CN1395096A - 立体多维多模式毛细管电泳方法及专用装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种立体多维多模式毛细管电泳方法及专用装置。它通过电压切换使流动相在不同流路之间切换，使样品组分在至少2根毛细管柱中，采用不同的毛细管电泳分离模式，通过串联、并联或串联并联组合的流路形式，以及不同流动相组合完成分离；其专用装置主要由至少2根毛细管柱、至少1个连接件、高压源组成，用连接件进行柱间样品输运，其接口处连接毛细管柱和空毛细管，高压源通过控制开关、装有流动相的容器安装在毛细管柱或空毛细管自由端。具有柱效损失小，峰容量更大，结构简单、检测灵敏度高特点。

Description

立体多维多模式毛细管电泳方法及专用装置

技术领域

本发明涉及毛细管电泳的分离技术，具体地说是一种立体多维多模式毛细管电泳方法及专用装置。

背景技术

毛细管电泳是近年来发展起来的微分离技术，由于其高效、样品用量少、应用范围宽等特点而引起分析化学领域的广泛关注。目前已发展成为包括毛细管区带电泳(CZE)、毛细管电动力学色谱(MEKC)、毛细管电色谱(CEC)等多种分离模式，数十种商品化仪器的新型学科。

尽管毛细管电泳方法具有较高的柱效，但是由于应用电压的限制，制约了所采用的分离柱长度，因而也限制了实际柱效和可能达到的峰容量。此外，毛细管柱过细的内径使得其光谱检测光程过小，对检测灵敏度产生很大影响。这些限制和影响在复杂生化样品、环境样品分析中尤为突出。因此发展具有较大峰容量和较高检测灵敏度的毛细管电泳仪器和方法对于进一步拓宽其应用和研究领域具有十分重要意义。

采用多维分离技术可以极大地提高系统的峰容量，也可以更方便地与高灵敏检测器联用，更好地完成复杂样品的分离分析任务。其方法目前主要有两种，一是通过柱切换技术实现高效液相色谱与毛细管电泳技术联用的二维分离；二是毛细管电泳-毛细管电泳的二维联用。文献1：A Simple Two-dimensionalHPLC/HPCE Set Up For The Separation Of Complex Mixtures，Electrophoresis，1999，Vol.20，Issue 7，1533-1537；文献2：J.Chromatogr.A.，Multi-DimensionalMapping Of Pyridylamine Labeled N-Linked Oligosaccharides By CE，1996，720，395-407；文献3：A Transparent Flow Gating Interface For The Coupling OfMicroclumn LC With CZE In A Comprehensive Two-Dimensional System，Anal.Chem.1997，69，4134。这些方法基于柱间电动-机械切换实现样品由一根毛细管柱进入另一根毛细管柱，由于流路中有泵、阀等组件，尽管可以使峰容量得到一定的提高，但由于切换过程损失柱效较大，对仪器条件的要求较为苛刻，限制了其应用；另外，在二维气相色谱中，第二维柱必须为短柱，也对柱效有较大影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种柱效损失小，峰容量更大，结构简单、检测灵敏度高的立体多维多模式毛细管电泳方法及专用装置。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：根据流动相在毛细管电泳输运过程中的特点，采用电压切换切换方式，实现样品特别是复杂样品在毛细管柱中进行多维分离，以极大增加峰容量，满足蛋白质组等复杂体系对分离的要求；具体地说是通过电压切换的方式使流体在不同流路之间切换，使样品组分可以在至少2根毛细管柱中，采用不同的毛细管电泳分离模式，通过串联、并联或串并联组合的流路形式，以及对应的不同流动相组合完成分离；

其专用装置：主要由至少2根毛细管柱、至少1个连接件、高压源组成，其中：用连接件进行柱间样品输运，其接口处连接毛细管柱和空毛细管，高压源通过控制开关、装有流动相的容器安装在毛细管柱或空毛细管自由端。

