CN1556198A

CN1556198A - 造血细胞在搅拌式生物反应器中的灌注培养方法

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Publication number: CN1556198A
Application number: CNA200410015668XA
Authority: CN
Inventors: 谭文松; 迟占有; 蔡海波
Original assignee: SHANHAI BORUI BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: SHANHAI BORUI BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd; East China University of Science and Technology
Priority date: 2004-01-05
Filing date: 2004-01-05
Publication date: 2004-12-22

Abstract

本发明公开了一种造血细胞在搅拌式生物反应器中的灌注培养方法，包括如下步骤：将分离得到的造血细胞悬浮于培养基中并接种至搅拌式反应器中进行培养；然后将培养基连续灌注于反应器，流出反应器的培养液在沉降截留装置中截留分离，截留分离的活细胞返回反应器。由于采取了灌注培养，反应器中总细胞、CFU－GM、和CD34⁺细胞的扩增倍数都显著高于静态培养，其中反应器中总细胞扩增56倍，CFU－GM扩增41倍，CD34⁺细胞扩增19倍。

Description

造血细胞在搅拌式生物反应器中的灌注培养方法

技术领域

本发明涉及一种造血细胞的培养方法，尤其涉及一种通过搅拌式生物反应器灌注培养造血细胞的方法。

背景技术

造血细胞包括各类血液细胞和淋巴细胞，在体内造血系统的发育中，所有的造血细胞由造血干细胞分化而来。造血干细胞的体外培养技术是在模拟体内造血系统发生和发育的基础上，添加造血细胞因子和各类营养成分，控制培养系统中的培养条件，从而实现造血细胞的增殖和发育，生产可用于医疗的造血干/祖细胞或各类成熟造血细胞的技术。

在造血细胞培养中，为了能及时补充营养成分、稳定培养环境，人们开发出了灌注反应器。早期的连续灌注反应器培养比换液培养提高了骨髓细胞的扩增量，而且它能获得LTC-IC的扩增。连续灌注培养更能使培养物中的葡萄糖和IL-3保持在高浓度而使乳酸保持低浓度。根据Palsson BO，Paek SH，Schwartz RM，et.al，Expansion of human bone marrow progenitorcells in a high cell density continuous perfusion system[J].Biotechnology.1993，11(3)：368-72.文献报导，Palsson等成功的利用灌注系统扩增了人骨髓CFU-GM和BFU-E。

根据Sandstrom CE，Bender JG，Papoutsakis ET，Miller WM.Effects ofCD34⁺cell selection and perfusion on ex vivo expansion of peripheral bloodmononuclear cells.Blood.1995，86(3)：958-70.文献报导，Sandstrom CE等人通过改进平板床培养腔，开发了无基质细胞的灌注式培养体系，成功地将CFU-GM扩增了17～19倍。这种培养腔包括多个微槽(与培养基流动的方向垂直)，它能提供均一的环境，允许营养物的扩散，但把细胞保留在腔体中。另外，这种培养系统能支持基质层细胞的形成。但这种系统由于几何形状的原因，放大比较困难，而且，它并没有完全消除浓度梯度的问题，细胞收获操作复杂。

根据Koller MR，Manchel I，Maher RJ，Goltry KL，Armstrong RD，SmithAK.Clinical-scale human umbilical cord blood cell expansion in a novelautomated perfusion culture system.Bone Marrow Transplant.1998，21(7)：653-63.文献报导，Koller等成功的设计了一个全新的自动灌注培养系统，并达到了临床规模。利用小规模的培养，该系统培养脐带血细胞，比静态培养时细胞总数提高了93％，CFU-GM提高了82％，LTC-IC提高了350％。

以上发明均为静态培养系统，其存在着培养环境不均一的问题，培养基中pH、溶氧、代谢物存在浓度梯度，而且，此浓度梯度还会由于初始条件如接种浓度、造血细胞类型的分布、培养基成分和培养样品的扩增程度不同而在各批培养之间造成很大的差异。另外，静态培养系统如孔板和方瓶是不可能进行在线监控，采集数据需要很烦琐的操作。最后，静态系统还受它能提供的表面积的限制而不能培养大量的细胞，这在放大时将造成很大的困难。因此，静态培养的缺点在于培养效率不高、重复性差、难以放大。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种造血细胞在搅拌式生物反应器中的灌注培养方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的方法包括如下步骤：

