CN1554026A - 预后指示剂 - Google Patents

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Abstract

一种转移预后指示剂，其含有一种抗骨桥蛋白抗体。

Description

预后指示剂
发明领域
本发明涉及一种转移(metastasis)预后指示剂，针对转移癌的一种疫苗，一种治疗转移的方法，和一种用于诊断危及生命的转移的试剂盒。
发明背景
大多数癌症被认为是由于特定基因的改变所致，这种改变的原因是：以某种方式使其基因产物更加有效的突变，或使作用增强的正常基因的过量表达。这些癌基因基本已经通过下列方法鉴定：将人类癌症的DNA的基因长度片段导入小鼠成纤维细胞系中，培养，筛选那些在液体或半固体培养基中以不受控制的方式生长的细胞系。癌基因本身利用标准重组技术通过从小鼠DNA中克隆人类DNA片段分离。此外，突变也能在抑制癌基因活性的基因(例如P53或Rb)或抑制其产物水平的基因(例如NM-23)中发生。它们被称为肿瘤抑制基因。对于常见的癌症，一般认为需要在癌基因或肿瘤抑制基因中有5-7个这样的改变才能导致充分发展的癌症。
主要的癌症形式，包括乳癌、肺癌和结肠癌，不能有效地治愈，因为，虽然当前的治疗对于原发肿瘤可能有效，但对扩散或转移的细胞基本无效，最终使患者死亡。尽管进行了大量的癌症研究工作，但对于转移的最重要的危及生命的过程，在分子水平上知之甚少。已经发现的大多数癌基因和抑制基因，是根据它们促进小鼠成纤维细胞系不受控制地生长的能力而发现的。该领域的主要问题是，测定细胞生长不能确定转移过程。实际上，虽然不受控制的生长是癌症发展初期事件的一个重要方面，但是远距转移的生长速率可能显著降低。因此，除最后阶段外，转移过程基本不依赖于与细胞生长有关的过程。因此，癌基因和肿瘤抑制基因不可能过多地参与转移过程，也不可能是控制和消除转移性疾病的有用的诊断或治疗靶标。
与癌症形成转移有关的一种蛋白质是骨桥蛋白(Oates，A.J.等人，1997，Invasion and Metastasis 17，1-15)。骨桥蛋白(OPN)是一种分泌的、整联蛋白结合的、钙结合的、带负电的糖基化磷蛋白，其分子量约为44-60Kda，与正常的和病理过程均有关。OPN在所有体液和矿化组织的细胞外基质中均有发现，是骨中较丰富的非胶原蛋白成分之一。除了活化的T淋巴细胞外，它一般还存在于骨、肾脏、血管、内耳、胆囊上皮细胞、胃肠道、支气管、乳腺、尿道和生殖道、唾液管和汗腺管、连续更新的组织中。OPN已经显示在恶性肿瘤细胞和转移性疾病患者的血液中高水平表达，因而推断OPN在恶性肿瘤中起作用(Singer D.R.等人，与肿瘤转化有关的分泌磷蛋白。Cancer Res 48：5770-5774，1988)。也有大量研究表明，由于转移，乳癌的血液OPN水平显著升高，较高的OPN水平对应于降低的存活率(Singhal，H，Clinic Cancer Res 3：605-611，1997；Bellahcene，A和Castranovo V，Am.J.Pathol 146：95-100，1995)。
人OPN前体的序列已经阐明，翻译如下：(SEQ ID No.1)
                  MRIAVI CFCLLGITCA IPVKQADSGS
SEEKQLYNKY PDAVATWLNP DPSQKQNLLA PQNAVSSEET
NDFKQETLPS KSNESHDHMD DMDDEDDDDH VDSQDSIDSN
DSDDVDDTDD SHQSDESHHS DESDELVTDF PTDLPATEVF
TPVVPTVDTY DGRGDSVVYG LRSKSKKFRR PDIQYPDATD
EDITSHMESE ELNGAYKAI PVAQDLNAPSD WDSRGKDSYE
TSQLDDQSAE THSHKQSRLY KRKANDESNE HSDVIDSQEL
SKVSREFHSH EFHSHEDMLV VDPKSKEEDK HLKFRISHEL
DSASSEVN
(Crosby，A.H.等人，人骨桥蛋白基因的基因组构成；排除了基因座在II型牙本质发生不全发病机理中的病因作用。Genomics27(1)，155-160，1995)。
骨桥蛋白在以前也被视为胃癌(Ue，T等人，Int J Cancer 79；127-132，1998)和乳癌(Tuck，AB等人，Int J Cancer 79；502-508，1998)的一种预后指示剂，但是预后的差异远非绝对的。
尽管主要的工作与癌细胞中存在OPN有关，但是还不能阐明OPN(通常)在癌症或(尤其在)转移中的作用。本发明的一个目的是为已知在癌细胞中存在OPN的患者获得实际利益。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供一种转移预后指示剂，其含有一种抗骨桥蛋白抗体。
申请人惊讶地发现，在不表达骨桥蛋白的乳癌个体中没有危及生命的转移扩散。
