CN1516741A - 用于简化复合肽混合物的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从含有多种肽的样品中获得简化肽混合物的方法和试剂。简化样品比原来的肽样品更容易分析，而且简化样品代表了混合蛋白样品中存在的全部或者接近全部的蛋白，原来的和更复杂的肽样品来自所述混合蛋白样品。本发明方法需要使用包括氨基酸特异性反应基(R)的标记部分。标记部分在特异氨基酸位点“标记”肽或者蛋白(例如，通过和一个氨基酸反应形成共价键)，最终能够分离含有这些特异氨基酸的肽。其它方法需要使用反应部分(Rp)，所述反应部分包括和选择的蛋白共价或者非共价选择性相互作用的试剂。例如，Rp可以为被标记受体的天然配体或者与被标记的第二个蛋白相互作用的蛋白。Rp可以为酶底物或者诸如抗体，ATP，GTP，NAD，NADP，NADH，NADPH，泛素或者其结构类似物的其它分子识别元件。

Description

用于简化复合肽混合物的方法和试剂盒
发明背景
用于细胞中蛋白的鉴定，定量和定位的蛋白质组(Proteomic)技术将大大推进通过基因组技术所获得的对细胞功能和发育的理解。例如，高级质谱技术能够分析复合蛋白混合物，例如多蛋白复合物，细胞组分和全细胞提取物有望提供强有力的高通量诊断和筛选方法。
质谱可用于鉴定混合物中的一种蛋白或者多种蛋白。另外，质谱可用于肽的从头测序。例如，复合蛋白混合物(例如，细胞提取物)的蛋白水解产生的肽的串联质谱可用于鉴定和定量最初混合物中存在的蛋白。这种结果的获得是因为能够选择单个m/z值并能够进行离子碰撞诱导解离(CID)的串联质谱可用作肽的测序和鉴定。由肽的CID产生的信息可用于搜索蛋白和核苷酸序列数据库以鉴定谱图所代表的氨基酸序列，从而鉴定肽所来源的蛋白。
用于鉴定来自降解蛋白的肽的复合混合物中肽的串联质谱使用三种类型的信息。首先，获得肽的质量。仅仅这个信息就可以大大降低肽序列的可能数目，尤其是如果蛋白用序列特异性蛋白酶降解时。第二种类型的信息是由肽离子的CID产生的碎片离子谱。将碎片离子谱和由序列数据库计算产生的理论碎片离子谱比较的分析方法可用来鉴定肽序列。这种方法可以鉴定最匹配肽并且可以统计确定哪种肽序列更可能正确。通过使用多维MS分析重新获得肽部分的序列能够进一步提高预测的准确性。这种直接序列信息可以用于进一步提高基于碎片离子谱的预测准确性。一旦肽得到鉴定，通过搜索序列数据库可很容易确定产生肽的蛋白。
复合混合物例如细胞提取物中的蛋白，可以通过将蛋白酶解，液相色谱分离，串联质谱，将肽质谱和那些基于序列数据库的理论预测相关联的计算机算法和从头测序结合起来进行鉴定。电雾化电离使得液相色谱直接和串联质谱结合从而使复合混合物能够在导入质谱之前而暂时分离。可用全基因组序列的生物体数目的增加将大大提高利用这种方法分析复合混合物的价值。
本发明的概述
本发明的特征在于从含有多种肽的样品，例如由蛋白混合物，例如从生物样品获得的蛋白混合物的蛋白酶降解产生的样品，获得简化肽混合物的方法和试剂。本发明的方法和试剂可用来根据合理和受控的方案减少样品中肽(或者蛋白)的数量从而获得含更少量肽的简化肽样品。例如，由蛋白酶降解混合蛋白样品产生的肽样品开始，可以获得简化肽样品，其含有仅仅一种或者少数由蛋白降解混合蛋白样品中每种蛋白所产生的肽。简化样品较原始肽样品更容易分析，而且简化样品代表了全部或者接近全部混合蛋白样品中存在的蛋白，原始和更复杂肽样品来自混合蛋白样品。因此，简化肽混合物可用于鉴定和定量在原始混合蛋白样品中的全部或者接近全部的蛋白。即使简化混合物不包括至少一种来自混合蛋白样品中每种蛋白的肽，简化混合物依然有用，因为在一些情况下，不必须鉴定或者定量混合蛋白样品中的所有蛋白。
本发明的方法和组合物可用于分析由复合蛋白混合物(例如，细胞提取物)的酶解所产生的肽。本发明的方法和组合物可用于任一设置，其中希望的是以受控和特定的方式降低肽混合物的复杂性，并且尤其在制备用于质谱分析的肽样品中有实用性。
本发明的方法需要利用包括氨基酸特异性反应基(R)的标记部分。标记部分在特异性氨基酸位点“标记”肽或者蛋白(例如，通过和一个氨基酸反应形成共价键)，最终能够分离含有这些特异性氨基酸的肽。由给定标记部分标记的氨基酸依赖于标记部分中存在的R基团的鉴定。当丝氨酸和苏氨酸存在于肽的氨基末端时，一个R基团(RS/T)标记丝氨酸(ser)和苏氨酸(thr)。另一个R基团(RC)在其巯基处标记在肽中无论何处存在的半胱氨酸(cys)。另一种R基团(RL)在其伯胺处标记在肽中无论何处存在的赖氨酸(lys)。
本发明的特征还在于反应部分(RP)，其包括和选择蛋白共价或者非共价选择性相互作用的试剂。例如，RP可为被标记受体的天然配体或者与被标记的第二个蛋白相互作用的蛋白。可以为酶底物或者诸如抗体，ATP，GTP，NAD，NADH，NADPH，泛素或者其结构类似物的其它分子识别元件。当其使用目的是通过选择性减少蛋白酶解前混合物蛋白样品中蛋白的数量而简化肽样品时，RP是R的特殊形式。
