CN1463701A - 联苯双酯作为肿瘤多药耐药逆转剂的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及联苯双酯作为多药耐药逆转剂新用途，特别是与抗肿瘤药物合用治疗发生多药耐药的肿瘤，提高肿瘤细胞对抗癌药的敏感性的新用途。

Description

联苯双酯作为肿瘤多药耐药逆转剂的新用途

发明领域

本发明涉及联苯双酯作为多药耐药逆转剂的新用途，特别是与抗肿瘤药物合用治疗发生多药耐药的肿瘤，提高肿瘤细胞对抗肿瘤药的敏感性的新用途。

背景技术

联苯双酯是我国研究中药五味子的基础上发展起来的一种治疗慢性肝炎药，它是合成五味子丙素的一种中间体，化学名称为4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2，2’-二甲氧羰基联苯，结构式如下，

用没食子酸为原料，通过酯化、单甲基化、亚甲基二氧基衍生物的形成、溴化以及UIImann反应共5步反应便可合成。

联苯双酯片剂和滴丸对慢性肝炎有显著降谷丙转氨酶(SGPT)效果，对降低甲胎蛋白(α-FP)、残留黄疸以及转肽酶均有一定疗效，亦能提高白蛋白比例，以及改善肝炎主要症状，例如厌食、疼痛和肠胃气胀。从1981年开始，联苯双酯被中华人民共和国应用于治疗慢性肝炎，尤其是乙型肝炎及药物诱导性肝损伤。联苯双酯收载于1995年中华人民共和国药典。

联苯双酯用于治疗肝炎时可以为片剂或滴丸，滴丸口服后吸收率比片剂高1-2倍。

联苯双酯还具有一定的抗肿瘤作用，能够剂量依赖性的抑制肿瘤组织DNA和蛋白质的合成。此外，临床上联苯双酯还能够与甲氨喋呤、6-巯基嘌呤等抗肿瘤药合用，而减轻这些抗肿瘤药对肝脏的损害。

肿瘤细胞经过化疗后产生的获得性耐药以及某些肿瘤细胞本身具有内在耐药性是肿瘤化疗失败的重要原因之一。产生多药耐药的机制非常复杂，多药耐药糖蛋白P-gp的过度表达为主要机制，许多化疗药物都是该膜蛋白的底物，例如长春碱类、蒽环类、表鬼臼毒素类、紫杉烷类等。逆转肿瘤细胞的多药耐药性从而使肿瘤细胞恢复对化疗剂的敏感性具有非常重要的临床应用价值。迄今已经发现不少化合物在体外及体内动物实验中具有很强的逆转MDR作用，如包括维拉帕米的钙通道阻滞剂、钙调蛋白拮抗剂、环孢菌素类、喹啉类、抗雌激素类，然而运用到临床上，除对某些血液系统的肿瘤耐药有较为肯定的逆转作用外，对实体瘤耐药的逆转作用很不理想。一般认为，这些化合物在人体可耐受剂量下在体内不能达到有效的逆转浓度，而一旦加大剂量使其血药浓度达到体外试验中具有逆转活性的浓度时，就会产生严重的毒副作用，或者逆转剂与抗肿瘤药物合用时了改变抗肿瘤药物的药代动力学参数，从而产生不可预见的毒副反应。例如，本发明中作为阳性对照的维拉帕米，虽然在体外有很强的肿瘤耐药逆转活性，但是应用到体内却发现在未达逆转耐药浓度时就产生了严重的心血管毒性，因而限制了其在临床上应用为多药耐药逆转剂。所以，开发作用强且毒副作用小的多药耐药逆转剂仍然是研究的主要方向。

发明内容

本发明发现目前临床上广泛应用的治疗慢性肝炎药联苯双酯在体外、体内都具有逆转肿瘤多药耐药性的作用。

为了克服现有技术的不足之处，本发明的主要目的在于提供一种联苯双酯在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的新用途。

