CN1506374A - 用于蛋白质分离的步进式切换多柱式连续逆流液－固层析设备 - Google Patents

Abstract

一种多柱式连续逆流液固层析设备，它包括装有多个层析柱和上下两个盘的动组件、具有与动组件上下盘外侧紧密接触的两个盘的静组件以及步进式切换控制装置。各个层析柱用与静组件中孔道外端连通的软管串联成吸附段、洗涤段、洗脱段和再生平衡段等的层析系统。静组件小孔距离轴心的分布半径与动组件盘面上各小孔的分布半径相同，静组件上下盘中的孔道数与动组件上下盘中的孔道数相同，且位置一一对应。本发明的设备可用于连续逆流层析分离和纯化蛋白质，与固定床层析技术相比，可以明显减少吸附载体的用量和流动相用量，提高分离后的产品浓度；连续操作也有利于分离操作的稳定性，提高产品质量和单位时间内处理能力。

Description

用于蛋白质分离的步进式切换多柱式连续逆流液-固层析设备

技术领域

本发明提出了一种步进式切换多柱式连续逆流液-固层析设备，特别是用于蛋白质层析分离的步进式切换多柱式连续逆流液-固层析设备。

背景技术

柱层析技术具有很高的分离效率，是蛋白质产品分离纯化的主流分离技术。通常采用固定床间歇操作方式，操作简单，便于实施，成功应用于为数众多的分离过程。然而由于间歇操作方式需要先后进行上柱、展开和洗脱操作，操作周期长，每个时刻床层内只有一小部分固定相在工作，所以间歇操作存在着载体利用率低和过程效率低的问题，影响了过程的经济性。

间歇操作的缺点推动了连续吸附技术的发展。随着吸附分离技术研究的深入，相继开发了多种用于实现连续吸附操作的设备形式，包括：移动床、模拟移动床、旋转木马吸附系统等。

(1)模拟移动床技术，将吸附柱分成多段，通过各股液流进出位置阀门的切换，来实现流动相和固定相之间的模拟逆流操作，以提高吸附操作的过程效率和分离效果。对于模拟移动床吸附层析，一般需要有一个整体的流动相循环，多采用三段操作或四段操作的封闭系统。对于如蛋白质分离这样的层析工艺，需要较多的进料、出料安排，包括目标产物的吸附、洗涤、洗脱，洗脱后的载体，还需要进行平衡处理，才能返回吸附重新使用；洗脱段和再生段的流动相不可避免地要与吸附段流动相发生一定程度的混合，具有较高离子强度的洗脱液和再生液与吸附段的流动相部分混合，会改变吸附段载体对蛋白质的吸附和分离性能，从而使得整个层析分离流程的操作效果偏离原先设计要求。而且蛋白质层析过程中物料的进、出口较多，应用模拟移动床来进行操作，在流程安排上很不方便。

(2)移动床操作，流动相和固定相之间逆流运动，但由于载体在运动过程磨损破碎很快，不适用于蛋白质等生物产品的层析分离过程。

(3)1997年10月14日授予的美国专利5,676,826公开了一种“旋转木马”连续吸附设备，其“旋转木马”结构由旋转盘及上、下两端分配器组成。通过机械装置的连续旋转来实现吸附柱连续切换，柱内一直有流动相通过，但旋转而上各切换口与固定盘面切换口的数目不同，切换过程中有时会出现两只孔道的液流同时流入一只层析柱，经过层析后，再分别流入两只不同的出口，造成了柱间混合和分离效率的降低。

蛋白质层析分离所用载体多为凝胶，凝胶载体是软载体，容易被压缩变形造成较大的床层压力降；因此需要采用适当的操作方式，来实现固定相和流动相的逆流流动。

发明内容

本发明在综合考虑了蛋白质层析分离的特点，以及现有的连续逆流吸附设备中存在局限的基础上，提出了一种采用步进式转盘液流切换方式的新型多柱式连续逆流液-固层析设备，它包括：