因此，OPN的表达可能是转移过程的起因。因此，利用本发明，通过阻止OPN表达缓解或治愈危及生命的癌症的方法是可能的。
在本发明中有用的抗体可以在组织学上用于骨桥蛋白基因产物或其保守变体或肽片段的原位检测。原位检测可如下进行：从患者采集组织学标本，然后加至本发明的抗骨桥蛋白抗体上，随后用标记的第二抗体显示。利用这种方法，不仅能确定骨桥蛋白基因产物或保守变体或肽片段的存在，而且能确定它在所检测的组织中的分布。应用本发明，普通技术人员可以理解，为了完成这种原位检测，能改进其它多种组织学方法，如染色方法。优选地，只检测癌上皮细胞；忽略巨噬细胞、宿主基质等引起的染色。
例如，可以用如上所述的抗体或抗体片段检测骨桥蛋白或其保守变体或肽片段的存在，或者可以用标记的cDNA反义探针检测mRNA。例如，可使用荧光标记抗体，通过与光学显微镜、流式细胞或荧光检测偶联的免疫荧光技术完成。
对骨桥蛋白基因产物或其保守变体或肽片段的测定一般包括：在能够鉴定骨桥蛋白基因产物或其保守变体或肽片段的可检测标记抗体存在下温育样品，如组织提取物、新收集的细胞或在细胞培养物中温育的细胞裂解物，并通过本领域众所周知的多种技术之一检测结合的抗体。
生物样品可以接触或固定于一种固体载体上，如硝酸纤维素，或能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的其他固体载体。洗涤载体，然后用可检测的标记骨桥蛋白特异性抗体或抗体片段处理。用一种缓冲液第二次洗涤固体载体，除去未结合的抗体。然后可以用常规方法检测结合于固体载体上的标记物的量。
根据本发明的第二方面，提供一种含有抗原肽的疫苗，它可产生一种抗骨桥蛋白抗体。
肽可来源于骨桥蛋白的至少10个连续氨基酸。优选地，该肽来源于骨桥蛋白的14-20个连续氨基酸。更优选地，该肽来源于骨桥蛋白的氨基端氨基酸，因为氨基端暴露于细胞外。更优选地，该肽来源于上述人OPN前体序列的28-48区(SEQ ID No.2)的氨基酸：EEKQLYNKY PDAVATWLNP DP。
更优选地，该肽来源于上述人OPN前体序列的32-45区(SEQ IDNo.3)的氨基酸：QLYNKYPDAVATWL。
该肽可能包含与SEQ ID No.2至少70％同源的氨基酸序列，优选地，该肽与SEQ ID No.2有至少80％的同源性，更优选地，该肽与SEQ ID No.2有至少90％的同源性。再更优选地，该肽与SEQ IDNo.3有至少70％的序列同源性，甚至更优选地，该肽与SEQ IDNo.3有至少80％的序列同源性，最优选地，该肽与SEQ ID No.3有至少90％的序列同源性。
优选地，该疫苗还含有佐剂：目前，明矾(氢氧化铝和/或磷酸铝)是获准普遍用于人类疫苗的唯一佐剂。其它佐剂，特别是弗氏完全佐剂，已经用于动物，并且十分有效，但是到目前为止，毒副作用仍然妨碍了它在人类中的应用。铝盐佐剂一般以两种方式与蛋白质佐剂一起使用：(a)作为明矾沉淀的疫苗和(b)作为明矾吸附的疫苗(Harlow，E&D.Lane，1988，《抗体：实验室手册》，冷泉港实验室；Nicklas，W.，1992，铝盐。Research in Immunology 143：489-493。市售明矾一般为Al(OH)3(丹麦/Accurate Chemical and Scientic Co，Westbury，New York的铝水凝胶-superfos)。
在本发明第二方面的一个实施方案中，抗原肽可与一种载体蛋白质偶联。
根据本发明的第三方面，提供一种治疗转移的方法，包括施用一种调节骨桥蛋白表达的化合物。
在一个实施方案中，可阻断骨桥蛋白的表达。
该化合物可以是一种抗骨桥蛋白抗体，它可提供阻断骨桥蛋白mRNAs翻译的反义分子，或者可提供与骨桥蛋白基因5’区互补并阻断转录的核酸分子。
该化合物也可以是调节表达的任何一种小分子。该化合物可通过阻断骨桥蛋白的转录或翻译，或通过与T细胞因子(TCF)4相互作用阻止其诱导，阻断骨桥蛋白表达的诱导，或者该小分子可与DNA上的CAAAG序列相互作用，阻止它与TCF4螯合，从而阻止骨桥蛋白的诱导(El Tanani等人，Oncogene 20，1793-97(2001)；El Tanani等人，Cancer Research 61，5619-5629(2001))。该化合物也可阻止骨桥蛋白与整联蛋白ανβ1、整联蛋白ανβ3、ανβ5或α4β1的相互作用(Liaw L等人，J Clin Invest 95，713-724(1991)；Miyaichi等人，J.Biol Chem 266，20369-20374(1991)；Bayless等人，J CellScience 111，1165-1174(1998))。优选地，该小分子的分子量小于2kDa。
根据本发明的第四方面，提供一种诊断转移的试剂盒，其包含如上所述的一种预后指示剂和一种或多种目视指示剂。