本发明的另一目的在于提供一种联苯双酯和抗肿瘤药物的联用。

所述的抗肿瘤药物包括为P-gp底物的抗肿瘤药物。所述的P-gp底物的抗肿瘤药物包括蒽环类、长春碱类、紫杉烷类、鬼臼类，以及米托蒽醌、放线菌素D、丝裂霉素C。所述的肿瘤包括具有P-糖蛋白过度表达的内在多药耐药性以及获得多药耐药性实体肿瘤和血液系统肿瘤。

因此，本发明涉及的联苯双酯可以用于预防和逆转肿瘤的多药耐药性。换言之，将含有联苯双酯的药物组合物向需预防和/或治疗的宿主给药。

本发明发现联苯双酯在体外、体内均有逆转肿瘤多药耐药性的作用。

在体外，联苯双酯能够逆转获得性多药耐药细胞株KBv200、MCF-7/Adr细胞对长春新碱(VCR)和阿霉素(Adr)的耐药性，联苯双酯还能够逆转KBv200细胞对紫杉醇和足叶乙甙(VP-16)的耐药性，但是对上述两种细胞各自的敏感细胞株没有影响。联苯双酯还能逆转具有内在多药耐药性细胞株Bel₇₄₀₂细胞对VCR和Adr的交叉耐药性。

KBv200细胞为人口腔上皮癌KB细胞经VCR筛选得到的多药耐药细胞株，对VCR和Adr的耐药性分别是敏感KB细胞的139和35倍。加入联苯双酯后，能逆转KBv200细胞对VCR和Adr的耐药性，并呈明显的剂量依赖关系。50μmol/L联苯双酯使KBv200细胞VCR的IC₅₀由3917nmol/L降至287nmol/L，逆转倍数为13.7倍，使Adr的IC₅₀由1055nmol/L降至70nmol/L，逆转倍数为15倍。而联苯双酯对KB细胞Adr和VCR的IC₅₀却没有影响。

KBv200细胞除对VCR和Adr耐药外，对紫杉醇和VP-16也有耐药性，其耐药倍数分别是KB细胞的137和11倍。联苯双酯同样能够剂量依赖性的逆转紫杉醇和VP-16的耐药性，在50μmol/L时逆转倍数分别为25.7和2.3。联苯双酯对紫杉醇和VP-16对KB细胞的敏感性也没有影响。

MCF-7/Adr细胞为人乳腺癌MCF-7细胞经Adr筛选得到的另外一种多药耐药细胞株，对VCR和Adr的耐药性分别是MCF-7细胞的4和89倍。加入联苯双酯后，能逆转MCF-7/Adr细胞的多药耐药性，并呈现明显的剂量依赖关系。50μmol/L联苯双酯使MCF-7/Adr细胞VCR的IC₅₀由2125nmol/L降至459nmol/L，逆转倍数为4.6倍，使Adr的IC₅₀由28750nmol/L降至3757nmol/L，逆转倍数为7.7倍。联苯双酯却不影响VCR和Adr对MCF-7细胞的敏感性。

由此可见，联苯双酯能够逆转肿瘤细胞的获得多药耐药性。对于具有内在多药耐药性的肿瘤细胞，联苯双酯也有一定的逆转作用，并且也具有明显的剂量依赖性。人肝癌Bel₇₄₀₂细胞株具有内在多药耐药性，联苯双酯使Bel₇₄₀₂细胞对VCR和Adr的敏感性增加，其中50μmol/L联苯双酯使Bel₇₄₀₂细胞VCR的IC₅₀由2147nmol/L降至279nmol/L，逆转倍数为7.7倍，使Adr的IC₅₀由516nmol/L降至152nmol/L，逆转倍数为3.4倍。

归纳以上结果，联苯双酯逆转多种肿瘤药物耐药的倍数见下表。

                                   逆转倍数细胞系       药物                  联苯双酯      (μmol/L)

                VPL(μmol/L)

                    50            25         12.5

                10KBv200       VCR        13.6       3.6    2.3    435.2

         Adr        15.1       4.8    2.3    14.5

         紫杉醇     25.7       6.3    3.0    61.4

         VP-16      2.3        2.1    0.6    4.4MCF-7/Adr    VCR        4.6        2.8    1.8    5.6

         Adr        7.7        5.0    1.9    25.2Bel₇₄₀₂      VCR        7.7        6.5    1.2    25.0

