CN1498896A

CN1498896A - 猪断奶重psme1基因及其制备方法

Info

Publication number: CN1498896A
Application number: CNA031562418A
Authority: CN
Inventors: 奎李; 李奎; 王彦芳; 余梅; 刘榜; 潘佩文; 熊统安; 樊斌; 赵书红
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2002-11-01
Filing date: 2003-09-02
Publication date: 2004-05-26
Anticipated expiration: 2023-09-02
Also published as: CN1263851C

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，具体地涉及猪断奶重PSME1基因的克隆、制备方法及应用。克隆的cDNA和DNA序列分别如序列表SEQ ID NO：1－2所述。制备步骤包括：电脑克隆、猪脾脏组织总RNA提取、RACE、RACE产物克隆测序、获得全长cDNA序列、设计引物扩增基因组DNA、获得PSME1基因的部分基因组DNA序列、RFLP多态性检测、RFLP多态性与断奶重的关联分析，SSCP多态性检测。本发明公开了猪PSME1基因cDNA全长序列和部分基因组DNA序列，制备基因组DNA序列的两对引物，并公开了基因组DNA序列中的两个位点的突变，C741－T741和C802－G802，以及PSME1－RFLP多态性用于检测猪断奶重的技术，为猪的标记辅助育种提供了新的标记。

Description

猪断奶重PSME1基因及其制备方法

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体地说涉及猪断奶重PSME1基因及其制备方法

背景技术

近年来，国内外学者对猪遗传标记与生产性能的关系进行了大量的研究。合适的遗传标记对于开展标记辅助选择，实行早期选种，提高选种准确性以及加速遗传进展是大有裨益的。

断奶重是衡量母猪繁殖力的重要指标，它与猪肥育期间的增重和屠宰体重呈强的正相关。一般说来，断奶重大的仔猪有较好的生长速度和较高的饲料报酬，有较短的肉猪饲养期和较低的饲养成本，经济效益高。断奶重大，一方面说明其早期生长速度快，另一方面说明其身体免疫功能良好，抗病力强，它是进行粗选的主要依据。虽然，有些单位已经开始进行“提高仔猪断奶重的推广”试验测定，但是，断奶重这个重要指标依旧没有受到遗传工作者的足够重视，对它的相关研究也是凤毛麟角。

李文平等选择大约克夏，长白猪和杜洛克猪进行了19项血液生化指标测定，分析了它们与断奶重的相关关系。结果表明断奶重与生化指标的相关程度在品种间存在差异。大约克猪的碱性磷酸酶(AKP)活性，铜氧化酶(CP)活性，蛋白质含量与断奶重呈较强正相关；长白猪断奶重与淀粉酶活性，铜氧化酶活性，葡萄糖含量呈较强正相关，而与无机磷(Pi)，钾离子及氧离子含量呈负相关；杜洛克猪断奶重与生化指标相关程度非常低(李文平等，几个外来猪品种血液生化指标于断奶重关系的探讨。湖南农业大学学报2000 26(1)：58-60)。

Rothschild实验室长期从事猪第7号染色体着丝粒附近的主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibility complex，MHC)基因单倍型与猪初生重、断奶重、生长速度、背膘厚等性状有关等性状的研究，他们认为MHC基因单倍型与上述生产性能存在相关关系(Rothschild MF，Identificationof quantitative trait loci and interesting candidate genes in the pig：progress and prospects.Proc 6th WCGALP 1998，26：403-409)。

李凤娥等对促卵泡素β(FSH-β)基因微卫星位点多态性与猪的生产性状进行了关联分析，发现该基因与断奶重有显著相关(李凤娥，猪ESR和FSH-β位点对繁殖性状的调控及其调控建立研究。博士学位论文。武汉，华中农业大学，2002)。促卵泡素β基因定位于猪的二号染色体上(Mellink等，PCRamplification and physical localization of the genes for pig FSH-βand LH-βcytogenet cellgenet，1995，70：224-227)。

PSME1基因编码20S蛋白酶体激活因子PA28α。PA28α是20S蛋白酶体的重要调节因子之一，该亚基在体外有激活20S蛋白酶体的肽酶活性，PA28α和PA28β形成异源二聚体，可增大20S蛋白酶体产生适合于与MHCI类分子结合的多种底物肽的能力，提高最大反应速度(zhang等，The proteasomeactivator 11S regulator or PA28 J Biol Chem，1998，273(46)：30660-30668)。