动组件，所述动组件的中央部分固定装有环形支架，支架的内圈固定在转轴上，外圈上均匀分布了多个用于安装固定多根层析柱的固定装置，支架的上、下两侧各有一个盘，也固定在转轴上，该盘上开有多个与转轴呈同心圆形均匀分布的小孔道，孔道数目与层析柱数目相同，每个孔道的一端可与静组件盘上各个对应的小孔相通，另一端与各只层析柱相通，

静组件，它包括与动组件上、下盘外侧紧密接触的两个盘，盘中有多个与转轴呈同心圆形均匀分布的小孔，孔道的内端分别与动组件盘上各孔道的外端相通，各个外端通过软管相互串联，将与孔道一一对应的各只层析柱分别组合成吸附段、洗涤段、洗脱段、再生段和平衡段，构成一个多柱层析系统，

切换控制装置，由推动动组件转动的驱动电机、控制驱动电机和液流输送泵电源通断的时间控制器、定位装置组成；正常层析操作时，通过时间控制器切断驱动电机电源，接通液流输送泵电源；开始切换时，通过时间控制器的动作，接通驱动电机电源，切断液流输送泵电源，切换到位时，立即使驱动电机停转，恢复正常层析操作，

静组件小孔距离轴心的分布半径与动组件盘面上各小孔的分布半径相同，静组件上下盘中的孔道数与动组件上下盘中的孔道数相同，且每次切换到位之后，位置一一对应。切换过程中，静组件和液流进出口位置不变，而动组件和层析柱转过一定的角度，相当于发生了流动相和层析载体之间的逆流相对运动。

本发明设备中，为了实现多只层析柱间液流的连通和组合，可以采用液流流向控制面板；液流流向控制面板上有数目为静组件上或下盘中孔道数目的2倍的小孔道，每个孔道贯穿控制面板，在该控制面板的正、反两面均有一个开口，一端开口分别与上、下静组件盘上的各个小孔的外端相连接，作为液流进出各层析柱上下端的通道；另一端开口则用软管相互连接，把静组件各个外端串接起来，从而使得对应的各只层析柱柱依次首尾相连，分别组合成吸附段、洗涤段、洗脱段和再生平衡段，或者连接到进、出层析系统的液流管路上，作为液流进入、或离开多柱层析系统的关口。

本发明设备中，为了可靠地实现层析柱切换后准确的定位，可采用步进式切换控制装置。通过控制装置实现动组件中层析柱的切换，造成流动相和固定相之间的逆流运动。而且，绝大部分时间内，本发明设备的转子部分(包括安装在其上的各层析柱)是静止的，流体流过层析柱，进行正常状态的层析分离；经过某一确定时间(由固定相运动速度决定)后，流体停流，转子迅速转动到下一位置，再恢复上述操作，不像传统的旋转木马设备为连续转动，减少了柱间返混，有利于得到更高的分离效率；这是本设备与传统旋转木马设备之间的重要区别。

本发明设备提供了一种开放的层析系统，可以通入多股洗涤、洗脱和再生液流；通过在液流控制面板上，把对应于各层析柱的进、出口通道的各个孔道按不同组合方式连接起来，既可以实现闭环层析流程，又可以实现开环的层析流程；总的层析柱数目、层析各段过程中的不同工作段(吸附、洗脱、再生等)包括的层析柱数目、各种进出液流的相对位置等条件，都可以改变。采用本发明设备，可以明显减少吸附载体的用量和流动相用量，提高分离后的产品浓度；连续操作也有利于分离操作的稳定性，提高产品质量和单位时间内处理能力。

附图说明

图1是本发明连续逆流液固层析设备主体结构的示意图。

图2是基因工程人血清白蛋白和杂质的连续逆流液固层析流程的示意图。

图3是人血清白蛋白和卵清蛋白混合的连续逆流液固层析流程的示意图。

图4是本发明连续逆流液固层析设备进行切换时定位控制的原理示意图。

具体实施方式

如图1所述，本发明所提出的步进切换多柱式连续逆流液固层析设备100包括动组件101A，101B、静组件102A，102B、转轴103、液流流向控制面板104和步进式切换控制部分。