         Adr        3.4        2.5    1.8    8.7

注：耐药逆转倍数＝IC₅₀(抗肿瘤药)/IC₅₀(抗肿瘤药+受试逆转药)

体内实验表明，本发明的联苯双酯在动物体内同样表现出良好的逆转肿瘤多药耐药活性。我们用裸鼠建立了对VCR耐药的动物肿瘤模型，并且在同一只裸鼠左右腋下分别皮下种植对VCR敏感和耐药的移植性KB实体肿瘤。结果发现，单用VCR(0.4mg/Kg，每两天一次，共5次)，能够显著抑制敏感的KB移植性肿瘤的生长，与对照组相比抑瘤率为39％，但是对耐药的KBv200移植性肿瘤则几乎没有抑制作用(与对照组相比抑瘤率为1％)。联苯双酯口服，每天一次，共14次，能够显著增强VCR对KBv200移植性肿瘤的抑制作用，其中，150、300和500mg/Kg联苯双酯与VCR合用，抑瘤率分别为19％、36％和48％，但是对VCR对KB移植性肿瘤的抑制作用没有影响，说明联苯双酯与VCR合用，能显著增加耐药肿瘤对VCR的敏感性。测定各组裸鼠体重发现，治疗前后各组体重均没有明显下降，并且在给药过程中没有观察到任何毒副作用，说明联苯双酯与VCR合用治疗耐药肿瘤是安全而有效的。

本发明的进一步研究表明联苯双酯逆转肿瘤细胞多药耐药性的机理，是与抑制多药耐药糖蛋白(P-gp)的活性和表达密切关系。

Adr为蒽环类的抗肿瘤药，能够自发荧光，因此应用荧光分光光度计可以检测Adr的荧光强度，从而确定Adr的含量。耐药的MCF-7/Adr细胞和敏感的MCF-7细胞与10μmol/L Adr孵育3小时以后，MCF-7细胞内Adr的浓度是MCF-7/Adr细胞的4.4倍，说明耐药的MCF-7/Adr细胞Adr的外排增加或摄入减少，从而使得胞内Adr的含量下降。在给Adr的同时加入联苯双酯，并没有增加MCF-7细胞内Adr的浓度，但是在MCF-7/Adr细胞，50和25μmol/L联苯双酯与Adr合用使细胞内Adr的蓄积量显著增加，经统计分析有显著差异，其中50μmol/L联苯双酯使得Adr的浓度增加2倍以上。联苯双酯能够增加抗肿瘤药物在耐药肿瘤细胞内的蓄积从而具有逆转多药耐药的活性。

经典的肿瘤细胞多药耐药由P-gp介导，细胞膜上P-gp过度表达使得细胞内药物浓度下降，从而降低抗肿瘤药物的细胞毒作用，VCR、Adr、紫杉醇和VP-16都是P-gp的底物。P-gp过度表达是肿瘤细胞产生多药耐药的主要机制。耐药的KBv200、MCF-7/Adr以及Bel₇₄₀₂细胞都有P-gp的过度表达，所以应用免疫荧光细胞染色法检测联苯双酯对MCF-7/Adr细胞膜上P-gp表达的影响。流式细胞仪的结果发现MCF-7/Adr细胞膜上P-gp表达水平显著高于敏感的MCF-7细胞，当MCF-7/Adr与50μmol/L联苯双酯孵育24小时后，膜上P-gp的表达水平下降，说明联苯双酯能够抑制P-gp在耐药细胞膜上的过度表达。25μmol/L联苯双酯也有抑制P-gp表达的活性。激光共聚焦显微镜观察，发现MCF-7/Adr细胞膜上的荧光强度比MCF-7细胞强，当MCF-7/Adr与联苯双酯孵育后，膜上的荧光强度显著下降。表明联苯双酯逆转肿瘤多药耐药作用的机制是抑制了与多药耐药密切相关的P-gp蛋白的过度表达。

