CN1488757A - 人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，具体涉及一种人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒及其制备方法和应用。本发明应用RT－PCR方法，扩增人VEGF121cDNA基因片段，构建VEGF121cDNA完整转录单元，与重组复制缺陷型腺病毒表达载体重组，获得腺病毒表达载体质粒，转染宿主细胞制备人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒。动物实验证实其在缺血性疾病的防治中有良好的作用，具有促进缺血区侧支循环的建立、改善缺血区血流灌注的功能。可用于缺血性疾病的防治。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种重组人血管内皮细胞生长因子121重组腺病毒及其制备方法和应用。
背景技术
血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是一类特异性促进血管内皮细胞增殖并增加血管通透性的细胞因子，在血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)中起重要作用，在缺血性疾病的治疗方面有潜在的临床价值。VEGF也是实体肿瘤生长和转移的关键因子，其功能一旦被抑制，肿瘤生长将受抑制。
人VEGF是由两条糖蛋白链形成的同源二聚体，由于基因转录水平剪切方式不同，VEGF至少有5种亚型，VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，其中VEGF121和VEGF165功能最强且以可溶性蛋白形式分泌于细胞外，VEGF121没有亲肝素及硫酸乙酰肝素的特性，外源给予VEGF121更有利于其扩散，显示更强的活性(Neufeld G，et al.FASEBJ，1999，13(1)：9-22，Mack C A，et al.J Thorac Cardiovasc Surg，1998，115(1)：168-177)。鉴于VEGF生物半衰期短，体内易降解的药代动力学特性，用VEGF cDNA基因治疗代替VEGF蛋白质治疗具有很强的现实意义(Isner J M.Nature，2002，415(6868)：234-239，Hammond H K，et al.Cardiovascular Research，2001，49(3)：561-567)。
由于腺病毒可感染非分裂期细胞，对靶细胞的高感染性和低病源性，能高效介导基因转移及表达，易纯化，适于原位注射，感染细胞后基因组不整合至宿主细胞基因组中，具有致癌、致突变几率小等优点，在缺血性疾病的基因治疗中被认为是理想的基因转移载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种人血管内皮细胞生长因子121重组腺病毒及其制备方法，包括制备能表达具有生物活性的VEGF121 cDNA基因；与穿梭质粒载体重组；与重组复制缺陷型腺病毒表达载体重组；用该载体转染宿主细胞；培养该宿主细胞；以及宿主细胞出现细胞病变效应(CPE)后分离纯化Adeno-X-VEGF121。
本发明应用基因工程及细胞工程方法对Adeno-X-VEGF121进行生产，所得产品具有高效的基因转移效率。利用所述重组腺病毒介导VEGF121 cDNA基因体外转移促进人脐静脉血管内皮细胞株ECV304增殖，促进毛细血管管腔样结构形成。体外表达产物能分泌至培液上清，并显示强烈血管通透作用。本发明采用的腺病毒载体系统，包装出的腺病毒中野生型腺病毒含量低、基因转移效率高、成本低，并且制备工艺简便。
本发明还提供Adeno-X-VEGF121在治疗缺血性疾病中的应用。
本发明从HeLa细胞中分离总RNA，用RT-PCR的方法克隆VEGF121cDNA基因，并引入信号肽及Kozak序列。引入信号肽以使VEGF121分泌至细胞外，引入Kozak序列以提高VEGF121 cDNA基因表达水平。本发明VEGF121 cDNA基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示。获得的cDNA与质粒pUC19重组，核苷酸序列分析验证cDNA基因。然后与穿梭质粒载体重组，引入启动子和加尾信号序列，形成VEGF121 cDNA完整转录单元。本发明不限于特定的穿梭质粒载体。在一优选实施方案中，本发明使用含CMV启动子和BGH PolyA加尾信号元件的穿梭质粒载体pShuttle。VEGF121 cDNA完整转录单元与重组复制缺陷型腺病毒表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的腺病毒表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用ΔE1ΔE3复制缺陷型腺病毒表达载体，例如pAdeno-X等。
上述重组复制缺陷型腺病毒表达载体按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明所涉及的宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达E1A基因，能够提供E1A反式作用因子从而包装成腺病毒。在一优选实施方案中，本发明使用人胚胎肾细胞株HEK293细胞。
本发明在宿主细胞出现细胞病变效应(CPE)后，进行细胞裂解、梯度离心、透析分离纯化Adeno-X-VEGF121。