标记部分的反应基直接或者间接和其它有助于标记肽分离的基团相连。因此，标记部分可包括一个连接基团(L)，可以将R基团连接到一个有助于标记肽俘获的基团(B或者M)上。B基团为例如选择性结合到俘获试剂的生物素，例如链亲和素。M基团为磁性粒子，可以通过磁力进行吸附。
分离的肽可通过质谱或者其它任一期望的方法进行分析。例如，质谱可用于鉴定和/或定量分析简化混合物中的一种或者多种肽。
因此，本发明的特征是减少样品中存在肽数量的方法，所述方法包括：(a)提供含有三个共价连接部分的标记部分：
R-L-B
其中，R为和肽或者蛋白反应的反应基(例如：RS/T，RC，RL或者RP)；L为在直链或者支链上含有零个或者多个原子以及一个任选选择性切割位点的连接基团；以及B为可以选择性结合到俘获试剂上的基团；(b)将样品和标记部分反应以提供标记肽或者蛋白；(c)将标记肽或者蛋白和俘获试剂接触以提供俘获的标记肽或者蛋白，并从样品中其它组分(例如，非标记肽或者蛋白)分离俘获的标记肽或者蛋白；(d)从俘获试剂释放标记肽或者蛋白的至少部分肽或者蛋白以提供释放的修饰肽或者蛋白；以及(e)通过质谱分析释放的修饰肽或者蛋白或其片段以鉴定样品中存在的至少一种肽或者蛋白。释放的修饰肽或者蛋白可以包括所有或者部分R以及所有或者部分L或者不包括L。
此外，本发明的特征任选在于R-L*-B部分，其中L*为L的同位素标记形式。这些同位素标记的标记部分为两种或者多种每个彼此相异标记并随后在质谱分析前混合在一起的样品提供了定量方法。同位素标记可以为2H，13C，15N，18O，34S或者其它任一合适同位素标记。本发明的特征任选还在于R*-L-B和R-L-B*，其中B*为B的同位素标记形式，而R*为R的同位素标记形式。本发明的部分也提供了获得差示同位素标记肽或者蛋白的方法。
另外，在本专利申请中，“肽”可以理解为包括“蛋白”或者“修饰肽或蛋白”。
在其它实施方案中，蛋白或者肽可被俘获以通过利用包含以下三种共价连接部分的标记部分的质谱进行分析：
M-L-R
其中M为磁性粒子；L为和M共价连接的连接基团，在直链或者支链上含有零个或者多个原子以及一个任选选择性切割位点；R为特异性反应基，包括和肽或者蛋白反应的一种上述特定反应基(RS，RC，RL，或RP)。在该实施方案中，标记肽或者蛋白可以分离自未标记的肽或者蛋白，通过对M部分选择性施加磁力进行，而不是通过对B部分的选择性试剂俘获进行。
肽可来自酶解蛋白或者通过其它生物或者合成方法加工而来。蛋白可分离自，例如，病人细胞样品，病人血清样品，或者病人组织样品。蛋白可来自，例如，培养细胞，用目的化合物(例如，治疗用化合物或者潜在的治疗用化合物)处理的培养细胞，或者植物细胞，微生物细胞，病毒，或者遗传修饰的细胞。
在不同实施方案中，RC包括巯基特异性反应基(例如，马来酰亚胺基或者吡啶-联硫基)，RL包括一个氨基特异性反应基(例如，琥珀酰亚胺基)，以及RS/T包括一个丝氨酸/苏氨酸特异性反应基(例如，酰肼基团)。RP可以包括RS/T，RC，RL或者酶底物或者其它诸如抗体，或者ATP，GTP，NAD，NADP，NADH，NADPH，泛素或者其结构类似物的其它分子识别元件。
L为单部分或者多部分连接基团，可以包括生物学或者非生物学寡聚体结构。例如，L可以包括任一序列的多肽链，相同氨基酸链(例如，聚甘氨酸或者聚丙氨酸)，交替氨基酸链或者不同氨基酸链。L可以包括例如：O，S，NH，CO，COO，COS，S-S，CH2，烷基，烯基，炔基和烷氧基，或者芳基。L可以包括化学或者酶切位点，能够从M释放修饰肽或者蛋白。L可以或者不可以被稳定或者放射性同位素原子差示标记。
在有些实施方案中，L是可切割的并含有二硫基或者连位二醇基，或者邻硝基苄醚，以及在有些实施方案中，L被同位素标记，和/或R被同位素标记。
多种类型的化学切割位点或者酶切位点或者二者可以包括在L中。例如化学切割可以为利用合适的还原试剂切割的二硫键。可以通过氧化切割乙二醇或者二元醇键。可以利用连二亚硫酸盐切割重氮键。可以利用羟胺，酸或者碱切割酯。可以利用合适的碱切割砜。如果L包括多肽，可以利用蛋白酶切割。可以利用脂酶切甘油酯。可以利用磷酸酶切磷酯。可以利用核酸酶切割多核苷酸或者寡核苷酸。
在各种不同实施方案中，释放步骤包括将俘获标记多肽与还原剂或者其它切割试剂接触，在通过质谱进行分析之前用色谱分离释放的修饰肽。在其它实施方案中，俘获的标记肽首先被处理以从俘获试剂中释放B(或者从磁场俘获中释放M)，然后被处理以从B和所有或者部分L(或者从M和所有或者部分L)释放修饰肽或者蛋白部分。
M，L和R部分可以多种方式通过合成连接。例如，可以购得市售带有结构M-L-NH2的磁性粒子。类似的，可以购得市售带有结构B-L-NH2的俘获试剂。氨基可以和多种双功能交联剂反应从而生成多种通过L连接到M或者B的R基团。