动组件101A，101B的主要部分固定在一根转轴103上。转轴上、下两末端分别以轴承固定，一端与驱动电机相连；当驱动电机处于通电状态时，在电机驱动下，可以实现动组件的旋转切换。

动组件101A，101B之间的中央部分固定装有环形支架，支架的内圈固定在转轴103上，外圈上均匀分布了多只用于安装固定多根层析柱105的固定装置，优选是凹槽。固定装置的数目一般为4-50，优选为4-32，更好为4-16，然而只要支架上有足够的位置，可以固定更多的层析柱。

层析柱在支架上的分布外形可以是任何形状，如正方形、长方形、棱形、平行四边形、圆形、椭圆形等，但优选是圆形。

支架的上、下两侧分别是一只盘，盘上开有多个与转轴呈同心圆形均匀分布的小孔道，孔道的数目与层析柱的数目相同，孔道的一端与静组件盘上各个对应的小孔相通，另一端与各只层析柱相连。每根层析柱的上、下出口分别用软管与动组件上、下两侧盘上的孔道一一对应相连。正常操作时，动组件盘上的孔道和静组件盘的孔道一一对应，是进出各层析柱的流体通道；发生切换时，通过转轴的转动，盘的相应孔道发生旋转和位移，每次切换转过一定角度，再与静组件盘下一位置上的相邻孔道对齐，起到步进切换的作用(即每次切换只转过相邻两小孔间隔的角度)；

静组件102A，102B包括与动组件转轴两端盘外侧面紧密接触的两个盘。静组件上也开有多个与转轴呈同心圆形均匀分布的小孔道，孔道数目与动组件盘中的孔道数目相同，静组件盘中每个孔道的内端分别与动组件盘中各个对应的小孔相通，静组件盘中每个孔道的外端则通过软管与液流流向控制面板上各个孔道相连。静组件小孔距离轴心的半径，与动组件盘面上各小孔的分布半径相同，使得动、静组件上的小孔可以一一对齐。

动组件盘和静组件盘的外形可以是任何形状，如正方形、长方形、棱形、平行四边形、圆形、椭圆形等，但优选是圆形。

在弹簧的压紧作用下，静组件和动组件之间紧密接触；动、静组件相互接触的表面经过精加工，具有很高的平行度和表面光洁度，可以保证切换时和正常操作中液体的密封。

本发明设备采用动静组合的转盘结构，各层析柱安装在可转动组件上，为了实现流动相和固定相载体的逆流运动，各层析柱采用步进式切换：包括转轴、动组件和层析柱的转子部分通常情况下是静止的，进行正常的层析操作；每经过一段切换间隔时间，流体停流，设备的可转动部分在电机驱动下开始旋转，迅速转动到下一位置，使得静组件盘上各液体流动通道分别与相邻的下一只层析柱连通后，电机停转，再恢复液体流动，进行下一周期的层析操作；切换时，静组件是不动的，与静组件相连接的各股液流进入和流出层析系统的位置保持不变，因此随着层析柱的切换，发生了载体相对于流动相的运动；由于转动方向与流程中流动相总的流向相反，随着切换就实现了流动相和固定相载体的逆流相对运动。