以上技术方法中所有基本分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》(第二版，科学出版社，1992)，基本细胞学操作均参照《细胞培养实验指南》(第一版，科学出版社，2001)。
具体实施方式
实施例1
设计、制备Adeno-X-VEGF121
(1)克隆VEGF121 cDNA基因、构建重组腺病毒表达质粒pAdeno-X-VEGF121。
按照hVEGF121的氨基酸顺序，设计引物序列，上游引物引入Kozak序列。采用RT-PCR的方法扩增该基因并与pUC19重组，转化大肠杆菌JM109，提取质粒，核苷酸序列分析证实基因序列正确。然后将VEGF121cDNA基因切出，并与穿梭质粒载体重组，形成VEGF121cDNA完整转录单元，构建质粒pShuttle-VEGF121。转化大肠杆菌JM109，抽提质粒并做相应的限制性内切酶酶切分析，获得特征性片段，证实获得阳性克隆。pShuttle-VEGF121经PI-SceI和I-CeuI双酶解后，与复制缺陷型腺病毒表达载体pAdeno-X重组，经PCR筛选证实获得阳性克隆pAdeno-X-VEGF121。
本发明所采用的限制性内切酶购自NEB公司，大肠杆菌JM109购自Promega公司，质粒pUC19购自Q-BIOgene公司，pShuttle、pAdeno-X质粒和HEK293细胞株购自Clontech公司。
(2)制备重组腺病毒粗提液
HEK293细胞在10％FBS的DMEM培养液、37℃、5％CO2环境中培养至50％-70％融合度时，脂质体介导下将PacI线性化的pAdeno-X-VEGF121转染HEK293细胞，具体方法参照GeneJammerTM TransfectionReagent说明书进行，3h后换成含5％FBS的DMEM培养液，培养10-14d，利用HEK293细胞中E1A蛋白，包装出重组腺病毒，出现细胞病变效应(CPE)，细胞核大，细胞粘附力降低，多数呈现串珠状。将出现病变的细胞吹下，反复冻融三次，得重组腺病毒粗提液，备用。
本发明所采用DMEM、胎牛血清(FBS)购自Gibco BRL公司；GeneJammerTM Transfection Reagent购自Stratagene公司
(3)单个噬斑纯化病毒
HEK293细胞接种于6孔板中，至80％融合度时，加入重组腺病毒粗提液，37℃感染2h，弃去病毒液，加入1.25％ SeaPlaque琼脂糖半固体培养基，室温30min使其凝固，培养10d后挑取单个噬斑，重新感染HEK293细胞，反复扩增，制备重组腺病毒，取1μl病毒液，PCR扩增、鉴定。结果显示Adeno-X-VEGF121有370bp特异性条带。本发明所采用SeaPlaque琼脂糖购自BMA公司。
(4)扩增及纯化Adeno-X-VEGF121
重组腺病毒大量扩增，分别进行不连续CsCl梯度离心(CsCl密度分别为1.4g/ml和1.2g/ml)和连续CsCl梯度离心(CsCl密度为1.3g/ml)，然后透析去除CsCl，保存于腺病毒保存缓冲液(10mM Tris，4％Sucrose.，2mM MgCl2，pH 8.0)。
(5)滴度测定Adeno-X-VEGF121
按噬斑分析法测定Adeno-X-VEGF121滴度。
实施例2
重组腺病毒介导VEGF121 cDNA体外转移与表达(1)体外转移促进人脐静脉血管内皮细胞株ECV304增殖作用
用含10％小牛血清的DMEM培养液，在37℃、5％CO2条件下传代培养ECV304细胞，经PBS漂洗、胰酶消化，用含2％小牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，接种到24孔板继续培养。24h后，吸弃培液，分别感染重组腺病毒Adeno-X-VEGF121(5、20、80、160、320PFU/细胞)及Adeno-X-LacZ(5、20PFU/细胞)，另设未感染对照组，感染24h后换为含2％小牛血清的DMEM培养液，6-7天后加入MTT，酶标仪测定A570的值，计算细胞生存率，方差统计分析Adeno-X-VEGF121感染组与Adeno-X-LacZ感染组及未感染组差异。结果显示：小牛血清降至2％后，ECV304生长受抑制，此时，重组腺病毒Adeno-X-VEGF121(5、20、80、160PFU/细胞)感染组ECV304细胞生存率与Adeno-X-LacZ感染组及未感染组有统计学差异(P＜0.01)，Adeno-X-VEGF121(320PFU/细胞)感染组由于感染复合指数(MOI)太高导致细胞高死亡率，细胞生存率与Adeno-X-LacZ感染组及未感染组没有统计学差异(P＞0.05)，Adeno-X-VEGF121(20PFU/细胞)感染组ECV304细胞显示最佳生长状态及最高生存率。
(2)体外转移促进毛细血管管腔样结构形成
于96孔板中加入ECMatrixTM50μl，37℃固化，分别加入Adeno-X-VEGF121(20PFU/细胞)和Adeno-X-LacZ(5PFU/细胞)感染48h后的ECV304细胞及其上清，另设未感染对照组，37℃、5％ CO2培养24h后，结果显示，加入Adeno-X-VEGF121感染过的ECV304细胞及其上清组有明显毛细血管管腔形成，而加入Adeno-X-LacZ感染过的ECV304细胞及其上清组和未感染对照组无明显毛细血管管腔形成，表明本发明重组腺病毒介导VEGF121 cDNA基因体外转移能促进毛细血管管腔样结构形成。
本发明所采用ECMatrixTM购自Chemicon公司。
(3)检测VEGF121 cDNA体外表达产物
用含10％小牛血清的DMEM培养液，在37℃、5％ CO2条件下传代培养ECV304细胞，经PBS漂洗、胰酶消化，用含2％小牛血清的DMEM培养液将ECV304细胞制成细胞悬液，接种到24孔板继续培养24h后，吸弃培液，分别感染重组腺病毒Adeno-X-VEGF121(20PFU/细胞)及Adeno-X-LacZ(5PFU/细胞)，另设未感染对照组，感染24h后换为含2％小牛血清的DMEM培养液，24h后收集上清，ELISA检测上清中VEGF121含量。结果显示Adeno-X-VEGF121感染组ECV304细胞培液上清有VEGF121，时相曲线见感染后7-10d VEGF121 cDNA表达达峰值，约20ng·mL-1·104cell-1·day-1，而Adeno-X-LacZ感染组和未感染组上清均检测不到VEGF121，表明VEGF121 cDNA基因获得表达。
本发明所采用VEGF ELISA kit购自R&D公司。
(4)VEGF121 cDNA体外表达产物的血管通透作用
用含10％小牛血清的DMEM培养液，在37℃、5％ CO2条件下传代培养ECV304细胞，经PBS漂洗、胰酶消化，用含2％小牛血清的DMEM培养液将ECV304细胞制成细胞悬液，接种到24孔板继续培养24h后，吸弃培液，分别感染重组腺病毒Adeno-X-VEGF121(20PFU/细胞)及Adeno-X-LacZ(5PFU/细胞)，另设未感染对照组，感染24h后换为含2％小牛血清的DMEM培养液，96h后收集上清，备用。
取雄性健康豚鼠3只，足趾静脉注射伊文氏蓝染液20mg/kg，背部皮内注射上述上清各400μl，10min后观察蓝斑范围，结果显示，皮内注射Adeno-X-VEGF121感染组上清后，显示很强血管通透作用，伊文氏蓝染液从注射点附近外渗，形成蓝色斑块；而皮内注射Adeno-X-LacZ感染组和未感染组上清后，均显示微弱血管通透作用，表明VEGF121 cDNA体外表达产物能分泌到培养液上清中，且具有生物学活性。
实施例3
Adeno-X-VEGF121治疗实验性缺血性疾病
应用本发明所制备的Adeno-X-VEGF121进行缺血性疾病动物模型实验，
(1)促进兔缺血后肢侧支血管形成
成年、雄性新西兰兔结扎髂外动脉远端，切除股总动脉，造成下肢闭塞性血管病模型，10天后治疗组肌肉注射Adeno-X-VEGF1211.0X108PFU，阴性对照组肌肉注射Adeno-X-LacZ 1.0×108PFU或生理盐水，给药14天后行血管造影检查。血管造影结果显示Adeno-X-VEGF121治疗组新生血管明显多于对照组，侧支循环的建立优于对照组。
(2)促进小型猪缺血心肌侧支血管形成
小型猪行胸廓切开术后将Ameroid constrictor套于冠状动脉回旋支(LCX)近端做成慢性心肌缺血模型，3周后治疗组心肌注射Adeno-X-VEGF1211.0×108PFU，阴性对照组肌肉注射Adeno-X-LacZ 1.0×108PFU或生理盐水，给药4周后行SPECT显像和冠状动脉造影，检测LCX分布区局部心肌灌注、左心室运动功能及冠状动脉侧支血管形成情况。结果显示Adeno-X-VEGF121治疗组明显改善局部心肌灌注与运动功能，新生血管明显多于对照组，侧支循环的建立优于对照组。
动物实验证实Adeno-X-VEGF121在缺血性疾病的防治中有良好的作用，具有促进缺血区侧支循环的建立、改善缺血区血流灌注的功能。
无需进一步详细阐述，采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。所有这些变更和改进均包括在所附权利要求的保护范围之内。
附图说明
图1是本发明所制备Adeno-X-VEGF121 PCR鉴定结果。
其中1：DNA Marker 2，3：Adeno-X-VEGF121 4：Adeno-X-LacZ
图2是本发明所制备重组腺病毒介导VEGF121 cDNA基因体外转移促进ECV304增殖作用。
其中A：Adeno-X-VEGF121感染组；B：Adeno-X-LacZ感染组；C：未感染组；D：统计结果。
图3是本发明所制备重组腺病毒介导VEGF121 cDNA基因体外转移促进毛细血管管腔样结构形成。
其中A：Adeno-X-VEGF121感染组；B：Adeno-X-LacZ感染组；C：未感染组。
图4是本发明所制备重组腺病毒介导VEGF121 cDNA基因体外表达产物ELISA检测结果。
图5是本发明所制备重组腺病毒介导VEGF121 cDNA基因体外表达产物血管通透作用。
人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒及其制备方法和应用SEQ
SEQUENCE LISTING<110>复旦大学<120>人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒及其制备方法和应用<130><160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>452<212>DNA<213>Human<400>1ccaccatgaa ctttctgctg tcttgggtgc attggagcct tgccttgctg ctctacctcc60accatgccaa gtggtcccag gctgcaccca tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg120aagtggtgaa gttcatggat gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg180tggacatctt ccaggagtac cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc240ccctgatgcg atgcgggggc tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg300agtccaacat caccatgcag attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag360agatgagctt cctacagcac aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcgagac420aagaaaaatg tgacaagccg aggcggtgat aa452
Claims (16)
1.人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒，其特征是具有SEQ ID NO：1的序列。ccaccatgaa ctttctgctg tcttgggtgc attggagcct tgccttgctg ctctacctcc 60accatgccaa gtggtcccag gctgcaccca tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg 120aagtggtgaa gttcatggat gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg 180tggacatctt ccaggagtac cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc 240ccctgatgcg atgcgggggc tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg 300agtccaacat caccatgcag attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag 360agatgagctt cctacagcac aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcgagac 420aagaaaaatg tgacaagccg aggcggtgat aa 452
2.权利要求1的血管内皮细胞生长因子重组腺病毒的制备方法，其特征在于采用下列步骤：
(1)分离总RNA，用RT-PCR的方法克隆VEGF121 cDNA基因；
(2)在VEGF121 cDNA基因上游引入信号肽及Kozak序列；
(3)与穿梭质粒载体重组，引入启动子和加尾信号序列，形成VEGF121cDNA完整转录单元；
(4)完整转录单元与腺病毒表达载体重组，形成重组腺病毒表达质粒；
(5)用上述重组腺病毒表达载体转染宿主细胞；
(6)裂解宿主细胞，分离和纯化重组腺病毒；
(7)生物学方法鉴定重组腺病毒。
3、根据权利要求2所述的方法，其中所述分离总RNA不限于特定的细胞或组织，只要它含hVEGF121mRNA。
4、根据权利要求2所述的方法，其中所述分离总RNA来源于HeLa细胞。
5、根据权利要求2所述的方法，其中所述构建VEGF121cDNA完整转录单元不限于特定启动子和加尾信号序列。
6、根据权利要求2所述的方法，其中所述构建VEGF121cDNA完整转录单元中启动子为CMV、加尾信号序列为BGH PolyA。
7、根据权利要求2所述的方法，其中所述腺病毒表达载体为复制缺陷型腺病毒表达载体。
8、根据权利要求2所述的方法，其中所述的复制缺陷型腺病毒表达载体为ΔE1ΔE3复制缺陷型腺病毒表达载体。
9、根据权利要求7所述的方法，其中所述的ΔE1ΔE3复制缺陷型腺病毒表达载体为pAdeno-X。
10、根据权利要求2所述的方法，其中所述的宿主细胞只要能够表达E1A基因。
11、根据权利要求2所述的方法，其中所述的宿主细胞为HEK293人胚胎肾细胞株。
12.根据权利要求2所述的方法，其中Adeno-X-VEGF121终产物是通过裂解细胞、不连续CsCl梯度离心、连续CsCl梯度离心和透析四步法纯化而获得。
13.根据权利要求2所述的方法，其特征为所述的生物学鉴定方法包括重组复制缺陷型腺病毒介导VEGF121 cDNA基因体外转移促进血管内皮细胞增殖、迁移和分化。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述的血管内皮细胞不限于特定种属血管内皮细胞，只要Adeno-X-VEGF121能促进其增殖、迁移和分化。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述的血管内皮细胞为人脐静脉血管内皮细胞。
16.人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒在制备治疗缺血性疾病药物中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN104073517A (zh) * | 2013-03-28 | 2014-10-01 | 卫生部北京医院 | p66Shc重组腺病毒载体及构建和应用 |
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2003
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