CN1555218A - 实现mRNA-介导的将遗传信息转移到植物中的方法及该方法的产物 - Google Patents

实现mRNA-介导的将遗传信息转移到植物中的方法及该方法的产物 Download PDF

Info

Publication number
CN1555218A
CN1555218A CNA018231772A CN01823177A CN1555218A CN 1555218 A CN1555218 A CN 1555218A CN A018231772 A CNA018231772 A CN A018231772A CN 01823177 A CN01823177 A CN 01823177A CN 1555218 A CN1555218 A CN 1555218A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mrna
seed
corn
plant
glycinin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA018231772A
Other languages
English (en)
Inventor
牛满江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MULTIGESIS CORP
Original Assignee
MULTIGESIS CORP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MULTIGESIS CORP filed Critical MULTIGESIS CORP
Publication of CN1555218A publication Critical patent/CN1555218A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明所公开的是用于有益的植物遗传转化的方法，该方法通过mRNA而非DNA介导遗传信息转移。此外还公开了表达由上述mRNA编码的蛋白的植物。

Description

实现mRNA-介导的将遗传信息转移到 植物中的方法及该方法的产物
                        发明领域
本发明属于分子生物学和遗传工程学领域。具体地说，本发明涉及将外源遗传物质(mRNA)引入植物的方法。
                        参考文献
本专利申请引用了多篇学术文章和科学出版物来描述本申请所涉及的现有技术。所有这些出版物均全文引入作为参考。
                        发明背景
现有技术中已有改良种多种作物的方法。其中的一些涉及将外源(即非内源)DNA引入植物细胞或组织，再分析所得植物中外源核酸的存在以及外源基因的表达。尽管这些方法在某些情况下可以取得成功，但它们费时、费力并且再现性差。因此，仍然需要进一步开发有利于农作物遗传转化的方法，以提高蛋白产量或对其进行改良使之更益于人和/或动物食用。
                        发明简述
一方面，本发明提供生产转基因植物的方法，该方法通过向植物中引入外源mRNA赋予所得转基因植物在其子代中合成外源蛋白的能力。本发明通过mRNA分子(而非DNA分子)传递遗传信息，相对于现有技术中应用的方法具有显著的进步。应用本发明的方法可使植物在表达有价值的外源蛋白的同时植物内源蛋白的表达也得到有益增长。
另一方面，本发明还包括表达有益外源蛋白的转基因植物，所述植物是通过下述步骤生产的：获得编码外源蛋白的mRNA的样品，在可使mRNA进入种子的条件下，用mRNA温育并接种植物种子，使种子发芽并从种子长成转基因植物。所述的mRNA样品优选来自大豆，最优选来自大豆的子叶或芽。另外，可通过经分离的、编码所述蛋白的DNA分子转录来获得上述mRNA样品，所述DNA分子例如编码在医药方面有用的蛋白(优选人蛋白，如γ干扰素，白介素1，白介素2和人生长激素)的DNA分子。更优选地，所述植物是玉米，最优选玉米品系27-1或85089。
