CN1524090A - 免疫原性减弱的经修饰胰岛素 - Google Patents

免疫原性减弱的经修饰胰岛素 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可施用的，尤其是施用于人的多肽，特别是用于治疗。所述的多肽是经修饰的，其中，所述的修饰使将上述多肽施用于人受体时引起免疫应答的倾向减弱。本发明特别涉及对人胰岛素进行修饰以产生胰岛素蛋白，该蛋白在体内使用时基本上无免疫原性，或比未经修饰的相应蛋白的免疫原性低。

Description

免疫原性减弱的经修饰胰岛素
发明领域
本发明涉及尤其是用于对人施用的、特别是用于治疗的多肽。所述的多肽是经修饰的多肽，其中，所述的修饰使得上述多肽在施用于人体时引起免疫应答的倾向减弱。本发明特别涉及对人胰岛素进行修饰以产生胰岛素蛋白变异体，该变异体在体内使用时基本上无免疫原性，或比未经修饰的相应蛋白的免疫原性低。本发明还涉及来自上述未经修饰蛋白的T-细胞表位肽，由此可以构建免疫原性减弱的胰岛素变异体。
发明背景
有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗小鼠抗体(HAMA)应答而未能成功应用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45：879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.135：1530-1535]。对于单克隆抗体，已发展了多种技术以试图减弱HAMA应答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在许多个体中，所得的“人源化”抗体仍然引起患者的免疫应答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2：449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 68：1417-1420]。
抗体并不是唯一一类作为治疗剂施用并可引起免疫应答的多肽分子。即使是来源于人且具有与人体内蛋白相同氨基酸序列的蛋白也可以在人体内诱导免疫应答。值得注意的例子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[Wadhwa，M.等(1999)Clin.Cancer Res.5：1353-1361]和干扰素α2[Russo，D.等(1996)Bri.J.Haem.94：300-305；Stein，R.等(1988)New Engl.J.Med.318：1409-1413」等的治疗性应用。
诱导免疫应答的主要因素是在蛋白中存在可经由MHC II类分子的呈递作用激活T-细胞活性的肽(即所谓的T-细胞表位)。这种潜在的T-细胞表位通常定义为任何具有与MHC II类分子结合的能力的氨基酸残基序列。可测定此种T-细胞表位以建立MHC结合。隐含地″T-细胞表位″是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过与TCR相互作用促进T-细胞应答而激活这些T-细胞。但可以理解，某些可与MHC II类分子结合的肽可能存留在蛋白序列中，因为这种肽在施用此最终蛋白的生物中被识别为“自身的”。
已知这些T-细胞表位肽中的某些可在肽、多肽或蛋白在细胞中降解的过程中释放出来，随后由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递以便引发T-细胞激活作用。对于MHC II类分子呈递的肽，这种T-细胞激活作用可，例如通过直接刺激B细胞产生抗体而引起抗体应答。
MHC II类分子是一组高度多态的蛋白，其对辅助T细胞筛选和激活起重要作用。人白细胞抗原群DR(HLA-DR)是这组蛋白的主要同种型也是本发明的焦点所在。鉴于同种型HLA-DQ和HLA-DP行使类似的功能，本发明对此两者均适用。MHC II类DR分子由α和β链组成，其C-末端插入并穿越细胞膜。每一异源二聚体都具有可与长度在9到20个氨基酸范围内变化的肽相结合的配体结合结构域，但是结合沟中最多容纳11个氨基酸。配体结合结构域由α链的1-85位氨基酸和β链的1-94位氨基酸组成。最近的研究表明DQ分子具有同源的结构，预期DP家族蛋白也非常类似。在人中已发现了DR同种型的约70种不同同种异型，对于DQ有30种不同的同种异型，对于DP有47种不同的同种异型。每一个体带有2到4个DR等位基因，两个DQ及两个DP等位基因。许多DR分子的结构已阐明，这种结构指向一种带有许多疏水口袋的开口肽结合沟，所述的疏水口袋与肽的疏水残基(口袋残基)相互作用[Brown等，Nature(1993)364：33；Stern等，(1994)Nature 368：215]。确立不同II类分子同种异型的多态性有助于肽结合沟中的不同肽结合表面的广泛多样性，并且在群体水平保证有关识别外来蛋白和引发针对病原生物免疫应答的能力的最大灵活性。在配体结合结构域内存在相当数量的多态性，并且在不同地域和种族群体存在着显著不同的“家族”。这一多态性影响着肽结合结构域的结合特性，因此，不同的DR分子“家族”对不同序列属性的肽具有特异性，但也可以有一些重叠。这种特异性决定了最终负责驱动针对β细胞表位的抗体应答的Th-细胞表位识别(II类T-细胞应答)，所述的β细胞表位存在于衍生所述Th-细胞表位的相同蛋白上。因此，个体中针对蛋白的免疫应答在很大程度上受到T-细胞表位识别作用的影响，这种识别作用是个体中与HLA-DR同种异型的肽结合特异性的函数。因而，为对全球种群背景下的肽或蛋白中的T-细胞表位进行鉴定，需要考虑到尽可能多样的HLA-DR同种异型组的结合特性，由此覆盖尽可能高比例的世界上的种群。
针对治疗性蛋白(如本发明的目的蛋白)的免疫应答通过MHC II类肽呈递途径进行。其间外源蛋白经吞噬和加工后与DR、DQ或DP型MHC II类分子结合以进行呈递。由专门抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突状细胞等表达MHC II类分子。通过在T细胞表面的关联性T-细胞受体与MHC II类肽复合物相互作用，加之与某些其他共同受体，如CD4分子交联可诱导T-细胞进入激活状态。上述激活作用可导致细胞因子释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞，产生抗体或激活T杀伤细胞形成完整的细胞免疫应答。
肽与给定的MHC II类分子结合以备在APC表面呈递的能力依赖于多种因素，最主要的是肽的一级结构。这影响其蛋白酶剪切倾向及其在MHC II类分子的肽结合隙中的结合亲和性。在APC表面的MHC II类/肽复合物向能识别决定簇的特定T-细胞受体(TCR)呈递一个结合面，其中所述决定簇由肽和MHC II类分子的暴露残基共同提供。