目前已有人、小鼠、大鼠和斑马鱼(McCusker等，Organization of the genes encoding the humanproteasome activators PA28αand β.Immunogenetics 1999，49：438-445；Jiang等，Sequence andexpression of mouse proteasome activator PA28 and the related autoantigen Ki.Immunol，1997，46：93-98.；Murray等，Immunoproteasome assembly and antigen presentation in mice lacking bothPA28α and PA28β.The EMBO Journal 2001，20(21)：5898-5907)的PSME1基因组织结构、表达和功能研究报道。人和小鼠PSME1基因的cDNA全长已被克隆和测序。Northern Blotting分析表明，PSME1基因在免疫组织，如脾脏、胸腺和睾丸中的表达量较高(Jiang等，Sequence and expression of mouseproteasome activator PA28 and the related autoantigen Ki.Immunol，1997，46：93-98)。人和小鼠PSME1基因均被定位在14号染色体上(Tanahashi等.Molecular properties of the proteasomeactivator PA28 family proteins and γ-interferom regulation.Genes cells 1997，2：195-211；Nadeau，Mouse chromosome 14.Mamm Genome 1996，6：245-255)。PSME1基因有11个外显子，小鼠PSME1基因的第4个内含子5’端并非GT，而是GC。这与GT/AG规则是不相符的。这个很稀少的剪接位点经实验证明，在mRNA的剪接过程中能够被准确地切开，都是要比切开GT序列的速度要慢得多。在人类的PSME1基因中，也有相同的现象存在(Kohda K等，Characterization of the Mouse PA28 ActivatorComplete Organizations of the Three Member Genes and a Physical Map of the 150-Kb Regioncontaining the α-subunit and β-subunit Genes.The Journal of Immunology 1998，160：4923-4935；McCusker D等，Organization of the genes encoding the human proteasome activatorsPA28α and β.Immunogenetics 1999，49：438-4451999)。

系统发生分析表明PSME1基因最初是在软骨鱼中检测到的，而MHC最初也是在这种脊椎动物中检测到的。这个基因因为参与MHC I类分子介导的抗原提呈过程，所以研究者推断PSME1基因与动物的免疫系统有关。研究人员用敲除基因的小鼠探讨这个基因的功能。Preckel等人认为，缺少PSME1基因的小鼠，其免疫蛋白酶体的装配与免疫应答遭到了损坏(Preckel T等，Impaired ImmunoproteasomeAssembly and Immune Responses in PA28-/-Mice.Science 1999，286：2162-2165)，而Murata等学者却认为PSME1基因与免疫蛋白酶体的装配与免疫应答没有关系，但是可以降低依赖于ATP的蛋白水解活性。它们并不是所有的抗原提呈的先决条件，而只与一定的抗原加工起关键的作用(Murata S等，Immunoproteasome assembly and antigen presentation in mice lacking both PA28α and PA28β.TheEMBO Journal 2001，20(21)：5898-5907)。

但目前国内外对猪PSME1基因的研究还是空白。

发明内容：

本发明的目的在于克隆猪的PSME1基因cDNA全长，对PSME1基因进行染色体定位，它的制备方法以及它的基因多态性的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种猪断奶重PSME1基因，它的全长cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

所述的基因，它的基因组DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所述。

所获得的PSME1基因cDNA全序列为1039bp，其中包含如附图3所述的750bp的开放阅读框，121bp的5’非翻译区和168bp的3’非翻译区。

序列表SEQ ID NO：2的第741位碱基处有一个碱基突变C741-T741，导致SphI-RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism)多态性。

序列表SEQ ID NO：2的第802位碱基处有一个碱基突变C802-G802，没有导致酶切位点的变化。

检测741位碱基突变C741-T741的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO：3和序列表SEQ ID NO：4所述。

检测802位碱基突变C802-G802的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO：5和序列表SEQ ID NO：6所述

制备所述的cDNA或基因组DNA序列的方法，其特征按照以下步骤：

(1)用人PSME1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后对EST进行拼接；设计5’和3’RACE(Rapid Amplification of cDNA ends)引物；提取猪脾脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录；RACE的PCR扩增和RACE产物的纯化克隆和测序、通过序列分析获得如序列表SEQ ID No.1的序列；

(2)制备如权利要求2所述的DNA序列的方法，其特征按照以下步骤：从猪血液基因组提取DNA，以猪PSME1基因cDNA序列为模板设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。

应用PCR-RFLP的方法检测猪PSME1基因C741-T741的多态性，并根据其基因型，初步判断猪的断奶重。我们还应用PCR-SSCP的方法检测猪PSME1基因C802-G802的多态性。本发明为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记。

对本发明作进一步的描述：

1.PSME1基因全长cDNA的克隆

(1)引物设计：

用人PSME1基因cDNA(GenBank收录号：NM_006263)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计3’RACE和5’RACE引物。序列如下：