将悬浮于培养基中的造血单个核细胞接种至搅拌式反应器中培养；然后将培养基连续灌注于反应器，流出反应器的培养液在沉降截留装置中截留分离，截留分离的活细胞返回反应器。

按照本发明优选的方法，包括如下步骤：

(1)将悬浮于培养基中的造血单个核细胞以1×10⁶cells/mL的密度接种至反应器中，反应器搅拌转速为10～50r/min，温度控制为37℃，pH为7.0～7.2，溶氧为15～30％(空气饱和度)，培养2～6天，优选4天；

(2)将培养基连续灌注于反应器，在起始灌注培养的4天中，灌注速率为D/V＝1/5～1/3，流出反应器的培养液在沉降截留装置中截留分离，截留分离的活细胞返回反应器，第5天开始，调整灌注速率为D/V＝1/3～1/1，再培养7～14天。

其中：D/V指的是每天灌注入反应器的培养基体积与反应器的工作体积之比。

所说的沉降截留装置可采用常规的沉降截留装置，优选采用中国专利，申请号为200310109264.2的造血细胞连续灌注悬浮培养过程细胞沉降截留装置；

所说的造血单个核细胞来源于骨髓、动员的外周血和脐血；

所说的造血单个核细胞包括单个核细胞和纯化的CD34⁺细胞。

所说的培养基可采用常规的培养基，如IMDM培养基、RPMI1640培养基，并添加重量百分比为10％～30％的胎牛血清(FBS)，以及细胞因子组合SCF 20ng/mL～100ng/mL，IL-620ng/mL～50ng/mL，IL-3 1ng/mL～3ng/mL，FL 20ng/mL～100ng/mL，TPO 20ng/mL～100ng/mL。

造血细胞的搅拌悬浮培养中，对细胞培养结果有重要影响的参数为pH、溶氧水平和搅拌转速。

pH对造血细胞分化和发育有着重要的影响，必须控制在合适的范围内。造血细胞对于剪切力非常敏感，因此，搅拌培养中搅拌转速不能过高，否则过大的剪切力会使细胞受到损伤，从而影响细胞的生长；同时，搅拌转速不可过低，否则细胞不能有效悬浮，沉在反应器底部，则不能实现悬浮培养。

细胞因子对造血干细胞的体外扩增结果有着非常重要的影响。在造血干细胞的体外扩增中，要求所采用的细胞因子能促进干细胞高效地增殖，但同时不可促进干细胞的分化，使培养得到的干细胞具有高增殖潜能和体内重建造血的能力。另外，在体外培养过程中，祖细胞(如CFU-GM)和成熟细胞的产生是不可避免的，祖细胞和成熟细胞的剂量也是保证移植成功的关键因素，CFU-GM和CFU-Mk以及成熟的粒细胞和巨核细胞的含量对移植中的成功有着重要影响，因此，所用的细胞因子要在避免刺激干细胞分化的同时能产生大量的CFU-GM、CFU-Mk和成熟的粒细胞和巨核细胞。

细胞培养的初期，细胞生长缓慢，处于延迟期，此时不需进行灌注，培养到第4～6天时，细胞开始生长，营养物和细胞因子消耗开始增多，但此时细胞量较少，对营养物需求较少，产生的代谢物也较少，因此，灌注速率宜控制在较小的范围内，灌注速率以D/V＝1/5～1/3为适宜，细胞灌注培养到第7-9天时，细胞密度增加较快，而且其代谢旺盛，需要增加灌注速率以及时补充营养物和移出代谢物，此时，灌注速率以D/V＝1/3～1为适宜。

经实验证明，搅拌培养中，溶氧水平控制在15～30％(空气饱和度)时，细胞的扩增较高，干细胞特性的维持较好。pH控制在7.00～7.20，最有利于细胞的扩增。而搅拌转速控制在10～50转/分钟时，细胞能有效悬浮而且不至于造成强烈的剪切。

