CN1539011A - 碳水化合物和多元醇用于溶解蛋白晶体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从培养液中回收目的蛋白的方法，包括：在回收过程中，向培养液中加入一种分子式为CnH2n+2On的多元醇，其中n为4－8，和/或一种碳水化合物，和/或其衍生物。

Description

碳水化合物和多元醇用于溶解蛋白晶体
技术领域
本发明涉及一种避免在回收过程中形成蛋白结晶/非晶形(amorphous)沉淀的方法。
背景技术
在发酵过程中，一些蛋白的产量超过了它的溶解度限制，也就是说，它们在培养液中以部分沉淀的形式存在。这种沉淀可以是结晶形的，也可以是非晶形沉淀。
虽然，在发酵过程中，一些蛋白的产量低于它的溶解度限制，但是，由于在回收过程中，需要对目的蛋白进行浓缩，而使得其浓度超过了它的溶解度限制，因此很可能形成部分蛋白结晶。
此外，为了在下游过程中节约用水以及满足消费者对高浓度产品的需求，人们都倾向于使用较高浓度的酶溶液处理。
因此，需要格外注意使蛋白保持在溶液中或使已经沉淀的蛋白重新溶解在溶液中，否则蛋白的回收产量将会降低。
本发明的目的就是提供一种简单而有效的方案来解决上述问题。
发明简述
本发明惊奇地发现，在回收过程中，通过向培养液中加入碳水化合物和/或多元醇和/或其衍生物可以提高蛋白的有效溶解性，进而简单而又有效地阻止培养液中蛋白沉淀或蛋白结晶的形成。本发明还提供了一种简单而有效地溶解蛋白沉淀或结晶的方法。本发明特别要求：
一种从培养液中回收目的蛋白的方法，包括：
在回收过程中，向培养液中加入一种分子式为CnH2n+2On的多元醇，其中n为4-8，和/或一种碳水化合物，和/或其衍生物；
以及
一种从培养液中回收目的蛋白的方法，包括使目的蛋白在超过其溶解度限制时仍然存在于溶液中的回收步骤，包括通过先于该回收步骤或在该步骤结束后立即向培养液中加入一种碳水化合物，和/或一种多元醇和/或其衍生物。
发明详述
本发明涉及一种新的、非常有效的避免或降低形成蛋白结晶或沉淀的方法。
本发明惊奇地发现，在回收过程中，通过向培养液中加入碳水化合物和/或多元醇和/或其衍生物可以降低蛋白结晶/沉淀，进而有效地阻止了培养液中蛋白结晶/沉淀的形成。
可以采用一种更为简单的回收方法来提高蛋白产量，在该方法中避免了回收过程中蛋白结晶/沉淀的形成。
在本发明的优选实施方案中，应用上述方法进行酶的回收，特别是水解酶(按照生物化学国际命名委员会推荐的酶的命名法，属于EC 3类)。
在特别优选实施方案中，优选采用下述水解酶：
蛋白酶：
合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶，优选微生物来源的蛋白酶，还包括了经过化学修饰或蛋白工程(包括取代、插入，和/或缺失)产生的蛋白酶突变体。蛋白酶可以是酸性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶类蛋白酶。碱性蛋白酶的实例可以是枯草杆菌蛋白酶，特别是那些来源于杆菌属(Bacillus)的蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶类蛋白酶的实例可以是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属(Fusarium)蛋白酶，描述于WO 89/06270和WO 94/25583。
有用的蛋白酶的实例是描述于WO 92/19729，WO 98/20115，WO98/20116和WO 98/34946中的变异体，特别是在位置27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274处发生一个或多个位点取代的变异体。
优选的商业蛋白酶包括AlcalaseTM，SavinaseTM，PrimaseTM，DuralaseTM，EsperaseTM，RelaseTM和KannaseTM(Novozymes A/S)，MaxataseTM，MaxacalTM，MaxapemTM，ProperaseTM，PurafectTM，Purafect OxPTM，FN2TM和FN3TM(Genencor国际公司)。
脂酶：
合适的脂酶包括细菌或真菌来源的脂酶，也包括了经过化学修饰或蛋白工程(包括取代、插入，和/或缺失)产生的脂酶突变体。可以采用的脂酶有来源于腐质霉属(Humicola)(与Thermomyces同义)的脂酶，例如描述于EP 258 068和EP 305 216的来源于H.Lanuginosa(T.Lanuginosus)的脂酶或描述于WO 96/13580的来源于H.insolens的脂酶；假单胞菌属(Pseudomonas)脂酶，例如来源于P.alcaligenes或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)的脂酶(EP 218 272)，来源于葱头假单胞菌(P.cepacia)的脂酶(EP 331 376)，来源于司徒茨氏假单胞菌(P.stutzeri)的脂酶(GB 1,372,034)，来源于荧光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌菌株(Pseudomonas sp.)株系的SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，来源于P.wisconsinensis的脂酶(WO 96/12012)；杆菌属脂酶，例如来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的脂酶(Dartois等，1993，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)的脂酶(WO 91/16422)。