5’-TCCGTGAAGACCTGTGTACCAAG-3’(3’RACE)

5’-AACCTTCTCCTGGACAGCCACTC-3’(5’RACE)

(2)RACE技术

利用TRIzoL试剂盒(美国GIBCO公司)从成年香猪脾脏组织中提取总RNA，具体操作依照试剂盒说明书进行。总RNA溶于RACE试剂盒提供的超纯水，用Beckman DU640核酸蛋白质浓度测定仪测定其A260nm值，并通过1.2％的甲醛凝胶电泳检测其完整性。

利用RACE试剂盒(美国CLONTECH公司)进行cDNA末端快速扩增，具体操作按试剂盒说明书进行。(3)RACE产物的纯化、克隆和测序

RACE产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mlEpendorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml Resin，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过Minicolumn挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30~50μl灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。

连接反应：将纯化RACE产物与pGEM-T载体连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl2×buffer，0.5μl的T载体，0.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T₄连接酶，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。

感受态细胞的制备：从37℃培养了16~20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD₆₀₀达到0.3~0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10~15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。

转化：无菌状态下取100~120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3~4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

质粒的小量制备：挑取平板上的单菌落，接种于2-3ml LB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5mlEP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I[50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II[0.2M NaOH，1％SDS]200μl，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III[5M乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H₂O28.5ml]150μl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚：氯仿：异戊醇500μl，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。

重组质粒的酶切鉴定：取3μl质粒DNA与适量的双蒸水混匀，使其总体积为15μl，加入2-3U限制性内酶EcoR I及2μl相应的10X限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。

(4)DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。

2.物理定位：

用于物理定位的实验材料

用猪×啮齿类体细胞杂种板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)进行染色体区域定位，用美国Minnesota大学共同构建的猪辐射杂种板(INRA-Minnesota porcine radiation hybridpanel，IMpRH)进行染色体精确定位，两套体细胞杂种板均由由法国Martin Yerle博士(Laboratoire deGénétique Cellulaire，INRA，Castanet-Tolosan，France)惠赠。

其中SCHP包括27个体细胞杂种细胞系，1~19号是猪×仓鼠体细胞杂种细胞系，20~27号是猪×小鼠体细胞杂种细胞系，并以仓鼠、小鼠和猪基因组DNA作为阳性对照(Yerle等，1996)。经细胞遗传学鉴定该杂种板保留了猪的除Y染色体外的全部18条常染色体以及X染色体，其中含有127个非重叠的染色体区域，各细胞系中所包含的猪染色体及染色体片段信息可从WWW(http：//www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)获得。

IMpRH使用的辐射剂量是7,000-rad。IMpRH包括118个猪×仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照，用757个标记的鉴定结果表明IMpRH中的平均标记存留率为29.3％，包含有128个连锁群，覆盖了18对常染色体及X染色体，用于估计标记间距离的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理论分辨率是145kb。

(3)PCR分型条件

进行扩增的PCR反应总体积为15μl，其中模板DNA为20ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃ 3min，循环35次94℃ 30s，61℃ 30s，然后72℃ 30s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.PCR-RFLP诊断方法建立

(1)引物序列

5’-TGAAAAGAAGAAGGGGGAAG-3’(正向，如序列表SEQ ID：3所示)，

5’-GTAAGCATTGCGGATCTCCA-3’(反向，如序列表SEQ ID：4所示)

该引物扩增片段长度1030bp。

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃ 4min，然后循环35次94℃ 40s，62℃ 45s，72℃ 1min，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是15μl，其中1×buffer 1.5μl，PCR产物3~5μl，限制性内切酶SphI为0.5μl(5U)，用H₂O补足15μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

4、标记性状关联分析

试验猪群是一个商业大白猪群，190个DNA样品用于基因型检测。

5.PCR-SSCP方法建立

(1)引物序列5’-TGCCTTCGGCCAGGATTGAG-3’(正向，在序列表SEQ ID：5所示)，

5’-ACTAGCTGCCGATAATCACC-3’(反向，在序列表SEQ ID：6所示)