本发明工作原理如下：

由于流体在毛细管中存在润湿现象，因此毛细管内径较小的情况下，只有在柱管两端施加适当的压力时，才能使流体在柱内输运。这一原理说明只有在通过连接件连接后的对应毛细管两端施加电压时，流动相才能够在对应的毛细管柱内输运，而没有被施加电压的毛细管中流动相不会随之流动。基于这种思想可以在毛细管柱径较小的情况下，无需接入阀门等组件即可保证切换过程顺利完成。具体方法是通过电压的切换使流动相在不同流路之间切换，使样品组分在多根毛细管柱中，采用不同的毛细管电泳分离模式和流动相组合完成分离。根据不同的分离要求和样品特征，设计二维及二维以上不同的分离模式(如CZE、CEC等)，这些模式能够在相应的毛细管柱内实现，且在流动相兼容的情况下，不同柱分离之间不产生相互影响。理论上讲，可以达到无限的柱容量，使得超复杂样品的分离成为可能。由于每一分离毛细管柱可配置相应的检测系统，因此结合切换程序的设计，能够得到多个多维立体谱图。

本发明具有如下优点：

1.峰容量大。本发明采用多维多模式毛细管电泳分离方案，可以在一台仪器上通过串联或并联等模式同时实现样品在多种类型柱、多种流动相体系下的分离分析，理论上讲，可以达到无限的柱容量，使得超复杂样品的分离成为可能。而且通过串联技术能够得到极高的实际柱效，总峰容量为各柱峰容量乘积。

2.成本低、柱效损失小。本发明采用零死体积交叉连接件进行柱间流体的输运，在毛细管柱径较小的情况下，无需接入阀门等组件即可保证转换过程顺利完成。由于省了泵和阀，避免了阀切换引起的柱效降低问题，装置简单，也保证了分离的高效性。

3.分离效果好。本发明通过电压的切换使流体在不同流路之间切换，样品组分在多根毛细管柱中，采用不同的毛细管电泳分离模式和流动相组合完成分离。

4.多分离模式。本发明根据不同的分离要求和样品特征，可以设计不同的分离模式(如CZE、CEC等)，这些模式能够在相应的毛细管柱内实现，且在流动相兼容的情况下，不同柱分离之间不相互影响。可实现多次的柱内富集。

5.检测灵敏度高。本发明结合多次柱内富集技术及溶剂置换技术，对不同组分而不是整个样品可以配以相应的检测器，可以极大地提高检测灵敏度。柱间切换可以采用定峰切换和定切换两种方案，也可以根据需要，设计切换程序按指定的切换方式切换。并且试样分析过程可实现切换程序设计的全自动化控制。切换方式和检测手段的改变，可以得到多个立体多维谱图，便于峰跟踪和定性、定量。

附图说明

图1为本发明一个实施例二维串联毛细管柱电泳装置结构示意图。

图2为图1中连接件结构示意图。

图3为本发明一个实施例二维串联毛细管柱电泳定时切换紫外可见光度检测器得到的三维谱图。

图4为本发明另一个实施例三维串联毛细管柱电泳装置结构示意图。

图5为本发明第三个实施例二维并联毛细管柱电泳装置结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详述本发明。

实施例1

二维串联毛细管柱电泳：

如图2所示，毛细管柱A1采用毛细管凝胶电泳分离模式，毛细管柱B2采用毛细管电色谱或毛细管区带电泳分离模式，设计所需毛细管柱A1、B2尺寸相同，分别插入连接件5的接口里，并经粘合剂粘结，连接件5为四通结构，在连接件5的点对称位置接合空毛细管4，为了避免不必要的柱效损失，经连接件5连接的毛细管柱A1和B2的设置，应使毛细管柱A1中的样品组分在通过切换进入毛细管柱B2的过程中不经过有小角度的流路，避免不必要的峰形展宽；在毛细管柱A1、B2流动相的流出端设置窗口，设检测器6为紫外光谱仪，高压源7通过控制开关K1～K4、装有流动相的样品瓶安放在毛细管柱或空毛细管自由端。