另一方面，本发明包括表达大豆球蛋白、人白介素1、人白介素2或人γ干扰素的转基因植物，优选玉米。最优选地，在本发明的这一方面所述的玉米是品系27-1；或者是玉米品系85089。
在一个实施本发明的示例中，从大豆子叶中分离并纯化出mRNA用于玉米种子微注射。使经处理的种子萌芽，分析所得植物中外源蛋白的表达。微注射并转化后，通过蛋白检测技术分析繁殖出的转基因玉米植株中蛋白的存在与含量。用大豆球蛋白特异的放射性标记DNA探针，通过DNA印迹证实在经转化的玉米中存在大豆DNA。
在本发明另一个示例性的实施方案中利用的是从大豆的芽中分离出的mRNA。此外，还可以应用其他的玉米品系，如玉米品系85089。可一次、两次甚至多次将mRNA微注射到受体种子中。利用本发明的方法成功地生产出表达大豆球蛋白的转基因玉米植株。
下面通过详细描述和实施例对本发明的其他特点和有益之处进行阐述。
优选实施方案及已知的本发明最佳实施方式的详细描述
为了便于理解本发明，提供下述定义：
mRNA：信使核糖核酸是编码蛋白的DNA有义链的暂时性的互补拷贝。在真核生物中，这一基因表达过程中的重要中间产物是通过RNA聚合酶II从编码蛋白的基因转录而来。通常，先转录出较长的前-mRNA，然后在核内对其进行加工。而且，对于大多数真核mRNA还要通过转录后修饰加上5′帽结构和3′poly A尾。
转基因植物：通过重组核酸技术工程化、表达由其他植物或动物编码的外源蛋白的植物。
DNA杂交实验：由Edward Southern于1975年开发的一种技术，这项技术指：经电泳分离的DNA片段变性后从琼脂糖凝胶上转移到覆盖在该凝胶上的硝酸纤维素或尼龙膜上，然后再使其与互补核酸探针杂交。之所以需要上述的转移步骤是因为与凝胶本身杂交效率很低。这项技术普遍应用于分子遗传学领域，其多种应用形式通常用于从限制性片段混合物中鉴定出特定的DNA序列，例如确定基因组中某基因的存在、位置和拷贝数。该项技术也可用于DNA分型。
蛋白印迹：一种从复杂的蛋白混合物(如细胞抽提物)中检测一种或多种特定蛋白的方法，由于该方法类似于鉴定DNA序列的DNA杂交和鉴定RNA的RNA印迹方法而得名。该方法包括：通过变性SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白混合物，再由电印迹将上述混合物转移并固定到硝酸纤维素膜或尼龙固体膜上。然后将加载后的膜与针对感兴趣的蛋白的抗体一起温育。然后利用与某种酶共价连接并针对上述第一抗体的第二抗体检测在膜上如此形成的抗原-抗体复合物。利用酶反应形成的可溶性反应物指示膜上靶蛋白的位置。
Ouchterlony双向琼脂免疫扩散实验：在该实验中，将抗原和抗体置于琼脂糖凝胶中的孔内，两者相向扩散，在以适当比例相接触的区域沉淀形成不透明的线。包含几种抗原则的沉淀物通常产生多条线。在相邻近的孔中设置沉淀反应可用于评估抗原间的免疫关系。各抗原形成的线可能完全汇合，显示出免疫同一性。若抗原间部分相关则表现为马刺状，若形成十字交叉则表明抗原间不相关。
本发明的方法可以从所选择的来源中分离和纯化mRNA。分离后，将mRNA单独注射到植物的种子中(例如，玉米谷粒)，然后将其种植下去并使其生长至成熟。转化后，分析所得植物子代中的蛋白含量。可通过免疫和生化方法证明经处理的植物中是否存在外源蛋白。
下文中详细列出的实验数据表明，将植物或动物的mRNA微注射到玉米谷粒中可形成转基因玉米植株代，该植株中可形成由所选择的mRNA编码的蛋白。在不试图通过任何特定的解释对这一现象进行限定的情况下，这一现象表明上述的mRNA进行了反转录并整合到玉米的基因组中。因此，例如大豆mRNA产生的球蛋白在玉米的后续世代中得以表达。利用32P-标记的互补大豆球蛋白探针通过DNA印迹可以证明大豆球蛋白核酸序列的存在。
本发明的方法可以生产转基因玉米，其中的转基因可在后续世代中稳定遗传，该方法包括下述步骤：