该引物扩增片段长度219bp。

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.3μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃ 4min，然后循环35次94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)SSCP检测PSME1基因C802-G802的多态性

a中性聚丙稀酰胺凝胶的制备

聚丙烯酰胺凝胶的配制：10％，20cm×20cm，1mm薄胶，每板胶约需35mL胶液。

双蒸水： 22mL

40％胶贮存液： 9mL

10×TBE缓冲液： 3.5mL

10％AP溶液： 200μL

将以上溶液于烧杯中混合均匀，在临灌胶前加入20μL TEMED，加速聚合反应。

b.PCR产物变性

取4μL经2％琼脂糖电泳验证过的PCR产物与6μL变性缓冲液于0.2mL PCR管中混合均匀，置PCR仪上100℃变性8min。变性结束后立即将PCR管置冰水中冰浴，防止DNA单链复性。

c上样、电泳

凝胶聚合后拔掉梳子，用注射器吸取1×TBE缓冲液冲洗梳孔，以除去未聚合的胶液，使样品容易沉降。组装好电泳设备，用1％的琼脂糖胶液封闭好玻板与电泳槽之间的缝隙，防止电泳缓冲液渗漏。在上下缓冲槽中倒入足量1×TBE电泳缓冲液，于100V恒压下预电泳10min。用50μL微量进样器将变性的PCR产物缓缓注入梳孔，并点上未变性的PCR产物作为对照。上样完毕后开启电泳电源，在110V-120V恒压下电泳12-15小时，直至二甲苯青电泳指示条带迁移到凝胶底部。

d凝胶染色

电泳完毕，取下玻板，小心地将凝胶从玻板上剥离下来，立即将浸入10％乙醇溶液固定20min。固定完毕，用双蒸水短暂洗涤凝胶(换水两次，每次1分钟)。接着将凝胶浸泡入0.1％的硝酸银溶液中染色，在摇床上避光轻柔振荡30min。染色结束后用双蒸水快速冲洗凝胶两次(每次10s)，洗去凝胶表明残留的硝酸银溶液。在染胶盒中倒入含3％Na2CO3和微量甲醛的显色液，立即快速地晃动胶盒，避免析出的黑色银颗粒在凝胶表面沉积。显色液颜色变暗时立即更换新鲜的显色液。注意观察显色情况，目的条带显现清晰后立刻将凝胶转入3％的乙酸溶液，浸泡10min停显。

本发明的效果

1、猪PSME1基因全长cDNA的克隆

3’和5’RACE扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物(如图2所示)。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示3’RACE产物长度为914bp，5’RACE产物长度为634bp。

将此两个片段用GeneTool软件的ASSEMBLY程序进行拼接，得到了PSME1基因的全长cDNA，长度为1039bp(图3所示)。将这段cDNA序列在GenBank中进行同源性检索，检索结果该序列与人PSME1基因cDNA(GenBank收录号：NM226263)的同源性达90％，序列分析表明该cDNA序列具有750bp(nt122-872)的开放阅读框，编码一个由249个氨基酸组成的蛋白质。

2、猪PSME1基因的定位

SCHP克隆板PCR分型结果表明，19个猪×中国仓鼠体细胞杂种细胞系(1-19号)中，10，11，12，16号出现与猪基因组DNA阳性对照扩增一致的188bp的目的片段，而在8个猪×小鼠体细胞杂种细胞系(20-27号)中，21，23，25，27号杂种细胞系均扩增得到188bp的目的片段。将上述实际观测的PCR分型数据提交给HybWeb(http：//www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)进行统计分析以获得区域定位信息，数据分析结果是PSME1基因定位于猪7号染色体上(P＝1.000)，进一步的区域定位结果为SSC7 q12-q23或者SSC7 q26(P＝0.4494，P＜0.1％)。

用IMpRH克隆板对PSME1进行精确定位。统计分析结果表明PSME1基因定位于SSC7 q12-q23，与猪7号染色体上的TCRA(T细胞受体α)基因紧密连锁，LOD值为10.58，RH图距是0.39Ray。

3、PCR-RFLP诊断方法建立

用引物扩增猪基因组DNA得到了1030bp特异性扩增片段，包括部分外显子5和和部分外显子10序列以及完整的内含子6.7.8.9.10的DNA序列(详见图4)。序列分析结果表明在740bp处存在1个SphI酶切位点(GCATG↓C)，在741处存在T741-C741的突变。当741处为C时，该基因座由B等位基因控制(740bp+290bp两个片段)，当741处为T时，该基因由A等位基因控制(只有1030bp一个片段)，这两个等位基因可组成三种基因型AA，AB，BB。

4、标记性状关联分析

对猪PSME1基因SphI-RFLP多态性位点基因型检测结果表明在190个个体中AA基因型有10个，AB基因型有62个个体，BB基因型有118个个体。在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状是初生重、断奶重和170日龄屠宰时的背膘厚。基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表1。关联分析结果表明，AA与AB基因型猪的断奶重呈极显著差异(P＜0.01)，AA与BB基因型猪，以及AB型与BB型猪的断奶重呈显著差异(P值分别为0.047和0.013)。