综上所述，联苯双酯逆转多药耐药的机制与抑制P-gp的活性和过度表达有关。联苯双酯能够增加耐药肿瘤细胞内抗肿瘤药的蓄积，并且能剂量依赖性的降低耐药肿瘤细胞膜上P-gp的表达水平。

根据本发明的实施方案，所述的联苯双酯还包括其药效学上可接受的盐、盐的水合物、酯或前体药物。

本发明因此还涉及含有作为活性成份的联苯双酯和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-90重量％的联苯双酯。

联苯双酯的药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将联苯双酯与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明的联苯双酯或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明联苯双酯组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明的联苯双酯可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。

为了将给药单元制成胶囊，将有效成分联苯双酯与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分联苯双酯制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明法的组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

最优选的给药剂型为滴丸或软胶囊。

本发明联苯双酯药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数等，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明联苯双酯组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的逆转肿瘤多药耐药的目的。通常对体重约75公斤患者，所给联苯双酯的日剂量为0.001mg/kg体重-100mg/kg体重，优选3mg/kg体重-30mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药这受限于给药医生的临床经验以及包括运用化疗、放疗手段的给药方案

附图说明

图1.DDB对敏感及耐药的MCF-7细胞内Adr蓄积的影响。

(■MCF-7细胞，□MCF-7/Adr细胞，^**：与单用Adr相比p＜0.01；^***：与单用Adr相比p＜0.001)

图2.流式细胞仪检测DDB对MCF-7/Adr细胞P-gp表达的影响(MCF-7/Adr细胞：—空白对照；—25μmol/L DDB；—50μmol/L DDB；—10μmol/L VPL；—MCF-7细胞)

图3.激光共聚焦显微镜观察DDB对MCF-7/Adr细胞P-gp表达的影响

(0：MCF-7/Adr细胞；1：MCF-7/Adr细胞+10μmol/L维拉帕米(VPL)；2：MCF-7/Adr细胞+50μmol/L DDB；3：MCF-7/Adr细胞+25μmol/L DDB；4：MCF-7细胞；5：MCF-7/Adr细胞，仅加二抗)

图4.DDB对VCR对裸鼠耐药的KBv200移植性肿瘤(A)以及敏感的KB移植性肿瘤(B)生长抑制作用的影响。

具体实施方式

下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1

取对数生长期的KB、KBv200、MCF-7、MCF-7/Adr、Bel₇₄₀₂、Bel₇₄₀₂/5-FU、L1210和L1210/cddp细胞，接种于96孔培养板(Coster)内，每孔分别含KB细胞1000个，KBv200细胞1500个，MCF-7细胞5000个，MCF-7/Adr细胞8000个，Bel₇₄₀₂细胞3500个，Bel₇₄₀₂/5-FU细胞5000个，L1210细胞2500个，L1210/cddp细胞4000个。培养24小时后，加入不同浓度的抗肿瘤药、逆转剂以及对照溶剂。继续培养72小时，弃去培养液，每孔加入0.5mg/ml MTT 100μl(用不含血清的RPMI 1640培养液稀释)，继续培养4小时，弃去MTT，每孔加入二甲基亚砜150μl，轻微振荡使沉淀溶解，于酶标仪(Bio-Red625型)570nm处测定吸光度。每组设三至四个复孔取其平均值，计算IC₅₀。以10μmol/L维拉帕米(VPL)作为阳性对照。

具体结果见表1-4。

表1.联苯双酯对KB以及KBv200细胞对Adr和VCR敏感性的影响

       浓度                     IC₅₀(nmol/L)药物       (μmol/L)      Adr                       VCR

                  KB      KBv200          KB        KBv200对照       0          30±9   1055±7         28±23    3917±325VPL        10         26±6   73±29          26±14    9±8联苯双酯   50         32±17  70±21          30±19    287±90

       25         29±9   219±66         24±12    1092±243

       12.5       29±3   461±41         30±6     1690±213

Adr和VCR的IC₅₀通过计算机中效分析软件计算得到，表示为三次以上独立试验得到的平均值±标准差。联苯双酯溶于二甲基亚砜，VPL溶于生理盐水。

表2.联苯双酯对KB以及KBv200细胞对紫杉醇和VP-16敏感性的影响药物        浓度                       IC₅₀

        (μmol/L)       紫杉醇(ng/ml)          VP-16(μmol/L)