本领域中有鉴定能结合MHC II类分子的合成肽的方法(例如WO98/52976和WO00/34317)。这种肽不是在所有情况下都行使T细胞表位的功能，特别是在体内会受加工途径和其他现象的影响。T-细胞表位鉴定是表位清除的第一步。鉴定及从蛋白中去除潜在T-细胞表位先前已有公开。本领域中已有检测T-细胞表位的方法，通常是通过计算机手段在经试验确定的T-细胞表位中扫描公认的序列基元，或利用计算机技术预测MHC II类结合肽，特别是DR-结合肽。WO98/52976和WO00/34317中公开了鉴定具有与人MHC II类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threadingapproaches)。这些教导中，通过在人源或非人源治疗性抗体或非抗体蛋白一级序列中进行准确的氨基酸替换以去除预测的T-细胞表位。
此外，利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合物，该复合物能与来自于人或受试实验动物外周血液样品中的T-细胞克隆相结合的技术也在本领域中有所应用[Kern，F.等(1998)Nature Medicine 4：975-978；Kwok，W.W.等(2001)TRENDS in Immunology 22：583-588]，这些技术也可以用于表位鉴定策略中。
根据上述描述，由此可能期望鉴定、去除或至少减少给定的具有重要的治疗价值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-细胞表位。
人胰岛素是这些有治疗价值的分子之一。本发明提供去除了一个或多个T细胞表位的经修饰人胰岛素。
胰岛素是参与调节葡萄糖体内平衡的蛋白激素。该蛋白专门在胰腺的胰岛细胞中产生，以86个氨基酸的前体形式合成。所述前体经蛋白水解加工产生成熟的α：β复合物，该复合物中21个氨基酸的α链与30个氨基酸的β链通过两个二硫键相偶联。
胰岛素生理学中的胰岛素缺乏或其他紊乱导致糖尿病，这是一种以高血糖、糖尿和蛋白及脂肪代谢失调为特征的严重的碳水化合物代谢疾病。糖尿病人中所引起的二级病理学涉及血管损伤。胰岛素替代治疗可成功地控制糖尿病，目前已有许多重组人胰岛素制剂用于治疗糖尿病病人。
本发明公开了在胰岛素一级结构内鉴定的序列，由于它们具有与MHC II类分子结合的可能性所以是潜在的T-细胞表位。这一内容特别涉及包含21个氨基酸残基的α链和30个氨基酸残基的β链的人胰岛素蛋白成熟(经加工的)形式。α链的序列如下(1-21位残基)GIVEQCCTSICSLYQLENYCN，β链的序列(1-30位残基)：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
也有人公开了经修饰的胰岛素分子[US，5,700,662，US，5,698,669；US5,747,642；US5,693,609]，但这些教导以及其他未引述的示例并没有认识到T-细胞表位对所述蛋白免疫原性的重要性，也不能据此联想到按照本发明的方案以特异的、可控制的方式直接影响所述蛋白的性质。
但是，一直存在对具有改进的性质的胰岛素类似物的需要。所需要的改进包括用于表达和纯化所述治疗剂的可供选择的方案和形式以及尤其是所述蛋白生物学性质的改善。特别需要改进的是在施用于人体时的体内特性。在这方面，非常需要提供在对人体具有减弱的或没有诱导免疫应答可能性的胰岛素。
发明内容
本发明提供了经修饰的胰岛素，其中，通过减弱或去除大量潜在的T-细胞表位的方式对该因子的免疫学特性进行修饰。
本发明公开了在胰岛素一级结构内鉴定的序列，由于它们具有与MHC II类分子结合的可能性，所以是潜在的T-细胞表位。这一内容特别涉及具有21个(α链)和30个(β链)氨基酸残基的人胰岛素蛋白。
本发明还公开了在基本上不影响生物学活性的前提下需要通过特定的氨基酸替代、添加或缺失进行改变的本发明分子的一级序列中的特异性位点。在只有同时丧失生物学活性才能去掉免疫原性的情况下，可通过在所述蛋白的氨基酸序列中做进一步的改造以恢复所述的活性。
本发明还公开了生产这种经修饰的分子的方法，尤其是鉴定需要改变以减弱或去除免疫原性位点的T-细胞表位的方法。
预期本发明的蛋白在人体中的循环时间会延长，因此对慢性或复发性疾病，如胰岛素的多种适应症特别有益。本发明提供经修饰的胰岛素蛋白，预期其在体内将表现出改进的性质。这些经修饰的胰岛素分子可应用于药物组合物。
总之，本发明涉及下述内容：
●一种经修饰的分子，其具有胰岛素的生物活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物活性但未经修饰的分子；
●如上所述的经修饰分子，其中，所述的修饰定位于胰岛素(优选人胰岛素)的α和/或β链；
●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位而实现的；
●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过减少能与来自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量来实现的；
●如上所述的分子，其中，去除了一个T-细胞表位；
●如上所述的分子，其中，原本存在的T-细胞表位是MHC II类配体，或表现出经II类分子呈递作用后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列；
●如上所述的分子，其中，所述的肽序列选自如表1所示的组；
●如上所述的分子，其中，任何原本存在的T-细胞表位中的1-9个氨基酸残基，优选1个氨基酸残基发生了改变；
●如上所述的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是用其他的氨基酸残基在特定的位置替代、添加或缺失原本存在的氨基酸残基；
●如上所述的分子，其中，按表2所示进行一个或多个氨基酸残基的替代；
●如上所述的分子，其中，另外还按表3所示进行一个或多个氨基酸残基的替代以减少能与由所述分子衍生的肽相结合的MHC同种异型的数量；
●如上所述的分子，其中，如需要时，通过替代、添加或缺失特定的氨基酸作进一步改变以恢复所述分子的生物学活性；
●编码任何上述和下述经修饰分子的DNA序列或分子；
●药物组合物，其包含如上述和/或权利要求中定义的具有胰岛素生物学活性的经修饰分子，并可任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂；
●制造具有如上引用的任何权利要求中定义的胰岛素生物学活性的经修饰分子的方法，该方法包括下述步骤：(i)确定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通过任意方法，包括利用体外或利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究(in silico)技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；(iii)设计新的序列变异体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定；(iv)通过重组DNA技术构建所述序列变异体，并检测所述的变异体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变异体；和(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)；