其它实例还可以采用描述于WO 92/05249，WO 94/01 541，EP 407 225，EP 260 105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO 95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中的脂酶的变异体。
优选的商业脂酶包括LipolaseTM，Lipolase UltraTM和LipexTM(NovozymesA/S)。
淀粉酶：
合适的淀粉酶(α和/或β-淀粉酶)包括细菌或真菌来源的淀粉酶，也包括了经过化学修饰或蛋白工程(包括取代、插入，和/或缺失)产生的淀粉酶突变体。淀粉酶包括了，例如详细描述于GB 1,296,839的来源于杆菌属，如来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)特殊株系的α-淀粉酶。
可以采用的淀粉酶实例有描述于WO 94/02597，WO 94/18314，WO96/23873和WO 97/43424的变异体，特别是在位置15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444处发生一个或多个位点取代的变异体。
商业淀粉酶有DuramylTM，TermamylTM，FungamylTM，NatalaseTM，Termamyl LCTM，Termamyl SCTM，Liquizyme-XTM和BANTM(Novozymes A/S)，RapidaseTM和PurastarTM(Genencor国际公司)。
纤维素酶：
合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶，也包括了经过化学修饰或蛋白工程(包括取代、插入，和/或缺失)产生的突变体。合适的纤维素酶包括了来源于芽孢杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)、草根霉属(Thielavia)和支顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US5,776,757和WO 89/09259的来源于Humicola insolens、Myceliophthorathermophila和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶是带有颜色效果(colour care benefits)的碱性或中性纤维素酶，所述纤维素酶的实例有描述于EP 0 495 257，EP 0 531 372，WO 96/11262，WO 96/29397和WO 98/08940的纤维素酶。还可以选用实例有描述于WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299中的纤维素酶的变异体。
商业纤维素酶有CelluzymeTM和CarezymeTM(Novozymes A/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor国际公司)，KAC-500(B)TM(Kao公司)。
氧化还原酶：
本发明使用的氧化还原酶可以是过氧化物酶和氧化酶，例如漆酶和过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)。
过氧化物酶：
具有过氧化物酶活性的酶可以是包含于酶分类(EC 1.11.1.7)中的任何过氧化物酶或显示过氧化物酶活性的由其衍生的片段。
本发明优选采用的过氧化物酶是由真菌或细菌等微生物产生的。一些优选的真菌包括属于Deuteromycotina亚类和丝孢菌(Hyphomycetes)类的菌株，例如镰孢属(Fusarium)，腐质霉属，Tricoderma，漆斑菌属(Myrothecium)，轮枝孢属(Verticillum)，Arthromyces，卡尔黑霉属(Caldariomyces)，Ulocladium，Embellisia，枝孢属(Cladosporium)或Dreschlera，特别是尖孢镰孢(DSM 2672)，Humicola insolens，Trichoderma resii，Myrotheciumverrucana(IFO 6113)，棉黄萎轮枝孢(Verticillum alboatrum)，大丽花轮枝孢(Verticillum dahlie)，Arthromyces ramosus(FERM P-7754)，烟色卡尔黑霉(Caldariomyces fumago)，Ulocladium chartarum，Embellisia alii或Dreschlerahalodes。