其中R共价连接到磁性粒子的标记部分有很多优点。首先，它们可用来在单个步骤中俘获肽。相比于下列方法这更高效且更容易进行样品操作：肽首先被包含亲和标记的试剂标记，随后将亲和标记俘获到例如珠子或者固体颗粒的固相支持物上，所述珠子或者固体颗粒用连接到亲和标记的俘获试剂包被。R共价连接到磁性粒子或者固相材料的标记部分避免了为了将俘获肽和固相支持物连接而要求实施的两个连接步骤。此外，通过使用固相支持物，例如M-L-R结构，样品清除和去除非衍生化的肽可以通过单个步骤完成。这种俘获更快速且更高效。另外，因为利用磁力吸引磁性粒子的方式分离标记肽，俘获步骤就不易受到反应混合物中存在的组分，例如肽，杂质的干扰，因此就不受诸如缓冲条件和温度等因素的影响。另外，磁性粒子提供了很多优点，容易进行样品操作。M-L-R形式的合适标记部分可以制备如下。具有共价连接伯胺基团Dynal A/S(Oslo，Norway)的磁性粒子(M部分)可以通过和一种来自Pierce Chemical公司的异二功能交联剂N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)反应而激活。这种试剂提供了可被含巯基肽的巯基取代的吡啶巯基。肽也可为包括一个连接不同R基团一级氨基的合成肽。因此含巯基肽组成了部分L基团。含巯基肽可被，例如13C或者氘标记。在这种情况下，M-L-R部分命名为M-L*-R。同位素标记使得在不同样品中的肽或者蛋白相对定量，所述不同样品混合在一起同时通过质谱进行分析。含有巯基的肽优选包括使得俘获肽释放的切割位点。切割位点的例子包括那些带有二硫键的位点，能够进行化学切割，或者例如通过胰蛋白酶进行酶切的位点。肽希望含有L基团，部分因为它们能够相当容易并相对简单合成。由于它们可被设计为基本上亲水性，基本上疏水性或者二者都不是，因此它们能够适应多种类型的溶液条件。另外，肽具有结构和构象的灵活性。肽可以很容易地设计为包括化学切割位点，酶切位点或者两种类型的切割位点。
如上所述，含有巯基肽的一级氨基可以和多种部分反应以使变化的R部分产生为M-L-R(或者B-L-R)。例如，一级氨基可以和包括酰肼基的部分反应。在这种情况下，R部分对在氨基末端含有苏氨酸或者丝氨酸的肽将是选择性的。或者，一级氨基可以和含有马来酰亚胺基的部分反应。在这种情况下，R部分将选择性和含有半胱氨酸的肽反应。其它合适和含半胱氨酸肽反应的亲电R基团包括：环氧基，α-卤代酰基，腈基，磺化烷硫醇基，和磺化芳基硫醇基。R部分也可包括用于和氨基(例如赖氨酸)反应的琥珀酰亚胺基团。
M-L-R或者B-L-R部分可被用于和(1)肽，包括那些来自酶切蛋白后产生的肽；(2)天然蛋白；(3)变性蛋白；(4)天然膜嵌入式蛋白。
在天然蛋白(以及足够大到呈现二级结构的特定肽)的情况下，仅仅那些存在于(即，立体结构合适的)分子外部的特异性氨基酸能够和M-L-R或者B-L-R部分反应。因此，附着使得能够特异性靶击蛋白“呈现”的部分。在变形蛋白的情况下，蛋白的所有部分都可能接近。蛋白随后可被降解为肽组分。M-L-R部分可用于俘获以天然或者变性形式存在的蛋白。蛋白可被化学降解或者酶解。M-L-R部分(带有附着肽)可被清洗以去除未结合肽(和其它不需要的组分)。随后，修饰肽释放出来。在一些情况下，可以希望进行多次清洗步骤。例如，标记肽或者标记多肽可以在俘获前或俘获后或者二者情况下进行清洗。
在酶解或者化学降解前标记多肽或者蛋白的情况下，若干途径都是可能的。例如，在样品中存在的部分多肽可以通过如下方法俘获和分析：(a)提供具有下式的标记部分：R-L-M，其中，R为和包括选择性氨基酸的多肽反应的反应基，L为连接基团，以及M为可被磁力吸引的磁性粒子；(b)将样品和标记部分反应以提供标记多肽；(c)通过施加磁力吸引M以分离标记多肽从而提供分离的标记多肽；(d)酶解或者化学降解分离的标记多肽以提供分离的标记多肽片段；(e)从M基团释放分离的标记多肽片段的至少部分多肽片段以提供释放的修饰多肽片段；以及(f)通过质谱分析释放的修饰多肽。用这种方法，降解步骤发生在标记多肽已被分离以后。步骤的顺序可以改变，使得降解发生在分离标记多肽之前。在这个途径中，该方法包括：(a)提供具有下式的标记部分：R-L-M，其中，R为和包括选择性氨基酸的多肽反应的反应基，L为连接基团，M为可被磁力吸引的磁性粒子；(b)将样品和标记部分反应以提供标记多肽；(c)降解标记多肽以提供标记多肽片段；(d)通过施加磁力吸引M分离标记多肽片段以提供分离的标记多肽片段；(e)从M基团释放分离的标记多肽片段的至少部分多肽片段以提供释放的修饰多肽片段；以及(f)通过质谱分析释放的修饰多肽。
