CN1428432A - 用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用 - Google Patents

用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1428432A
CN1428432A CN 02152034 CN02152034A CN1428432A CN 1428432 A CN1428432 A CN 1428432A CN 02152034 CN02152034 CN 02152034 CN 02152034 A CN02152034 A CN 02152034A CN 1428432 A CN1428432 A CN 1428432A
Authority
CN
China
Prior art keywords
yeast
chs2
chitin synthetase
gene
chs1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 02152034
Other languages
English (en)
Inventor
陈志仕
刘阳
杨杏
徐涛
张文庆
钟英长
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen University filed Critical Sun Yat Sen University
Priority to CN 02152034 priority Critical patent/CN1428432A/zh
Publication of CN1428432A publication Critical patent/CN1428432A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用。本发明采用PCR基因阻断技术阻断酵母(W303)的几丁质合成酶基因CHS2,获得重组酵母(⊿CHS2);在酵母(⊿CHS2)中整合表达果蝇几丁质合成酶基因,再阻断该酵母的几丁质合成酶基因CHS1,获得重组酵母(⊿CHS2,⊿CHS1,DmCS-1+)。由酵母A(W303)、酵母B(⊿CHS2)和酵母C(⊿CHS2,⊿CHS1,DmCS-1+)一起组成本发明酵母模型。该酵母模型可用于筛选抑制昆虫几丁质合成酶的物质。其所筛选的活性物质靶标专一,选择性和灵敏度高,能有效检测出不同来源的、传统筛选方法难以检测到的低浓度的抑制昆虫几丁质合成酶活性物质。筛选出来的活性物质可以开发为新型高效、高选择性杀虫剂。

Description

用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用
                                    技术领域
本发明涉及一种用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法,以及利用该酵母模型筛选抑制昆虫几丁质合成的活性物质的方法。
                                    背景技术
传统杀虫剂的筛选思路是先筛选对昆虫有毒性的化合物,然后确定其作用靶点。这种筛选方法的缺陷性是比较盲目,筛选得到的化合物往往对人畜毒性大,容易污染环境,而且研发周期长、成本高。作用于昆虫特有的代谢途径(如几丁质合成酶)的生物农药被称为“二十一世纪农药”,对环境和人畜非常安全,是新型生物农药的研发热点。近年来,虽然该领域获得了一些可喜的研究成果,但由于受到筛选方法落后的制约,没有取得突破性的进展。因此,筛选新型杀虫剂的关键是建立一套快速有效的筛选方法。
几丁质是NDP-乙酰氨基葡萄糖(NDP-GlcNAc)的聚合物。几丁质是昆虫表皮(外骨骼)的主要成分,也是许多昆虫肠道表皮的重要成分。任何干扰昆虫几丁质合成的物质都会对昆虫的生长和发育产生剧烈的影响。几丁质合成酶(NDP-GlcNAc转移酶,E2.4.1.16)是催化生成几丁质聚合反应的关键酶。近年来,干扰几丁质合成途径是新型生物农药研发的热点,取得了一些研究成果。苯甲酰基苯基脲类即除虫脲是最为成功的例子。但是除虫脲只是偶然发现的,而且没有直接作用在几丁质合成酶上,更多是全身性的影响。其他作用于这个位点的化合物如尼可霉素和Polyxin等,普遍药效比较低且容易产生抗、耐药性。因此目前迫切需要筛选作用于昆虫几丁质合成酶的新化合物。
迄今已克隆了果蝇等少数模式昆虫的几丁质合成酶基因,但对昆虫几丁质合成酶缺乏系统的研究,酶促反应机理尚不清楚。几丁质也是真菌细胞壁的主要组成成分。相比昆虫,真菌的几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)研究得比较深入。已经在真菌中分离到6种几丁质合成酶的同功酶,其中CHS1、CHS2、CHS3比较普遍。也已经克隆了部分真菌的几丁质合成酶的基因。在酿酒酵母中有CHS1、CHS2和CHS3三种同功酶,每个酶具有不同的功能和位点,其中CHS1和CHS3同时缺陷会引起酵母细胞的死亡。CHS3催化大部分的几丁质的合成。研究表明,昆虫和酵母几丁质合成酶的不同之处主要是C-端和N-端的氨基酸残基变化,而催化域的氨基酸残基同源性非常高。昆虫和酵母几丁质合成酶体外酶促反应要求的条件基本一致,且底物与产物相同。