其它优选的真菌包括属于Basidiomycotina亚类和担子菌类(Basidiomycetes)的菌株，例如Coprinus，Phanerochaete，Coriolus或栓菌属(Trametes)，特别是Coprinus cinereus f. microsporus(IFO 8371)，Coprinusmacrorhizus，Phanerochaete chrysosporium(例如NA-12)或栓菌属(Trametes)(以前称为多孔菌属(Polyporus))，例如T.Versicolor(例如PR4 28-A)。
进一步优选的真菌包括属于Zygomycotina亚类和Mycoraceae类的菌株，例如根霉属(Rhizopus)或毛霉属(Mucor)，特别是冻土毛霉(MucorHiemalis)。
一些优选的细菌包括属于Actinomycetales目的菌株，例如浑球链霉菌(Streptomyces spheroides)(ATTC 23965)，嗜热紫链霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)(IFO 12382)或Streptoverticillum verticillium ssp.Verticillium。
其它优选的细菌包括短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(ATCC 12905)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，Rhodobacter sphaeroides，Rhodomonas palustri，乳链球菌(Streptococcus lactis)，Pseudomonaspurrocinia(ATCC 15958)或荧光假单胞菌(NRRL B-11)。
进一步优选的细菌包括属于粘球菌属(Myxococcus)的菌株，例如变绿粘球菌(M.virescens)。
特别优选重组产生的过氧化物酶，例如来源于Coprinus sp.的过氧化物酶，特别是描述于WO 92/16634的C.macrorhizus或C.cinereus，或其突变体，例如描述于WO 93/24618和WO 95/10602的突变体。
漆酶及漆酶相关酶：
本发明的漆酶及漆酶相关酶是指酶分类(EC 1.10.3.2)包含的任何漆酶，酶分类(EC 1.10.3.1)包含的任一chatechol氧化酶，酶分类(EC 1.3.3.5)包含的任一胆红素氧化酶或酶分类(EC 1.14.18.1)包含的任单酚单加氧酶。
微生物来源的漆酶可以来源于细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)，合适的实例有来源于曲霉属(Aspergillus)，脉孢菌属(Neurosrora)，例如粗糙链孢霉(N.crassa)，Podospora，葡萄孢属(Botrytis)，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属(Lentinus)，灰侧耳菌属(Pleurotus)，栓菌属，例如T.villosa和T.verdicolor，丝核菌属(Rhizoctonia)，例如茄属丝核菌(R.solani)，Coprinus，例如C.plicatilis和C.cinereus，Psatyrella，毁丝霉属(Myceliophthora)，例如M.thermophila，Schytalidium，多孔菌属(Polyporus)，例如P.pinsitus，射脉菌属(Phlebia)，例如辐射射脉菌(P.radita)(WO 92/01046)或革盖菌属(Coriolus)，例如毛革盖菌(C.hirsutus)(JP 2-238885)的菌株，特别是来源于栓菌属，毁丝霉属，Schytalidium或多孔菌属的漆酶。
其它优选的水解酶是糖苷酶，包括了MannawayTM。其它优选的酶类还有转移酶，裂解酶，异构酶和连接酶。
回收过程：
可以采用现有技术中已知的方法进行目的蛋白的发酵培养，例如描述于US 3,723,250的蛋白酶SavinaseTM的发酵。
典型的从发酵培养液中回收目的蛋白的过程一般都包括下列步骤中的数步或全部(并不限制于此)：
1)培养液的预处理
2)从培养液中去除细胞和其它固体物质(初始分离)
3)过滤
4)浓缩
5)过滤
6)稳定化和标准化。
在预处理步骤，细胞和固体物质被凝集成絮状物，同时一些可溶性成分也被沉淀下来。可以按照WO 96/38469中描述的方法完成此步骤。可以通过离心或过滤的方法去除细胞和其它固体材料。可以包括过滤步骤来改善蛋白溶液的清晰度和/或去除微生物细胞。典型的浓缩步骤包括超滤或在低压下将水分蒸发的过程。浓缩过程中所形成的固体材料可以在进一步过滤去除。最后，蛋白产品还要经过稳定化和标准化过程以达到现有技术中已知的浓度。除上述蛋白回收步骤(unit)之外，还可能采用许多其它的回收过程或步骤，例如调整pH值，改变温度，采用活性炭对蛋白溶液进行处理，以及使用各种吸附剂例如去除副活性(side-activities)和有色物质等非目的化合物。