为了在动组件和静组件之间进行周期性步进式切换，本发明设备还包括切换控制部分，以保证保证切换后动组件的准确定位。优选的方法是采用如图4所示的装置，利用控制信号的发射和接收进行控制，控制采用红外线、可见光、声波、超声波等信号；在切换开始以后发射探头发出控制信号，切换完成即停止。设备上部的动静圆盘上，分别安装两只圆环，上圆环上有一只小孔；下圆环上有多只均匀分布的小孔，小孔的数目与层析柱的数目相同。在切换时，随着动组件的旋转面同步转动，小孔位置发生变化；上、下圆环上小孔距离圆环圆心的半径相同，正常操作时上圆环小孔和下圆环上某一小孔对齐。信号发射探头106安装在下圆环的下方，信号接收探头107安装在上圆环小孔的上下方，两只探头位于同一条垂直线上；切换开始后，随着下圆盘的转动，原来对齐的两孔位置发生偏离，信号传递通路被切断；当转动到上圆环小孔和下圆环下一位置小孔对齐时，控制信号穿过两只对齐的小孔到达接收探头，发生相应的控制动作，使驱动电机立即停转，即可完成一次切换过程。

在本设备发明中，切换是步进式的，绝大部分时间内为正常操作，动组件并包括安装在其上的各层析柱是静止的，各层析柱内流体流动，进行层析分离；在t_o时刻，切换开始，动组件在电机的驱动下开始旋转；切换到位前，下圆环上任何一只小孔都不与上圆环小孔对齐时，所发射的控制信号不能被收到，电机连续转动；当下圆环中任何一只小孔转到与上圆环小孔轴心对齐时，切换到位，接收探头就能接收到控制信号，并发生控制动作使电机停转，完成一个切换过程；切换过程消耗的时间为t_s。整个切换过程中，液体输送泵停转，使得层析柱内流体停流，以尽可能减小切换时的柱间混合。t_o+t_s时刻，切换到位后，再开始正常层析过程，直到经过时间Δt，在t_o+t_s+Δt时刻，又开始下一次切换。

两次切换之间间隔时间Δt的长短，取决于固定相的运动速度，可以根据具体的层析分离工艺要求，预先设定和调节(2分-120分钟)。切换是周期性的间歇操作，每次切换时间t_s很短(2-5秒)，因而相对于层析操作所用的时间很短，层析过程绝大部分时间在静态下进行。本设备中层析柱流道与动静盘上切换端口数目相同，且位置一一对应。除了短暂的切换期间之外，各个层析柱的进出口流体均为一对一的组合方式，可以有效地减少连续切换时柱床层的返混。

本发明设备中，为了便于实现液流通道的转换，将上、下静组件102A，102B上作为进出各只层析柱的液流通道的各个孔道都连接到液流流向控制面板104的孔道，而进、出层析系统的各股液流也均与液流流向控制面板上的孔道相连。控制面板上开有多只小孔道，孔道数目为层析柱数目的2倍。每个孔道贯穿控制面板，在面板的正、反两面均有一个开口，一端开口通过软管分别与上、下静组件102A，102B的圆盘上各个小孔的输出端相连接，从而成为液流进出各层析柱上端、下端的通道；控制面板上孔道的另一端开口用于相互连接，把连接各层析柱按照适当方式串接起来，或者与进入层析系统的各股液流的输送泵相连，或者与离开层析系统的液流出口相连。在操作中可根据具体层析过程的需要，来安排控制面板上各通道的连接方式，使得各层析柱首尾相接，以保证液流按设计好的流程依次流经各只层析柱，各股液流在所设计的位置进入或离开系统，以实现满足工艺需要的连续层析分离系统。