表1：不同PSM1基因SphI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

基因型个体数初生重断奶重背膘厚

Genotypes N Birth weight Weaning weight Backfat thickness

(kg) (kg) (mm)

Psme1-SphI AA 10 1.50±0.16 11.57±1.51 11.01±1.40

BB 118 1.47±0.24 10.11±1.64 11.25±1.94

AB 62 1.59±0.27 10.66±1.42 11.17±2.09

P-value AA-AB 0.30 0.008 0.32

AA-BB 0.44 0.047 0.38

AB-BB 0.28 0.013 0.39

5.PCR-SSCP方法建立

用引物扩增猪基因组DNA得到了219bp特异性扩增片段，对该片段进行PCR-SSCP分析.对电泳带型有差异的个体进行不同PCR反应、不同批次电泳的重复实验，选取差异可重复的代表个体进行PCR产物直接测序，将双向测序峰图用DNAstar5.01的seqMan软件比较，结果表明在序列表SEQ ID No.2的802处，找到变异位点(C/G)。由测序结果可知：存在两种纯合子，GG纯合子和CC纯合子和一种杂合子GC型。

序列表、附图及其说明：

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪断奶重PSME1基因的全长cDNA序列；

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的猪断奶重PSME1基因的DNA序列；

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的用PCR-RFLP检测猪断奶重PSME1基因多态性的引物序列；

序列表SEQ ID NO：4是本发明克隆的用PCR-RFLP检测猪断奶重PSME1基因多态性的引物序列。

序列表SEQ ID NO：5是本发明克隆的用PCR-SSCP检测猪断奶重PSME1基因的引物序列；

序列表SEQ ID NO：6是本发明克隆的用PCR-SSCP检测猪断奶重PSME1基因的引物序列。

图1：是本发明的技术流程图

图2：是5’和3’RACE的琼脂糖凝胶电泳图谱。

琼脂糖胶浓度为1.2％。1泳道：3’RACE产物，长度为914bp；2泳道：5’RACE产物，长度为634bp；M泳道：DNA分子量标记(100-1000bp ladder)

图3：是猪PSME1基因全长cDNA序列和推导的氨基酸序列。起始密码子和终止密码子用加黑字母表示，引物的序列用方框显示，Poly(A)信号用下画线表示，推导的氨基酸用单字母符号写在密码子的下面。

图4：是猪PSME1的基因组DNA序列。

阴影部分分别为外显子5，6，7，8，9，10。空白区域分别为内含子6，7，8，9，10。5’-和3’拼接位点的两个保守核苷酸(GT/AG)用黑体标出，引物的位置用方框显示。

具体实施方式

实施例1

PCR-RFLP-Sph I多态性在3个猪品种中的分布情况

(1)引物序列：5’-TGAAAAGAAGAAGGGGGAAG-3’(正向，如序列表SEQ ID：3所示)，

5’-GTAAGCATTGCGGATCTCCA-3’(反向，如序列表SEQ ID：4所示)

(2)PCR扩增条件：PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶。扩增程序：94℃ 4min，然后循环35次94℃ 40s，62℃ 45s，72℃ 1min，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)RFLP检测条件：酶切反应体积是15μl，其中1×buffer 1.5μl，PCR产物3~5μl，限制性内切酶Sph I为0.5μl(5U)，用H2O补足15μl，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

表2 PCR-RFLP-Sph I多态性在3个猪品种中的分布

基因型等位基因频率

品种个体数

AA AB BB A B

杜洛克 21 0 0 21 0 1

藏猪 25 1 14 10 0.32 0.68

二花脸 25 0 6 19 0.12 0.88

根据表2的基因型和基因频率的结果显示，在所检测的3个猪品种中，都是B等位基因占优势。

实施例2：

我们用建立起的PCR-RELP诊断方法，对一个大白猪群190个DNA样品进行PSME1-RFLE-SphI的基因型检测。

检测结果表明在190个个体中AA基因型有10个，AB基因型有62个个体，BB基因型有118个个体。在与断奶重的关联分析中，基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表4。关联分析结果表明，AA与AB基因型猪的断奶重呈极显著差异(P＜0.01)，AA与BB基因型猪，以及AB型与BB型猪的断奶重呈显著差异(P＜0.05)。

表3：不同PSME1基因SphI-RFLP基因型与断奶重的关联分析

基因型Genotypes 个体数N 断奶重Weaning weight(kg)

Psme1-SphI AA 10 11.57±1.51

BB 118 10.11±1.64

AB 62 10.66±1.42

P-value AA-AB 0.008

AA-BB 0.047

AB-BB 0.013

实施例3：

用如前所述的基因诊断方法检测108头通城猪的基因型和仔猪断奶重的关系。通城猪的基因型和仔猪断奶重的关系见表5。

表4通城猪的基因型和仔猪断奶重的关系

基因型个体数断奶重(kg)