依据目的蛋白，发酵条件和发酵产量，目的蛋白可以在培养液中以沉淀的形式存在，或者是在回收过程中将蛋白沉淀出来。如果是后一种情况，可以通过改变pH、温度、盐浓度或增加蛋白本身的浓度将之沉淀初始出来。
本发明发现通过向含有蛋白的溶液中加入多元醇和/或碳水化合物可以防止蛋白沉淀或有助于溶解已经沉淀的蛋白。既可以在回收步骤形成典型的蛋白沉淀之前立即加入多元醇和/或碳水化合物，也可以在回收步骤的后面加入，但一定要在整个过程中(process stream)去除固体物质步骤之前完成。
如果目的蛋白在收获培养液之前已经沉淀下来，应该在初始分离之前加入多元醇和/或碳水化合物。如果目的蛋白是在浓缩步骤中或在浓缩步骤之后形成沉淀，则既可以在浓缩步骤之前加入多元醇和/或碳水化合物，也可以在浓缩步骤之后，但在例如下游过滤步骤之前加入。一些情况下，由于蛋白常常以沉淀的形式存在时更加稳定，因此在浓缩步骤中进行蛋白沉淀有利。这种情况可能是例如在通过减压蒸发所进行的浓缩过程中，该方法中将含有蛋白的溶液加热以有利去除水分。此时可以在浓缩步骤之后加入多元醇和/或碳水化合物。沉淀可以是自发的和不受控制的，或者优选是一种控制过程以使蛋白沉淀为结晶形式。可以采用许多方法完成结晶作用(例如WO 91/09943或WO 94/22903中所描述的)。在本发明的实施例2和3中蔗糖和山梨糖醇特别利于蛋白结晶/沉淀的再溶解过程。在其它一些情况下，在蒸发过程中所形成的部分沉淀形式的酶的不希望被存在。本发明通过在浓缩步骤之前加入低浓度的多元醇和/或碳水化合物，典型浓度为1-10％w/w，从而保证酶保存于溶液中。由于蛋白和多元醇和/或碳水化合物的浓度随后都有所增加，导致回收步骤中的溶解度限制也有所增加。
在其它一些情况下，在蛋白的回收操作过程中，不希望形成沉淀(例如沉淀能够封堵滤膜或者磨损和撕裂滤膜)。本发明可以在蛋白回收操作之前加入多元醇和/或碳水化合物以避免沉淀的形成。
因此，本发明涉及下述实施方案：
a：一种从培养液中回收目的蛋白的方法，包括：
在蒸发之前向培养液中加入一种式为CnH2n+2On的多元醇，其中n为4-8，和/或一种碳水化合物，和/或它们的衍生物。
b：一种从培养液中回收目的蛋白的方法，包括：
在回收浓缩步骤之前或浓缩步骤结束后立即向培养液中加入一种式为CnH2n+2On的多元醇，其中n为4-8，和/或一种碳水化合物，和/或其衍生物。
c：一种从培养液中回收目的蛋白的方法，包括：
在超滤之后和蛋白成粒(granulation)之前向培养液中加入一种式为CnH2n+2On的多元醇，其中n为4-8，和/或碳水化合物，和/或其衍生物。
在一些情况下，如果在高pH值(典型的为9＜pH＜12)或低pH值(低于pH6)下完成部分或全部的过程，可以进一步提高蛋白的溶解度。蛋白的溶解度也受到盐分和温度的影响。上述因素对蛋白溶解度的效果依据不同的蛋白特性而不同。
溶解度限制：
如上所述，蛋白的溶解度受到许多因素的控制，例如温度，pH值，盐分、其它蛋白和杂质等存在。相图是以函数的形式描绘出盐浓度、pH值、温度或多元醇量对蛋白溶解度的影响。这种相图通常至少包含4个不同的区域(例如参见M.Ries-Kautt和A.Ducruix，“Crystallization of Nucleic Acidsand Proteins，A practical approach”，A.Ducruix和R.Giege编辑，IRL印刷，牛津大学出版社(1992)201页)。在给定的条件下(pH值、温度、盐分等)，从蛋白沉淀的含水悬浮液开始，当这种由以溶解的形式和沉淀形式存在的目的蛋白构成的该系统达到平衡时，蛋白的溶解度被定义为蛋白在水相中的浓度。
如果蛋白浓度低于它的溶解度，即为未饱和溶液，所有的蛋白为可溶形式的。然而一般情况下，如果总蛋白浓度高于蛋白的溶解度，溶液就是蛋白的过饱和溶液。过饱和区又可以进一步划分为3个区：(a)过量蛋白从溶液中以非晶形状态沉淀出来的沉淀区；(b)形成蛋白晶核及过量蛋白以结晶形式沉淀出来的成核区；(c)虽然未形成晶核但已有的结晶能够增长(grow)的亚稳定区(metastable zone)。结晶继续增长直到可溶性蛋白的浓度达到它的溶解度限制。从蛋白以全部溶解状态存在的蛋白溶液开始，如果使蛋白的浓度保持在低于成核区和亚稳定区的状态下，很有可能即使增加蛋白浓度到高于它的溶解度限制，也不会形成蛋白沉淀。由于蛋白的结晶过程通常是一个相当缓慢的过程，因此在蛋白的浓缩步骤中，通常可能在很短的时间范围(frame)内，进入成核区而不形成蛋白沉淀。也就是即使蛋白浓度在成核区范围内，蛋白在数秒、分钟甚至是数小时的时间范围内都有可能保持为浓缩的蛋白溶液，而没有蛋白结晶或蛋白沉淀存在。
有效溶解度是指溶液中可溶性蛋白的浓度，在给定的条件下，当蛋白溶液达到过饱和状态时，有效溶解度可以高于蛋白的溶解度。
在EP 0 201 017中，首先通过加入盐成分使酶沉淀出来，然后分离上述酶沉淀(cake)，最后通过将上述酶沉淀与多元醇接触以使之溶解。EP 0 201017中所述的多元醇包括了低分子量的聚乙二醇和具有至少2个羟基基团的C2至C8醇。根据其发明内容，包括甘油在内的、超过2个羟基基团的多元醇都可以使用，但是优选仅含有2个羟基基团的醇类，特别是它们位于碳链中2个相邻的碳原子上。