采用本发明设备来进行蛋白质的连续逆流层析分离，通过控制面板的适当连接方式，将各层析柱连接起来，组合成所需的蛋白质层析工艺，通常包括吸附段、洗涤段、洗脱段和再生平衡段。例如，实施例1中图2所示是采用本发明的设备来实现蛋白质连续逆流层析的一种技术路线。分离体系是从基因工程菌发酵所得的混合物中分离重组人血清白蛋白和杂质。图2中，16个层析柱分为吸附段、洗涤段、洗脱段、再生段和平衡段，其中吸附段由4个层析柱组成、洗涤段由3个层析柱组成、洗脱段由6个层析柱组成，再生段包括3个层析柱。洗脱段的出口液流，不进入洗涤段，洗脱段和洗涤段互不连通。为了实现图2所示的层析流程，在液流流向控制面板104上，将面板上对应于层析柱1上端的孔道与对应于层析柱2下端的孔道连接起来，将对应于层析柱2上端的孔道与对应于层析柱3下端的孔道连接，将对应于层析柱3上端的孔道与对应于层析柱4下端的孔道连接，将进料的输送泵与对应于层析柱4上端的孔道相连，并将对应于层析柱1下端的孔道作为余液的出口，就构成层析系统的吸附段；类似地，将层析柱5，6，7首尾相连，并且将控制面板上对应于层析柱5下端的孔道与对应于层析柱4上端的孔道相连，将洗涤缓冲液的输送泵与面板上对应于层析柱7上端的孔道相连，就构成了洗涤段；将层析柱8，9，10，11，12首尾相连，将洗脱缓冲液的输送泵与面板上对应于层析柱12上端的孔道相连，并将面板上对应于层析柱8下端的孔道作为产品液的出口，就构成了洗脱段；将层析柱13，14，15首尾相连，将再生缓冲液的输送泵与面板上对应于层析柱15上端的孔道相连，并将面板上对应于层析柱13下端的孔道作为再生液的出口，就构成了再生段；最后，将平衡缓冲液的输送泵与面板上对应于层析柱16上端的孔道相连，并将对应于层析柱16下端的孔道作为平衡液的出口。这样，就形成了完整的层析系统。随着层析柱的周期性切换，载体从层析柱1的位置向层析柱16的位置移动，再从层析柱16的位置返回层析柱1的位置；每次切换时，各层析柱均移动到下一个相邻层析柱的位置。混合液中不同组分，按照与层析载体结合力的强弱，可分为作为目标产物的血清白蛋白、吸附力较血清白蛋白弱的弱吸附杂质、吸附力较血清白蛋白强的强吸附杂质等。进料液由第4根层析柱进入系统，在吸附段和洗涤段，目标组分和强吸附组分被固定相吸附，并随着固定相的切换移动向右移动，而弱吸附组分由于与载体吸附作用较弱，随着流动相的运动从柱1流出；在洗脱段，目标产物被洗脱缓冲液从载体上被洗脱下来，作为产品液从层析柱8流出；充分洗脱除去产物后的吸附剂载体，随着层析柱的切换运动进入再生段，载体上强吸附的杂质组分将被再生液洗脱而进入再生液，从层析柱14离开。这样，就实现了目标产物、强吸附组分、弱吸附组分的层析分离。再生后的载体在层析柱16中进行平衡处理，并随着下一次的切换返回层析柱1，重新进入吸附段。