1.分离或通过其他的方法获得所需的mRNA。
2.收获待遗传修饰的植物物种的种子。
3.使上述种子吸液膨胀。
4.将mRNA微注射到上述种子中。
5.种植上述种子并使其生长至成熟。
6.筛选长成的植株并从中选出含有由所需mRNA编码的蛋白的植株。
第一步，通过分离或其他方法获得所需的mRNA，任何在所需植物中表达的mRNA均可用于本发明。本申请中以两大类mRNA为例：(1)编码植物主要结构蛋白的mRNA，例如，大豆球蛋白；(2)编码具有有用的生物活性的蛋白；例如人生长激素(HGH)和人γ干扰素的mRNA。利用本发明的方法已引入植物的其他mRNA包括：
引入玉米品种85079的：大豆球蛋白，人生长激素，人白介素1，β，2，人γ-干扰素；
引入玉米品种27-1的：大豆球蛋白；
引入玉米品种340的：人白介素2；
引入美国甜玉米的：大豆球蛋白和人γ-干扰素；
引入水稻的：大豆球蛋白；
引入小麦的：大豆球蛋白和(试验性的)鸡肌球蛋白。
其他可用于本发明的mRNA包括但不限于人白蛋白，人尿激酶型纤溶酶激活物、水蛭素(来自水蛭的抗凝血剂)和人胸腺素-4。总之，本发明包括使用任何植物和动物的mRNA。
用常规方法分离mRNA，如Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory)(1989)或Ausubel等(编)现代分子生物学技术(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons(2001)中所描述的方法。
在一个优选实施方案中，所需的mRNA是主要的结构或贮存蛋白(如，大豆球蛋白)的mRNA，适量的mRNA可通过分离表达所述蛋白的组织如，大豆子叶或芽的总mRNA成分而获得。在另一实施方案中，所需的mRNA不是主要组分，该mRNA可由经分离的编码所述蛋白(如人细胞中的γ-干扰素)的DNA分子通过体外转录获得。体外转录系统是可商购的，如可购自Promega Biotech，Madison，Wisconsin或BRL，Rockville，Maryland。
接下来，需获得待遗传修饰的植物的种子。其可以是任何植物物种的种子，没有特别限定。优选地，所述的种子是可施用微注射技术的重要农作物的种子。在一个优选的实施方案中是来自玉米或小麦的种子。在另一个实施方案中是来自水稻的种子。在另外的实施方案中，它们可以来自其他重要的农作物，如大豆、大麦、苜蓿、高粱和黑麦，另外，它们也可以是其他果蔬作物的种子，包括但不限于番茄、胡萝卜、黄瓜、豌豆、花椰菜、菜花、卷心菜、菠菜等。特别优选用于本发明的是玉米，其任何品种均适用。特别适合的是品种27-1和85089。
将种子在水中浸泡适当时间，如对玉米为2-3天以使其充分吸液膨涨以适于微注射。利用可商购的微注射系统通过常规方法实施微注射。对玉米而言，微注射针应尽可能地靠近种子的中心轴。注射到玉米中的适宜mRNA量为1μg/μl蒸馏水。在将种子种植下去之前可进行多次注射，并且可注射多种特异的mRNA。
注射后种植种子并使其生长，对长成的植株的适当部分进行分析以确定是否存在由所注射的mRNA编码的蛋白。这种分析是本领域已知的。其包括蛋白分离(例如，实际地纯化所述外源蛋白并进行氨基酸组成或序列分析)或检测技术(例如免疫学技术，如蛋白印迹、免疫沉淀或Ouchterlony扩散)，以及mRNA或DNA检测(例如应用特异的DNA探针进行的斑点印迹、RNA印迹、DNA印迹)。
下述实施例对本发明的优选实施方式进行说明，其不对本发明进行任何形式的限制。
                       实施例1
              编码大豆球蛋白的mRNA对玉米的稳定转化
已在玉米中证实了基于转移由mRNA而非DNA编码的信息的遗传转化。由大豆的子叶和芽中提取mRNA，并将其分别引入玉米谷粒，然后种植经处理的谷粒。
材料和方法