根据本发明的第五方面，提供如权利要求1-8中任一项所述的预后指示剂的用途，用于确定研究对象是否有发生转移的危险，包括使受检样品接触该预后指示剂，检测预后指示剂与受检样品间复合物的形成。
根据本发明的另一方面，提供一种确定研究对象是否有发生转移的危险的方法，包括使受检样品接触如权利要求1-8中任一项所述的预后指示剂，检测预后指示剂与受检样品间复合物的形成。
仅以举例方式，现在参照下列实施例和附图，描述检测骨桥蛋白的存在的一种方法：
附图说明
图1.乳癌患者的Kaplan Meier存活曲线，其中原发肿瘤表达不同含量的OPN，混合阳性染色组。
图2.图1中确定的乳癌患者的Kaplan Meier存活曲线，其中这些组别分开表示，显示骨桥蛋白表达的剂量-应答作用。
图3.显示肽检测的Western印迹分析，其中使用抗Cys+兔骨桥蛋白前体的氨基酸32-45(SEQ ID No.4CQLYHKHPDALATWL)的抗血清。
实施例
图1和图2显示Kaplan Meier存活曲线，其中手术切除的乳癌组织采自一组339名原发癌症患者，他们处于可进行手术的疾病第一阶段和第二阶段，来自Merseyside地区，于1976-1982年间在皇家大学医院诊断(Winstanley等人，1991，Br J Cancer 63：447-450；1993，Br J Cancer 67：762-772)。年龄范围为29-92岁(平均57岁)。标本组织在中性缓冲的福尔马林中常规固定，并且保存于石蜡块中。获得患者存活率的后续信息并且更新至1995年8月31日。抗骨桥蛋白(alphaMBIII Bio(1))来自爱荷华州大学的Development StudiesHybridoma Bank，是IgG1同种型的一种单克隆小鼠抗体，用含有0.05％BSA的PBS 1/30稀释使用。第二种抗体是生物素化的绵羊抗小鼠抗体(Amersham，Bucks)，用含有0.5％BSA的PBS 1/200稀释使用。抗体用ABC复合物(Dako，Bucks)和二氨基联苯胺显色。由两名独立的观察者评估染色，记录每种标本两个切片中，骨桥蛋白细胞质染色的癌细胞的百分数，在200×放大倍数下每个切片10个视野(未染色的细胞用Mayer′s Haemalum复染)。忽略原位癌的染色水平，以及巨噬细胞、淋巴细胞、宿主基质、纺锤细胞和血管的染色。分组定义如下：＜1％的细胞染色＝ve，＜5％＝+/-，5-25％＝+，25-50％＝++，50-75％＝+++，75-100％＝++++。这些组分别包含51、66、60、95和67个癌。参照图1和图2，对于除-对+/-和+++对++++之外的所有组，组间差异显著，水平为5％。
申请人进一步表示，当MCF-7细胞(一种人类乳腺转移性细胞系)在培养中存活时，该细胞被上述抗骨桥蛋白抗体识别，这清楚地表明，该疫苗将在体内起作用。
图3显示一种Western印迹分析，其中牛骨桥蛋白(3μg)在12％SDS凝胶中电泳，并电印迹到硝酸纤维素膜上。将膜切成三部分，每一部分与用含有0.05％(v/v)TWEEN 20的Tris-缓冲盐溶液(pH7)(PBST)1∶1000稀释的抗血清一起4℃温育过夜。在用TBS-T洗涤几次后，该膜与1∶1000稀释的与辣根过氧化物酶(Dako)偶联的猪抗兔免疫球蛋白一起室温温育2小时。结合的抗体用ECL发光底物试剂盒(BioRad)和感光胶片显示。通过将显色的胶片叠加在膜上，能在胶片上指出预染色的已知分子量的蛋白质在膜上的位置。抗肽1抗血清针对兔骨桥蛋白序列的15个氨基酸的肽。GO61和GO62是指来自接种该肽的两只动物的抗血清。LF123是针对重组人骨桥蛋白的全兔血清。
肽CQLYHKHPDALATWL(Cys+骨桥蛋白前体的氨基酸32-45)商业合成(Genosphere Biotechnologies，2 Rue de Gravillieres，75003，巴黎，法国)，并通过半胱氨酸与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联(Lener等人，1981，PNAS 78，3404-3407)。两只兔子注射该构建体以及佐剂(以3周的间隔注射4次)，第一次注射使用弗氏完全佐剂，其它使用弗氏不完全佐剂，最后一次注射2周后放血。
用含有1％牛血清白蛋白和0.01％叠氮钠的磷酸盐缓冲液1∶10000稀释的抗血清，通过ELISA检测肽，而1∶1000稀释的抗血清通过Western印迹法检测牛OPN。在Western印迹中，一只兔也识别一种～35kDa的较小的多肽。
这证明：(i)该肽是抗原性的，(ii)短期内，不会损害宿主。
                          序列表
<110>University of Liverpool
<120>预后指示剂
<130>P403645WO/jdm/dgr
<140>
<141>
<150>0023080.5
<151>2000-09-20
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>314
<212>PRT