Psme1-SphI AA 2 10.69±1.35

BB 82 9.36±1.58

AB 24 10.21±1.40

P-value BB-AB 0.032

在本例中，由于只检测出2例AA型的猪，所以在做关联分析时，我们将AA型忽略不计，只对BB-AB型的断奶重做了T检验。结果表明，AB和BB型猪的断奶重呈显著差异，与前面得出的结果是一致的。

实施例4：

PCR-RFLP-Sph I多态性在小梅山，大白和清平猪的分布情况

表5 PCR-RFLP-Sph I多态性在3个猪品种中的分布

基因型等位基因频率

品种个体数

AA AB BB A B

梅山 32 8 21 3 0.5781 0.4219

大白 12 0 3 9 0.125 0.875

东北民猪 42 13 19 10 0.5357 0.4643

清平猪 47 17 23 7 0.6064 0.3936

小梅山，东北民猪和清平猪都是中国地方猪种，它们都是A等位基因占优势，大白猪是欧洲猪种，B等位基因占优势。

实施例5：

PCR-SSCP检测猪断奶重PSME1基因的C802-G802突变的多态性

表6 PCR-SSCP检测猪断奶重PSME1基因的C802-G802突变的多态性

基因型等位基因频率

品种个体数

CC CG GG C G

梅山 22 5 13 4 0.5228 0.4772

大自 12 0 0 12 0 1

东北民猪 42 8 21 13 0.4405 0.5595

二花脸 22 0 4 18 0.0909 0.9091

藏猪 36 7 19 10 0.4583 0.5417

清平猪 25 17 7 1 0.82 0.18

在上述6个猪群中就上述变异位点按照经测序验证的差异代表的电泳条带模式统计群体的等位基因频率。T检验说明该变异位点在猪群中存在着变异。

序列表(猪断奶重)SEQUENCE LISTING

<110>华中农业大学

<120>猪断奶重PSME1基因及其制备方法

<130>

<141>2003-08-26

<150>02139235.8

<151>2002-11-01

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1039

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1039)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(872)..(1039)

<223>

<220>

<221>polyA_signal

<222>(989)..(994)

<223>

<220>

<221> CDS

<222>(122)..(871)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(121)

<223>

<400>1

acgcgggaag cagtggtatc aacgcagagt acgcgggggc ggggagcgag cgctgctttc 60

gctttccctt ccctgtgccc actcctcgct ccgcgtgtga cgctaggccc cctccccggc 120

c atg gcc gcg ctc agg gtc cag ccc gaa gcc caa gcc aag gtc gat gtg 169

Met Ala Ala Leu Arg Val Gln Pro Glu Ala Gln Ala Lys Val Asp Val

1 5 10 15

ttc cgt gaa gac ctg tgt acc aag aca gag aac cta ctc ggg agc tat 217

Phe Arg Glu Asp Leu Cys Thr Lys Thr Glu Asn Leu Leu Gly Ser Tyr

20 25 30

ttc ccc aag aag att tct gag ttg gat gca ttt tta aag gag cca gct 265

Phe Pro Lys Lys Ile Ser Glu Leu Asp Ala Phe Leu Lys Glu Pro Ala

35 40 45

ctc aat gaa gcc aac ctg agc aat ctg aag gcc cca ttg gac att cca 313

Leu Asn Glu Ala Asn Leu Ser Asn Leu Lys Ala Pro Leu Asp Ile Pro

50 55 60

gtg cct gat ccg gtc aag gag aaa gag aag gag gaa agg aag aaa cag 361

Val Pro Asp Pro Val Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Arg Lys Lys Gln

65 70 75 80

cag gag aag gaa gac aaa gat gaa aag aag aag ggg gaa gat gag gat 409

Gln Glu Lys Glu Asp Lys Asp Glu Lys Lys Lys Gly Glu Asp Glu Asp

85 90 95

aaa ggt cct ccc tgt ggc cca gtg aac tgc aat gag aag atc gtg gtc 457

Lys Gly Pro Pro Cys Gly Pro Val Asn Cys Asn Glu Lys Ile Val Val

100 105 110

ctt ctg cag cgc ctg aag cct gag atc aag gat gtc att gag cag ctc 505

Leu Leu Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Lys Asp Val Ile Glu Gln Leu