然而，进行蛋白沉淀及随后的分离沉淀通常都是非常耗时的过程，特别是为了增加纯度而将蛋白沉淀成结晶形式时。在进行大规模生产时，由于不良的沉淀产量和物理性损失，常常蛋白产量的损失非常显著。虽然用于沉淀蛋白的一些盐类可以循环利用，但是这样就增加了用于循环自身过程和废水处理过程(由于加入盐成分而造成的)的额外费用。此外，当终产物中不希望有盐成分存在时，还要采取特殊的措施来去除盐成分。另一方面，进行蛋白沉淀是为了提供浓度足够高的蛋白物质以进行进一步的配制过程(以液体的形式或以固体的形式)。在从既含可溶性酶又含沉淀形式的酶的溶液开始时，由于酶浓度不能超过溶解度的限制，因此需要加入高浓度的例如单丙二醇(monopropylene glycol)等物质以对酶进行溶解。也就是仅仅向由盐沉析出的酶沉淀中加入类似于MPG的多元醇是很难达到过饱和等状态的。
然而按照本发明的内容，无需通过盐沉淀步骤即可获得不含沉淀形式的目的蛋白的高强度浓度(high strength concentrate)产物。本发明通过超滤或蒸发的方式对蛋白进行浓缩。目的蛋白可以浓缩至处于亚稳定区、甚至成核区的浓度。
浓缩步骤(unit)所形成的产物可以直接通入含有碳水化合物或多元醇的容器中。或者碳水化合物和/或多元醇可以连续不断地加入到含有从浓缩步骤产出的浓缩物的加工液中。在起始蛋白结晶尚未形成之前，当碳水化合物和/或多元醇加入到浓缩物时，就可能获得不含沉淀或结晶形式的高蛋白浓度的浓缩产物。应当加入足够量的碳水化合物和/或多元醇以使蛋白浓度处于未饱和状态或亚稳定区。如果是在亚稳定区进行操作，可以通过采用机械压力或加入精细颗粒的方法来启动结晶或沉淀作用。如果采用的是上述方法，在随后的下游过程中要格外注意对产物进行的处理。
然而，当蛋白浓度接近溶解度曲线时，溶液在沉淀和/或结晶能力方面就会变得越来越稳定。
除了向浓缩液中加入碳水化合物和/或多元醇之外，pH值、温度、加入盐成分等其它因素也可用于进一步增加目的蛋白的溶解度。随着碳水化合物和/或多元醇的加入，蛋白的有效溶解度也随之增加。如果采用EP 0 201017教导的方法，可以在使用较低浓度的多元醇的情况下，获得极高浓度的可溶性蛋白。在本发明一个优选模式中，浓缩步骤采用一种连续的方式。因此，如果浓缩步骤所形成的产物(out-let)直接通入含有碳水化合物和/或多元醇的容器中，或者碳水化合物和/或多元醇连续不断地加入到如上所述含有从浓缩步骤产出的浓缩物的加工液中，就可以大大缩短浓缩耗费的时间，从而在蛋白开始沉淀之前即可达到非常高的浓度。
在本发明的优选方式中，碳水化合物或多元醇添加到蛋白溶液后的浓度在整个过程中保持在2％w/w以上。优选的多元醇是MPG、甘油、山梨糖醇或它们的混合物。优选的单糖、二糖和多糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、异麦芽糖、海藻糖、maltulose、蔗糖、糊精、限制糊精、环糊精或支链淀粉。
在一些情况下，向含有从浓缩步骤产出的浓缩物的加工液中加入盐也是非常有利的，例如将NaCl或KCl等盐类与诸如葡萄糖、麦芽糖或蔗糖等碳水化合物和/或山梨糖醇等多元醇联合使用。
因此，本发明提供：一种从培养液中回收目的蛋白的方法，包括了回收步骤，在所述回收步骤中，目的蛋白虽然超过了它的溶解度限制，但仍然在于溶液中，上述回收目的蛋白的方法包括了在回收步骤之前或回收步骤结束后立即向培养液中加入碳水化合物，和/或多元醇和/或它们的衍生物。
在生产液态产品时，即使在生产过程中已经避免了蛋白沉淀的存在，但为了获得更高清晰度的产品或降低产品中微生物的数量，通常在浓缩步骤之后要补充一个过滤步骤。由于碳水化合物或多元醇的粘性随其浓度的增加而增高，因此为了确保下游过滤步骤中的流通性，尽可能地保持较低浓度的碳水化合物或多元醇是非常重要的。
绘制一个描述给定蛋白溶解度的相图是十分困难的，特别是在过饱和状态下确定不同区域之间的边界线。其原因之一是晶核的形成是一种随机事件。在可以成长为蛋白结晶的稳定晶核未形成之前，处于成核区的蛋白溶液可以多年保持清晰而无任何结晶形成。同时也是因为一个既定系统在一套既定条件下达到平衡之前所需的时间在实际上是不确定的。
然而，本发明将蛋白的溶解度定义为，在pH值、温度、溶液中所有成分的浓度以及其它可能影响蛋白溶解度的因子保持恒定的条件下，温和搅拌含有可溶性目的蛋白及其沉淀形式的蛋白溶液24小时后，蛋白在水相中的浓度。影响蛋白溶解度因子的有关信息可以在相关文献中发现，例如“Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，A practical approach”，A.Ducruix和R.Giege编辑，IRL印刷，牛津大学出版社(1992)和“ProteinCrystallization.Techniques，Strategies，and Tips”，T.M.Bergfors编辑，International University Line(1999)。可以通过下述步骤确定处于成核区和亚稳定区之间蛋白的浓度：