mRNA的分离：根据文献(Niu，M.C.，L.C.Niu，C.Ma，Z.P.Lin and Y.L.Zhang(1980) Scientia Sinica，23：119-122.)公开的方法，利用发芽的大豆的子叶和/或芽(茎和根轴)提取mRNA。大豆中80％的poly A mRNA编码大豆球蛋白(1 IS和7S)。
玉米种子的微注射：分别处理来自玉米品系27-1和85089的种子，并进行下述分析：200粒玉米种子(即谷粒)为一批用自来水冲洗两次。然后在4NC条件下于双蒸水中浸润48到72小时。其间换水2或3次。再用可商购的微注射器将大豆mRNA(分离自大豆芽或大豆子叶)微注射到吸涨的种子中，所述的微注射器是带有一根不锈钢针、容量为100微升、带刻度的玻璃管。将针插入尽可能靠近种子中心轴的位置。注射量为每1毫克双蒸水1微克大豆mRNA。90％以上经注射的种子萌芽并长成了玉米植株。
从玉米谷粒中抽提蛋白：以6颗谷粒为一组于4℃下在双蒸水中浸泡过夜。去掉外皮在丙酮中浸泡脱水、醚浸泡脱脂、再碾成细粉末。用3ml抽提液(10％甘油，5％2-巯基乙醇，2.3％SDS，8M/L尿素，0.02％溴酚蓝溶于0.625M/L Tris-HCl中，pH6.8)抽提蛋白。离心(4000rpm 10min)去除沉淀。将上清液煮沸3min，离心(5000rpm5min)。将上清液贮存于-20℃以备分析。
SDS-PAGE：用不连续的SDS-PAGE方法(Laemmli，U.K.(1970)Nature，227：681-685)，提取出的蛋白可分离成一系列的带，用考马斯亮蓝R250染色。
Ouchterlony双向琼脂免疫扩散实验：用1.2％的琼脂制备实验用平板。兔抗-大豆蛋白血清用于检测在经mRNA-处理的谷粒和未经处理的对照样品中是否存在大豆蛋白。
利用蛋白印迹技术检测大豆蛋白：将在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验中获得的额外的带转移到硝酸纤维素膜上(Vaessen，R.T.M.J.，J.Kreke和G.S.P.Groot(1981)FEBSletter 124：193-196)。用下述缓冲液洗膜：(0.02M/L Tris缓冲盐溶液(TBS)，pH 7.4，和0.05％ Tween 20(TTBS))，然后密封在含4％牛血清白蛋白(BSA)TTBS的避光小室中，在30NC下作用2小时。在用TTBS液体清洗后，利用ProtoBlot蛋白印迹AP系统依照Promega技术手册检测大豆蛋白。
DNA分子杂交检测大豆DNA：从经大豆mRNA处理的和对照玉米样品中抽提DNA。将DNA在凝胶上电泳后转移到硝酸纤维素膜上。用可商购的反转录酶催化大豆mRNA转录成cDNA(Szkukalek，A.，和F.Solymosy(1994)Plant Science 99：183-187)。该cDNA切口平移成32P-标记的cDNA。用与大豆mRNA互补的32P-标记的cDNA探针对经处理的和对照玉米DNA进行DNA印迹分析。出现的杂交带表明在经处理的玉米中存在大豆球蛋白DNA序列。在对照样品中没有出现上述的杂交带。典型的凝胶包括含下述样品的泳道：大豆DNA对照；从未经注射的对照玉米样品中分离的DNA；从生长在不同田地中经大豆mRNA处理的玉米中提取的DNA。
结果
抽提蛋白随后进行生化实验表明，这些玉米谷粒表达大豆球蛋白。此外，通过蛋白印迹实验证明了在玉米的后续世代中存在mRNA-诱导的大豆球蛋白。
用与大豆球蛋白RNA特异的、32P-标记的cDNA探针对从经大豆球蛋白mRNA处理的玉米中分离的DNA进行DNA杂交分析。表明在经处理的玉米中存在大豆球蛋白核苷酸序列。
这些结果证明通过导入编码农业上重要蛋白的mRNA构建有价值的转基因植物是可行的。
重要经济植物物种的遗传转化是非常需要的。至今，将基因转移到植物中的策略通常包括将外源DNA导入原生质体或愈伤组织中，以使其导入核基因组。但是，难于使经上述转化的原生质体再生成特定的植物物种。这一实施例表明大豆球蛋白mRNA在玉米中的转化能力。这一结果说明通过mRNA分子递送遗传信息可用于稳定转化单子叶植物。本发明的利用mRNA分子的方法代表了一种比利用外源DNA转移遗传信息更可靠的向植物中引入新基因的方式。并且，mRNA诱导的遗传信息改变是稳定的，而由DNA诱导的遗传信息改变不稳定。