                    KB           KBv200      KB          KBv200对照                    644.7±201.  4.53±2.11  0.43±0.24  4.7±0.3

                    2联苯双酯    2.5         268.7±148.  7.50±1.12  0.41±0.20  5.2±1.8

                    8

        25          127.5±84.6  2.14±0.42  0.31±0.13  4.5±0.7

        50          31.5±12.3   2.00±0.30  0.41±0.19  3.9±1.5VPL         10          13.2±0.7    1.04±0.18  0.28±0.05  6.3±1.8

紫杉醇和VP-16的IC₅₀通过计算机中效分析软件计算得到，表示为三次以上独立试验得到的平均值±标准差。联苯双酯溶于二甲基亚砜，VPL溶于生理盐水。

表3.联苯双酯对MCF以及MCF-7/Adr细胞对Adr和VCR敏感性的影响

        浓度                         IC₅₀(nmol/L)药物        (μmol/L)             Adr                           VCR

                     MCF-7        MCF-7/Adr    MCF-7     MCF-7/Adr对照        0            323±13      28750±7000  487±130  2125±290VPL         10           333±25      1142±492    219±41   380±49联苯双酯    50           380±74      3757±1000   470±6    459±21

        25           348±261     5720±891    539±14   759±296

        12.5         373±310     14967±851   283±198  1170±42

表注说明同表1

表4.联苯双酯对Bel₇₄₀₂细胞对Adr和VCR敏感性的影响

     药物    浓度             IC₅₀(nmol/L)

             (μmol/L    Adr                  VCR

             )

     对照    0           516±58              2147±189

     VPL     10          59±4.2              86±7

  联苯双酯    50      152±26    279±73

              25      203±11    328±16

              12.5    285±55    1805±276

表注说明同表1

实施例2

取对数生长期的MCF-7以及MCF-7/Adr细胞，以相同的细胞数接种数瓶，待细胞铺满瓶底的70-80％时，更换含Adr 10μmol/L的RPMI 1640培养液，并加入终浓度分别为50、25、12.5μmol/L联苯双酯，以10μmol/L VPL为阳性对照，每组设三个平行样品，37℃、5％C0₂继续培养3小时，用冰冷的PBS(pH7.4)洗三遍终止反应。收集细胞，取一定数量细胞，用1.2ml盐酸(0.3N)-乙醇(50％)悬浮细胞，并于超声波仪上打碎细胞后，10,000rpm离心15分钟，取上清液1.0ml加入2.0ml上述盐酸-乙醇溶液，测定Adr的荧光值，Ex为470nm，Em为580nm，用Adr含量-荧光度标准曲线计算10⁶个细胞中Adr的含量。结果见图1。

实施例3

收集对数生长期的MCF-7细胞以及与联苯双酯或VPL孵育24小时的MCF-7/Adr细胞，PBS洗三次后，在100％的甲醇中于-20℃固定10分钟，PBS洗涤后加入10％小牛血清/1％牛血清白蛋白(BSA)/PBS，室温封闭30分钟，然后加入1∶25稀释的单抗JSB-1，37℃孵育1.5小时，PBS洗涤后，再加入1∶50稀释的FITC标记的二抗，37℃孵育1小时，用PBS彻底清洗细胞后，流式细胞仪计10,000个细胞，测定平均荧光值。结果见图2。

实施例4

取对数生长期的MCF和MCF-7/Adr细胞接种于洁净灭菌的单凹载玻片上，37℃，5％CO₂培养过夜，MCF/Adr细胞加入联苯双酯或VPL培养24小时，PBS洗三次后，用冷丙酮固定10分钟，PBS洗细胞三次后，用10％小牛血清室温封闭20分钟，加入1∶20稀释的单抗JSB-1，37℃湿盒内孵育1.5小时，PBS洗细胞三次后，再加入1∶50稀释的FITC标记的二抗，37℃孵育1小时，用PBS彻底清洗细胞后，共聚焦激光扫描显微镜(MERIDIAN^TM Ultima 212型)观察P-gp荧光显色的部位和荧光强度。结果见图3。