115 120 125

aac ctg gtt acc acc tgg ttg cag ctg cag ata cct cgg att gaa gac 553

Asn Leu Val Thr Thr Trp Leu Gln Leu Gln Ile Pro Arg Ile Glu Asp

130 135 140

ggt att aat ttt gga gtg gct gtc cag gag aag gtt ttc gag ctg atg 601

Gly Ile Asn Phe Gly Val Ala Val Gln Glu Lys Val Phe Glu Leu Met

145 150 155 160

acc gcc ctt cac acc aaa ctg gaa ggc ttc cac act caa atc tcc aag 649

Thr Ala Leu His Thr Lys Leu Glu Gly Phe His Thr Gln Ile Ser Lys

165 170 175

tat ttc tct gag cgg ggc gat gct gtg gcc aaa gca gct aag cag cct 697

Tyr Phe Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Ala Lys Ala Ala Lys Gln Pro

180 185 190

cac gtg ggt gat tat cgg cag cta gtg cac gag ctg gat gag gca gag 745

His Val Gly Asp Tyr Arg Gln Leu Val His Glu Leu Asp Glu Ala Glu

195 200 205

tac cgg gat atc cgg ctg atg gtc atg gag atc ctc aat gct tac gct 793

Tyr Arg Asp Ile Arg Leu Met Val Met Glu Ile Leu Asn Ala Tyr Ala

210 215 220

gtg tta tat ggc atc atc ctg aag aac ttt gag aaa ctc aag aag cct 841

Val Leu Tyr Gly Ile Ile Leu Lys Asn Phe Glu Lys Leu Lys Lys Pro

225 230 235 240

agg gga gaa aca aaa ggc atg atc tat tga gagcctcccc tccttctgtg 891

Arg Gly Glu Thr Lys Gly Met Ile Tyr

245

atgggtccag cagaccttcc tgacttttac tggggactcc aggctttccc caccttctgc 951

ctgttgaggt ttctccctca ccttgcctct caggcacaat aaatatagtc gtaccgttaa 1011

aaaaaagaaa aaaaaaaaaa aaaaaagt 1039

<210>2

<211>249

<212>PRT

<213>猪(Sus scrofa)

<400>2

Met Ala Ala Leu Arg Val Gln Pro Glu Ala Gln Ala Lys Val Asp Val

1 5 10 15

Phe Arg Glu Asp Leu Cys Thr Lys Thr Glu Asn Leu Leu Gly Ser Tyr

20 25 30

Phe Pro Lys Lys Ile Ser Glu Leu Asp Ala Phe Leu Lys Glu Pro Ala

35 40 45

Leu Asn Glu Ala Asn Leu Ser Asn Leu Lys Ala Pro Leu Asp Ile Pro

50 55 60

Val Pro Asp Pro Val Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Arg Lys Lys Gln

65 70 75 80

Gln Glu Lys Glu Asp Lys Asp Glu Lys Lys Lys Gly Glu Asp Glu Asp

85 90 95

Lys Gly Pro Pro Cys Gly Pro Val Asn Cys Asn Glu Lys Ile Val Val

100 105 110

Leu Leu Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Lys Asp Val Ile Glu Gln Leu

115 120 125

Asn Leu Val Thr Thr Trp Leu Gln Leu Gln Ile Pro Arg Ile Glu Asp

130 135 140

Gly Ile Asn Phe Gly Val Ala Val Gln Glu Lys Val Phe Glu Leu Met

145 150 155 160

Thr Ala Leu His Thr Lys Leu Glu Gly Phe His Thr Gln Ile Ser Lys

165 170 175

Tyr Phe Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Ala Lys Ala Ala Lys Gln Pro

180 185 190

His Val Gly Asp Tyr Arg Gln Leu Val His Glu Leu Asp Glu Ala Glu

195 200 205

Tyr Arg Asp Ile Arg Leu Met Val Met Glu Ile Leu Asn Ala Tyr Ala

210 215 220

Val Leu Tyr Gly Ile Ile Leu Lys Asn Phe Glu Lys Leu Lys Lys Pro

225 230 235 240

Arg Gly Glu Thr Lys Gly Met Ile Tyr

245

<210>3

<211>1030

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1011)..(1030)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(944)..(1030)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(813)..(867)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(651)..(718)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(497)..(565)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(150)..(257)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(1)..(32)

<223>

<220>

<221>variation

<222>(802)..(802)

<223>

<220>

<221>variation

<222>(741)..(741)