将两个高产玉米品系85089和27-1用于上述转化实验：利用冷苯酚抽提法从粉末化的大豆(子叶或芽)中分离总RNA，再经寡DT层析纯化。将分离出的mRNA调节为1微克每微升；将1微升所得溶液分别注射到吸涨的玉米谷粒中。经注射的两个不同品系的谷粒在10×12米的菜园中分别成排播种，排间用通道间隔。品系85089在四月末播种，品系27-1在五月末播种。种植期不同是为了避免交叉杂交。在田地中数米以外的地方播种未经注射的玉米谷粒(对照)。90％以上未经注射和经大豆mRNA-注射的种子均萌芽并长成植株。所有的植株均在10月份收获。
本发明的方法利用玉米品系27-1和85089实施。用于微注射的mRNA要从大豆的至少两个部位(如，子叶和芽)获得。
播种经微注射的玉米种子，并收获第一代玉米谷粒。分离自第一代的玉米蛋白SDS-PAGE结果表明额外的带约为67KD。利用兔抗-大豆蛋白血清进行的Ouchterlony双向琼脂免疫扩散实验表明上述的额外带来自大豆，并且是由于存在大豆球蛋白。接下来种植上述第一代的谷粒以观察所述大豆蛋白是否可以传递到下一代。
按下述方法对玉米第一代谷粒的抽提物进行分析以检测大豆球蛋白：SDS-PAGE：一穗玉米谷粒组成一个样品。总共分析了134个mRNA-处理组的样品和10个对照样品。在mRNA-处理组的134个样品中有29个表现出额外的带，其他的没有。在经处理的玉米的抽提物中额外带为67KD。来自未经处理的玉米的对照抽提物中没有发现新的带。
134个经mRNA-处理的玉米样品的SDS-PAGE分析数据总结于表1。当大豆子叶mRNA微注射到玉米品系85089和27-1一次后，有18.75％的85089植株表现出额外的带，而有23.68％的27-1玉米植株表现出额外的带。因此，对品系27-1的转化比对品系85089的转化更为有效。用大豆子叶分离的mRNA对每一27-1和85089植株进行两次微注射后所得的数据可进一步支持上述结果。在这些实验中，有26.47％的27-1玉米植株表现出额外的带，而只有20％的85089玉米植株表现出额外的带，结果参见表1。
将大豆芽mRNA一次或两次微注射到玉米品系85089中。由表1所示结果表明，第二次将大豆芽mRNA注射到玉米品系85089中并没有增加含额外带的植株的数量。
如下述表1所示，比较用来自大豆子叶或芽的mRNA微注射玉米品系85089后所得的结果表明，分离自大豆子叶的mRNA比分离自大豆芽的mRNA对产生转基因玉米植株更为有效：
    表1由SDS-PAGE证明的mRNA诱导的玉米蛋白额外带的形成频率
    实验结果   实验组   对照组
    mRNA的来源   大豆子叶     大豆芽   无
    mRNA处理次数   一次     两次     一次     两次   无
    所用的玉米菌株   85089   27.1     85089     27.1     85089     85089   85089     27.1
    实验的样品数   16   38     15     34     18     13   5     5
    表现出额外带的样品数量   3   9     3     9     3     2   0     0
    表现出额外带的样品百分比   18.75％   23.68％     20.0％     26.47％     16.67％     15.38％   0％     0％
Ouchterlony双向琼脂扩散实验：在SD S-PAGE实验结果的基础上，来自对照谷粒、带有或不带有额外带的玉米蛋白抽提物与兔抗大豆蛋白血清一起进行双向琼脂免疫扩散实验。所有带有额外带的玉米蛋白均与抗血清反应产生沉淀线，但强度有所不同。参见表2。