●如上所述的方法，其中步骤(iii)是通过在任何原本呈现的T-细胞表位中替代、添加或缺失1-9个氨基酸残基来实现的；
●如上所述的方法，其中，所述的改变是参照同源蛋白质序列和/或利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究模拟技术进行的；
●如上所述的方法，其中步骤(ii)是通过下述步骤进行的：(a)在所述的肽中选择一个具有已知氨基酸残基序列的区域；(b)然后由所选择的区域中顺序抽取预定统一大小且至少由3个氨基酸残基组成的重叠氨基酸残基片段；(c)通过对存在于抽样氨基酸残基片段中的每个疏水氨基酸残基侧链赋值求和，计算每一抽样片段的MHC II类分子结合分值；和(d)根据计算出的该片段的MHC II类分子结合分值鉴定至少一个适于修饰的片段，以在基本上不减弱所述肽的治疗功效的前题下改变整体的MHC II类结合值；步骤(c)优选地通过下述步骤利用经改进而包含了12-6范德华配体-蛋白能量排斥项和配体构象能量项的Bhm得分函数(scoring function)进行，所述步骤为(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；(2)提供所述MHC II类分子模型容许的肽主链的第二数据库；(3)从第一数据库中筛选模型；(4)从第二数据库中筛选容许的肽主链；(5)鉴定在每个抽样片段中存在的氨基酸残基侧链；(6)确定存在于每个抽样片段中的所有氨基酸残基侧链的结合亲和值；以及对每一模型和每一所述的主链重复步骤(1)到(5)；
●选自表1的具有潜在的MHC II类结合活性且由未经免疫遗传修饰的胰岛素构建的13肽T-细胞表位肽，及其在制造在体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物学活性的任何未经修饰的分子的胰岛素中的用途；
●由上述的13肽T-细胞表位肽中的至少9个连续的氨基酸残基组成的肽序列，及其在制造在体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物学活性的任何未经修饰的分子的胰岛素中的用途。
根据对本发明的理解，术语″T-细胞表位″是指具有下述能力的氨基酸序列，即能结合MCH II、能刺激T-细胞和/或以与MHC II的复合物的形式结合(但不一定可测量地激活)T-细胞。此处及后附权利要求中所用的术语“多肽”是指包含两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸之间通过肽键相连(定义见下)。肽的生物生产中涉及20种不同的天然存在的氨基酸，任意数量的所述氨基酸可按任意的顺序连接形成肽链或环。用于生物生产肽中的天然存在的氨基酸全部具有L-构型。可应用常规的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或两种不同构型氨基酸的各种组合制备合成肽。一些肽仅包含少量的氨基酸单元。例如含有不到10个氨基酸单元的短肽有时被称作″寡肽″。其他的包含大量氨基酸残基，例如达100个或更多个氨基酸残基的肽称作“多肽”。习惯上将含有3个或3个以上氨基酸的任何肽链多看作“多肽”，而将“寡肽”视为特定类型的短“多肽”。因而本文所提及的“多肽”也包括“寡肽”。而且，所用到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。不同的氨基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，多肽的数量以及可形成的蛋白的数量实际上是无限的。“α碳(Cα)”是肽链中碳-氢(CH)组分中的碳原子。“侧链”是Cα的侧基，其可包含简单的或复杂的基团或部分，且具有与所述肽的大小相比可显著变化的外形大小。
本发明可应用于与此处公开的胰岛素具有基本上相同的一级氨基酸序列的任何胰岛素分子，也可以包括利用基因工程手段或其他方法获得的并且可能包含多于或少于21或30个氨基酸残基的胰岛素。
胰岛素蛋白，如从其他哺乳动物来源中鉴定出的相关蛋白与本发明中公开的肽序列之间存在大量共有序列，且与列表中公开的肽序列间存在大量基本上相同的共有序列。因此这样的蛋白序列也落入本发明的保护范围。
本发明是为了克服实际应用中存在的下述问题，即将可溶性蛋白引入自体生物中可引发免疫应答，产生可与所述可溶性蛋白相结合的宿主抗体。其中的一个例子是干扰素α2，尽管这一蛋白是内源产生的，但许多病人都会产生针对它的抗体[Russo，D.等(1996)，出处同上；Stein，R.等(1988)，出处同上]。将胰岛素用于治疗用途时可能也会存在类似的问题，本发明试图通过提供在施用于人体时引起免疫应答的倾向发生改变的胰岛素蛋白来解决这一问题。
本发明中形成经修饰的胰岛素的总的方法包括下述步骤：
(a)确定多肽或其中一部分的氨基酸序列；
(b)通过任意方法，包括利用体外或利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；
(c)设计新的序列变异体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定。构建此序列变异体以避免由所述的序列变异体产生新的潜在T-细胞表位，否则所述的新的潜在T细胞表位又通过此种方式进行修饰以基本上减弱或消除T-细胞表位活性；和
(d)通过重组DNA技术构建所述序列变异体，并检测所述的变异体以便根据已知的重组技术鉴定一个或多个具有所需功能的变异体。
对于步骤(b)中对潜在T-细胞表位的鉴定可依照本领域已公知的方法进行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317中也公开了适当的方法，并优选用于鉴定胰岛素-衍生的肽对MHC II类分子的结合倾向。
在实施例部分公开了另一种非常有效的通过计算鉴定T-细胞表位的方法，它是本发明的优选实施方案。
实践中，制备许多胰岛素蛋白变异体并检测所需的免疫和功能特性。最优选通过重组DNA技术生产所述的变异体蛋白，同时也可以利用其他的方法，包括化学合成胰岛素片段。
涉及20/31个氨基酸残基的人胰岛素蛋白序列的根据上述方案中步骤(b)的分析结果列于表1。
表1：具有潜在人MHC II类结合活性的人胰岛素的肽序列肽的α链：
GIVEQCCTSICSL，QCCTSICSLYQLE，TSICSLYQLENYC肽的β链：
QHLCGSHLVEALY，CGSHLVEALYLVC，SHLVEALYLVCGE，
HLVEALYLVCGER，EALYLVCGERGFF，ALYLVCGERGFFY，
LYLVCGERGFFYT，YLVCGERGFFYTP肽是13肽，氨基酸用单字母表示。
涉及本发明的经修饰分子的根据上述方案中步骤(c)和(d)所得的设计结果和构建体列于表2和表3。
表2：导致人胰岛素的潜在T-细胞表位消除的替代(WT＝野生型，α＝α链；β＝β链)。