<223>

<400>3

tga aaa gaa gaa ggg gga aga tga gga taa ag gtatcattgt ggtggaaggg 52

Lys Glu Glu Gly Gly Arg Gly Arg

1 5

atttgcatct tacctcccag gagttccttc ctaaggatgc ctcttccctg cccctcacag 112

ccccagccat gtgactgacc cagtgtccac ctcttag g tcc tcc ctg tgg ccc 165

Ser Ser Leu Trp Pro

10

agt gaa ctg caa tga gaa gat cgt ggt cct tct gca gcg cct gaa gcc 213

Ser Glu Leu Gln Glu Asp Arg Gly Pro Ser Ala Ala Pro Glu Ala

15 20 25

tga gat caa gga tgt cat tga gca gct caa tct ggt gag ccc tc 257

Asp Gln Gly Cys His Ala Ala Gln Ser Gly Glu Pro Ser

30 35 40

ctcgttctac tccctgattt cagatcaaac cctttgtcct cctttgtcca tgccagttag 317

ggcatggcac ctgccagctc tttacaggcg agggcacaac aagtgaagcc agaataccct 377

ggggctccga acagacctga catacttctc cccactgtgg tcagagaaac aaagaaggac 437

aggaacctgg gatttggggc ggggactaat ggggctttga tgccattcct tcctcccag 496

g tta cca cct ggt tgc agc tgc aga tac ctc gga ttg aag acg gta ata 545

Leu Pro Pro Gly Cys Ser Cys Arg Tyr Leu Gly Leu Lys Thr Val Ile

45 50 55

att ttg gag tgg ctg tcc ag gtgagagtgc taccccactc tcctgccttc 595

Ile Leu Glu Trp Leu Ser Arg

60

cttctctctc cagtccatgc tgtcttccac ttcccccctt gctttctttc cccag g 651

aga agg ttt tcg agc tga tga ccg ccc ttc aca cca aac tgg aag gct 699

Arg Arg Phe Ser Ser Pro Pro Phe Thr Pro Asn Trp Lys Ala

65 70 75

tcc aca ctc aaa tct cca a gtgagtgact tgcacccgca tgctcctgcc 748

Ser Thr Leu Lys Ser Pro

80

ttcggccagg attgaggcca gggctccctc ctcctcccac tccacaccct tctccttccc 808

acag gt att tct ctg agc ggg gcg atg ctg tgg cca aag cag cta agc 856

Ser Ile Ser Leu Ser Gly Ala Met Leu Trp Pro Lys Gln Leu Ser

90 95

agc ctc acg tg gtaggtgagg cctaggtcag ggtgcatggg aggagggaca 907

Ser Leu Thr Trp

100

cctttgaagt cagggcgtga cccgtgtctc ccacag g gtg att atc ggc agc tag 962

Val Ile Ile Gly Ser

105

tgc acg agc tgg atg agg cag agt acc ggg ata tcc ggc tga tgg tca 1010

Cys Thr Ser Trp Met Arg Gln Ser Thr Gly Ile Ser Gly Trp Ser

110 115 120

tgg aga tcc gca atg ctt ac 1030

Trp Arg Ser Ala Met Leu

125

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<400>4

tgaaaagaag aagggggaag 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<400>5

gtaagcattg cggatctcca 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer bind

<222>(1)..(20)

<223>

<400>6

tgccttcggc caggattgag 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<400>7

actagctgcc gataatcacc 20

Claims

1、猪断奶重PSME1基因，它的全长cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

2、根据权利要求1所述的基因，它的基因组DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所述。

3.、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：所获得的PSME1基因cDNA全序列为1039bp，其中包含如附图3所述的750bp的开放阅读框，121bp的5’非翻译区和168bp的3’非翻译区。

4、.根据权利要求2所述的DNA序列，其特征在于：序列表SEQ ID NO：2的第741位碱基处有一个碱基突变C741-T741，导致SphI-RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism)多态性。

5.根据权利要求2所述的DNA序列，其特征在于：序列表SEQ ID NO：2的第802位碱基处有一个碱基突变C802-G802，没有导致酶切位点的变化。

6.权利要求2所述的基因，检测741位碱基处碱基突变C741-T741的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO：3和序列表SEQ ID NO：4所述。

7.权利要求2所述的基因，检测802位碱基处碱基突变C802-G802的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO：5和序列表SEQ ID NO：6所述

8、制备如权利要求1或2所述的cDNA序列的方法，其特征按照以下步骤：

(1)用人PSME1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后对EST进行拼接；设计5’和3’RACE(RapidAmplification of cDNA ends)引物；提取猪脾脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录；RACE的PCR扩增和RACE产物的纯化克隆和测序、通过序列分析获得如序列表SEQID No.1的序列；

(2)制备如权利要求2所述的DNA序列的方法，其特征按照以下步骤：从猪血液基因组提取DNA，以猪PSME1基因cDNA序列为模板设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

9、应用PCR-RFLP的方法检测猪PSME1基因的多态性。