  表2.双向琼脂免疫扩散实验结果注；强反应＝4+，阳性反应＝2+，弱反应＝+
  实验结果                   mRNA处理组     对照
    带有额外带的29个样品     无额外带的105个样品     10个未经处理的样品
  免疫反应     4+，2+，+     无     无
对照及由不表达额外带的样品获得的玉米蛋白没有出现沉淀带。
对来自第二代玉米谷粒的抽提物进行如下分析：蛋白印迹技术：种植第一代谷粒收获第二代谷粒。利用蛋白印迹技术对第二代谷粒抽提物进行分析。结果出现了两条60-70KD间的带。而对照未观察到带。大豆蛋白出现在第二代玉米谷粒中的现象说明大豆mRNA将遗传信息转移到了玉米基因组中，因此使大豆球蛋白在下一代得以表达。
DNA印迹：在第二代及后续世代的玉米中发现大豆蛋白说明mRNA编码的大豆遗传信息已反转录并整合到玉米基因组中。这大概是由于在玉米种子中存在反转录酶。DNA印迹的结果表明在经转化的玉米中存在编码大豆球蛋白的DNA。杂交带的存在为经注射的大豆mRNA的反转录提供了证据。在由未经处理的玉米的DNA中未检测出来自大豆的核酸序列。
总的说来，鉴定玉米中的大豆蛋白分三步进行。第一步利用SDS-PAGE。观察到由经mRNA-处理的玉米谷粒长成的玉米抽提物的额外带。从未经处理的玉米分离的抽提物没有上述额外带。第二步由Ouchterlony双向琼脂免疫扩散实验，利用兔抗大豆蛋白血清对表现出额外带的玉米谷粒抽提物进行分析。抗血清和在SDS-PAGE中表现出额外带的谷粒抽提物之间出现了沉淀线(表2)。在抗血清和对照抽提物间没有出现沉淀线。第三步，为验证大豆球蛋白是否在玉米的下一代中表达，再次种植第一代的谷粒。收获由这些谷粒长成的玉米通过蛋白印迹分析其蛋白抽提物。这一实验的结果表明所出现的两条带应当代表两种大豆球蛋白，7S和11S(1)。最后，利用32P-标记的大豆特异性探针通过DNA杂交实验表明经mRNA处理的玉米中存在编码大豆球蛋白的核酸。
                     实施例2
      在转基因玉米谷粒中鉴定人生长激素和人γ干扰素
本实施例中所用的在转基因玉米中鉴定外源蛋白的方法是Yu和Niu在“RNA在发育和繁殖中的作用”( The Role of RNA in Development and Reproduction)一书pp.893-903，1981(引入作为参考)(编者：Niu和Chuang，China Press and distributed by Nostrand andReinhard Co.，New York，Cincinnati，Toronto，London andMelbourne)中发表的方法。
获取编码人生长激素(HGH)和γ干扰素蛋白的mRNA，依照如实施例1中所述的方法将其注射到玉米谷粒中。种植经注射的玉米谷粒并使其生长(此处指“第一代”)。种植第一代的谷粒使其长成成熟的植株(“第二代”)。
对于第一代，以6颗谷粒为一组，依照实施例1中描述的与从经大豆mRNA处理的玉米中抽提大豆球蛋白相同的方法进行抽提。对于第二世、代，以6颗谷粒为一组，每组的6颗谷粒分别来自6个穗轴(每一穗轴来自6株玉米植株的每一株)。离心抽提物。将水层用于SDS-PAGE分析。
SDS-PAGE表明与未经处理的植株相比，来自经HGH mRNA处理的玉米的谷粒表现出一条额外的带，推测为HGH。
SDS-PAGE分析进一步表明，经γ干扰素处理的植物植株的谷粒表现出一条与在上述经HGH-处理的植株中观察到的带几乎等分子量的额外的带。据认为两蛋白带定位近似是由于HGH和γ干扰素分子量相近的原因。
将每一凝胶板上的额外的带切除出来并从凝胶中洗脱。向分别来自γ干扰素凝胶平板和HGH凝胶平板的洗脱物中加入抗γ干扰素的兔血清或抗HGH的兔血清。得到两种沉淀：一种来自γ干扰素凝胶平板，另一种来自HGH凝胶平板。
作为对照，纯化的γ干扰素和纯化的HGH同样分别与相同的相应兔抗血清进行免疫沉淀反应。各种免疫沉淀反应如下：