其中：不同毛细管电泳柱内富集技术皆可通过操作条件的适当控制，在毛细管柱A1和B2上实现，例如，第一维中采用毛细管凝胶电泳的分离模式，并通过场放大进样技术实现样品的初步富集；样品经毛细管柱A1分离后，根据有机调节剂浓度的改变和离子强度等的相应调整，在毛细管柱B2的毛细管电色谱模式中可实现再一次的柱内富集，使检测灵敏度得到极大的提高。

毛细管柱之间的常用切换方式有两种：定峰和定时切换，本实施例为定时切换，即设定程序，在一定的时间间隙(如5分钟)完成切换。

其分离操作可按下述步骤进行：

1.组装好设备，在第一～二瓶11～12和第三～四瓶21～22分别装入两次分离用流动相，保持电路中所有开关处于断开状态；

2.按一般毛细管电泳柱进样方法进样；

3.在高压电源7的控制下将第一～二开关K1、K2闭合，在电场的驱动下，样品在流动相1的氛围中沿毛细管柱A1向柱尾迁移，使试样初步分离；

4.根据设定的切换时间(5分钟)，将第一开关K1断开，接通第四开关K4，接通沿柱毛细管柱A1和B2电路，样品组分经连接件5进入到毛细管柱B2中；

5.断开第一开关K1完成毛细管柱B2的进样过程；

6.接通第三～四开关K3、K4在毛细管柱B2中以流动相2冲洗进一步完成分离，并通过检测器6  得到检测结果，这期间毛细管柱A1内组分停止迁移；

7.毛细管柱B2中的组分完成分离后，断开K3并接通K1，进行下一次进样；

8.重复上述步骤，直至所有组分从毛细管柱A1和B2中流出。

定时切换与二维气相色谱的原理相同，但不需要冷阱，切换时间可以任意选择，经与GC-GC(气相色谱)相似的软件处理后，可以得到二维分离谱图。如图3所示，图中的每一列峰对应于毛细管柱A1的分离结果，而其垂直方向的峰对应于毛细管柱B2的分离，这种系统中，毛细管柱A1的检测器6可以略去，即只采用毛细管柱B2的检测器6检测；为了保证每次毛细管柱B2中所有组分都能够在下一次进样前全部流出，由程序设计保证毛细管柱B2开启足够的时间，由于样品组分在毛细管电泳柱内的浓差扩散较GC中小很多，因此可适当加长毛细管柱B2，增加其实际柱效(相应的分析时间加长)从而可以避免二维气相色谱中第二维柱必须为短柱，柱效较低的缺陷。

在切换过程中，根据毛细管柱A1和B2的电渗流速率的差别，应合理调整切换时间，(尤其在定峰切换的情况下)，以保证目标峰全部由毛细管柱A1进入毛细管柱B2中。在研究生物大分子如蛋白时，可以基本上不考虑分子扩散问题，在毛细管凝胶电泳或毛细管区带电泳模式下的组分峰形极窄，可以方便地完成这种切换。

实施本发明对不同样品可以任选分离模式和不同类型的检测器，以达对目标组分实现高灵敏度的检测。

实施例2

与实施例1不同之处在于：本实施例中毛细管柱A1，B2采用相同的毛细管凝胶电泳的分离模式，而且毛细管柱内径不同，并采用与之匹配的连接件5，在电场驱动下，辅助施以使样品不会从自由毛细管柱端口流出的适当压力，进行分离，即实现整体系统具有很大的选择性调节灵活性。

实施例3

与实施例2不同之处在于：根据分离模式和实际分离的需要，本发明流动相不同，除需考虑其兼容性，每一种流动相可以不受影响地单独调节，当毛细管柱A1和B2分离模式相同时，流动相不同的分离结果类似于特殊的台阶梯度洗脱分离，可以方便地改变台阶的长度和高度，有利于分离条件的优化。

实施例4

与实施例2不同之处在于：本发明也可采用定峰切换方式，即在毛细管柱A1的检测器6检测到有峰出现后，将该峰切换到毛细管柱B2中进行分离，即对毛细管柱A1的每个目标峰进行切换；在毛细管柱A1和B2为相同的分离模式时，定峰切换与一般二维平板电泳的分离原理类似，但具有更高的柱效，分离效果更好，且操作方便，能够采用的检测方法更多。