A：从澄清的蛋白溶液起始，在既定的pH值、温度、盐浓度和碳水化合物及多元醇存在的情况下，通过超滤逐步浓缩蛋白溶液。
B：在一定间隔内，取出等分浓缩液快速通过0.22μm的滤膜进行过滤(这一过滤样品水相中的蛋白浓度称为起始浓度)。
C：将过滤的样品温和地搅拌至48小时，并经常进行检查。如果形成了非晶形沉淀，则起始浓度处于沉淀区，形成上述沉淀通常是一个快速的过程。如果过滤样品中自发形成了结晶形式，则起始浓度处于成核区，如果没有结晶形成，则起始浓度低于成核区。
D：如果从步骤(C)获得的过滤样品中没有结晶或沉淀形成，可以加入少量的目的蛋白结晶(晶种)，并且继续搅拌样品10小时。
E：在固定间隔内，从步骤(D)中重新取出等分样品，确定其晶体的数量和大小的潜在变化。可以通过现有技术中许多已知的方法来评估晶体的大小，例如显微术和图像分析。如果加入的结晶大小减小了，表明溶液处于未饱和状态，如果增加了，表明起始蛋白溶液处于亚稳定区。如果形成了新的结晶，表明起始蛋白溶液处于成核区。如果加入的结晶数量既没有增多、大小也没有减小，则表明水相中的蛋白浓度正处于溶解度的限制。通过缩减超滤期间采取样品的时间，可以构建出对实际目的非常有用的相图。
在整个实验过程中保持温度恒定是十分重要的。此外，检测实验必须在无菌条件下进行。或者，如果对目的蛋白的溶解度不会造成影响，也可以选择加入抗微生物剂，例如RodalonTM、Proxel LVTM或叠氮化钠。
碳水化合物：
John F.Robyt在Essentials of Carbohydrate Chemstry，p.2(1998)中对碳水化合物进行了定义：“对碳水化合物的现代定义是指多羟基醛或酮类，或多羟基醛或酮类通过下列任何方式衍生的化合物：(1)还原以产生糖醇；(2)氧化以产生糖酸；(3)采用各种化学基团取代一个或多个羟基基团，例如采用脱氧糖取代氢[H]，取代氨基基团[NH2或乙酰-NH]以产生氨基糖；(4)采用各种部分(moiety)对羟基进行衍生化，例如采用磷酸以产生磷糖，硫酸以产生硫糖或采用醇类与羟基进行反应以产生糖类、低聚糖和多聚糖”。
本发明将碳水化合物限定为4个或更多的碳原子，优选4-12个碳原子，特别是4-6个碳原子。
本发明优选多羟基醛或酮类。
特别优选选自葡萄糖、果糖、甘露糖或半乳糖的单糖。
在取代糖中，优选甲基糖苷、N-乙酰-葡糖胺、N-乙酰-半乳糖胺和它们的去乙酰化形式。
在其它优选的实施例中，优选选自乳糖、麦芽糖、异麦芽糖、海藻糖、maltulose或蔗糖的双糖。
在低聚糖中，优选糊精、极限糊精、环糊精和支链淀粉。糖酸既包括糖醛酸又包括糖酸(“onic”acid)，例如葡糖酸、葡糖醛酸和半葡糖醛酸。
在本发明的一个特定实施方案中，碳水化合物以0.1-75％w/w的含量加入到培养液中，优选0.1-50％w/w，更加优选0.1-40％w/w，更优选0.1-25％w/w，更优选0.1-10％w/w，更优选0.1-5％w/w，特别是0.5-5％w/w。
在一些情况下，采用碳水化合物和盐类的混合物可能会更加有利，例如蔗糖和NaCl或KCl的混合物。
多元醇：
虽然可以采用任何多元醇，但是优选多元醇来源于至少4个碳原子的碳水化合物。上述多元醇具有通式CnH2n+2On，其中n为4-8个碳原子，特别是n为4-6个碳原子。
多元醇包括了山梨糖醇，甘露醇，赤藓糖醇，核糖醇和木糖醇，但并不仅仅限定为上述化合物。在本发明的特定方面也可以使用甘油和单丙二醇(MPG)。
在本发明的一个特定实施例中，多元醇以0.1-80％w/w的含量加入到培养液中，优选0.1-60％w/w，更加优选0.1-40％w/w，更优选0.1-20％w/w，更优选0.1-10％w/w，更优选0.1-5％w/w，特别是0.5-5％w/w。
在一些情况下，采用例如甘油和单丙二醇等两种或更多种多元醇或葡萄糖和山梨糖醇等多元醇与碳水化合物的混合物可能会更加有利。
在一些情况下，采用多元醇和盐类的混合物可能会更加有利，例如山梨糖醇和NaCl或KCl的混合物。
对碳水化合物和/或多元醇的选择也有助于稳定终产物中的蛋白。
衍生物：
按照本发明，可以采用的衍生物有：甲基糖苷、葡糖醛酸、氨基糖或N-乙酰-葡糖胺。
调整pH值：
为了使目的蛋白的有效溶解度达到最大化以及保持蛋白的稳定性，需要对已加入碳水化合物和/或多元醇和/或它们衍生物的培养液进行pH值调整以便寻找其最适值。
寻找最适值的方法通常是从pH值为11时开始进行实验，然后在pH值分别为10、9、8、7依次直到3时进行实验。如果发现了适宜的pH值范围，例如在4-5之间，则进一步在该范围内进行实验直到找到最适pH值为止。通常最适pH值在4-11之间变化。
事实上，可以采用任一酸或碱来调整pH值。酸可以是无机酸也可以是有机酸。可以采用的一些例子有：盐酸、硫酸、亚硫酸、亚硝酸、磷酸、乙酸、柠檬酸和甲酸。优选磷酸、甲酸、柠檬酸和乙酸。优选的碱有氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙和氢氧化铵，特别是氢氧化钠。
调整温度：
为了使其中目的蛋白的有效溶解度达到最大化以及保持蛋白的稳定性，需要对加入碳水化合物和/或多元醇和/或它们的衍生物的培养液进行温度调整以便寻找其最适温度。
