喷雾干燥的富硒氨基酸粉末，制成重量为0.5克、含硒量为片剂25～35μg Se/片或胶囊25～35μg Se/粒的制剂，其中含有富硒氨基酸粉末40％～65％；淀粉10％～50％；羧甲基纤维素钠0％～15％；苯甲酸钠0％～1％；Na₂SeO₃ 0.04％～0.0065％，混匀后压片或填充胶囊。口服每日3次，成人每次2片或2粒。

对富硒蛋白质采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶进行水解制备富硒氨基酸。蛋白质水解后，除了以氨基酸的形式存在外，还可以低肽(如二、三肽等)的形式存在。某些低肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，且同时具有防病、调节人体生理机能的功效，有些则是原蛋白质或组成氨基酸所没有的独特的生理功能。

本发明产物富硒氨基酸的硒含量为1～2μg Se/mL；氨基酸测序结果显示。氨基酸自动分析仪测得氨基酸组成为：异亮氨酸5.2％，赖氨酸7.5％，亮氨酸9.2％，苯丙氨酸5.9％，蛋氨酸2.6％，苏氨酸5.4％，缬氨酸5.4％，色氨酸2.1％，酪氨酸5.7％，半胱氨酸7.1％，精氨酸6.6％，天冬氨酸7.3％，丝氨酸5.8％，脯氨酸4.0％，甘氨酸5.1％，谷氨酸6.7％，组氨酸1.7％，丙氨酸6.7％。

富硒氨基酸的抗癌作用

将所制备的富硒氨基酸溶液，通过浓缩成硒浓度范围为10～50μmol/L的富硒氨基酸，然后加入到培养有人肝癌细胞SMMC-7721的培养液中(硒的终浓度范围在0.5～2.5μmol/L)，作用一定的时间。结果发现，该富硒氨基酸可降低细胞的存活率，并对细胞存活率的抑制作用呈现量效和时效依赖关系，如硒浓度分别为0.5、1.5和2.5μmol/L的富硒氨基酸作用肝癌细胞72小时后对肝癌细胞的存活率分别为74.1％、59％和48.5％，硒浓度为2.5μmd/L的富硒氨基酸作用细胞24、48和72小时后，细胞的存活率分别为69.5％、66.1％和59.1％；该富硒氨基酸也可诱导细胞凋亡，细胞凋亡率随硒浓度的增大而显著性增加，呈现出剂量依赖性，如硒浓度分别为0.5、1.5和2.5μmol/L的富硒氨基酸作用肝癌细胞72小时后，细胞凋亡率分别为9.40％、17.60％和52.16％。

本发明所制备的富硒蛋白质中硒的含量为10～20mg Se/kg蛋白质，是普通蚕蛹蛋白质硒含量的20～200倍，其中含硒物质主要为含硒蛋白质、含硒多肽、含硒氨基酸。所采用的工艺流程简单、原料成本低、对温度和压力的要求不高以及蛋白质提取产率较高。

本发明的优点是：将富硒蚕蛹制备成富含硒的蛋白质和氨基酸，可以制备成片剂、胶囊和口服液，在补充人体必需氨基酸地同时补充硒，使其兼具营养、保健功能。所制备的富硒氨基酸的功能大于普通蚕蛹氨基酸。制成的不同剂型可满足各种年龄段及各种健康状况人群的需要。

具体实施方式

实施例1富硒蛋白质的制备

将100g富硒鲜蚕蛹冲洗干净，自然晒干至八成干，用粉碎机粉碎，用300mL石油醚抽提脱脂，得到脱脂蚕蛹，然后加入1％氢氧化钠360mL，于30℃搅拌溶解蚕蛹蛋白质10小时，用涤纶布过滤后，残渣用少量水洗涤，收集滤液。滤液用0.5g活性碳进行脱色和除臭处理5h，过滤后再用6mol.L^-1 HCl调节滤液pH为4.5，于4℃静置过夜，次日蛋白质析出，用离心机于4000转/分离心，沉淀冷冻干燥即得富硒蛋白质。质量检测结果：干蛹中蛋白质产率为45.3％、蛋白质中的硒含量为13.5mg Se/kg蛋白质。

实施例2富硒蛋白质的制备

将100g富硒鲜蚕蛹冲洗干净，烘干至八成干，用粉碎机粉碎，用300mL石油醚抽提脱脂，得到脱脂蚕蛹，然后加入2.5％氢氧化钠300mL，于30℃搅拌溶解蚕蛹蛋白质10小时，用涤纶布过滤后，残渣用少量水洗涤，收集滤液。滤液用0.8g活性碳进行脱色和除臭处理5h，过滤后再用6mol.L^-1 HCl调节滤液pH为4.5，于4℃静置过夜，次日蛋白质析出，用离心机于4000转/分离心，沉淀冷冻干燥即得富硒蛋白质。质量检测结果：干蛹中蛋白质产率为48.5％、蛋白质中的硒含量为15.0mg Se/kg蛋白质。

实施例3富硒氨基酸的制备

取10g富硒蛋白质粉，加120mL水溶解，再同时加入胰蛋白酶0.1g和木瓜蛋白酶0.2g，于30℃、在搅拌的条件下水解10小时。用离心机于2500转/分离心过滤，残渣采用上述同样的方法进行水解。重复上述过程两次至富硒蛋白质全部溶解，即得富硒氨基酸溶液，其中硒含量为1.17μg Se/mL。喷雾干燥(≤60℃)可得氨基酸粉末。