相对而言，采用定峰切换较定时切换所用分析时间较少，但操作相对较复杂，对于定峰切换在没有峰出现时不执行切换操作，只是将毛细管柱A1分离的每一个完整峰引入到毛细管柱B2中进行分离。

如果毛细管柱A1和B2的峰容量分别为M和N，则这种串联柱分离系统的总峰容量为M×N。

实施例5

三维串联毛细管电泳：

与实施例1不同之处在于：采用3根毛细管柱A1、B2、C3，2个连接件5，适于较实施例1更复杂的样品分析。如图4所示，流路设计为串联结构，毛细管柱A1、C3分别通过连接件5与其对应位置的空毛细管安装在一起，两个连接件5通过毛细管柱B2串联起来，在三维串联中，毛细管柱A1、B2、C3中可分别采用毛细管凝胶电泳、电色谱、毛细管区带电泳的分离模式，流动相1、2、3可以在基本不受影响的情况下进行调节。

操作步骤如下：

1.组装好设备，在第一～二瓶11～12、第三～四瓶21～22、第五～六瓶31～32内分别装入三次分离所需流动相，保持电路中所有开关处于断开状态；

2.按一般毛细管电泳柱进样方法进样；

3.在高压源7的控制下将第一～二开关K1～K2闭合，第三～六开关K3～K6为断开状态，在电场的驱动下，样品在流动相1的氛围中沿毛细管柱A1向柱尾迁移，使试样的第一步分离；

4.采用定时切换方式，在设定的时间(如5分钟)将第二开关K2断开，接通第四开关K4，将沿毛细管柱A1和毛细管柱B2电路接通，样品组分经连接件5进入到毛细管柱B2中；

5.断开第一开关K1完成毛细管柱B2的进样过程；

6.接通第三、四开关K3、K4，在毛细管柱B2中以流动相2冲洗，完成第二步分离。并通过检测仪得到检测结果。这期间毛细管柱A1内组分停止迁移；

7.选择定峰切换方式，在目标峰出现后，将第四开关K4断开，接通第五开关K5，在第三开关K3配合下将沿毛细管柱B2和毛细管柱C3电路接通，样品组分经连接件5进入到毛细管柱C3中；

8.断开第三开关K3，接通第六开关K6在毛细管柱C3中以流动相3冲洗，完成最后分离，并通过检测仪得到检测结果；

9.毛细管柱C3中的组分完成分离后，断开第五、六开关K5、K6并接通开关K1、K2，进行下一次进样；

10.重复上述步骤6-9，直至所有组分从毛细管柱B2中流出；

11.断开K5、K6并接通K1、K2重复上述步骤3-10，直至所有组分从毛细管柱A1中流出。

毛细管柱A1、B2及B2、C3之间的切换可用不同的定峰或定时切换方式，对样品完成三维分离。

在电泳分离过程中，电压过高将不利于操作；电压一定时，随柱长的加大，场强逐渐减小，电渗及电泳速率随之减小，也不利于分离；在三维串联系统中，采用相同柱分离模式时，其结果相当于毛细管柱的加长，且避免了过高的电压。不同毛细管电泳分离模式的相对柱效尽管很高，但由于柱长的限制，实际柱效并不能达到理想的效果。例如：毛细管区带电泳的理论塔板数可以达到500000/m，但由于所能够实际采用的柱长只有0.2m，因此实际柱效只有100000/m。在不考虑连接件及切换过程对柱效影响的情况下，三维串联系统的实际柱效相当于三根柱柱效的加和，而峰容量为三根柱各自峰容量的乘积。

本实施例由毛细管柱A1和B2构成的二维系统可以提供相应的三维谱图，同样，由毛细管柱B2和C3构成的二维系统也可以提供另外的三维谱图，通过对两张三维谱图的对比，并研究流动相组成的改变对峰序等的影响，可以为峰跟踪和组分定性提供更多的信息。