来自经γ干扰素mRNA处理的谷粒的额外的带     g-AB+g-蛋白
与纯化的γ干扰素的免疫沉淀：               g-AB+g-AG
来自经HGH mRNA处理的谷粒的额外的带：       HGH-AB+HGH蛋白
与纯化的HGH的免疫沉淀：                    HGH-AB+HGH-AG
将g-AB+g-AG及g-AB+g-蛋白(其由额外的带洗脱得来)形成的沉淀进行SDS-PAGE。可以看到两种沉淀均分离成两条带。这些水平排列在接近17kDa分子量标记处的带有着近似的分子量(约15-17kDa)。将这些带洗脱出来。一个洗脱物是经纯化的蛋白，另一个是来自玉米谷粒的γ干扰素。
Yu和Niu在1981年利用离子交换层析分析了经胰蛋白酶消化的蛋白组分。他们发现两种蛋白(实验蛋白和对照蛋白)的肽图谱在化学组成上相似。但此处我分析了两种蛋白的氨基酸组成(纯化抗原和从谷粒中抽提的γ干扰素)，发现其各自的氨基酸组成几乎是相同的。
HGH-AB+HGH-AG和HGH-AB+HGH蛋白所形成的沉淀接受与上述相同的处理。发现这两种蛋白(抗原和经抽提的HGH)的氨基酸组成几乎相同。
上述为本发明的优选实施方案和示例性的说明，但本发明并非局限于上述的实施方案。在不脱离本发明的范围、不违背本发明的精神的情况下可对本发明进行修饰，如下述权利要求以及等同内容所示。

Claims (20)

1.一种生产表达外源蛋白的转基因植物的方法，该方法包括
a)获得编码所述外源蛋白的mRNA样品；
b)在可使所述mRNA进入所述种子的条件下，将所述植物的种子和mRNA一起温育；
c)使所述的种子萌芽；和
d)由所述种子长成所述转基因植物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的外源蛋白是大豆球蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述的外源蛋白选自：人生长激素，人γ干扰素，人白介素1，人白介素β和人白介素2。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的种子是玉米种子。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述外源蛋白利用选自下组的方法检测：蛋白印迹，双向琼脂免疫扩散，和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6.如权利要求1所述的方法，其中，通过微注射将所述mRNA引入所述种子中。
7.如权利要求2所述的方法，其中，所述的mRNA是从大豆子叶或芽分离的。
8.如权利要求3所述的方法，其中，mRNA是由经分离的DNA分子转录产生的。
9.一种由下述方法生产的表达外源蛋白的转基因植物，该方法包括
a)获得编码所述外源蛋白的mRNA样品；
b)在可使所述mRNA进入所述种子的条件下，将所述植物的种子和mRNA一起温育；
c)使所述的种子萌芽；和
d)由所述种子长成所述转基因植物。
10.如权利要求9所述的转基因植物，其中，所述的外源蛋白是大豆球蛋白。
11.如权利要求9所述的转基因植物，其中，所述的外源蛋白选自：人生长激素，人γ干扰素，人白介素1，人白介素β和人白介素2。
12.如权利要求9所述的转基因植物，其中所述的种子是玉米种子。
13.由权利要求9所述的转基因植物获得的种子。
14.如权利要求13所述的种子，其是玉米谷粒。
15.一种生产表达大豆球蛋白的转基因玉米植株的方法，该方法包括：
a)获得编码大豆球蛋白的mRNA；
b)在可使所述mRNA进入所述玉米种子的条件下，将玉米种子和所述mRNA一起温育；
c)使经步骤b)处理的玉米种子萌芽；
d)由所述萌芽的种子长成植株；和
e)在所得的转基因玉米植株中检测所述大豆球蛋白。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述的玉米是品种27-1或品种85089.