也可利用R-L-B标记部分标记完整蛋白或者多肽。因此，本发明包括的方法含有：(a)提供具有下式的标记部分：R-L-B，其中，R为和包括选择性氨基酸的多肽反应的反应基，L为连接基团，以及B为可以选择性结合到俘获试剂的基团；(b)将样品和标记部分反应以提供标记多肽；(c)将标记多肽片段和俘获试剂接触以提供俘获的标记多肽(d)降解俘获的标记多肽以提供俘获的标记多肽片段；(e)从B基团释放俘获的标记多肽片段的至少部分多肽以提供释放的修饰多肽片段；以及(f)通过质谱分析释放的修饰多肽片段。本发明还包括的方法含有：(a)提供具有下式的标记部分：R-L-B，其中，R为和包括选择性氨基酸的多肽反应的反应基，L为连接基团，以及B为可以选择性结合到俘获试剂的基团；(b)将样品和标记部分反应以提供标记多肽；(c)降解俘获的标记多肽以提供俘获的标记多肽片段；(d)将标记多肽片段和俘获试剂接触以提供俘获的标记多肽片段；(e)从B基团释放俘获的标记多肽片段的至少部分多肽片段以提供释放的修饰多肽片段；以及(f)通过质谱分析释放的修饰多肽片段。
当利用一种本发明的标记部分标记多肽或者蛋白时，应该理解所述多肽或者蛋白不必要是完整的天然存在的多肽或者蛋白(虽然其可能是)。有时，天然存在或者多肽可以在标记之前进行预处理减小其大小。
在另一具体提及膜嵌入式和/或不溶性蛋白的实施方案中，含有结构基团M，L，Sol和R的标记部分可用于简化蛋白和肽混合物以进行质谱分析。在这个标记部分，M为磁性粒子，L为连接基团，Sol为不透膜的可溶性基团，以及R为化学反应基可以选择性地结合于特异性氨基酸或者修饰氨基酸，诸如上述的那些。增溶剂基团可以为聚合物物种，诸如聚乙二醇(PEG)或者甲氧基化的聚乙二醇(MPEG)，其可以提高连接到R基团的蛋白的溶解性。当蛋白一旦从膜中移走，其本身在水溶液中不充分溶解的情况，这种途径尤其有用。这些组分可以采用的各种组合包括：
M-L-Sol-R，
M-SOL-L-R，
M-L-Sol-L-R，
M-L-R-Sol，
M-L-R-L-Sol，以及
Figure A0281020200181
在M，Sol或者R基团之间可以提供一个或者多个化学切割位点(例如，如上所述)，但是在最优选实施方案中，L基团在接近磁性粒子处包括一个切割位点，切割后产生用于连接到R，L和Sol的蛋白的肽。切割位点可以包括二硫化物或者可酶解寡肽。因此，切割后，Sol基团提高了连接蛋白的水溶解性。溶解性的提高对于在质谱分析以前蛋白必须经受的利用诸如电喷雾的流体电离技术的过程很有益处。第二个切割位点可用于释放Sol基团，离开连接到所有或者部分R以及所有或者部分L或者不含L的肽或蛋白。
任选地，一个或者多个L，R和Sol可进行同位素标记。
如上所述，B基团可代替M基团使用。因此，生物素或者其它一些亲和性碱基可以代替磁性粒子使用。在这些情况下，可以利用，例如，链亲和素-包被的磁性粒子俘获标记肽。在这种情况下，由R，L，Sol和B组成的增溶剂可以起到阻止氨基酸特异性试剂(R)跨过脂膜的转移的作用。因此，该试剂可以有效用于选择给脂膜外侧呈现外貌的特异性膜内蛋白，此外，在蛋白酶解和LCMS分析上游的其它样品制备步骤过程中对这些蛋白进行增溶。
也应用由R，L和Sol组成的通用溶解试剂一般用于溶解膜结合蛋白。并不经常需要固相俘获。例如，多种液相色谱装置可被用于分离膜来源的组分。
本发明的特征还在于含有具如下化学式标记部分的试剂盒：
R-L-B
R-L-M
R，L，Sol和M
R，L，Sol和B，以及
R，L和Sol
其中R包括一种以上四种详述的反应基(RS/T，RC，RL或RP)，L如上所述为连接基团，B如上所述为能够选择性结合俘获试剂的基团；并且任选一种蛋白水解酶。在多个实施方案中，L或者R被同位素标记(表示为L*或者R*)，RS含有式-CO-NH-NH2的结构，以及整个标记部分为生物素酰肼。
在其它实施方案中，试剂盒进一步包括：俘获试剂，俘获试剂含有结合到诸如乳胶粒子或者磁性粒子的固相支持物的亲和素和链亲和素；D-生物素，氧化剂(例如，偏高碘酸钠)和能够猝灭氧化试的试剂，以及特异性配比用于优化涉及的反应和分离的缓冲液。
在其它实施方案中，质谱的分析包括确定至少一个释放的修饰肽和/或至少一个释放修饰肽的至少部分氨基酸序列的分子量，肽在和标记部分反应之前进行化学处理。
本发明的方法是有用的，部分因为复合肽混合物的分析非常困难并且耗时。由酶解或者其他方法从全细胞提取物，细胞器，蛋白复合物或者组织样品产生的肽混合物可以包括异常多的肽。例如，全哺乳动物细胞裂解物的胰蛋白酶酶解产物可以含有1,000,000或者更多的肽。分析这样混合物中每种肽的含量，虽然大大低于每种肽的身份识别，但依然是一个繁重的任务。尝试鉴定肽所来源的蛋白进一步提高了分析的复杂程度。但是，本领域技术人员可以理解，在混合物中存在的给定蛋白可以基于一种或者少数几种由蛋白质降解所产生的肽而加以鉴定和定量分析。通过结合特异于该蛋白的抗体来鉴定蛋白的存在是生物学上普遍接受的应用，即使抗体仅仅识别和结合所有蛋白结构的很少部分。换言之，可以通过检测较所有来自蛋白降解产生的肽少的样品就可以鉴定一种蛋白。因此，通过分离混合物中存在的肽亚群以控制和可预测的方式降低肽混合物复杂性的方法可以大大利于产生肽混合物的蛋白的鉴定和/或定量分析。