                                    发明内容
本发明的目的是提供一种用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法,以及应用该酵母模型筛选抑制昆虫几丁质合成的活性物质。筛选出来的活性物质可以开发为新型高效、高选择性昆虫生长调节剂。
本发明的用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型由指示菌酵母A(W303)、酵母B( CHS2)和酵母C( CHS2,
Figure A0215203400053
CHS1,DmCS-1+)三种不同基因型的酵母组成。
其中,指示菌酵母A是现有酵母(W303);指示菌酵母B( CHS2)是阻断酵母几丁质合成酶CHS2基因的基因工程菌酵母(
Figure A0215203400055
CHS2);指示菌酵母C( CHS2,
Figure A0215203400057
CHS1,DmCS-1)是整合表达昆虫几丁质合成酶催化域和阻断酵母几丁质合成酶CHS1基因的基因工程菌酵母(
Figure A0215203400058
CHS2,
Figure A0215203400059
CHS1,DmCS-1+)。
本发明的用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型的构建方法包括:
1.用现有的PCR基因阻断技术阻断酵母(W303)的几丁质合成酶基因CHS2(genebank序列号:M23865,网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),获得重组子酵母( CHS2)。
具体方法是:用PCR方法扩增酵母几丁质合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段,大小为100到500。通过PCR融合或者用酶切连接,将酵母几丁质合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段分别与选择标记基因融合,产生两段融合DNA。采用PEG转化法、电转化法或者CaCl2转化法等合适的方法,将上述两个融合片段转化酵母(W303)感受态细胞。在选择性平板上筛选目的重组子,即酵母的几丁质合成酶基因CHS2编码区大部分被选择标记基因取代的重组子。这些重组子CHS2被阻断,不能合成CHS2。通过PCR或者采用其他方法如Northern杂交来鉴定重组子。
2.在酵母( CHS2)中整合表达果蝇几丁质合成酶基因,得到重组子酵母(
Figure A02152034000512
CHS2,DmCS-1+):再采用现有的PCR基因阻断技术阻断该酵母(
Figure A02152034000513
CHS2,DmCS-1+)的几丁质合成酶基因CHS1(genebank序列号:M14045,网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/);获得重组子酵母( CHS2,
Figure A02152034000515
CHS1,DmCS-1+)。
昆虫和酵母几丁质合成酶的不同之处主要是C-端和N-端的氨基酸残基变化,而催化域的氨基酸残基同源性非常高。几丁质合成酶C-端和N-端的氨基酸序列主要功能是酶的定向运输。在昆虫中几丁质合成酶的表达和运输中有组织专一性,而酵母只是单细胞无组织。因此用昆虫的几丁质合成酶取代酵母的几丁质合成酶的功能,只需要用昆虫几丁质合成酶催化域替换酵母的几丁质合成酶的催化域。这样既可以实现催化功能,又能让杂合的几丁质合成酶运输到合适的位置。因此,酵母(
Figure A02152034000516
CHS2,
Figure A02152034000517
CHS1,DmCS-1+)具体方法可以是:
(1).果蝇几丁质合成酶基因的催化域是由其编码序列的第一个外显子编码的。用PCR方法扩增果蝇几丁质合成酶基因DmCS-1(genebank序列号:AF227729,网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的催化域编码序列。用PCR方法扩增酵母几丁质合成酶(CHS1)的催化域上游的编码序列和催化域下游的编码序列。通过PCR融合或者用酶切连接等方法,将CHS1催化域上游的编码序列、果蝇几丁质合成酶基因的催化域编码序列、CHS1催化域下游的编码序列按顺序连接起来。连接产物克隆到整合型表达载体,得到果蝇几丁质合成酶的整合表达载体(含有杂合几丁质合成酶基因的表达载体),并在大肠杆菌中增殖。用内切酶(位点在CHS1的催化域上游的序列内,至少离起始碱基100bp)线性化含有杂合几丁质合成酶基因的表达载体,转化酵母( CHS2)的感受态细胞。在选择性平板上筛选目的重组子。通过PCR或者采用其他方法如Northern杂交来鉴定重组子。获得重组子酵母(
Figure A0215203400061
CHS2,DmCS-1+)。
(2).采用与上述步骤1阻断CHS2一样的方法,用PCR基因阻断技术,阻断酵母(
Figure A0215203400062
CHS2,DmCS-1+)的几丁质合成酶基因CHS1;不同之处是来自酵母的两个片段是几丁质合成酶基因CHS1保守域的5’端和3’端片段。获得重组子酵母( CHS2,