实施例2中图3所示是采用本发明的设备分离人血清白蛋白和卵清蛋白。人血清白蛋白和卵清蛋白两者的等电点非常接近，用间歇操作的离子交换层析通常难于分离。在图3中，16个层析柱分为吸附段、洗脱段、再生段和平衡段，其中吸附段由3个层析柱组成、洗脱段由6个层析柱组成、再生段由5个层析柱组成，平衡段包括2个层析柱。洗脱段的出口液流，和进料汇合后，进入吸附段；洗脱段和再生段互不连通，构成一个相对开放的层析系统。为了实现图3所示的层析流程，在液流流向控制面板104上，将面板上对应于层析柱1上端的孔道与对应于层析柱2下端的孔道连接起来，将对应于层析柱2上端的孔道与对应于层析柱3下端的孔道连接，将进料的输送泵与对应于层析柱3上端的孔道相连，同时将对应于层析柱3上端的孔道与对应于洗脱段层析柱4下端的孔道连接，并将对应于层析柱1下端的孔道作为洗脱液的出口，就构成层析系统的吸附段；类似地，将层析柱4，5，6，7，8，9首尾相连，并且将控制面板上对应于层析柱4下端的孔道与对应于吸附段层析柱3上端的孔道相连，将洗脱缓冲液的输送泵与面板上对应于层析柱9上端的孔道相连，就构成了洗脱段；将层析柱10，11，12，13，14首尾相连，将再生缓冲液的输送泵与面板上对应于层析柱14上端的孔道相连，并将面板上对应于层析柱10下端的孔道作为再生液的出口，就构成了再生段；最后，将平衡缓冲液的输送泵分别与面板上对应于层析柱15、16上端的孔道相连，并将面板上对应于层析柱15、16下端的孔道作为平衡液的出口，就构成了平衡段。这样，就形成了完整的层析系统。随着层析柱的周期性切换，载体从层析柱1的位置向层析柱16的位置移动，再从层析柱16的位置返回层析柱1的位置。混合液中人血清白蛋白和卵清白蛋白，按照与层析载体结合力强弱的微小差异，可以得到初步的分离。进料液由第3根层析柱进入系统，洗脱缓冲液由第9根层析柱进入系统；在吸附段和洗脱段，人清白蛋白与载体的结合力较卵清蛋白稍弱，卵清蛋白趋向于随着固定相的切换移动向右移动，而人清白蛋白在洗脱液的作用下趋向于随着流动相的运动从层析柱1流出；在再生段，洗脱能力较洗脱缓冲液更强的再生缓冲液从层析柱14进入，使仍然被吸附的蛋白从载体上被洗脱下来，再生液从层析柱10流出，其中富集了卵清蛋白；这样，就实现了人血清白蛋白和卵清蛋白的初步分离。再生后的吸附剂载体，随着层析柱的切换运动进入平衡段，在经过层析柱15、16中平衡处理后，返回层析柱1。

类似地，采用本发明的连续逆流液固层析设备时，各种流程的连续层析工艺均可以通过在控制面板上有关孔道的连接来实现。在本发明设备中，利用控制面板上各孔道连接方式的改变，可以改变层析流程，包括改变每段层析柱的分配数、各种进出液流的相对位置、各层析柱内液体流向等操作条件，可以实现不同于封闭的三区或四区操作的模拟移动床系统的多种具体层析工艺路线。

采用本发明设备进行连续逆流层析分离纯化蛋白质，与固定床层析技术相比，可以明显减少吸附载体的用量和流动相用量，提高分离后的产品浓度，为层析后进一步的处理提供了方便；连续操作也有利于分离操作的稳定性，提高产品质量和单位时间内处理能力。

                               实施例1

采用本发明设备进行基因工程人血清白蛋白和杂质的连续逆流层析分离。原料为通过基因工程菌发酵培养后，经过初步分离所得的含有目标产物-重组人血清白蛋白和杂质的粗蛋白。采用离子交换载体，进行目标产物和杂质的层析分离。层析分离的一种技术路线如图2所示。根据层析分离的需要，安排各层析柱的分配方式，图中16个层析柱分为包括吸附段、洗涤段、洗脱段和再生平衡段，其中吸附段由4个层析柱组成、洗涤段由3个层析柱组成、洗脱段由5个层析柱组成，再生段包括3个层析柱用于再生，1只用于平衡。

如图2所示，含有蛋白粗制品的料液在泵的输送下，由进口4处(第四根层析柱)进入系统，分别通过编号为4、3、2、1的层析柱，最后弱吸附的组分从编号1的层析柱流出(余液)，而强吸附组分，随着层析柱的运动移动到洗涤段；在洗涤段，洗涤缓冲液从编号为7的层析柱进入，洗涤液从右至左分别进入层析柱7、6、5，并与进料液混合后，再进入吸附段。在洗脱段，洗脱缓冲液从编号为12的层析柱进入，洗脱液从右至左分别通过层析柱12、11、10、9、8，洗脱下来的组分从层析柱8流出系统，作为含有纯化后目标蛋白的产品液；充分洗脱除去产物的吸附剂载体，随着层析柱的运动进入再生段，与再生液逆流接触，调节载体的离子强度pH值等条件，使之适于吸附，再生液从层析柱15进入，而从层析柱13离开。载体再生后，在层析柱16中平衡后，下一次切换时，会移动到层析柱1的位置，开始下一轮循环。在图中，液体总的流动方向是从右至左，而通过步进式的定时切换，层析载体的移动方向是从左向右，这样就实现了流动相和载体之间的逆流运动。