分析之所以被促进是因为用于数据库搜索鉴定混合物中存在肽(和肽来源的蛋白)所需要的时间和存储大大减少。由本发明方法获得的速度，简化性以及分析可靠性的提高可得以实现，最多只损失少量信息。信息的损失可能发生，例如，因为在一些情况下，一些少量蛋白部分不能产生可被指定R基团标记的肽。因此，在一些条件下，少量蛋白不能被检测到。但是通过进行其它分析困难可被大大克服。例如，连接不同R基团的标记部分可用于其它分析。在利用RS/T标记部分的情况下，原始混合蛋白样品中的蛋白可以交替方式进行降解，即从在第一种降解条件下不产生这些肽的蛋白中产生氨基末端丝氨酸肽和/或氨基末端苏氨酸肽。这就强调了本发明所述方法的一个重点，也就是其依赖于蛋白中存在的序列信息，意味着用不同特异性的酶切割蛋白将产生一组可以接近正交于原始组的肽。来自二次分析的结果可以和初次分析的结果结合从而建立原始样品中存在蛋白的完全分析。
本发明的其它特征和优点将在下列的详细描述和权利要求中一目了然。
附图简述
图1显示了由胰蛋白酶降解线虫(C.Elegans)所有蛋白质组的生物信息模型产生的肽/蛋白的分布。
图2显示了由胰蛋白酶降解线虫所有蛋白质组的生物信息模型产生，随后选择含半胱氨酸肽的含半胱氨酸肽/蛋白的分布。
图3显示了由胰蛋白酶降解线虫所有蛋白质组的生物信息模型产生，随后选择氨基端丝氨酸和氨基端苏氨酸肽的氨基端丝氨酸和氨基端苏氨酸肽/蛋白的分布。
图4显示了生物素酰肼的结构。
图5A-5C显示了各种M-L-R标记部分。
图6显示了一个B-L-Sol-L-R标记部分。
本发明的详细描述
利用本发明的方法，复合肽混合物可以通过分离肽进行简化，所述肽包括特定氨基酸(例如，具有氨基端丝氨酸的肽(“氨基端丝氨酸肽”)或者氨基端苏氨酸的肽(“氨基端苏氨酸肽”))。通过将肽和标记部分反应分离所述肽，所述标记部分和目的肽反应并且通过俘获试剂的俘获将它们标记。标记部分包括反应基(R)，连接基团(L)，和能够选择性结合到俘获试剂的基团(B)，或者代替B，对磁力有反应的磁性基团(M)。标记肽的俘获和分离方法是将它们与俘获试剂(例如，结合到固体支持物上的俘获试剂)接触，其中标记部分包括B基团，或者用施加的磁力吸引标记肽，其中标记部分包括M基团。依赖于使用的R基团的类型，含有半胱氨酸的肽，含有赖氨酸的肽或者具有氨基端丝氨酸或者氨基端苏氨酸的肽可以自混合物中存在的其它组分(例如，其它肽)分离。分离后，俘获肽从俘获试剂释放并通过质谱进行分析。肽可通过选择性切割标记部分中的连接基团或者破裂俘获试剂和选择性结合到俘获试剂的基团之间的相互作用而得以释放。在很多情况下，释放肽为修饰肽，因为它们可能包括来自标记部分的组分，例如所有或者部分连接基团(L)和/或所有或者部分反应基(R)。在一些情况下也可以以基本上未修饰的形式释放肽。
俘获试剂可以为亲和素或者链亲和素或者修饰的亲和素或者链亲和素，标记部分可以包括生物素或者修饰的生物素。或者，俘获试剂可以为生物素或者修饰的生物素，而且标记部分可以包括亲和素或者链亲和素或者修饰亲和素或者链亲和素。为了有助于将标记肽和其它组分分离，俘获试剂可以结合于，优选共价结合于诸如玻璃珠，微量滴定板的微孔，磁性粒子等固相支持物上。因此，标记肽可以利用亲和素或者链亲和素包被的磁性粒子进行俘获。
肽，例如氨基端丝氨酸和氨基端苏氨酸肽可以通过切割蛋白或者蛋白混合物产生。切割可用酶解。例如，可以通过标准技术利用胰蛋白酶降解蛋白或者蛋白混合物产生。
用于质谱分析的氨基端丝氨酸和氨基端苏氨酸肽的制备如下。含有蛋白混合物的样品置于变性条件下。变性蛋白用胰蛋白酶降解。存在于氨基端丝氨酸肽和氨基端苏氨酸肽的β-氨基醇部分通过向溶解于pH7磷酸缓冲液的肽混合物加入偏高碘酸钠进行选择性氧化以制成40mM的高碘酸盐溶液。在室温黑暗条件下保温5分钟，通过加入乙二醇将多余的氧化剂猝灭。修饰肽通过直接向反应混合物加入生物素酰肼并保温30分钟进行生物素酰化。然后选择性生物素酰化的肽被俘获到单体链亲和素包被的颗粒上。在冲走非修饰肽并用HPLC起始缓冲液清洗以后，通过用游离D-生物素置换从颗粒中洗脱肽。或者，含有可切割连接基团的特定生物素-酰肼可用于生物素酰化步骤，可加入选择性切割试剂以从颗粒释放结合肽。可以掺入接头的可切割基团的例子包括二硫基(用TCEP切割)，或者邻位二醇基(用偏高碘酸钠切割)。一旦分离肽从颗粒中释放，通过将样品注射到液相色谱-质谱仪(LC/MS)可以直接进行分析。
前面描述的获得简化肽混合物的方法已经利用半胱氨酸(cys)的活性巯基分离含有半胱氨酸肽。通过分离含有氨基端丝氨酸或者氨基端苏氨酸的肽，本发明的方法可以更简化，很少或者没有蛋白损失数量的增加。通常，简化性的提高以及部分序列信息的知识使得人们能够进行更限制性的数据库搜索，并用更快的搜索产生更小的数据库，不需要加强使用处理容量和存储。另外，利用本发明的方法，每种分析肽的一部分是已知的(例如，已知存在氨基端丝氨酸或者苏氨酸或者已知存在半胱氨酸或者已知存在赖氨酸)。这就限制了数据库搜索，并有助于MS/MS裂解图谱(fragmentation pattern)的解释。此外，在氨基端修饰的肽的分析可以较内部修饰肽的分析容易。本发明的方法降低了峰停驻(peak parking)的必要性，因此引起样品通量的增加，因为共洗脱峰的发生频率减少。