本发明采用灌注培养技术，能及时补充培养所需的营养成分，并及时移出培养中所产生的代谢废物，培养环境相对恒定，而减少了补料培养过程中培养环境的波动。灌注培养可实现细胞高密度培养，这就可以避免补料培养中存在的细胞培养到后期补料体积大大超过培养的初始体积，甚至出现反应器工作体积不能满足细胞培养所需体积的情况。灌注培养中，细胞密度可达到10⁷cells/mL，对于1L体积的反应器，可获得10¹⁰个细胞，这个数量能确保造血细胞的临床应用。利用搅拌式生物反应器培养细胞，消除了静态培养中浓度梯度引起的问题，其培养环境均一，有利于检测和实现在线监控，而且有利于建立标准化的培养工艺。由于采取了灌注培养，反应器中总细胞、CFU-GM、和CD34⁺细胞的扩增倍数都显著高于静态培养，其中反应器中总细胞扩增56倍，CFU-GM扩增41倍，CD34⁺细胞扩增19倍。

附图说明

图1为工艺流程图。

图2为总细胞扩增效果。

图3为CFU-GM细胞扩增效果。

图4为CD34⁺细胞扩增效果。

具体实施方式

参见图1，本发明的方法包括如下步骤：

(1)将悬浮于培养基中的造血单个核细胞接种至搅拌反应器1中培养；

(2)将培养基连续灌注于反应器1，流出反应器1的培养液在沉降截留装置2中截留分离，截留分离的活细胞返回反应器1。

实施例1

脐血经淋巴细胞分离液(Ficoll)梯度离心后，收集单个核细胞，并以IMDM培养基洗涤两次。体外培养基本培养基用IMDM，使用时添加20％胎牛血清(FBS)，以及SCF(50ng/mL)、IL-3(2ng/mL)、IL-6(20ng/mL)、FL(50ng/mL)和TPO(20ng/mL)，用上述培养基悬浮脐血单个核细胞，以1×10⁶cells/mL接种至反应器中。反应器搅拌转速为30r/min，温度控制为37℃，pH控制在7.1，溶氧为22％(空气饱和度)。

培养到第4天，开始进行灌注培养，灌注所用培养基与接种时培养基相同，7天时，灌注速率为D/V＝1/5，细胞培养到第7天以后，调整灌注速率为D/V＝1/3。

以方瓶静态培养做静态培养对照，其中方瓶置于37℃，5％的二氧化碳培养箱中进行培养，方瓶静态培养到第4天开始，每2天换液50％。

由图2，3和4可见，由于采取了灌注培养，反应器中总细胞、CFU-GM、和CD34⁺细胞的扩增倍数都显著高于方瓶，其中反应器中总细胞扩增56倍，CFU-GM扩增41倍，CD34⁺细胞扩增19倍。

Claims

1.一种造血细胞在搅拌式生物反应器中的灌注培养方法，其特征在于，将悬浮于培养基中的造血单个核细胞接种至搅拌式反应器中培养，然后将培养基连续灌注于反应器，流出反应器的培养液在沉降截留装置中截留分离，截留分离的活细胞返回反应器。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将悬浮于培养基中的造血单个核细胞接种至反应器中，反应器搅拌转速为10～50r/min，温度控制为37℃，pH为7.0～7.2，溶氧为15～30％，空气饱和度，培养2～6天；

(2)将培养基连续灌注于反应器，在起始灌注的4天中，灌注速率为D/V＝1/5～1/3，流出反应器的培养液在沉降截留装置中截留分离，截留分离的活细胞返回反应器，第5天开始，调整灌注速率为D/V＝1/3～1/1，再培养7～14天；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：将悬浮于培养基中的造血单个核细胞以1×10⁶cells/mL的密度接种至反应器中。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所说的造血单个核细胞来源于骨髓、动员的外周血和脐血。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所说的造血单个核细胞包括单个核细胞和纯化的CD34⁺细胞。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所说的培养基为常规的IMDM培养基，并添加重量百分比为10％～30％的胎牛血清(FBS)，以及细胞因子组合SCF20ng/mL～100ng/mL，IL-6 20ng/mL～50ng/mL，IL-31ng/mL～3ng/mL，FL20ng/mL～100ng/mL，TPO20ng/mL～100ng/mL。

7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于：沉降截留装置为重力沉降截留装置。