具体的操作条件如下：

层析柱内径10mm；每根柱装填湿载体质量为3.1g；温度为20℃。

进料液：基因工程菌发酵液经过灭菌、过滤，再经初步的前处理净化后，其中重组人血清白蛋白(rHSA)的含量为28％，用pH值为6.0的缓冲液溶解，作为连续层析的进料液，其中rHSA浓度为8mg/mL；进料流量0.3mL/min。

洗涤缓冲液：pH值为6.0，流量为0.5mL/min。

洗脱缓冲液：pH值为6.0，NaCl浓度为0.12mol/L，流量为1.0mL/min。

再生液：pH值为6.0，NaCl浓度为0.3mol/L，流量为1.2mL/min。

平衡液：pH为6.0，浓度为0.01mol/L的磷酸盐溶液，流量为0.3mL/min。

连续层析操作时，切换时间为3min-30min；如果设定切换时间为6min，当连续层析操作达到稳定态以后，在产品液中，人血清白蛋白的相对含量可达98％，与进料液中人血清白蛋白的相对含量仅为28％相比，纯度有了大幅度的提高；可见，采用本发明设备进行连续层析操作，是重组人血清白蛋白大规模分离提纯的有效方法。

                             实施例2

采用本发明中设备进行人血清白蛋白与卵清蛋白混合溶液的连续逆流层析分离。所用载体为DEAE-琼脂糖凝胶。具体工艺路线如图6所示。洗脱液(主要含人血清白蛋白)从吸附段出口获得，而再生液(主要含卵清蛋白)从再生段出口获得；流程包括4个阶段：吸附段、洗脱段、再生段和缓冲液平衡段，16根柱分为4段，其中吸附段使用3根层析柱，洗脱段6根，再生段5根，缓冲液平衡段2根。产品液(主要含HSA)从洗脱段出口获得，而再生液(主要含卵清蛋白)从再生段出口获得。具体条件如下：

层析柱内径12mm；每根柱装填湿载体质量为1.5g；温度为20℃。

进料液：人血清白蛋白4mg/mL，卵清蛋白4mg/mL，两种蛋白的相对含量均为50％，用于配制进料的缓冲液pH为6.0，浓度为0.01mol/L的磷酸盐溶液；进料流量0.2mL/min。

洗脱缓冲液：pH为6.0值，NaCl浓度为0.12mol/L，流量为1.0mL/min。

再生液：pH为6.0，NaCl浓度为1mol/L，流量为1.7mL/min。

平衡液：pH为6.0，浓度为0.01mol/L的磷酸盐溶液，流量为0.5mL/min。

操作时切换范围为3-30min。如果设定切换时间为7min，当连续层析分离操作达到稳定状态后，在洗脱液中出口，人血清白蛋白的相对含量为90.7％，收率为91.2％；在再生液出口，卵清蛋白的相对含量为90.5％，人血清白蛋白的相对含量为9.5％。与固定床层析分离结果对比，如下表所示。

                    移动床连续逆流层析和固定床层析分离结果对比

操作方式	进料溶液质量配比(HSA：卵清蛋白)	纯度(％)	收率(％)	产率(mg/min·g载体)
					固定床层析	1∶1	65.1	31.9	0.0199
移动床连续逆流层析	1∶1	90.7	91.2	0.0638