实施例4富硒氨基酸的制备

取10g富硒蛋白质粉，加120mL水溶解，再同时加入胰蛋白酶0.125g和木瓜蛋白酶0.175g，于40℃、在搅拌的条件下水解10小时。用离心机于3500转/分离心过滤，残渣采用上述同样的方法进行水解。重复上述过程两次至富硒蛋白质全部溶解，即得富硒氨基酸溶液，其中硒含量为1.52μg Se/mL。喷雾干燥(≤60℃)可得氨基酸粉末。

实施例5富硒蛋白各种剂型的制备，用于正常人群补硒

采用上述方法制备富硒蛋白质粉，制成重量为0.5克、含硒量为片剂5μg Se/片或胶囊5μg Se/粒的制剂；其中含有富硒蛋白质64.5％；淀粉30％；羧甲基纤维素钠5％；苯甲酸钠0.5％，混匀后压片或填充胶囊。口服每日3次，成人每次2片或2粒，儿童(4～8岁)每次1片或1粒。

实施例6富硒蛋白各种剂型的制备，用于补硒抗癌的人群

采用上述方法制备的富硒蛋白质粉，制成重量为0.5克、含硒量为片剂30g Se/片或胶囊30μg Se/粒的制剂；其中含有富硒蛋白质粉64.5％；淀粉30％；羧甲基纤维素钠5％；苯甲酸钠0.5％；Na₂SeO₃ 0.006％，混匀后压片或填充胶囊。口服每日3次，成人每次2片或2粒。

实施例7富硒氨基酸各种剂型的制备，用于正常人群补硒

取富硒氨基酸溶液，加入羧甲基纤维素钠3.5μg/mL，薄荷1μg/mL，砂糖5μg/mL，醋酸2μg/mL，灭菌后装瓶制成含硒量约为10μg Se/瓶，15mL/瓶的口服液。口服每日3次，每次1瓶。

取喷雾干燥的富硒氨基酸粉末，制成重量为0.5克、含硒量为片剂5μg Se/片或胶囊5μg Se/粒的制剂；其中含有富硒氨基酸粉末64.5％；淀粉30％；羧甲基纤维素钠5％；苯甲酸钠0.5％，混匀后压片或填充胶囊。口服每日3次，成人每次2片或2粒，儿童(4～8岁)每次1片或1粒。

实施例8富硒氨基酸各种剂型的制备，用于补硒抗癌的人群

取富硒氨基酸溶液，加Na₂SeO₃ 0.007mg/mL，再加入羧甲基纤维素钠3.5μg/mL，薄荷1μg/mL，砂糖5μg/mL，醋酸2μg/mL，灭菌后装瓶制成含硒量约为60μg Se/瓶，15mL/瓶的口服液。口服每日3次，每次1瓶。

取喷雾干燥的富硒氨基酸粉末，制成重量为0.5克、含硒量为片剂30μg Se/片或胶囊30g Se/粒的制剂；其中含有富硒氨基酸粉末64.5％；淀粉30％；羧甲基纤维素钠5％；苯甲酸钠0.5％；Na₂SeO₃ 0.006％，混匀后压片或填充胶囊。口服每日3次，成人每次2片或2粒。

Claims

1.一种以硒含量为1～5mg Se/kg富硒鲜蚕蛹为原料制备的，硒的含量为10～20mg Se/kg的富硒蛋白质。

2.权利要求1所说的富硒蛋白质的制备方法，其步骤为：

①将硒含量为1～5mg Se/kg富硒鲜蚕蛹干至八成干后粉碎，用石油醚进行索氏抽提，干蛹与石油醚的比例为1g∶10～12mL；

②加0.25～5％氢氧化钠溶液25～40℃搅拌溶解蚕蛹蛋白质8～12小时进行蛋白质抽提，脱脂蚕蛹与该浓度范围的氢氧化钠溶液的比例为1g∶10～15mL；然后用涤纶布过滤，收集滤液；

③上述滤液用活性碳进行脱色和除臭处理4～8小时，蛋白质与活性碳的重量比例为1∶0.02～0.1；

④用6mol/L HCl调节上述滤液pH为3～5，4℃静置过夜，次日蛋白质析出，离心、沉淀冷冻干燥即得硒含量为10～20mg Se/kg富硒蛋白质粉。

3.权利要求1所述的富硒蛋白质在制备具有补硒功能的食品中的应用。

4.权利要求1所述的富硒蛋白质在制备具有预防癌症功能的食品中的应用。

5.一种以权利要求1所述的富硒蛋白质为原料制备的，硒含量为1～2μg Se/mL的富硒氨基酸。

6.权利要求5所说的富硒氨基酸的制备方法，其步骤为：①加水溶解富硒蛋白质粉，富硒蛋白质与水的重量比为1∶10～15；

②向该溶液中同时加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶与富硒蛋白质的重量比为0.5～1.5∶1.5～2.5∶100，在25～45℃搅拌的条件下水解8～12小时，酶解反应液的pH为6～8；

③离心过滤，残渣再采用①和②同样的方法进行水解；

重复上述过程直至富硒蛋白质全部溶解，即得硒含量1～2mg Se/mL富硒氨基酸溶液。

7.权利要求5所述的富硒氨基酸在制备具有补硒功能的食品中的应用。

8.权利要求5所述的富硒氨基酸在制备具有预防癌症功能的食品中的应用。

9.权利要求5所述的富硒氨基酸喷雾干燥制成的富硒氨基酸粉在制备具有补硒功能的食品中的应用。

10.权利要求5所述的富硒氨基酸喷雾干燥制成的富硒氨基酸粉在制备具有预防癌症功能的食品中的应用。