<213>人
<400>1
Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys
Ala
  1               5                  10                  15
Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln
Leu
             20                  25                  30
Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp
Pro
         35                  40                  45
Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser
Glu
     50                  55                  60
Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn
Glu
 65                  70                  75
80
Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp
His
                 85                  90                  95
Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val
Asp
            100                 105                 110
Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp
Glu
        115                 120                 125
Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr
Glu
    130                 135                 140
Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg
Gly
145                 150                 155
160
Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg
Arg
               165                 170                 175
Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser
His
            180                185                 190
Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val
Ala
        195                200                 205
Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp
Ser
    210                215                 220
Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser
His
225                 230                 235
240
Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn
Glu
                245               250                  255
His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg
Glu
            260               265                 270
Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val
Asp
        275                280                285
Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser
His
    290                295                300
Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn
305                 310
<210>2
<211>21
<212>PRT
<213>人
<400>2
Glu Glu Lys Gln Leu Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr
Trp
  1               5                 10                  15
Leu Asn Pro Asp Pro
             20
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>3
Gln Leu Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu
  1               5                  10
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>兔
<400>4
Cys Gln Leu Tyr His Lys His Pro Asp Ala Leu Ala Thr Trp Leu
  1               5                  10                  15

Claims (28)

1.一种转移预后指示剂，其含有一种抗骨桥蛋白抗体。
2.如权利要求1所述的预后指示剂，其包含一种抗骨桥蛋白基因产物的抗体。
3.如权利要求2所述的预后指示剂，其中该抗体针对一种来源于骨桥蛋白的肽。
4.如权利要求3所述的预后指示剂，其中该肽来源于骨桥蛋白的氨基端。
5.如权利要求3所述的预后指示剂，其中该肽包含SEQ IDNo.1的至少10个连续氨基酸的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的预后指示剂，其中该肽包含SEQ IDNo.1的14-20个连续氨基酸的氨基酸序列。
7.如权利要求5或6之一所述的预后指示剂，其中该肽包含与SEQ ID No.2至少70％同源的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的一种预后指示剂，其中该肽包含与SEQID No.2至少90％同源的氨基酸序列。
9.一种针对转移癌的疫苗，其含有一种来源于骨桥蛋白的抗原肽。
10.如权利要求9所述的疫苗，其中该疫苗针对转移性乳癌。
11.如权利要求9或10之一所述的疫苗，其中该抗原肽来源于骨桥蛋白的氨基端。
12.如权利要求10或11之一所述的疫苗，其中该抗原肽包含SEQ ID No.1的至少10个连续氨基酸的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的疫苗，其中该抗原肽包含SEQ IDNo.1的14-20个连续氨基酸的氨基酸序列。
14.如权利要求12或13之一所述的疫苗，其中该抗原肽包含与SEQ ID No.2至少80％同源的氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的疫苗，其中该抗原肽包含与SEQ IDNo.2至少90％同源的氨基酸序列。
16.如权利要求9-15中任一项所述的疫苗，其中该抗原肽与一种载体蛋白偶联。
17.如权利要求9-16中任一项所述的疫苗，其含有一种佐剂。
18.如权利要求17所述的疫苗，其中该佐剂是明矾或弗氏完全佐剂。
19.一种治疗转移的方法，包括施用一种调节骨桥蛋白表达的化合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中骨桥蛋白的表达被阻断。
21.如权利要求19所述的方法，其中该化合物是一种抗骨桥蛋白抗体。
22.如权利要求19所述的方法，其中该化合物提供一种阻断骨桥蛋白mRNAs翻译的反义分子。
23.如权利要求19所述的方法，其中该化合物提供一种与骨桥蛋白基因5’区互补并阻断转录的核酸分子。
24.如权利要求19所述的方法，其中该化合物是一种小分子。
25.如权利要求24所述的方法，其中该化合物的分子量为2KDa或更低。
26.一种诊断转移的试剂盒，其包含如权利要求1-8中任一项所述的一种预后指示剂和一种或多种目视指示剂。
27.如权利要求1-8中任一项所述的预后指示剂的用途，用于确定研究对象是否有发生转移的危险，包括使受检样品接触该预后指示剂，检测预后指示剂与受检样品间复合物的形成。
28.一种确定研究对象是否有发生转移的危险的方法，包括使受检样品接触如权利要求1-8中任一项所述的预后指示剂，检测预后指示剂与受检样品间复合物的形成。
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