本发明方法获得的简化可以通过检查复合产自基因组的蛋白质组进行描述。图1-3显示了胰蛋白酶降解全线虫蛋白质组的生物信息分析结果。图1显示了由胰蛋白酶降解所有蛋白质组产生的肽/蛋白的分布。图2显示了由胰蛋白酶降解所有蛋白质组产生的含半胱氨酸肽/蛋白的分布。图3显示了由胰蛋白酶降解所有蛋白质组产生的氨基端丝氨酸和氨基端苏氨酸肽/蛋白的分布。这些计算结果提示通过选择氨基端丝氨酸和氨基端苏氨酸肽比选择含半胱氨酸肽可以获得更大程度的简化。这些计算显示用每种方法大约5％的蛋白质组是不可检测的(具有0个肽/蛋白的蛋白部分)。这些计算已经去除了作为酶切结果含3个或者更少氨基酸的肽。
图4显示了生物素酰肼的结构。这个化合物是B-L-RS/T标记部分的一个例子。其包括一个含有生物素2的B基团和L基团4，以及含有酰肼基团6的RS/T基团。
图5A-5C显示了M，L和R的示例组合(即，M-L-R标记部分)。图5A显示适合俘获具有氨基端丝氨酸或者苏氨酸的肽的标记部分。标记部分包括磁性粒子8，和含有一个二硫键切割位点12的L基团10，以及含有酰肼基团14的反应基。图5B显示了适合俘获具有半胱氨酸肽的标记部分。标记部分包括磁性粒子16，和含有一个二硫键切割位点20的L基团18，以及含有马来酰亚胺基团22的反应部分。图5C显示了适合俘获具赖氨酸肽的标记部分。标记部分包括磁性粒子24，和含有一个二硫键切割位点28的L基团26，以及包含琥珀酰亚胺基团30的反应部分。
标记部分可被同位素标记，例如通过用稳定的同位素原子取代连接基团或者反应部分中的一个或者多个原子，例如一个或者多个氢原子可被氘取代，或者一个或者多个12C可被13C取代，或14N可被15N取代，或者将它们组合。当使用同位素标记的标记部分时，释放的修饰肽可进行同位素标记。当两种肽样品和差示同位素标记，但是化学上相同的标记部分反应时，有助于两个样品中肽相对含量的定量。这是因为两种肽样品的混合物，一种用“轻”形的标记修饰，另一种用“重”形的标记修饰，含有两种化学上实体相同的轻形和重形。因此，这种方法已被用于定量分析含有半胱氨酸的肽(Gygi等人，(1999)Nature Biotech.17：994；和PCT申请WO 00/11208)，而类似方法可被用于定量分析氨基端丝氨酸肽和氨基端苏氨酸肽和含赖氨酸肽。
两种不同肽样品，例如一种来自与选择化合物接触的细胞的样品，另一种来自与选择化合物未接触的细胞的样品，可以利用本发明的标记部分进行差示同位素标记。来自两种样品的分离的修饰差示同位素标记肽可以混合在一起通过质谱进行分析。
图6描述了一个B-LA-Sol-LB-R标记部分的例子。这个标记部分的R基团为生物素32，LB基团34为至少13长的链。包括甲氧基聚乙二醇(MPEG)的Sol基团36通过酰胺键38在一端连接到LB基团，而通过酰胺键40在另一端连接到标记部分的剩余部分。MPEG的分子量可以为5,000道而顿或者高于5,000道而顿，并可以包括一个或者多个与L基团和R基团反应的亲核和亲电基团。Sol基团36通过第二个连接区LA44连接到R基团42上，所述LA44包括一个可容易切割的二硫键46。R基团42为琥珀酰亚胺基团，能够选择性和氨基反应(例如，含有赖氨酸的肽)。
实施例
根据标准方法用胰蛋白酶(Promega，Inc)分别降解牛血清白蛋白(BSA；Sigma化学公司)和马肌红蛋白(Sigma化学公司)。降解产生的肽混合物用NaIO4处理。随后通过加入乙二醇将多余的氧化剂猝灭。通过将肽混合物和生物素酰肼(Pierce化学公司；图4)温育30分钟对修饰肽进行选择性生物素酰化。利用MPG链亲和素包被的磁性粒子(CPG公司)俘获生物素酰化肽。利用KingFisher自动磁性粒子加工机(Lab Systems公司)对样品进行加工。
利用Surveyor HPLC(ThermoFinnigan公司)分析样品，设定成毫微级的流动操作，连接到毫微喷射源装置的LCQDeca质谱仪(ThermoFinnigan公司)。利用PicoFrit填充柱(Packed tip)(NewObjective)(75um内径，10cm长)进行反相HPLC，标准反相梯度的流速为100nL/分钟。
基于BSA的序列，胰蛋白酶降解可以产生六种苏氨酸/丝氨酸氨基端肽。基于马肌红蛋白的序列，胰蛋白酶降解应产生一种苏氨酸/丝氨酸氨基端肽。BSA的六种预计的肽和肌红蛋白的一种预计的肽是在俘获部分观察到的唯一肽。
所有本申请中引用的参考文献，专利和公开专利申请的内容此处全部引作参考。
其它实施方案