实施例5

建立KB和KBv200裸鼠移植性肿瘤模型。无菌条件下，收集KB或KBv200细胞，稀释于生理盐水中，每只裸鼠皮下接种1×10⁸个于腋下，待肿瘤长至直径约1cm时，在无菌条件下选择生长良好的瘤块切成约30～40mm³的小块，用套管针接种到裸鼠的腋下以进行KB或KBv200移植性肿瘤的传代。

进行联苯双酯体内逆转肿瘤耐药实验时，取生长良好的KB肿瘤切成小块，接种到裸鼠的左腋下，再取生长良好的KBv200肿瘤切成小块，接种到同一只裸鼠的右腋下。待接种的KB以及KBv200肿瘤增殖到直径为7-15mm时(大约两周)随机分组给药，此时为第1天，每组7~8只。共分7组，空白对照组：不做任何处理；仅给VCR组：VCR 0.4mg/Kg，第二天开始腹腔注射(i.p.)，每两天一次，共5天；VCR+聚乙二醇400组：聚乙二醇400，第一天开始口服，每天一次，连续14天，VCR给法同仅给VCR组；仅给联苯双酯组：联苯双酯500mg/Kg，第一天开始口服，每天一次，连续14天；VCR+联苯双酯150mg/Kg、VCR+联苯双酯300mg/Kg和VCR+联苯双酯500mg/Kg组：联苯双酯150mg/Kg、300mg/Kg以及500mg/Kg，第一天开始口服，每天一次，连续14天，VCR给法同仅给VCR组，聚乙二醇400以及各剂量的联苯双酯口服体积为5ml/Kg，并且与VCR腹腔注射的时间间隔为3小时。VCR以及VPL溶于无菌生理盐水，联苯双酯溶于聚乙二醇400。每两天测定裸鼠的体重以及肿瘤的长和宽，用公式V＝a²×b/2(其中a为宽，b为长，单位：mm)计算肿瘤的体积，用公式RTV＝V_X/V₁将不同组肿瘤大小标准化，其中RTV为相对肿瘤体积，V_X为第X天时测量的肿瘤体积，V₁为治疗第一天测量的肿瘤体积。用抑瘤率IR来评价联苯双酯的作用，IR＝(对照组RTV的平均值-治疗组RTV的平均值)/对照组RTV的平均值×100％。具体结果见表5和图4。

表5.给药第16天联苯双酯对VCR对KB以及KBv200移植性肿瘤抑制作用的影响

                         体重增组别                         加百分             IR(％)

                         率(％)       KB肿瘤   KBv200肿瘤空白对照                     6.6          -        -仅给联苯双酯500mg/Kg         18.2         14.5     17.6仅给VCR组                    3.5          39.2^a   1.0VCR+聚乙二醇400              0.0          37.9^a   3.1VCR+联苯双酯150mg/Kg         2.4          49.6^b   19.1VCR+联苯双酯300mg/Kg         8.6          47.8^a   36.1^*VCR+联苯双酯500mg/Kg        -3.1          57.9^b   47.5^**与KBv200移植性肿瘤空白对照相比，^*：P＜0.05；^**：P＜0.01与KB移植性肿瘤空白对照相比，^a：P＜0.05；^b：P＜0.01

Claims (5)

1.联苯双酯在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，联苯双酯与抗肿瘤药物联用。

3.根据权利要求2的用途，其特征在于，所述的抗肿瘤药物包括为P-gp底物的抗肿瘤药物。

4.根据权利要求3的用途，其特征在于，所述的P-gp底物的抗肿瘤药物包括蒽环类、长春碱类、紫杉烷类、鬼臼类，以及米托蒽醌、放线菌素D、丝裂霉素C。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤包括具有P-糖蛋白过度表达的内在多药耐药性以及获得多药耐药性实体肿瘤和血液系统肿瘤。

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