链   残基#    WT残基           替代
α         3        V                A C D E G H K N P Q R S T
α         10       I                A C D E G H K N P Q R S T
β         6        L                A C D E G H K N P Q R S T
β         11       L                A C D E G H K N P Q R S T
β         15       L                A C D E G H K N P Q R S T
链   残基#    WT残基           替代
α         3        V                M W Y
α         4        E                A C G P V W Y
α         5        Q                A C G P
α         6        C                D E H K N P Q S T
α         8        T                H P
α         9        S                T
α         11       C                E H I N P Q S T
β         6        L                W
β         15       L                W
β         17       L                W Y
β         22       R                AC F G I L M PV
β         24       F                I K N P S T
β         26       Y                H I P T V W
β         27       T                A C F G I L M P V W Y
β         16       Y                A C D E G H K N P Q R S T
β         17       L                A C D E G H K N P Q R S T
β         18       V                A C D E G H K N P Q R S T
表3：导致相应于一个或多个MHC同种异型的潜在T-细胞表位去除的额外替代
本发明涉及胰岛素类似物，其中，在可以导致所述蛋白中基本上减弱或从所述蛋白中去除一个或多个潜在的T-细胞表位的位点替代了至少一个氨基酸残基。表1中鉴定的任何潜在的MHC II类配基中特定位点的一个或多个氨基酸的替代，可产生当作为治疗剂施用于人体时具有减弱的潜在免疫原性的胰岛素分子。优选地，在预计可以实现基本上减弱或去除T-细胞表位活性的肽序列中的适当位点进行氨基酸替代。实践中，合适的位点优选地等同于在MHC II类结合沟内提供的疏水口袋之一中结合的氨基酸残基。
最优选是在所述肽中称作P1或P1锚的位置改变裂缝中第一口袋内的结合。公认地，肽的P1锚残基和MHC II类结合沟第一口袋之间的结合相互作用的质量是整个肽的总结合亲和性的主要决定因素。在所述肽这一位置的适当替代应当是替换为不易容纳到所述口袋中的残基，例如替换为更亲水的残基。所述肽中相应与MHC结合裂缝内其他口袋区域结合的位置处的氨基酸残基也被认为是落入本发明的范围内。
可以理解，由给定的潜在T-细胞表位内的单一氨基酸替代导致该表位去除的路线是最优选的。也可以进行单一表位内的组合替代，例如，这对于单独定义的表位间彼此重叠的情况特别适宜。此外，在给定的表位内一个一个地进行或在一个表位内组合进行的氨基酸替代也可以发生在非对应于MHC II类结合沟的″口袋残基″的位置，在所述肽序列内的任意位点进行。替代可参照同源结构或由本领域已知的利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究技术产生的结构方法，也可以根据本发明分子的已知结构特征进行。所有此类替代均落入本发明的范围内。
也可以考虑不在上面所鉴定的肽内进行氨基酸替代，特别是与在所列肽内进行的替代相结合的情况下。例如可以考虑利用某种改变恢复变异体分子的结构或生物学活性。这种补偿性的改变和由胰岛素多肽中缺失或添加特定的氨基酸残基得到具有所需活性的变异体的改变，以及任何本发明公开的肽中的改变均落入本发明的范围内。
本发明的范围涉及经修饰的胰岛素，含有上述经修饰的胰岛素蛋白或经修饰的胰岛素蛋白片段的组合物，及其相关的组合物应认为均落入本发明的范围内。另一方面，本发明涉及编码经修饰的胰岛素实体的核酸。另一方面本发明涉及利用经修饰的胰岛素蛋白对人进行治疗的方法。
实施例
有多种因素对决定蛋白或多肽的总体结构起重要作用。首先是肽键，即将氨基酸连接在一起形成链的键，它是一种共价键。这种键是平面结构的，实质上是一种取代的酰胺。“酰胺”指含-CONH-基团的一组有机化合物中的任何一组化合物。
连接相邻氨基酸的Cα的平面肽键如下所示：
Figure A0280626200181
由于O＝C和C-N原子位于一个相对刚性的平面中，所以不会发生沿这些轴的自由旋转。因此，图中虚线所示的平面有时被称作″酰胺″平面或″肽平面″，肽主链中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氢(H)原子位于其中。Cα原子位于酰胺平面中相对的角上。由于肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不发生旋转，所以多肽链包含一系列连接Cα原子的平面肽键。
第二个对决定多肽或蛋白的整体结构或构象起重要作用的因素是绕共有Cα键的每一酰胺平面的转角。此后术语″转角″和″扭转角″是等同的术语。假定O、C、N和H原子保留在酰胺平面中(这通常是一种正确的假设，尽管在一些构象中这些原子会轻微的偏移平面)，这些转角确定了N和R多肽主链构象，即相邻残基之间的结构。这两个转角称为φ和ψ。因此，一套φi和ψi角(其中，脚标i代表多肽链中的特定残基)有效地限定了多肽的二级结构。在文献中定义了用于确定φ和ψ角的惯例，即在规定的多肽中酰胺平面形成0度角的参考点，以及哪个角是φ角，哪个角是ψ角的定义。参见Ramachandran等.Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)，285-94页，这些页中的内容在此引入作为参考。