可以联合使用两种或者多种具有不同R基团的标记部分。能够选择性和含有半胱氨酸的肽反应的标记部分可用于从目的样品的一个部分中分离含半胱氨酸肽。能够选择性和氨基端丝氨酸和氨基端苏氨酸肽反应的标记部分可用于从目的样品的第二个部分中分离氨基端丝氨酸和氨基端苏氨酸肽。利用两种类型的标记部分分离的修饰肽可以组合在一起并通过质谱进行分析，或者可以单独分析，并将结果合并。如果可以利用相同俘获试剂俘获标记部分，标记肽(含半胱氨酸，氨基端丝氨酸，和氨基端苏氨酸肽混合物)可以在单独反应中用俘获试剂进行俘获。释放的修饰肽混合物可通过质谱进行分析。差示同位素标记的标记部分可用于差示标记在两种或者多种不同样品中的肽。释放肽可通过除了质谱以外的方法进行分析。因此，本发明的多种标记部分和方法可用于分离和纯化用于任何目的的肽或者简化复合混合物。
等同物
只利用常规试验，本领域技术人员会认识到或者能够确定很多本发明所述的特定实施方案的等同物。这些等同物包括在下列权利要求中。

Claims (48)

1.一种鉴定样品中存在的至少一种肽的方法，所述方法包括：
(a)提供具有下式的标记部分：
R-L-B
其中，R为和带有氨基端丝氨酸或氨基端苏氨酸的肽反应的反应基，L为一个连接基团；以及B为可以选择性结合到俘获试剂的基团；
(b)将样品和标记部分反应以提供标记肽；
(c)将标记肽和俘获试剂接触以提供俘获的标记肽；
(d)从俘获试剂释放俘获的标记肽的至少部分肽以提供释放的修饰肽；以及
(e)通过质谱分析释放的修饰肽。
2.权利要求1的方法，其中R包括-CO-NH-NH2。
3.权利要求1的方法，其中B包括生物素。
4.权利要求1的方法，其中B包括d-亚氨基生物素。
5.权利要求3的方法，其中俘获试剂包括亲和素或者链亲和素。
6.权利要求3的方法，其中释放步骤包括将俘获的标记多肽与生物素接触。
7.权利要求3的方法，其中俘获试剂包括针对生物素的选择性抗体。
8.权利要求1的方法，其中标记部分为生物素酰肼。
9.权利要求1的方法，其中在样品接触标记部分之前，将样品与氧化剂接触。
10.权利要求1的方法，其中L包括一个二硫基。
11.权利要求1的方法，其中L包括一个邻位二醇基。
12.权利要求1的方法，其中L为同位素标记。
13.权利要求1的方法，其中释放的修饰肽在质谱分析之前通过色谱分离。
14.权利要求1的方法，其中R为同位素标记。
15.权利要求1的方法，其中质谱分析包括鉴定至少一种肽。
16.权利要求1的方法，其中质谱分析包括对至少一种肽进行定量。
17.一种试剂盒，包括：
一种具有下式的标记部分：
R-L-B
其中R为和带有氨基端丝氨酸或氨基端苏氨酸的肽反应的反应基，L为一个连接基团；以及B为可以选择性结合俘获试剂的基团。
18.权利要求17的试剂盒，进一步包括一种蛋白水解酶。
19.权利要求17的试剂盒，进一步包括一种俘获试剂。
20.权利要求17的试剂盒，其中R包括-CO-NH-NH2。
21.权利要求17的试剂盒，其中标记部分为生物素酰肼。
22.权利要求21的试剂盒，进一步包括含有结合到固相支持物上的亲和素或者链亲和素的俘获试剂；和D-生物素。
23.权利要求22的试剂盒，进一步包括一种氧化剂。
24.权利要求23的试剂盒，其中氧化试剂为偏高碘酸钠，以及试剂盒进一步包括能够猝灭氧化剂的试剂。
25.权利要求17的试剂盒，其中L或者R为同位素标记。
26.一种鉴定样品中存在的至少一种肽的方法，所述方法包括：
(a)提供具有下式的标记部分：
R-L-M
其中，R为和包含选择性氨基酸的肽反应的反应基，L为连接基团，以及M为可被磁力吸引的磁性粒子；
(b)将样品和标记部分反应以提供标记肽；
(c)通过施加磁力吸引M以分离标记肽；
(d)从M基团释放俘获的标记肽的至少部分肽以提供释放的修饰肽；以及
(e)通过质谱分析释放的修饰肽。
27.权利要求26的方法，其中L为同位素标记。
28.一种试剂盒，包括：
一种具有下式的标记部分：
R-L-M
其中，R为和包含选择性氨基酸的肽反应的反应基，L为连接基团，以及M为可被磁力吸引的磁性粒子。
29.权利要求28的试剂盒，其中R包括：
(a)一种氨基反应部分，
(b)-CO-NH-NH2，
(c)一种巯基反应部分，或者
30.权利要求28的试剂盒，其中L为同位素标记。
31.权利要求28的试剂盒，其中R为同位素标记。
32.一种鉴定样品中存在的至少一种肽的方法，所述方法包括：
(a)提供具有如下组分的标记部分：
R，L，Sol和M
其中，R为和包含选择性氨基酸的肽反应的反应基，L为连接基团，Sol为亲水聚合物，以及M为可被磁力吸引的磁性粒子；
(b)将样品和标记部分反应以提供标记肽；
(c)将标记肽和可通过磁力结合到磁性粒子上的俘获表面接触以提供俘获的标记肽；
(d)从俘获表面释放俘获的标记肽的至少部分肽以提供释放的修饰肽；以及
(e)通过质谱分析释放的修饰肽。
33.一种含有部分的试剂盒，包括：
一种具有式R-L-Sol-M、R-L-Sol-L-M或者R-Sol-L-M的标记部分，其中R为和包含选择性氨基酸的肽反应的反应基，L为连接基团，Sol为亲水聚合物，以及M为可被磁力吸引的磁性粒子；
34.权利要求33的试剂盒，其中R包括：