比较发现，进行固定床层析时，由于分离选择性很小，两种蛋白的分离效果很不好，洗脱峰不出现两个出峰，洗脱液中人血清白蛋白相对含量在48.3％-68.3％范围内，人血清白蛋白和卵清蛋白几乎没有得到分离；如果要将两种蛋白分离得比较好，固定床层析必须很长的层析柱，填充更多的载体，这样分离效率很低、不经济。而采用本发明设备进行连续逆流层析，在合理的缓冲液和切换时间等操作条件下，可将两种蛋白分离得较好，人血清白蛋白纯度和收率很高，产率也大大高于固定床层析。

Claims (10)

1.一种多柱式连续逆流液固层析设备，它包括：

动组件，所述动组件的中央部分固定装有环形支架，支架的内圈固定在转轴上，外圈上均匀分布了多个用于安装固定多根层析柱的固定装置，支架的上、下两侧各有一个盘，该盘上开有多个与转轴呈同心圆形均匀分布的小孔道，孔道数目与层析柱数目相同，每个孔道的一端与静组件盘上各个对应的小孔相通，另一端与各只层析柱相通，

静组件，它包括与动组件上、下盘外侧紧密接触的两个盘，盘中有多个与转轴呈同心圆形均匀分布的小孔，孔道的内端分别与动组件盘上各孔道的外端相通，各个外端通过软管相互串联，将与孔道一一对应的各只层析柱分别组合成吸附段、洗涤段、洗脱段、再生段和平衡段，构成一个多柱层析系统，

切换控制装置，它包括推动动组件转动的驱动电机、控制驱动电机和液流输送泵电源通断的时间控制器、定位装置；正常层析操作时，通过时间控制器切断驱动电机电源，接通液流输送泵电源；开始切换时，通过时间控制器的动作，接通驱动电机电源，切断液流输送泵电源，切换到位时，立即使驱动电机停转，恢复正常层析操作，

其特征在于，静组件小孔距离轴心的分布半径与动组件盘面上各小孔的分布半径相同，静组件上下盘中的孔道数与动组件上下盘中的孔道数相同，每次切换到位之后，位置一一对应。

2.如权利要求1所述的多柱式连续逆流液固层析设备，其特征在于所述固定装置、层析柱和孔道的数目为4-50。

3.如权利要求1所述的多柱式连续逆流液固层析设备，其特征在于所述固定装置、层析柱和孔道的数目为4-32。

4.如权利要求1所述的多柱式连续逆流液固层析设备，其特征在于所述固定装置、层析柱和孔道的数目为4-16。

5.如权利要求1所述的多柱式连续逆流液固层析设备，其特征在于所述的固定装置为凹槽。

6.如权利要求1所述的多柱式连续逆流液固层析设备，其特征在于所述的切换控制装置是步进式切换控制装置。

7.如权利要求1所述的多柱式连续逆流液固层析设备，其特征在于所述的步进式切换控制装置是周期性间歇操作的。

8.如权利要求6或7所述的的多柱式连续逆流液固层析没各，其特征在于所述的步进式切换控制装置利用红外线、可见光、声波或超声波信号的发射和接收进行控制。

9.如权利要求1所述的多柱式连续逆流液固层析设备，其特征在于所述动组件盘和静组件盘的外形是圆形，动组件上层析柱的分布形状呈圆形。

10.如权利要求1所述的多柱式连续逆流液固层析设备，其特征在于利用液流流向控制面板来实现各只层析柱间液流的连通；液流流向控制面板上有数目为静组件上或下盘中孔道数目的2倍的小孔道，每个孔道贯穿控制面板，在该控制面板的正、反两面均有一个开口，一端开口分别与上、下静组件盘上的各个小孔的外端相连接，作为液流进出各层析柱上下端的通道；另一端开口则用软管相互连接，把静组件各个外端串接起来，从而使得对应的各只层析柱柱依次首尾相连，分别组合成吸附段、洗涤段、洗脱段和再生平衡段，或者连接到进、出层析系统的液流管路上，作为液流进入、或离开多柱层析系统的关口。

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