本发明的方法可应用于任何蛋白，并部分基于下述发现，即人MHCII类分子结合沟的初级口袋1锚定位点可以具有设计好的对特定氨基酸侧链的特异性。这一口袋的特异性由MHC II类分子β链第86位的氨基酸的身份来确定。这一位点位于口袋1的底部并决定可容纳于这一口袋中的氨基酸侧链的大小。Marshall，K.W.，J.Immunol.，152：4946-4956(1994)。如果这一残基是甘氨酸，则所有的疏水性脂肪族和芳香族氨基酸(疏水性脂肪族氨基酸指：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族氨基酸指：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容纳于所述的口袋中，优选芳香族侧链。如果这一口袋残基是缬氨酸，则该氨基酸的侧链伸到口袋中并限制了可容纳的肽侧链的大小，所以只有疏水性脂肪族侧链可容纳进去。因此在氨基酸残基序列中，无论哪里发现了带有疏水性脂肪族或芳香族侧链的氨基酸，即有存在MHC II类限制性T-细胞表位的可能性。但是，如果所述的侧链是疏水性脂肪族侧链，其与T-细胞表位结合的可能性约是芳香族侧链的两倍(假定1型口袋近似平均地分布于全球种群中)。
将本发明具体化的计算机方法描绘出肽区域包含T-细胞表位的可能性，该方法如下：(1)扫描预定长度肽片段的一级序列，并鉴定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族侧链。(2)对疏水性脂肪族侧链赋予比芳香族侧链高的值；优选两倍于赋予芳香族侧链的值，例如，给疏水性脂肪族侧链赋值为2，给芳香族侧链赋值为1。(3)将所述肽中的预定统一长度的每一重叠氨基酸残基片段(窗口)中确定存在的值总和起来，再将某一特定片段(窗口)的总值赋予该片段(窗口)中间位置的某个单个氨基酸残基，优选赋予处于抽样片段(窗口)中间点的氨基酸残基。将这一过程对每一抽样的重叠氨基酸残基片段(窗口)重复进行。因此，所述肽的每一氨基酸残基均被赋予了一个值，该值与T-细胞表位存在于此特定片段(窗口)中的可能性相关。(4)用按照上述步骤3的描述中计算、赋予的值对被评估的整个氨基酸残基序列的氨基酸坐标作图。(5)序列中具有预定值(例如该值为1)的所有部分均被认为可能包含T细胞表位，并且在需要时可进行修饰。
在这一方面本发明提供了通用的方法，由此可描述可能包含T-细胞表位的肽区域。在这些区域中对所述的肽进行修饰有可能改变对MHCII类的结合特性。
依照本发明的另一方面，可利用更复杂的计算方法更精确地预测T-细胞表位，该方法考虑了肽与MHC II等位基因模型之间的相互作用。根据这一方面，计算机预测存在于所述肽中的T-细胞表位包括，根据所有已知的MHC II类分子结构构建至少42个MHC II类等位基因模型，将这些模型应用于T-细胞表位计算机鉴定的方法，构建每一模型的肽主链文库以便允许在相关肽主链α碳(Cα)位置具有已知的变异性，在肽和MHC II类分子相互作用的关键位置上的20种可供选择的氨基酸中的每一种，构建与每一主链坞(dock)的氨基酸侧链构象文库，利用这些主链和侧链构象文库并结合得分函数选择对与特定MHC II类分子结合的特定肽而言最佳的主链和侧链构象，并从这一相互作用推导出结合分数。
MHC II类分子模型可从Brookhaven蛋白数据库(″PDB″)中的许多类似的结构出发通过同源建模推导得出。它们可通过使用引入了模拟退火算法的半自动同源建模软件(Modeller，Sali A.& Blundell TL.，1993.J.Mol Biol 234：779-815)并结合用于能量最小化的CHARMm力场(购自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)制备。也可以应用其他的建模方法。
本发明的方法与下述的其他计算机方法有着显著的不同，这些方法为：利用从实验中得来的关于一小组MHC II类分子结合沟中每一位点的每一种氨基酸选项的结合数据文库的方法(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1(3)：157-162)(1995)；或利用类似的实验结合数据以定义所述的沟中特定结合口袋类型的结合特性(同样再利用相对小的MHC II类分子亚组)，然后将这一口袋文库中的口袋类型进行‘混合和匹配’以人工构建更“实际的”MHC II类分子的方法(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)：555-561(1999)。这两种现有方法的主要缺陷在于实验的复杂性和需要合成大量的肽变异体，而仅有少量的MHC II类分子可通过实验扫描。因此第一种已知的方法仅能预测少量的MHC II类分子。第二种已知的方法还假设在不同II类等位基因的背景下在一个分子中衬有类似氨基酸的口袋将具有相同的结合特性，并且其另外的缺陷在于，仅仅可“实际地”地构建出那些包含口袋文库中所包含的口袋的MHC II类分子。利用本发明的建模方法可推导出任意数量和类型的MHC II类分子的结构，因此可特异性地选择等位基因以代表全球种群的特征。此外，扫描的MHC II类分子的数量可通过构建更多的模型而增加而无需通过复杂的实验获得额外的数据。
利用主链文库使得被扫描的各种肽在与特定的MHC II类分子结合时其Cα原子位置处可进行变化。这也与上述现有技术中的计算机方法不同，在那些方法中依赖于利用简化的肽主链来扫描结合在特定口袋中的氨基酸。这些简化的主链不可能代表在“真正的”肽中的主链文库构象，导致对肽结合的预测不准确性。本发明的主链文库是通过叠加蛋白数据库中所有与MHC II类分子结合的肽的主链，并考虑到位于结合沟内的11个氨基酸的每个氨基酸的Cα原子之间的均方根(RMS)差而构建的。尽管该文库可来自少量合适的可获得的小鼠和人的结构(当前为13种)，为了允许存在甚至更大变异的可能性，将每一C″-α位点的RMS数字提高50％。然后确定每一氨基酸的平均Cα位置，围绕这一点划一个球，其半径等于在该位置的RMS差加50％。该球体代表所有可允许的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸残基的Cα，等同于结合沟中11个残基的位置2)起运作，将所述的球三维网格化，网格内的每个顶点作为该氨基酸Cα的可能位置。将后续的酰胺平面(相应于与后续氨基酸的肽键)接枝到这些Cα的每一个上面，将φ和ψ角以设定的间隔逐步地转动以便于安置后续的Cα。如果后续的Cα落入对这一Cα而言‘可被允许的位置球’中，则此二肽的取向即可被接受，如果其落入所述球之外则所得的二肽不能被接受。对每一后续Cα位置均重复这一过程，使肽从所述的口袋1 Cα‘种子’开始生长，直到全部9个后续的Cα的位置均根据之前Cα的所有可能排列确定下来。然后对口袋1前的单个Cα再重复上述步骤1次以构建定位于结合沟内的主链Cα位置文库。生成的主链数目取决于几种因素：‘可被允许的位置球’的大小；对口袋1位点处‘最初的球’网格化的细度；用于定位后续Cα的φ和ψ角逐步旋转的细度。利用这一程序可以构建大的主链文库。主链文库越大越可能发现对MHC II类分子结合沟内特定肽的最适主链。