17.由权利要求14所述方法产生的转基因玉米。
18.表达大豆球蛋白的转基因玉米植物。
19.如权利要求18所述的植物，其中，所述的植物是玉米品种27-1或85089。
20.表达大豆球蛋白的转基因玉米谷粒。
CNA018231772A 2001-02-27 2001-02-27 实现mRNA-介导的将遗传信息转移到植物中的方法及该方法的产物 Pending CN1555218A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2001/006104 WO2002067663A1 (en) 2001-02-27 2001-02-27 Methods for effectuating mrna-mediated transfer of genetic information into plants and products of the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1555218A true CN1555218A (zh) 2004-12-15

Family

ID=21742366

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA018231772A Pending CN1555218A (zh) 2001-02-27 2001-02-27 实现mRNA-介导的将遗传信息转移到植物中的方法及该方法的产物

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1370130A4 (zh)
CN (1) CN1555218A (zh)
WO (1) WO2002067663A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4956282A (en) * 1985-07-29 1990-09-11 Calgene, Inc. Mammalian peptide expression in plant cells
US5215912A (en) * 1986-08-29 1993-06-01 Lubrizol Genetics, Inc. Monocot seed storage proteins in dicots
GB9118759D0 (en) * 1991-09-02 1991-10-16 Univ Leicester Recombinant dna
WO1993008682A1 (en) * 1991-11-05 1993-05-13 State University Of New Jersey - Rutgers A method of obtaining high methionine-containing corn seeds, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002067663A1 (en) 2002-09-06
WO2002067663A8 (en) 2004-02-19
EP1370130A1 (en) 2003-12-17
EP1370130A4 (en) 2004-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1045995C (zh) 在植物中诱导赖氨酸过量生成的方法
AU2003289283B2 (en) Plant with reduced protein content in seed, method of constructing the same and method of using the same
CN1533438A (zh) 在植物生产蛋白质的方法
CN104073486B (zh) 一种与大口黑鲈快速生长相关的snp位点及其鉴定方法和应用
CN110066323A (zh) 微藻捕光蛋白NoHLR1基因及其应用
EP2365071B1 (en) Transformed soybean plant which stores vaccine, and use thereof
CN106496313B (zh) 抗病相关蛋白IbSWEET10及其编码基因与应用
CN108558992B (zh) 调控金针菇子实体发育的转录因子pdd1及其编码基因与应用
US11202419B2 (en) Soybeans with reduced antinutritional factor content
CN1193047A (zh) 表达c4植物光合酶的c3植物
CN108103087A (zh) 一个插入内含子修饰的大豆氨基酸转运蛋白融合基因及其应用
Yu et al. Seed-specific expression of the lysine-rich protein gene sb401 significantly increases both lysine and total protein content in maize seeds
CN110616225B (zh) 玉米生长素转运基因ZmABCB15及其在抗粗缩病中的应用
CN1471578A (zh) 在植物种子中高水平蓄积外源基因产物的方法
CN114807172B (zh) 一种盐响应的玉米功能基因
CN1636056A (zh) 拟南芥属(Arabidopsis)用于生产人类及动物的治疗及诊断用蛋白质的商业用途
CN1555218A (zh) 实现mRNA-介导的将遗传信息转移到植物中的方法及该方法的产物
CN108610405A (zh) 蛋白质TaNRT2.5在调控植物根系发育中的应用
CN106834270A (zh) 一种离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法
CN102952811B (zh) 一种小麦类燕麦b类蛋白基因及其应用
CN111996128A (zh) 一种适合工厂化栽培的金针菇及其分子鉴定方法
CN1966691A (zh) 提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体及其制法和用途
CN108504665A (zh) 一种花椰菜内参基因及其应用
CN1422665A (zh) 生产抗哺乳动物病毒标记疫苗的方法
US6198025B1 (en) Methods for effectuating mRNA transfer of genetic information between species and product of the same

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication