CN1465712A - 一种预测acei类降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种预测降压药药效的试剂盒、方法和复方药，特别用于通过测定功能基因多态性位点基因型，来预测ACEI类降压药药效的方法及其应用。该试剂盒包括组成包括：引物(Primer)；限制性内切酶NcoI和限制性内切酶缓冲液4。方法为通过测定受试者的ADRB2基因Arg16Gly多态性位点的基因型，可定性预测ACEI类降压药药效。当把基因型检测结果作为参数，结合其他基本生理参数和特殊参数通过计算机语言运算后，可得到预测结果更为精确的血压下降的定量值。该方法可应用于制造至少两类药效提高的ACEI类降压药。本发明便于医生在用药时根据个体差异进行选择，提高了临床用药和治疗的效率与安全性，降低了发生毒副作用和经济负担的风险。
Description
技术领域
本发明涉及一种预测降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药，特别用于通过测定功能基因多态性位点基因型，来预测ACEI类降压药药效的方法及其应用。
背景技术
高血压病是我国和全球最常见的慢性疾病之一，是引起严重的心血管病如心肌梗塞、脑卒中，以及肾脏疾病等的主要原因。高血压病在我国患病率为11％，目前已有一亿多患者，每年增加约300万新发病人。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类降压药，是临床控制高血压最常用的一类药物。它主要通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统中ACE酶的活性来发挥降压药效。
现有各类降压药的降压效果并不理想，单一用药的有效率约为60-70％，并且个体差异性大。这主要是由于缺少可预测药物疗效的指示系统，所以医生在用药时无从根据个体差异进行选择，相对降低了临床用药、治疗的效率和安全性，增加了发生毒副作用和经济负担的风险。
本发明的原理如下：一、血压调节的机制及降压药物调控作用：
肾素-血管紧张素-醛固酮系统在血压调节及高血压发病中都有重要的作用。血管紧张素I转化酶(ACE)是该通路一调控血压的、具有关键生物学意义的活化酶。体内血管紧张素原在肾素作用下，转化成血管紧张素I，再经血管紧张素转化酶(ACE)的作用，生成血管紧张素II，血管紧张素II可引起血管强烈收缩、刺激醛固酮分泌，引起血管收缩和水钠潴留，导致血压升高。血管紧张素II还可引起心肌肥厚、血管增生及血管壁中层增厚等。
血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类降压药，主要通过抑制ACE的活性，扩张血管，减少醛固酮的分泌，发挥降压作用。
苯那普利是一种非巯基长效ACE抑制剂，每日仅需口服一次，常用剂量为5-80mg，临床广泛用于治疗轻、中度高血压病。(Moser M，Abraham PA，Bennett WM，et al.，Theeffects of benazepril，a new angiotensin-converting enzyme inhibitor，in mild to moderate essentialhypertension：a multicenter study.Clin Pharmacol Ther 1991，49(3)：322-9)。其他ACEI类临床常用药还包括：卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、西拉普利(dilazapril)、贝那普利(benazepril)、培哚普利(perindopril)、雷米普利(ramipril)、福辛普利(fosinopril)等。二、本发明发现的人类ADRB2基因多态性Gly16Arg对ACEI类抗高血压药物药效的预测作用：
人类ADRB2基因编码一种广泛分布于体内各组织中的G蛋白藕联的受体(β2肾上腺素受体)，该受体在激动剂作用下可引起血管扩张，支气管扩张和脂肪分解等广泛的生理学效应。ADRB2基因存在几种改变ADRB2受体功能的单核苷酸多态性的模式(Reihsaus E，Innis M，MacIntyre N，Liggett SB.Mutations in the gene encoding for the beta 2-adrenergicreceptor in normal and asthmatic subjects.Am J Respir Cell Mol Biol 1993；8(3)：334-9)。其中ADRB2基因Gly16/Arg16多态位点是编码该蛋白的16位密码子由甘氨酸替代了精氨酸。
研究中发现，人类β2-肾上腺素受体(ADRB2)基因Gly16Arg多态性与ACEI类降压药的作用密切相关。对轻、中度两组的高血压人群服用ACEI类降压药(苯那普利、卡托普利)后舒张压的降压效果进行分析，结果有相同的趋势：Gly16/Gly16(GG)纯合突变型的降压效果最好，Gly16/Arg16(GR)杂合子的降压效果次之，Arg16/Arg16(RR)纯合野生型的降压效果最差。同时，在获知ADRB2基因Gly16Arg多态性位点的基础上，结合获得的生理参数或其它特征参数，可以定量预测ACEI类抗高血压药物的降压幅度。
由此，可将ADRB2基因的基因型作为预测ACEI类抗高血压药物的指示系统。不仅可以指示并定性和定量地预测ACEI类降压药的药效，而且可以指示ADRB2活性功能状态，由此指导复方降压药物的研发。三、用ADRB2基因Gly16Arg多态性位点预测ACEI类抗高血压药物药效与指导复方降压药物研发的原理：
一种预测ACEI类降压药药效的方法的应用，该应用为指导抗高血压复方药物的研发；通过测定受试者的ADRB2基因Arg16Gly多态性位点基因型，预测ADRB2受体的活性，在复方药物中加入作用于ADRB2受体而改变其活性的化合物，从而调节ACEI类降压药药效。
依据本发明中人β2-肾上腺素受体(ADRB2)基因Gly16Arg多态性与苯那普利药效密切相关的特征，不同个体中苯那普利降压效果依ADRB2 Gly16Arg多态性基因型GG、GR、RR顺序递减。此外，对中国仓鼠卵巢细胞和人体主要平滑肌细胞的体外研究显示，与表达Arg16等位基因的细胞相比，表达ADRB2基因中的Gly16等位基因的细胞能增强ADRB2活性下调功能。根据上述原理、动物实验和临床观察等依据，可根据ADRB2 Gly16Arg多态性基因型设计出调节ADRB2功能的可增强ACEI药效的复方药，因此ADRB2基因多态性检测结果可以应用到以下两种情况：
(1)当RR基因型时，以下机制将可以应用在指导研发ACEI类药与ADRB2激动剂制成复合降压新药，将会提高ACEI类药物的降压药效，原理如下：
ADRB2与血管紧张素II受体间存在交互作用，血管紧张素II受体与ADRB2可能共同竞争血管平滑肌细胞表面β-arrestin。动物实验资料表明，在大鼠心肌内此基因与人脑中该基因有88.0％的同源性，第16位均为Gly，第27位均为Glu；Arg16-Gly可加剧受体的下调，而Gln-27-Glu则使下调降低。据此推测，特别对RR基因型的人将有显著的作用，ADRB2受体激动剂与ACEI联用，可提高ACEI的降压药效。
(2)当GG或RG基因型时，以下机制将可以应用在指导研发ACEI类药与β2-肾上腺素受体拮抗剂制成复合降压新药，将会提高ACEI类药物的降压药效，原理如下：
单独应用ACEI治疗高血压会导致血浆中血管紧张素I和肾素含量增高，同时血管紧张素I含量的增加可能会激发一种称为Chymase的糜蛋白酶将血管紧张素I转换成血管紧张素II，导致血管紧张素II在血浆或局部组织内含量增加，降低ACEI的降压药效，若将ACEI联用β受体拮抗剂可以降低血浆中肾素的含量，使得血管紧张素原转换成血管紧张素I的量减少，进而使血管紧张素II的量下降。因而使用β受体阻滞剂可能会影响ACEI的降压药效。
发明内容
解决的技术问题
为提高临床用药的个体选择性，提高药物疗效，减少毒副作用的发生，本发明提供了一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药，通过测定受体基因多态性位点基因型来预测和改善ACEI类降压药的药效。技术方案
为实现上述发明目的，采取以下技术方案：
一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒，通过测定ADBR2功能基因多态性位点预测降压药药效，其组成包括：引物(Primer)；限制性内切酶NcoI和限制性内切酶缓冲液4，还可包括PCR缓冲液(PCR buffer)、耐热DNA聚合酶(Taq)和脱氧三磷酸单核苷酸(dNTP)。
所述引物(Primer)的序列为：上游引物：ADRB2 5′GCCTTCTTGCTGGCACCCCAT3′；下游引物：ADRB2 5′CAGACGCTCGAACTTGGCCATG3′。该引物为人工设计并采用寡核苷酸合成仪合成。G/C比例合理，正反链的退火温度接近，扩增片段内只有该酶(NocI)酶切位点，特异性强。
一种预测ACEI类降压药药效的方法，该方法通过测定受试者的ADRB2基因Arg16Gly多态性位点的基因型，预测ACEI类降压药药效。
所述测定ADRB2 Arg16Gly多态位点基因型中包括下述步骤：
(1)提取宿主细胞的基因组DNA；
(2)使用聚合酶链式反应扩增ADRB2功能基因；
(3)限制性内切酶消化；
(4)电泳检测ADRB2 Arg16Gly多态位点基因型；
所述预测药效中，按检测基因类型预测ACEI类降压药药效：
基因型为Gly16/Gly16纯合突变型时，ACEI类降压药药效的降压幅度最大；基因型为Gly16/Arg16杂合子时ACEI类降压药药效的降压幅度次之；基因型为Arg16/Arg16纯合野生型时ACEI类降压药药效的降压幅度最少。
一种预测ACEI类降压药药效的软件，在测定ADRB2功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序运算实现以下步骤：(1)获取ADBR2功能基因型参数和基本生理参数：年龄、体重、性别、身高、基础SBP和基础DBP；(2)进行如下运算：Y0(ΔSBP)＝(1.60*杂合突变+2.41*纯合突变)+(0.26*年龄-0.15*体重+0.02*身高-1.86*性别+0.35*基线SBP)-18.0；Z0(ΔDBP)＝(024*杂合突变+1.47*纯合突变)-(0.13*年龄+0.08*体重+0.02*身高+1.60*性别-0.38*基线DBP)-14.3。(3)根据运算结果定量预测ACEI类降压药药效。
一种改善ACEI类降压药药效的复方药，在测定ADRB2基因多态性位点基因型的基础上改善ACEI类降压药的疗效，该复方药包括ACEI类降血压药物，和β2肾上腺素受体激动剂或拮抗剂。有益效果
本发明提供了利用功能基因预测ACEI类抗高血压药物疗效的一种试剂盒、一套方法和一套软件，可作为ACEI类降压药药效的指示系统，通过测定功能基因ADRB2Arg16Gly多态位点基因型，预测ACEI类降压药疗效；还可将基因型作为参数结合基本生理参数和特殊参数通过计算定量地预测ACEI类降压药的药效，提高预测精度；便于医生在用药时根据个体差异进行选择，提高了临床用药和治疗的效率与安全性，降低了发生毒副作用和经济负担的风险。本发明通过测定基因型，还可以指导新药研发至少形成两类ACEI类复合新药，特别对于目前治疗效果不佳的患者，提供了更好的选择。总之，应用这类(种)功能基因多态性的发明成果，对今后更加经济有效地指导抗高血压药物的临床选药、预测用药疗效和指导新药研制具有产业与服务的应用价值。
附图说明
图1为ADRB2基因型分析琼脂糖凝胶电泳图谱
具体实施方式实施例1：使用试剂盒预测ACEI类降压药药效
一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其成分包括：
A液：PCR缓冲液(PCR buffer)，成分为KCL、Tris-HCl及MgCl2；
B液：脱氧三磷酸单核苷酸(dNTP)；
C液：引物(Primer)，由寡核苷酸合仪合成；
D液：耐热DNA聚合酶(Taq)；保存温度为-20℃；
E液：限制性内切酶NcoI；保存温度为-20℃；
F液：限制性内切酶缓冲液4，成分为Tris-醋酸、醋酸镁、醋酸钾、和二硫苏糖醇。
该试剂盒中的引物的序列为：
上游引物：ADRB2 5′GCCTTCTTGCTGGCACCCCAT3′；
下游引物：ADRB2 5′CAGACGCTCGAACTTGGCCATG3′。
使用本试剂盒预测ACEI类降压药药效的步骤如下：(1)扩增目的基因片段：10μl PCR反应体系中加入基因组DNA 20ng，A液1ul，B液1.6ul，C液0.2ul，D液0.05ul；按如下条件进行PCR反应：95℃ 5-15min，
72℃ 7～15min。(2)限制性内切酶消化：按如下体积将反应物混合，置37℃恒温箱保温4小时以上：
PCR产物 10ul
F液 1.5ul
E液 0.3ul
双蒸水 加至15ul(1×消化体积)(3)电泳检测ADRB2 Arg16Gly多态性位点基因型：
酶切后产物用3.5％的琼脂糖凝胶电泳，使用TAE电泳缓冲液，DNA Marker使用50bp或100bp DNA ladder(购自上海生物工程技术服务有限公司)，用量为1ug/孔，电压为250V，电泳时间为20～50分钟。电泳后的凝胶经溴化乙锭染色，在紫外分析仪下观察结果。
如图1所示，M为DNA marker，以其100bp和150bp片段的位置作为本发明检测结果的参照。本发明涉及的146bp和128bp两片段出现在上述两条参照条带之间。电泳结果只显示146bp片段的为纯合野生型Arg/Arg，如2、5；电泳结果显示146bp和128bp两片段的为杂合子Gly/Arg，如1、3、4、6、7、9；电泳结果只显示128bp片段的为纯合突变型Gly/Gly，如8。(4)预测药效：
基因型为Gly16/Gly16纯合突变型时，ACEI类降压药药效的降压幅度最大；
基因型为Gly16/Arg16杂合子时ACEI类降压药药效的降压幅度次之；
基因型为Arg16/Arg16纯合野生型时ACEI类降压药药效的降压幅度最少。实施例2：测定ADRB2受体多态性位点基因型并推测ACEI类降压药苯那普利的药效。(一)、测定ADRB2 Arg16Gly多态位点基因型：(1)提取宿主细胞的基因组DNA：(a)全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；(b)于4℃、2000转离心/分10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟。将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml已装入75％乙醇的滤纸上，使液体挥发干。(e)加DNA水化液1.5ml，置摇床，摇动过夜，备用；(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度；(2)使用PCR-RFLP方法扩增ADRB2功能基因：
用PCR仪扩增ADRB2功能基因，10ulPCR反应体系中含有基因组DNA20ng，1.5mmol/L MgCl2，20μmol/L dNTP，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，0.5U/μl Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，每一引物0.2μmol/L(0.1～0.4μmol/L均可)，引物的序列为：
上游引物：ADRB2 5′GCCTTCTTGCTGGCACCCCAT3′
下游引物：ADRB2 5′CAGACGCTCGAACTTGGCCATG3′
PCR反应条件如下：
95℃ 5-15min，
72℃ 7～15min。(3)PCR产物大小：168bp(4)限制性内切酶消化：(NocI购自上海生物工程技术服务有限公司)
PCR产物 10ul
酶切缓冲液4 1.5ul
限制性内切酶NcoI 0.3ul(5u/10ul)
双蒸水 3.2ul
混合后37℃恒温箱保温4-15小时以上。(5)电泳检测ADRB2 Arg16Gly多态位点基因型：
方法与结果同实施例1。(二)、预测药效：方法同实施例1。
以上方法通过两组临床观察进行验证，结果如下：
患者服用苯那普利后收缩压的降压幅度，A和B两组观察分析结果有相同的趋势，即Gly16/Gly16纯合子最多，Gly16/Arg16杂合子次之，Arg16/Arg16纯合子最少。将两组样本进行合并，也发现ADRB2基因的Gly16等位基因能增大服用苯那普利后收缩压的降压(dSBP)幅度且有统计学意义(p＝0.02)。患者服用苯那普利后舒张压降压幅度(dDBP)，仅在人群中也发现ADRB2基因的Gly16等位基因能增大服用苯那普利后舒张压的降压(dSBP)幅度这种趋势。结果见表1。
将对药物反应当作二分变量即以患者药物治疗后血压是否降为正常为标准将变量分为有效，无效两种(i.e.SBP＜140mmHg，DBP＜90mmHg)，进一步探讨了ARDB2R16G多态位点和药物药效的关系。结果见表2。
表1苯那普利治疗16天后高血压患者降压程度与ADRB2基因型的关系(相对降压效果)基 观 收缩压下降(mmHg) 舒张压下降(mmHg)因 察 均数 标准 关联 标准 P值 均数 标准 关联系 标准 P值
差 系数 误 差 数 误型 数A组RR§ 106 12.7 17.7 8.8 11.5GR 181 16.6 19.4 -3.4 2.0 0.099 12.1 13.4 2.7 1.4 0.054GG 91 17.4 16.7 -3.8 2.3 0.092 12.0 13.1 1.9 1.6 0.245B组RR§ 219 8.6 15.1 4.9 10.1GR 323 10.3 14.7 1.8 1.2 0.129 4.7 10.2 -0.4 0.8 0.629GG 103 11.0 15.3 2.9 1.7 0.088 6.2 10.5 1.2 1.1 0.310合并组RR§ 325 9.9 16.1 6.2 10.7GR 504 12.5 16.8 2.4 1.1 0.020 7.3 11.9 0.7 0.7 0.347GG 194 14.0 16.2 3.2 1.4 0.024 8.9 12.1 1.4 0.9 0.150
表2苯那普利治疗16天后高血压患者降压程度与ADRB2基因型的关系(降压至正常值效果)
SBP有效 DBP有效基 基础 用药后 ％ 优 95％可 P值 基础 用药后 ％ 优 95％可 P值
SBP SBP 信区 DBP DBP 信区因 势 势
≥140 ＜140 间 ≥90 ＜90 间型 比 比A组RR§ 194 72 37.1 1.00 - - 178 78 43.8 1.00 - -GR 289 111 38.4 0.99 0.6-1.5 0.966 253 113 44.7 1.07 0.7-1.6 0.737GG 91 43 47.3 1.56 0.9-2.8 0.141 84 45 53.6 1.47 0.8-2.6 0.178B组RR§ 99 31 31.3 1.00 - - 76 36 47.4 1.00 - -GR 169 70 41.4 1.88 1.0-3.4 0.038 1.50 90 60.0 1.93 1.1-3.5 0.033GG 83 34 41.0 1.61 0.8-3.2 0.174 79 51 646 2.06 1.0-4.1 0.040合并组RR§ 293 103 34.8 1.00 - - 254 114 44.9 1.00 - -GR 458 181 39.5 1.26 0.9-1.8 0.189 403 203 50.4 1.29 0.9-1.8 0.141GG 174 77 44.3 1.52 1.0-2.4 0.065 163 96 58.9 1.63 1.1-2.5 0.027实施例3：测定ADRB2基因多态性位点基因型并预测ACEI类降压药卡托普利的药效
方法同实施例2，在ACEI类药物卡托普利(captopril)的动物实验中观察到与苯那普利相似的结果。实施例4：测定ADRB2基因多态性位点基因型并预测ACEI类降压药福辛普利的药效
方法同实施例2，在ACEI类药物福辛普利(fosinopril)的动物实验中观察到与苯那普利相似的结果。实施例5、一种预测ACEI类降压药药效的软件
在测定ADRB2功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序运算实现以下步骤：(1)获取ADBR2功能基因型参数和基本生理参数：年龄、体重、性别、身高、基础SBP和基础DBP；(2)进行如下运算：Y0(ΔSBP)＝(1.60*杂合突变+2.41*纯合突变)+(0.26*年龄-0.15*体重+0.02*身高-1.86*性别+0.35*基线SBP)-18.0；Z0(ΔDBP)＝(0.24*杂合突变+1.47*纯合突变)-(0.13*年龄+0.08*体重+0.02*身高+1.60*性别-0.38*基线DBP)-14.3；(3)根据运算结果定量预测ACEI类降压药药效。
以上步骤(1)中的基因型参数值的取值方式如下：按测定的ADRB2基因多态性位点的基因型取值，当发生杂和突变时(GR型)，杂和突变参数取1，纯合突变参数取0；当发生纯合突变时(GG型)，杂和突变参数取0，纯合突变参数取1。
以上步骤(1)中的基本生理参数值的取值方式如下：年龄参数取实际年龄数值，单位为岁；体重参数取实际体重值，单位为公斤(kg)；性别参数为男取1，为女取2；身高参数取实际身高值，单位为米(m)；基础SBP参数为基础收缩血压值，单位为毫米汞柱；基础DBP参数为基础舒张血压值，单位为毫米汞柱。
经过步骤(2)的计算得出的Y0值为收缩压的变化量(毫米汞柱)，Z0值为舒张压的变化量(毫米汞柱)，通过这两个值可以定量地预测ACEI类降压药的药效。实施例6、一种预测ACEI类降压药药效的软件
在测定ADRB2功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序运算实现以下步骤：
步骤同实施例5，在步骤(1)中获取了基因型参数和基本生理参数之后，再获取特殊参数：现吸烟、既往吸烟、饮酒、教育、职业；在步骤(2)中进行运算之后，对Y0和Z0值进行如下校正计算：Y0(ΔSBP)＝(1.55*杂合突变+2.44*纯合突变)-(0.26*年龄+0.14*体重+0.003*身高+3.14*性别-0.35*基线SBP)-19.1Z0(ΔDBP)＝(0.19*杂合突变+1.42*纯合突变)-(0.14*年龄+0.08*体重+0.02*身高+2.04*性别-0.39*基线DBP)-15.0
校正后的Y0和再Z0进行如下运算：Y1(ΔSBP)＝Y0-0.62*现吸烟-1.24*既往吸烟-1.64*饮酒-0.38*教育-0.61*职业Z1(ΔDBP)＝Z0+1.04*现吸烟-0.34*既往吸烟-1.45*饮酒-0.79*教育-0.17*职业
以上步骤(1)中的特殊参数值的取值方式如下：现吸烟参数依受试者现在的吸烟情况取值，为是时取1，为否时取0；既往吸烟参数的取值同前述，为是时取1，为否时取0；饮酒参数依受试者的饮酒情况取值，为是时取1，为否时取0；教育参数依受试者受教育情况取值，为小学及以下时取0，为初中及以上时取1；职业依受试者所从事的职业情况取值，为农业时取0，为非农业时取1。其余参数的取值方式同实施例5。
将以上参数代入步骤(2)，经计算得出的Y1值为收缩压的变化量(毫米汞柱)，Z1值为舒张压的变化量(毫米汞柱)，通过这两个值可以定量地预测ACEI类降压药的药效，并且通过简单的询问方式获得现吸烟、既往吸烟、饮酒、教育、职业等特征参数，经计算得到的较实施例5更为精确的血压下预测降值。实施例7、一种预测ACEI类降压药药效的软件
在测定ADRB2功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序运算实现以下步骤：
步骤同实施例5，在步骤(1)中获取了基因型参数和基本生理参数之后，再获取特殊参数QTc；在步骤(2)中进行运算之后，对Y0和Z0值进行如下校正计算：Y0(ΔSBP)＝(1.67*杂合突变+2.58*纯合突变)-(0.27*年龄+0.15*体重+0.03*身高+2.18*性别-0.35*基线SBP)-13.1Z0(ΔDBP)＝(0.56*杂合突变+1.70*纯合突变)-(0.13*年龄+0.08*体重+0.06*身高+2.00*性别-0.38*基线DBP)-9.4
校正后的Y0和再Z0进行如下运算：Y2(ΔSBP)＝Y0-4.70QTcZ2(ΔDBP)＝Z0-0.53QTc
以上步骤(1)中的特殊参数值的取值方式如下：特殊参数QTc为心率校正Q-T间期，QTc＝QT/RR，其中QT为心电向量Q-T间期值，RR为R-R间期值。其余参数的取值方式同实施例5。
将以上参数代入步骤(2)，经计算得出的Y2值为收缩压的变化量(毫米汞柱)，Z2值为舒张压的变化量(毫米汞柱)，通过这两个值可以定量地预测ACEI类降压药的药效，并且可通过心电图客观测量结果获得特殊参数QTc，经计算可得到的较实施例5更为精确的血压下降预测值。实施例8、一种预测ACEI类降压药药效的软件
在测定ADRB2功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序运算实现以下步骤：
步骤同实施例6，在步骤(1)中获取了基因型参数、基本生理参数和特殊参数之后，再获取特殊参数QTc；在步骤(2)中进行运算之后，对Y1和Z1值进行如下校正计算：Y1(ΔSBP)＝(1.65*杂合突变+2.65*纯合突变)-(0.27*年龄+0.14*体重+0.02*身高+3.69*性别-0.35*基线SBP)-(0.59*现吸烟+1.86*既往吸烟+1.81*饮酒+0.61*教育+0.81*职业)-13.6Z1(ΔDBP)＝(0.49*杂合突变+1.64*纯合突变)-(0.14*年龄+0.08*体重+0.05*身高+2.47*性别-0.38*基线DBP)+(0.94*现吸烟-0.58*既往吸烟-1.55*饮酒-0.66*教育+0.06*职业)-10.0
校正后的Y1和再Z1进行如下运算：Y3(ΔSBP)＝Y1-5.9QTcZ3(ΔDBP)＝Z1-0.97QTc
QTc的取值方法同实施例7，其余参数的取值方式同实施例6。
将以上参数代入步骤(2)，经计算得出的Y3值为收缩压的变化量(毫米汞柱)，Z3值为舒张压的变化量(毫米汞柱)，通过这两个值可以定量地预测ACEI类降压药的药效，通过增加更多有预测意义的各项特殊参数，经计算得到较前述实施例5、或实施例6、或实施例7都更为精确的血压下降预测值。实施例9：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：苯那普利+沙丁胺醇
该复方药在测定ADRB2基因多态性位点基因型的基础上设计制造，改善ACEI类降压药的疗效。
沙丁胺醇是一种临床常用ADRB2激动剂，主要治疗呼吸系统疾病，尚未用于复方制剂治疗高血压。
具有RR基因型的二肾一夹型高血压大鼠的动物实验表明，苯那普利+沙丁胺醇复方药物，降压作用大于苯那普利药物组。实施例10：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：苯那普利+拉贝洛尔
该复方药在测定ADRB2基因多态性位点基因型的基础上设计制造，改善ACEI类降压药的疗效。
拉贝洛尔是一种临床常用ADRB2拮抗剂，尚未用于联合复方制剂治疗高血压。
非RR基因型的二肾一夹型高血压大鼠的动物实验表明，苯那普利+拉贝洛尔复方药物，降压作用大于苯那普利药物组。
序列表<110>安徽省生物医学研究所<120>一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药<130><160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1gccttcttgc tggcacccca t 21<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2cagacgctcg aacttggcca tg 22
Claims (22)
1、一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于通过测定ADBR2功能基因多态性位点预测降压药药效，其组成包括：引物(Primer)；限制性内切酶NcoI和限制性内切酶缓冲液4。
2、如权利要求1所述的一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于：所述引物(Primer)的序列为：
上游引物：ADRB2 5′GCCTTCTTGCTGGCACCCCAT3′
下游引物：ADRB2 5′CAGACGCTCGAACTTGGCCATG3′。
3、如权利要求1或2所述的预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR缓冲液(PCR buffer)和耐热DNA聚合酶(Taq)。
4、如权利要求3所述的预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括脱氧三磷酸单核苷酸(dNTP)。
5、如权利要求3所述的预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液的成分为KCL、Tris-HCl及MgCl2。
6、如权利要求3所述的预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于：所述限制性内切酶缓冲液4的成分为Tris-醋酸、醋酸镁、醋酸钾、和二硫苏糖醇。
7、一种预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：该方法通过测定受试者的ADRB2基因Arg16Gly多态性位点的基因型，预测ACEI类降压药药效。
8、如权利要求7所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：在所述预测药效中，按检测的基因型预测ACEI类降压药药效，基因型为Gly16Gly16纯合突变型时，ACEI类降压药药效的降压幅度最大；基因型为Gly16/Arg16杂合子时ACEI类降压药药效的降压幅度次之；基因型为Arg16/Arg16纯合野生型时ACEI类降压药药效的降压幅度最少。
9、如权利要求7所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述测定ADRB2Arg16Gly多态位点基因型中包括下述步骤：(1)提取宿主细胞的基因组DNA；(2)使用聚合酶链式反应扩增ADRB2功能基因；(3)限制性内切酶消化；(4)电泳检测ADRB2Arg16Gly多态位点基因型；
所述预测药效中，按检测基因类型预测ACEI类降压药药效：
基因型为Gly16/Gly16纯合突变型时，ACEI类降压药药效的降压幅度最大；基因型为Gly16/Arg16杂合子时ACEI类降压药药效的降压幅度次之；基因型为Arg16/Arg16纯合野生型时ACEI类降压药药效的降压幅度最少。
10、如权利要求9所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述聚合酶链式反应扩增ADRB2功能基因步骤中，引物的序列为：
上游引物：ADRB2 5′GCCTTCTTGCTGGCACCCCAT3′
下游引物：ADRB2 5′CAGACGCTCGAACTTGGCCATG3′。
11、如权利要求9所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述聚合酶链式反应扩增ADRB2功能基因步骤中，引物的浓度为0.1μmol/L～0.4μmol/L。
12、如权利要求9所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述聚合酶链式反应扩增ADRB2功能基因步骤中，PCR反应的反应条件为：