鉴于和结合结构域的氨基酸可能存在冲突，所以不是所有的主链均适合于与所有MHC II类分子模型‘对接’(docking)，故对每个等位基因建立包含适合于该等位基因的主链的亚文库。利用所述的主链文库并结合MHC II类分子模型可以构建出由与每一容许主链对接的每一MHC II类分子结合沟的每一位点中的每一氨基酸的容许侧链构象所组成的详尽数据库。可以利用简单的立体重叠函数构建这一数据组，其中，主链与MHC II类分子对接，氨基酸侧链在所需位置被嫁接到主链上。将侧链上每一个可旋转的键以设定的间隔逐步旋转，记录下依赖于该键的原子的最终定位。将所述原子与结合沟侧链原子间的相互作用记录下来，根据下述的标准确定是否接受这些位置：如此定位的所有原子的重叠总量不能超过预定值。因此，构象搜索的严谨度是在键的逐步旋转中所用间隔及对总重叠的预定限度的函数。如果已知特定的口袋是刚性的，则后一值可以较小，但若已知口袋侧链位置相对灵活则严谨度可放松。这样可以模拟结合沟口袋内灵活性的变化。针对与每一个MHC II类分子对接后每一主链的所有位点上的所有氨基酸重复这种构象搜索以建立详尽的侧链构象数据库。
用适当的数学表达式评价MHC II类分子模型与肽配体构象的结合能量，所述的肽配基构象需通过扫描上述的主链/侧链大数据库根据经验获得。这样，通过对每一长度在9-20个氨基酸范围内变化(尽管对于每一次扫描长度是一定的)的可能肽进行下述计算，扫描蛋白以搜索潜在的T-细胞表位：选择MHC II类分子及适合于该分子的肽主链，将相应于所需肽序列的侧链移植到其上。对于氨基酸的每一容许构象(由上述数据库获得)，收集与主链上特定位点的特定侧链相关的原子身份和原子间距数据。对沿主链的每一侧链重复此过程，利用评分函数推导肽得分。保留该主链的最佳得分，对所选模型的每一允许主链重复该过程。比较所有容许主链的得分，最高的得分被认为是该MHC II类模型中所需肽的得分。对每一模型用从扫描的蛋白得到的所有可能肽重复上述过程，列出肽相对于模型的得分。
在本发明中，用于结合亲和力计算的每种配体都是选自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配基为来自已知序列的肽、多肽或蛋白的长度为约9到20个氨基酸的选定氨基酸链。此后术语“氨基酸”和“残基”视为等同的术语。将移植到选自上述主链文库的主链上的待检测肽中的连续氨基酸肽形式的配基，通过肽主链上C″-α原子坐标定位到来自MHC II类分子模型库的MHC II类分子的结合裂缝中，并从所允许的构象数据选择每一侧链的允许构象。相关的原子身份和原子间距也来自这一数据库并用于计算肽结合分数。将对MHC II类结合口袋具有高亲和力的配基作为侯选标记出来用于定点诱变。在标记的配基中(也由此在目的蛋白中)进行氨基酸替代，然后用评分函数重新测定以确定使结合亲和力降低到预定的阈值以下的变化。这些变化即可引入到目的蛋白中以去除T-细胞表位。
肽配基与MHC II类分子结合沟的结合涉及非共价键相互作用，其包括但不限于：氢键、静电相互作用、疏水(亲脂)相互作用和范德华相互作用。它们包括在下面将详细描述的肽评分函数中。应当理解，氢键是非共价键，其可在极性或带电的基团之间形成，由被两个其他原子共享的氢原子构成。氢供体中的氢带正电荷，而氢受体带有部分负电荷。用于肽/蛋白相互作用时，氢键供体可以是连接氢的氮，或连接在氧或氮上的氢。氢键受体原子可以是没有连接氢的氧、没有连接氢并具有一或两个连接的氮或仅有一个连接的硫。某些原子，如连接了氢的氧或亚胺氮(如C＝NH)，既可以是氢受体也可以是氢供体。氢键的能量在3-7Kcal/mol，大大强于范德华键，但弱于共价键。氢键具有高度的方向性，且当供体原子、氢原子和受体原子共线时最强。静电键是在带有相反电荷的离子对间形成的，根据库仑定律这种相互作用的强度与原子间距离的平方成反比。离子对间的最佳距离是约2.8。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、组氨酸或赖氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之间形成静电键。该键的强度依赖于电离基团的pKa和培养基的介电常数，尽管其与氢键的强度类似。
亲脂相互作用是蛋白和肽配基之间发生的有利的疏水-疏水相互作用。这种相互作用通常出现在埋于结合沟口袋中的肽的疏水性氨基酸侧链间，以使它们不暴露在溶剂中。将疏水残基暴露于溶剂中是非常不利的，因为周围的溶剂分子被迫在彼此间形成氢键而形成笼状结构。所导致的熵值降低是非常不利的。亲脂性原子可以是既非极性又不是氢受体的硫和非极性的碳原子。
范德华键是相距3-4的原子间的非特异性的力。它比氢键和静电键弱、特异性低。原子周围的电荷分布随时间变化，并且在任何瞬间电荷分布均是不对称的。这种瞬间的电荷不对称性诱导临近原子中的类似不对称性。此时在范德华接触距离所导致的原子之间的吸引力达到最大，而在约1到2处迅速消失。相反，当原子间隔距离小于此接触距离时，由于原子外部的电子云重叠使斥力不断增强成为主导。尽管与静电和氢键相比，此时吸引力相对较弱(约0.6Kcal/mol)，但所述斥力对于决定肽配基是否能与蛋白成功结合可能非常重要。
在一个实施方案中，利用Bhm评分函数(SCORE1方法)评估结合常数(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)：243-256(1994)，该文献在此全文引入作为参考)。在另一个实施方案中，用评分函数(SCORE2方法)评估结合亲和力，所述的亲和力作为含有T-细胞表位的配基的指标(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)：309-323(1998)，该文献在此全文引入作为参考)。但是上述文献描述中的Bhm评分函数是用于评估下述情况中配基对蛋白的结合亲和力的，即已知所述的配基可成功地与所述蛋白结合，且蛋白/配基复合物的结构已解析，这一结构已列于蛋白数据库(″PDB″)中。因此，利用已知的实际结合数据使评分函数得到了发展。为了使肯定和否定的结合者相区别，需向方程中加入排斥项。此外，可通过以两两配对方式计算亲脂相互作用，而非利用上述Bhm函数中基于面积的能量项来进行更理想的结合能量评估。因此，在一个优选实施方案中，用经修饰的Bhm评分函数评估结合能。在经修饰的Bhm评分函数中，在评估蛋白和配基之间的结合能(ΔGbind)时考虑了下述参数：由于配基的平移熵和转动的整体损失造成的结合能降低(ΔG0)；理想氢键的贡献(ΔGhb)，其中至少一个配对物是中性的；  无扰离子相互作用的贡献(ΔGionic)；亲脂配基原子和亲脂受体原子之间的亲脂相互作用(ΔGlipo)；由于配体中内在自由度的冻结(即绕每一C-C键的旋转自由度降低了)造成的结合能损失(ΔGrot)；蛋白和配基之间相互作用的能量(Evdw)。考虑到这些项给出方程式1：
(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(Evdw)
其中N是对于特定项限定的相互作用数目，在一个实施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常数，其值分别为：5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb项依照方程式2计算：
Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcs
f(ΔR，Δα)是罚函数，其解释氢键自理想情况的巨大偏离，并依照方程式3计算：
f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)
其中：
如果ΔR＜＝TOL           则f1(ΔR)＝1，或者
如果ΔR＜＝0.4+TOL       则f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者
如果ΔR＞0.4+TOL         则f1(ΔR)＝0
并且：
如果Δα＜30°           则f2(Δα)＝1，或者
如果Δα＜＝80°         则f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者
如果Δα＞80°           则f2(Δα)＝0
TOL是氢键键长所能允许的偏差＝0.25
ΔR是H-O/N氢键键长与理想值＝1.9的偏差
Δα是氢键键角∠N/O-H..O/N与180°理想值的偏差
f(Nneighb)区分蛋白表面的凹凸部分，并因此赋予口袋中而非蛋白表面的极性相互作用更高的权重。这一函数根据下述式方程4计算：
f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5
Nneighb为蛋白中与任意给定蛋白原子之间的距离小于5的非氢原子的数量。
Nneighb，0是常数＝25
fpcs是用于估计每氢键的极性接触表面面积的函数，由此区分强和弱的氢键，其值由下述的标准确定：
当Apolar/NHB＜102时      fpcs＝β
当Apolar/NHB＞102时      fpcs＝1
Apolar是极性蛋白-配基接触面的大小
NHB是氢键的数目
β是常数＝1.2
由于假定了相同的几何相关性，在实施经修饰的Bhm评分函数时，离子相互作用的贡献ΔGionic用与上述有关氢键的类似方式计算。Nlipo项按下述的方程式5计算：
Nlipo＝∑ILf(rIL)
根据下述标准，对于所有亲脂配基原子I和所有亲脂蛋白原子L，计算f(rIL)：
当rIL＜＝R1时              f(rIL)＝1
当R2＜rIL＞R1时            f(rIL)＝(rIL-R1)/(R2-R1)
当rIL＞＝R2时              f(rIL)＝0
其中：R1＝rI vdw+rL vdw+0.5
      R2＝R1+3.0
      rI vdw是原子I的范德华半径
      rL vdw是原子L的范德华半径
Nrot项是氨基酸侧链中可旋转的键的数目，其被视为无环的sp3-sp3及sp3-sp2键的数目。末端-CH3或-NH3的旋转未考虑进去。
最终项Evdw依照如下方程式6计算：
Evdw＝ε1ε2((r1 vdw+r2 vdw)12/r12-(r1 vdw+r2 vdw)6/r6)，
其中：ε1和ε2是取决于原子身份的常数
r1 vdw+r2 vdw是范德华原子半径
r是原子对间的距离。
关于方程式6，在一个实施方案中，ε1和ε2常数被赋予如下原子值，分别为：C：0.245，N：0.283，O：0.316，S：0.316(即分别对于碳、氮、氧和硫原子)。对于方程式5和6，给予范德华半径如下原子值，分别为C：1.85，N：1.75，O：1.60，S：2.00。
应当理解上述方程式中所有预定的值和给定的常数都是在现有的对蛋白配基相互作用的理解局限内具体相对于此处所用的计算类型确定的。因此，随着这种评分函数的进一步精简，这些值和常数也会因此而改变，任何能在蛋白和配基结合能的评估方面给出所需结果的适宜数值均可使用，而且，其也落入本发明的保护范围。如上所述，所述的评分函数应用于由上述侧链构象、原子身份和原子间距数据库中提取的数据。为本说明书的目的，该数据库中包含的MHC II类分子数是42个模型加上4个已解析的结构。从上述描述中可清楚地了解到，本发明的计算机构建方法的模块性质意味着，可简单地添加新的模型，并利用肽主链文库和侧链构象搜索功能进行扫描以创建其它的可通过上述的肽评分函数处理的数据集。这使得经扫描的MHC II类分子库可以很容易地增加，或者如果可以获得相关数据，则可以替换结构和相关数据以创建现有等位基因的更精确的模型。本发明的预测方法可以相对于包含大量已通过实验确定了其对不同MHC II类分子的亲和力的肽的数据集进行校准。将计算值与实验数据相比较，可确定一截断值，已知该值之上所有经实验确定的T-细胞表位都得以正确的预测。应当理解，尽管上述评分函数与现有的一些复杂方法相比相对简单，但是计算进行得非常迅速。还应当理解的是目的并不在于计算出对接到所选择的MHC II类蛋白结合沟内的每种肽的真正结合能本身。根本的目的在于获得相对的结合能数据，以助于根据所选择蛋白的一级结构(即氨基酸序列)来预测T-细胞表位的定位。相对高的结合能或结合能高于选定的阈值意味着在配体中存在T-细胞表位。然后可以将所述配体进行至少一轮氨基酸替代，并再次计算结合能。由于计算可迅速进行，对肽序列的这些操作可在现有成本划算的计算机硬件上于程序用户界面中互动进行。由此不需要对计算机硬件进行大量投资。本领域的技术人员应当了解，也可使用其他软件达到相同的目的。特别是可以使用能将配基对接入蛋白结合位点并与能量最小化相结合的更复杂的软件。对接软件的例子为：DOCK(Kuntz等.，J.Mol.Biol.，161：269-288(1982))，LUDI(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8：623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.，等.，ISMB，3：300-308(1995))。分子建模和操作软件的例子包括：AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用这些计算机方法将严重限制本发明方法的信息吞吐量，这是由于进行必要的计算所需的处理时间导致的。但是可行的方式为，将这些方法作为‘第二级筛选’以获得关于通过本发明的方法发现为‘正结合体’的肽的更精确的肽结合能计算值。用于复杂的分子机械或分子动力学计算的处理时间的限制是由进行所述计算的软件设计和目前计算机硬件技术限制共同确定的。可以预期在将来，随着编写更高效的代码和计算机处理器速度的不断提高，在更易于控制的时间框架内进行上述计算是可行的。有关用于大分子的能量函数的其他信息和有关在折叠蛋白结构内发生的多种相互作用的考虑可参考下述文献：Brooks，B.R.，等，J.Comput.Chem.，4：187-217(1983)，有关蛋白-配体一般相互作用的信息参见：Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)：31-47(1988)，这些文献均全文引入作为参考。其他有用的背景资料也可参见Fasman，G.D.编辑，Prediction of Protein Structure and the Principles of ProteinConformation，Plenum Press，New York，ISBN：0-306 4313-9。