三维串联系统中第三维柱的另一重要作用为对样品溶剂的置换，例如：当流动相2不适于进行质谱检测时，可以考虑通过较短的与毛细管柱B2差别较大的毛细管柱C3进行溶剂置换，使目标组分的溶剂符合质谱检测的要求，此时毛细管柱C3的作用已不是为了分离，主要起到溶剂置换的作用。

本发明所述毛细管柱A1、B2、C3也可采用相同的分离模式；毛细管柱A1、B2及B2、C3之间的切换也可采用相同的切换方式；也可以对某些峰采用一维或二维分离，针对不同的样品分离和切换模式可以任意调整。

实施例6

二维并联毛细管电泳系统：

如图5所示，毛细管柱A1、B2和C3采用不同的分离模式，即：在毛细管柱A1中采用毛细管凝胶电泳的分离模式进行初步分离，在毛细管柱B2中可以采用毛细管电色谱进行分离，而在毛细管柱C3中采用毛细管区带电泳的分离模式。

本实施例与所述实施例1、2不同之处在于：分离系统的流路设计的并联形式(相当于实施例1)。如果分析的样品性质、结构差别较大，首选这种模式，其中：连接件5采用六通结构，3根毛细管柱A1、B2、C3与空毛细管点对称式与连接件5安装在一起，在毛细管柱A1中先完成族分离后，将每一族组分分别切换到相应的第二维柱系统中，进一步完成下一步分离。对于不同性质的样品组分可以极其方便地在毛细管柱B2上配置相应的检测器6，便于提高目标组分的检测灵敏度。

分离过程如下：

1.在第一～二瓶11～12、第三～四瓶21～22及第五～六瓶31～32中分别装入各自分离所需的流动相，保持电路中所有开关在断开状态；

2.按一般的毛细管电泳方法进样；

3.在高压源7的控制下，使第一～二开关K1和K2在闭合状态，而第三～六开关K3～K6均为打开状态，在电场的驱动下，样品在流动相1的氛围中沿毛细管柱A1向柱尾迁移，并在输运过程中实现初步分离；

4.采用定峰切换的方式完成对二维柱系统的进样，即将毛细管柱A1中的每一个峰切换到相应的柱系统中；如：为了将毛细管柱A1中的第一个峰切换到毛细管柱B2中，可以在毛细管柱A1的检测器6检测到峰后的一定时间将第二开关K2断开，并接通第四开关K4，这相当于沿毛细管柱A1和毛细管柱B2的电路接通，样品组分经连接件5进入到毛细管柱B2中；

5.断开第一开关K1，完成毛细管柱B2的进样过程；

6.接通第三开关K3，与闭合的第四开关K4配合在毛细管柱B2中以流动相2冲洗进一步完成分离，并通过检测器6得到检测结果；

7.毛细管柱B2中的组分完成分离后，断开第三～四开关K3、K4并接通第一～二开关K1、K2，进行下一个峰的进一步分离和检测，如：第二个峰需切换到毛细管柱C3中，可以在毛细管柱A1的检测器6检测到该峰后的一定时间将第二开关K2断开，并接通第六开关K6，完成对毛细管柱C3的进样；

8.断开第一开关K1，接通第五开关K5，在毛细管柱C3中以流动相3冲洗，完成进一步分离，并通过检测器得到检测结果；

9.重复上述步骤，直至所有组分从毛细管柱B2和C3中流出。

本实施例毛细管柱A1与毛细管柱B2、C3在连接件中5的连接角应尽可能接近水平，以减小柱效的损失；在切换过程中，应保证将毛细管柱A1中的完整峰引入到毛细管柱B2中；如果毛细管柱A1、B2和C3的峰容量分别为M、N和P，而毛细管柱A1中有A个峰被引入到毛细管柱B2中，则这种并联柱分离系统的总峰容量为A×N+(M-A)×P。由于本方法可以在不同固定相和流动相下操作，因此可以得到更好的分离效果，尤其对于实际生物样品中复杂组分的分离分析。