95℃ 5～15min
72℃ 7～15min。
13、如权利要求9所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述限制性内切酶消化步骤中，反应体系为：
PCR产物 8～10ul
限制性内切酶缓冲液 1～2ul
限制性内切酶NcoI 3～5u/个反应
双蒸水 加至总体积15ul。
14、如权利要求9所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述限制性内切酶消化步骤中，反应体条件为：37℃恒温箱保温4小时以上。
15、一种预测ACEI类降压药药效的软件，其特征在于：在测定ADRB2功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序运算实现以下步骤：(1)获取ADBR2功能基因型参数和基本生理参数：年龄、体重、性别、身高、基础SBP和基础DBP；(2)进行如下运算：Y0(ΔSBP)＝(1.60*杂合突变+2.41*纯合突变)+(0.26*年龄-0.15*体重+0.02*身高-1.86*性别+0.35*基线SBP)-18.0；Z0(ΔDBP)＝(0.24*杂合突变+1.47*纯合突变)-(0.13*年龄+0.08*体重+0.002*身高+1.60*性别-0.38*基线DBP)-14.3；(3)根据运算结果定量预测ACEI类降压药药效。
16、如权要求15所述的预测ACEI类降压药药效的软件，其特征在于：在步骤(1)中获取了基因型参数和基本生理参数之后，再获取特殊参数：现吸烟、既往吸烟、饮酒、教育、职业；在步骤(2)中进行运算之后，对Y0和Z0值进行校正计算，再进行如下运算：Y1(ΔSBP)＝Y0-0.62*现吸烟-1.24*既往吸烟-1.64*饮酒-0.38*教育-0.61*职业；Z1(ΔDBP)＝Z0+1.04*现吸烟-0.34*既往吸烟-1.45*饮酒-0.79*教育-0.17*职业。
17、如权利要求15所述的预测ACEI类降压药药效的软件，其特征在于：在步骤(1)中获取了基因型参数和基本生理参数之后，再获取特殊参数QTc；在步骤(2)中进行运算之后，对Y0和Z0值进行校正计算，再进行如下运算：Y2(ΔSBP)＝Y0-4.70QTc；Z2(ΔDBP)＝Z0-0.53QTc。
18、如权利要求16所述的预测ACEI类降压药药效的软件，其特征在于：在步骤(1)中获取了基因型参数、基本生理参数和特殊参数之后，再获取特殊参数QTc；在步骤(2)中进行运算之后，对Y1和Z1值进行校正计算，再进行如下运算：Y3(ΔSBP)＝Y1-5.9QTc；Z3(ΔDBP)＝Z1-0.97QTc。
19、一种改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于在测定ADRB2基因多态性位点基因型的基础上改善ACEI类降压药的疗效，该复方药包括ACEI类降血压药物，和β2肾上腺素受体激动剂或拮抗剂。
20、如权利要求19所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的ACEI类降压药为卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、西拉普利(cilazapril)、贝那普利(benazepril)、培哚普利(perindopril)、雷米普利(ramipril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、氯沙坦(losartan)、维沙坦(valsartan)中的一种或几种。
21、如权利要求19或20所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的β2肾上腺素受体激动剂为沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、丙卡特罗(procaterol)、福莫特罗(formoterol)、氯丙那林(clorprenaline)、沙美特罗(salmeterol)中的一种或几种。
22、如权利要求19或20所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的β2肾上腺素受体拮抗剂为普萘洛尔(propranolol)、拉贝洛尔(labetalol)、纳多洛尔(nadolol)、塞利洛尔(celiprolol)中的一种或几肿。
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