寻找最适温度的方法通常是从5℃时开始进行实验，然后在温度分别为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃时进行实验。如果发现了适宜的温度范围，例如在30℃-40℃之间，则进一步在该范围内进行实验直到找到最适温度为止。值得注意的是一些酶的溶解度在特定条件下随着温度的降低会相应提高。
盐：
为了进一步改善回收过程，提高蛋白的稳定性或增加蛋白的溶解度，需要向培养液中加入一种或多种盐分。
优选的盐类有：镁、钠、钾、铵或钙的氯化物、柠檬酸盐、乙酸盐、甲酸盐或硫酸盐，例如MgCl2、CaCl2、NaCl、KCl、NH4Cl、MgSO4、Na2SO4、K2SO4或(NH4)2SO4。
在本发明的一个特定实施例中，加入培养液中的盐的浓度为每升0.02-10摩，优选每升0.02-5摩，更加优选每升0.02-1.2摩，更优选每升0.04-1.0摩，更优选每升0.04-0.7摩，最优选浓度为每升0.04-0.5摩。
按照本发明，可以只用一步进行加盐，也可以多于一步。通常采用一步加盐可以达到更加满意的回收效果。
以下实施例用于进一步阐述本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1
在下游过程中加入糖/多元醇避免结晶/沉淀
在进行蒸发之前，向无结晶或无沉淀的蛋白酶溶液中加入山梨糖醇(1.5％w/w)。蛋白酶溶液从20浓缩至38RI。采用B+S RFM80数字折射(refractometer)仪对RI(折射指数)进行测量。
作为对照的浓缩溶液形成了明显的结晶，而含有山梨糖醇的浓缩蛋白酶溶液却没有出现结晶。通过旋转沉淀(spindown)％v/v来对结晶作用进行测量(在2000rpm下离心10分钟)。对照样品具有55.5％的旋转沉淀，而含有山梨糖醇的样品无旋转沉淀。
对结晶和/或非晶形沉淀的抑制作用非常重要。典型的下游过程包括了过滤步骤，其目的是为了提高清晰度和/或去除微生物，如果产品形成了结晶或非晶形沉淀，产品的产量就会受到明显损失。
由于加入了山梨糖醇和/或蔗糖(达到5％)，下游过程的产量提高了5％。
实施例2
在下游过程中加入糖和/或多元醇溶解酶结晶/沉淀
在酶的生产过程中，加入糖和/或山梨糖醇并结合加热处理(达到70℃)有助于溶解蛋白的结晶和/或非晶形沉淀。典型情况下，在酶蛋白浓度较高或酶蛋白与杂质比例较高时，酶蛋白溶液中会自发形成部分或全部的结晶和/或沉淀。上述酶蛋白的部分或全部结晶/沉淀造成了物理性损失，或在过滤、离心或澄清等典型的下游操作过程中造成下游产品产量的降低。本实施例描述了淀粉酶溶液形成结晶/沉淀的情况。淀粉酶溶液在不同含量的糖和/或盐存在时形成结晶。所有的溶液在2-4小时内部分或全部形成结晶。为了重新溶解结晶/沉淀，将溶液加热到60℃。含有蔗糖和蔗糖加盐(见表1)的淀粉酶溶液全部溶解。然而，当冷却时，含有蔗糖加盐的淀粉酶溶液重新发生结晶作用，而即使重新冷却至室温，仅含有蔗糖的淀粉酶溶液也没有发生重新结晶作用。
表1
  样品 24小时后的％旋转沉淀 60℃时结晶或沉淀的溶解 已经溶解的结晶或沉淀的重新结晶或沉淀作用(2天后)
  对照溶液   24％     No     NA
  +5％蔗糖   16％     Yes     No
  +10％蔗糖   16％     Yes     No
  +5％蔗糖+5％NaCl   17％     Yes     Yes
  +10％蔗糖+5％NaCl   15％     Yes     Yes
实施例3
加入山梨糖醇和/或单丙二醇后调整pH值
在酶的生产过程中，加入山梨糖醇和/或单丙二醇并且调整或不调整pH值(达到pH值11.0)有助于溶解酶结晶和/或非晶形酶沉淀。典型情况下，在酶蛋白浓度较高或酶蛋白与杂质比例较高时，酶蛋白溶液中会自发形成部分或全部的结晶和/或沉淀。这种酶蛋白的部分或全部结晶/沉淀造成了物理性损失，或在过滤、离心或澄清等典型的下游操作过程中造成了下游产品产量的降低。本实施例描述了在30％MPG中的新鲜甘露聚糖酶浓缩液的制备。上述溶液在达到2小时能够保持澄清，但是24小时之后，溶液中的酶开始形成部分结晶/沉淀形式。为了重新溶解结晶/沉淀，向溶液中加入了山梨糖醇和/或MPG或蔗糖。含有山梨糖醇的甘露聚糖酶溶液重新溶解了全部的甘露聚糖酶结晶/沉淀(加入15％或更多的山梨糖醇)。
单独加入单丙二醇并不具有上述效果。与将pH值调整到11.0联合使用是能够产生上述效果的(使用高浓度的单丙二醇)。由于pH值降低到11.0以下后，甘露聚糖酶结晶/沉淀又重新形成，表明了仅仅调整pH值不具有上述效果。
采用Hach 2100AN浊度计(Turbidimeter)对本实施例的清晰度进行了测定。
表2
  相对MPG 相对山梨糖醇     pH 清晰度 结晶酶的体积
  ％   ％ NTU ％旋转沉淀
  对照(a)   30   0     8.5 +200 20
  5％山梨糖醇(b)   28.5   5     8.5 +200 12.5
  10％山梨糖醇(c)   27   10     8.5 +200 1.5
  15％山梨糖醇(d)   25.5   15     8.5 34 0
  20％山梨糖醇(e)   24   20     8.5 26 0
  25％山梨糖醇(f)   22.5   25     8.5 20 0