Claims (29)

1.一种经修饰的分子，其具有胰岛素的生物活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物功能但未经修饰的分子。
2.如权利要求1所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位而实现的。
3-如权利要求1或2所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过减少能与由所述分子衍生的肽相结合的MHC同种异型的数量来实现的。
4.如权利要求2或3所述的分子，其中，去除了一个T-细胞表位。
5.如权利要求2-4中任意一项中所述的分子，其中，原本存在的T-细胞表位是MHC II类配体，或表现出经II类分子呈递作用后具有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列。
6.如权利要求5所述的分子，其中，所述的肽序列衍生自胰岛素的α链和/或β链，并选自如表1所示的组。
7.如权利要求2-6中任意一项所述的分子，其中，任何原本存在的T-细胞表位中的1-9个氨基酸残基发生了改变。
8.如权利要求7所述的分子，其中，有一个氨基酸残基发生了改变。
9.如权利要求7或8所述的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是用其他的氨基酸残基在特定的位置替代原本存在的氨基酸残基。
10.如权利要求9所述的分子，其中，按表2所示在自胰岛素的α链和/或β链上进行一个或多个氨基酸残基的替代。
11.如权利要求10所述的分子，其中，另外还按表3所示在自胰岛素的α链和/或β链上进行一个或多个氨基酸残基的替代以减少能与由所述分子衍生的肽相结合的MHC同种异型的数量。
12.如权利要求9所述的分子，其中，按表3所示进行一个或多个氨基酸的替代。
13.如权利要求7或8所述的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是在特定的位置缺失原本存在的氨基酸残基。
14.如权利要求7或8所述的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是在特定的位置向原始序列中添加氨基酸残基。
15.权利要求7到14中任一项所述的分子，其中，通过进一步的改变恢复所述分子的生物学活性。
16.如权利要求15所述的分子，其中，进一步的改变是替代，添加或缺失特定的氨基酸。
17.如权利要求7-16中任意一项所述的经修饰分子，其中，所述氨基酸的改变是参照同源蛋白序列进行的。
18.如权利要求7-16中任意一项所述的经修饰分子，其中，所述氨基酸的改变是参照利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究模拟技术进行的。
19.编码权利要求1-18中任意一项所述的经修饰胰岛素分子的DNA序列。
20.一种药物组合物，其包含上述任意一项权利要求中所定义的具有胰岛素生物学活性的经修饰分子，并可任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
21.制造上述任何一项权利要求中所定义的具有胰岛素生物学活性的经修饰分子的方法，该方法包括下述步骤：
(i)确定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；
(ii)通过任意方法，包括利用体外的或利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；
(iii)设计新序列的变异体，在该变异体中经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由在体外的或利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合，或通过肽-MHC复合物与T-细胞相结合来确定；
(iv)通过重组DNA技术构建所述序列的变异体，并检测所述的变异体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变异体；和
(v)可选择的重复步骤(ii)-(iv)。
22.如权利要求21所述的方法，其中步骤(iii)是通过在任何原本存在的T-细胞表位中替代、添加或缺失1-9个氨基酸残基来进行的。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述的改变是参照同源蛋白序列和/或利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究模拟技术进行的。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中，步骤(ii)是通过下述步骤进行的：
(a)在所述的肽中选择一个具有已知氨基酸序列的区域；
(b)然后由所选择的区域中顺序抽取预定统一大小且至少由3个氨基酸残基组成的重叠氨基酸残基片段；
(c)通过对存在于抽样氨基酸残基片段中的每个疏水氨基酸残基侧链赋值求和，计算每一抽样片段的MHC II类分子结合值；和
(d)根据计算出的该片段的MHC II类分子结合分值鉴定至少一个适于修饰的片段，以在基本上不减弱所述肽的治疗功效的前提下改变整体的MHC II类的结合分值。
25.如权利要求24所述的方法，其中，步骤(c)通过下述步骤利用经改进而包含12-6范德华配体-蛋白能量排斥项和配体构象能量项的Bhm评分函数进行，所述步骤为：
(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；
(2)提供可允许用于所述MHC II类分子模型的肽主链的第二数据库；
(3)从第一数据库中筛选模型；
(4)从第二数据库中筛选可允许的肽主链；
(5)鉴定在每个抽样片段中存在的氨基酸残基侧链；
(6)确定存在于每个抽样片段中的所有氨基酸残基侧链的结合亲和值；和对每一模型和每一所述的主链重复步骤(1)到(5)。
26.一种选自表1所示组的13肽T-细胞表位肽，其具有潜在的MHC II类结合活性，且由未经修饰的胰岛素α链和/或β链构建。
27.一种肽序列，其由如权利要求26所示的13肽T-细胞表位肽中至少9个连续的氨基酸残基组成。
28.如权利要求26所述的13肽T-细胞表位肽在制造胰岛素中的用途，其中，所述的胰岛素在体内使用时，基本上没有免疫原性、或其免疫原性低于具有相同生物学活性的任何未经修饰的分子。
29.如权利要求27所述的肽序列在制造胰岛素中的用途，其中，所述的胰岛素在体内使用时，基本上没有免疫原性、或其免疫原性低于具有相同生物学活性的任何未经修饰的分子。
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