采用这种系统可以首先对复杂样品在第一维(毛细管柱A1)中进行分阶处理，并在第二维中实现真正分离，结合多次柱内富集技术，并对不同的组分配以相应的检测器，可以极大地提高检测灵敏度，且操作方便，当由前一柱流出的组分不适于进入质谱等检测器分离时，通过一小的短柱可以达到改变样品溶剂的目的，因此特别适用于与质谱等的联用分析，同时这种系统可以方便与压力驱动系统配合使用，达到加快分析速度等目的。

本发明所述电压切换也可根据需要，设计特定的切换程序，在一个实施例中采用定峰切换和定时切换混合方式切换，如先按指定的切换模式、在一定时间(3、5、8分钟)内定时切换，再在另一时间段根据目标峰定峰切换，实现分离；其设计切换程序为现有技术。

Claims (12)

1.一种立体多维多模式毛细管电泳方法，其特征在于：根据流动相在毛细管电泳输运过程中的特点，采用电压切换切换方式，实现样品特别是复杂样品在毛细管柱中进行多维分离，以极大增加峰容量，满足蛋白质组等复杂体系对分离的要求；具体地说是通过电压切换使流动相在不同流路之间切换，使样品组分在至少2根毛细管柱中，采用不同的毛细管电泳分离模式，通过串联、并联或串并联组合的流路形式，以及对应的不同流动相组合完成分离。

2.按照权利要求1所述立体多维多模式毛细管电泳方法，其特征在于：所述毛细管电泳分离模式为毛细管凝胶电泳分离模式、毛细管电色谱分离模式、毛细管等电聚焦分离模式、毛细管无胶筛分电泳分离模式、毛细管胶束电动力学色谱分离模式或毛细管区带电泳分离模式。

3.按照权利要求1所述立体多维多模式毛细管电泳方法，其特征在于：所述毛细管电泳分离模式为相同模式，以加长毛细管柱之效果，实际柱效为各柱柱效之和，总峰容量为各柱峰容量乘积。

4.按照权利要求1所述立体多维多模式毛细管电泳方法，其特征在于：所述流路为通过毛细管柱的串联、并联或串并联结合的连接方式，组成二维或多维毛细管电泳分析体系。

5.按照权利要求1所述立体多维多模式毛细管电泳方法，其特征在于：所述柱间切换方式为定峰切换、定时切换或定峰切换和定时切换混合方式。

6.按照权利要求5所述立体多维多模式毛细管电泳方法，其特征在于：所述定时切换方式为根据设定的程序、在一定的时间间隙完成相应的切换。

7.按照权利要求5所述立体多维多模式毛细管电泳方法，其特征在于：所述定峰切换方式为针对毛细管柱中样品的目标峰进行切换，即在一个毛细管柱的检测器检测到组分峰后，进一步将该峰切换到下一维毛细管柱中进行分离。

8.一种按照权利要求1所述立体多维多模式毛细管电泳方法的专用装置，其特征在于：主要由至少2根毛细管柱、至少1个连接件、高压源组成，其中：用连接件进行柱间样品输运，其接口处连接毛细管柱和空毛细管，高压源通过控制开关、装有流动相的容器安装在毛细管柱或空毛细管自由端。

9.按照权利要求8所述专用装置，其特征在于：所述连接件为零死体积交叉连接件，具有中间通路，至少四个接口，所述连接件接口的内径与毛细管柱的外径匹配，其中间的通路与毛细管柱内径匹配。

10.按照权利要求8所述专用装置，其特征在于：所述连接件间为通过毛细管柱的串联、并联或串并联组合的连接方式，组成二维或多维毛细管电泳分析系统。

11.按照权利要求8所述专用装置，其特征在于：采用不同类型检测器进行毛细管柱上检测或柱尾检测。

12.按照权利要求11所述专用装置，其特征在于：所述检测器采用紫外可见光度检测器、荧光检测器、激光诱导荧光检测器、电化学检测器之一或其组合。

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