(a)一种氨基反应部分，
(b)一种巯基反应部分，
(c)-CO-NH-NH2，或者
(d)一种酶底物或者诸如ATP，GTP，NAD，NADP，NADH，NADPH，泛素或者其结构类似物的其它非共价分子识别元件。
35.权利要求33的试剂盒，其中R或者L为同位素标记。
36.一种鉴定样品中存在的至少一种肽的方法，所述方法包括：
(a)提供具有如下组分的标记部分：
R，L，Sol和B
其中，R为和包含选择性氨基酸的肽反应的反应基，L为连接基团，Sol为亲水聚合物，以及B为可以选择性结合俘获试剂的基团；
(b)将样品和标记部分反应以提供标记肽；
(c)将标记肽和可通过磁力结合到磁性粒子上的俘获表面接触以提供俘获的标记肽；
(d)从俘获表面释放俘获的标记肽的至少部分肽以提供释放的修饰肽；以及
(e)通过质谱分析释放的修饰肽以鉴定样品中存在的至少一种肽。
37.一种含有部分的试剂盒，包括：
一种具有式R-L-Sol-B或者R-Sol-L-B的标记部分，
其中，R为和包含选择性氨基酸的肽反应的反应基，L为连接基团，Sol为亲水聚合物，以及B为可以选择性结合到俘获试剂的基团。
38.权利要求37的试剂盒，其中R包括：
(a)一种氨基反应部分，
(b)一种巯基反应部分，
(c)-CO-NH-NH2，或者
(d)一种酶底物或者诸如ATP，GTP，NAD，NADP，NADH，NADPH，泛素或者其结构类似物的其它非共价分子识别元件。
39.权利要求37的试剂盒，其中R或者L为同位素标记。
40.一种含有部分的试剂盒，包括：
一种具有式R-L-Sol的标记部分，
其中，R为和包含选择性氨基酸的肽反应的反应基，L为连接基团，以及Sol为亲水聚合物。
41.权利要求40的试剂盒，其中R包括：
(a)一种氨基反应部分，
(b)一种巯基反应部分，
(c)-CO-NH-NH2，或者
(d)一种酶底物或者诸如ATP，GTP，NAD，NADP，NADH，NADPH，泛素或者其结构类似物的其它非共价分子识别元件。
42.权利要求37的试剂盒，其中R或者L为同位素标记。
43.一种用于分析样品中存在的部分多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供具有下式的标记部分：
R-L-M
其中，R为和包含选择性氨基酸的多肽反应的反应基，L为连接基团，以及M为可被磁力吸引的磁性粒子；
(b)将样品和标记部分反应以提供标记多肽；
(c)通过施加磁力吸引M以分离标记多肽从而提供分离的标记多肽；
(d)酶解分离的标记多肽以提供分离的标记多肽片段；
(e)从M基团释放分离的标记多肽片段的至少部分多肽片段以提供释放的修饰多肽片段；以及
(f)通过质谱分析释放的修饰多肽片段。
44.一种分析样品中存在部分多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供具有下式的标记部分：
R-L-M，
其中，R为和包含选择性氨基酸的多肽反应的反应基，L为连接基团，以及M为可被磁力吸引的磁性粒子；
(b)将样品和标记部分反应以提供标记多肽；
(c)降解标记多肽以提供标记多肽片段；
(d)通过施加磁力吸引M以分离标记多肽片段从而提供分离的标记多肽片段；
(e)从M基团释放分离的标记多肽片段的至少部分多肽片段以提供释放的修饰多肽片段；以及
(f)通过质谱分析释放的修饰多肽片段。
45.一种分析样品中存在的部分多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供具有下式的标记部分：
R-L-B
其中，R为和包含选择性氨基酸的多肽反应的反应基，L为连接基团，以及B为可以选择性结合到俘获试剂的基团；
(b)将样品和标记部分反应以提供标记多肽；
(c)将标记多肽片段和俘获试剂接触以提供俘获的标记多肽；
(d)降解俘获的标记多肽以提供俘获的标记多肽片段；
(e)从B基团释放俘获的标记多肽片段的至少部分多肽以提供释放的修饰多肽片段；以及
(f)通过质谱分析释放的修饰多肽片段。
46.一种分析样品中存在的部分多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供具有下式的标记部分：
R-L-B，
其中，R为和包含选择性氨基酸的多肽反应的反应基，L为连接基团，以及B为可以选择性结合到俘获试剂的基团；
(b)将样品和标记部分反应以提供标记多肽；
(c)降解标记多肽以提供标记多肽片段；
(d)将标记多肽片段和俘获试剂接触以提供俘获的标记多肽片段；
(e)从B基团释放俘获的标记多肽片段的至少部分多肽片段以提供释放的修饰多肽片段；以及
(f)通过质谱分析释放的修饰多肽片段。
47.权利要求43-46任一项的方法，其中L为同位素标记。
48.权利要求43-46任一项的方法，其中R为同位素标记。
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