  25％MPG(g)   47.5   0     8.5 +200 6
  pH11(h)   30   0     8.5→11 +200 1.5(pH调整回8.5后20％)
  pH11，25％MPG，25％水(i)   40   0     8.5→11→8.5 45 0.5
  15％MPG，35％水(j)   30   0     8.5 +200 3.4
  15％MPG，10％山梨糖醇，25％水(k)   30   10     8.5 27 0
表2还显示了随着山梨糖醇浓度的增加蛋白(此处是甘露聚糖酶)的溶解度是如何增加的(参见实验(a)-(f))。
从甘露聚糖酶的稀释培养液出发，通过加入山梨糖醇(25％w/w)而不添加MPG而将上述甘露聚糖酶稀释培养液浓缩成与实验(a)-(k)中所用相同的浓度是完全可行的。在上述条件下，即使经过24小时后也没有沉淀形成，NTU值也低于50。
实施例4
在下游过程中加入糖并结合搅拌溶解酶结晶/沉淀
1，4-a-D-葡聚糖α-麦芽糖水解酶(按照现有技术中发酵)经过浓缩后，酶的主要部分以结晶或沉淀的形式存在。结晶/沉淀在浓缩物中以淤渣(sludge)的形态存在。可以通过离心的方法测量上述淤渣的含量，通常它的范围在10-15％(v/v)。
加入15％(w/w)的蔗糖并且搅拌30分钟之后，酶结晶/沉淀完全溶解。溶解上述酶结晶/沉淀并不需要加热过程，因此可以在10-25℃的温度范围内加入糖，并且完成搅拌过程。
现在，酶溶液可以进一步加工并最终形成稳定的液态终产品或颗粒形式。对于液态产品而言，蔗糖也可用作稳定剂。
实施例5
采用MPG避免α-淀粉酶的结晶作用
在pH值为10.5和温度为30℃的条件下，采用超滤的方法将来源于B.licheniformis的α-淀粉酶浓缩至每kg大约含有100g酶蛋白。平行进行两组实验(A和B)。其中之一(A)作为对照实验。另一个(B)在进行超滤之前加入5％w/w的MPG。浓缩结束后，留出上述两种浓缩液，并同时在5℃下缓慢搅拌24小时。24小时之后，在样品A中形成比较严重的结晶状沉淀(10％v/v的淤渣体积)，而样品B中却没有沉淀形成。因此MPG可以阻止α-淀粉酶浓缩液中沉淀的形成。
向样品B中加入少量的α-淀粉酶结晶(晶种)并在5℃下进一步搅拌，在加入了晶种的样品B浓缩液中产生了1-2％v/v的淤渣体积，这表明加入了MPG的浓缩液处于过饱和状态。

Claims (18)

1.一种从培养液中回收目的蛋白的方法，包括：
在回收过程中，向培养液中加入一种式为CnH2n+2On的多元醇，其中n为4-8，和/或一种碳水化合物，和/或其衍生物。
2.根据权利要求1的方法，其中的蛋白为一种酶。
3.根据权利要求2的方法，其中的酶选自水解酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂酶、氧化还原酶或糖苷酶。
4.根据权利要求1的方法，其中的碳水化合物选自葡萄糖、蔗糖、葡萄糖糖浆、果糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、低聚糖、限制糊精、糊精、淀粉、甘露糖或半乳糖。
5.根据权利要求1的方法，其中的多元醇选自山梨糖醇、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇或木糖醇。
6.根据权利要求1的方法，其中的碳水化合物和/或多元醇和/或其衍生物是在进行蒸发之前加入的。
7.根据权利要求1的方法，其中的碳水化合物和/或多元醇和/或其衍生物是在回收浓缩步骤之前或在回收浓缩步骤结束后立即加入的。
8.根据权利要求1的方法，其中的碳水化合物和/或多元醇和/或其衍生物是在超滤之后、颗粒形成之前加入的。
9.根据权利要求1的方法，其中碳水化合物加入量为0.1-75％(w/w)。
10.根据权利要求1的方法，其中多元醇加入量为0.1-80％(w/w)。
11.根据权利要求1的方法，其中的多元醇为两种多元醇的混合物。
12.根据权利要求1的方法，其中在回收过程中进行pH值调整。
13.根据权利要求1的方法，其中在回收过程中进行温度调整。
14.根据权利要求1的方法，其中在回收过程中加入盐。
15.根据权利要求14的方法，其中的盐选自镁、钠、钾、铵或钙的氯化物、柠檬酸盐、乙酸盐、甲酸盐或硫酸盐。
16.一种含有回收步骤的从培养液中回收目的蛋白的方法，在上述回收步骤中目的蛋白虽然仍然在溶液中，但超过了它的溶解度限制，其包括：在上述回收步骤之前或在上述回收步骤后立即向培养液中加入碳水化合物，和/或多元醇和/或其衍生物。
17.根据权利要求16的方法，其中的碳水化合物选自葡萄糖、蔗糖、葡萄糖糖浆、果糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、低聚糖、限制糊精、糊精、淀粉、甘露糖或半乳糖。
18.根据权利要求16的方法，其中的多元醇选自山梨糖醇、单丙二醇、甘油、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇或木糖醇。
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