Figure A0215203400064
CHS1,DmCS-1+)。
3.由现有野生型酵母(W303)与上述获得的重组子酵母(
Figure A0215203400065
CHS2)和酵母(
Figure A0215203400066
CHS2, CHS1,DmCS-1+)作为指示菌,构成本发明的用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型。
上述构建的本发明酵母模型可用于筛选抑制昆虫几丁质合成酶的活性物质,包括抑制昆虫几丁质合成酶的物质(化合物)和能产生抑制昆虫几丁质合成酶活性物质的微生物。抑制昆虫几丁质合成酶的活性物质可以开发为新型昆虫生长调节剂,用于害虫的防治。
应用本发明酵母模型筛选抑制昆虫几丁质合成酶的活性物质的具体方法是:
同时以酵母A(W303)、酵母B( CHS2)、酵母C(
Figure A0215203400069
CHS2, CHS1,DmCS-1+)作为指示菌,以已知的几丁质合成酶抑制剂为正对照;分别将正对照抑制剂和供试物质加入培养有指示菌的细胞培养板,继续培养一段时间;根据指示菌生长状况,按以下筛选供试物质:如果供试物质与正对照抑制剂一样只抑制酵母C的生长,对酵母A和酵母B没有抑制作用,说明供试物质能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性,可以用于开发为昆虫生长调节剂;如果供试物质同时抑制酵母C和酵母B的生长,对酵母A没有抑制作用,说明供试物质不但能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性也能抑制酵母几丁质合成酶的活性,可以用于开发为杀菌剂或者杀虫剂。
应用本发明酵母模型筛选产生抑制昆虫几丁质合成酶的活性物质的微生物的具体方法是:
同时以酵母A(W303)、酵母B(
Figure A02152034000611
CHS2)、酵母C(
Figure A02152034000612
CHS2,
Figure A02152034000613
CHS1,DmCS-1+)作为指示菌,以已知的几丁质合成酶抑制剂为正对照,以供试微生物培养物上清液为供试物质;分别将正对照抑制剂和供试物质加入培养有指示菌的细胞培养板,继续培养一段时间;根据指示菌生长状况,按以下筛选供试物质:如果供试物质与正对照抑制剂一样只抑制酵母C的生长,对酵母A和酵母B没有抑制作用,说明供试微生物能产生抑制昆虫的几丁质合成酶的活性物质,可以用于开发生产昆虫生长调节剂;如果供试物质同时抑制酵母C和酵母B的生长,对酵母A没有抑制作用,说明供试微生物产生的活性物质不但能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性也能抑制酵母几丁质合成酶的活性,可以用于开发生产杀菌剂或者杀虫剂
本发明用昆虫几丁质合成酶基因取代酵母的几丁质合成酶基因,在酵母中表达昆虫几丁质合成酶满足酵母几丁质合成的需要;构建了以昆虫几丁质合成酶为靶标的酵母筛选模型;并应用该模型建立了一种新的昆虫几丁质合成酶抑制剂筛选方法;该方法是一种新型生物农药筛选方法,其所筛选的活性物质靶标非常专一,具有高度选择性;克服了传统筛选方法靶标比较盲目,筛选的化合物往往对人畜毒性大和容易污染环境,而且研发周期长、成本高的缺点;同时与传统的筛选方法相比,本方法对活性物质更为灵敏,能有效的检测出不同来源的、传统筛选方法难以检测到的低浓度的抑制昆虫几丁质合成酶活性物质。这些活性物质可以开发为具有高度选择性的新型生物农药,用于害虫防治。
以下通过附图和实施例对本发明作进一步说明。
                           附图说明
图1是果蝇几丁质合成酶的整合表达载体的结构示意图;
图2是用酵母模型筛选产抑制昆虫几丁质合成酶活性物质的微生物的流程图。
                        具体实施方式实施例1:构建筛选昆虫几丁质合成酶抑制的酵母模型
1.采用PCR基因阻断技术阻断酵母(W303)的几丁质合成酶基因CHS2,构建酵母(
Figure A0215203400071
CHS2)
以酵母(W303)的DNA为模板,用引物1和2扩增出几丁质合成酶基因CHS2 5’端片段。PCR反应体系包括20ng酵母DNA,5μM引物1、2各1μl,5μl 10倍PCR缓冲液,5μl 2mMdNTPs,1U pfu酶,加双蒸水至50μl。反应程序为94℃变性4分钟,接着30个温度循环(94℃1分钟,55℃30秒,72℃2分钟),再72℃8分钟,最后保持在4℃。
以酵母(W303)的DNA为模板,用引物3和4扩增出几丁质合成酶基因CHS2 3’端片段。PCR反应体系和反应程序与扩增几丁质合成酶基因CHS2 5’端片段一样。
以质粒Ycp50的DNA为模板用引物5和6扩增出选择标记基因URA3编码DNA。PCR反应体系包括20ng Ycp50,5μM引物5、6各1μl,5μl10倍PCR缓冲液,5μl2mMdNTPs,1U pfu酶,加双蒸水至50μl。反应程序为94℃变性4分钟,接着30个温度循环(94℃1分钟,52℃30秒,72℃2分钟),再72度8分钟,最后保持在4℃。用低熔点琼脂糖电泳回收PCR产物。
将CHS2 5’端片段和选择标记基因URA3编码DNA混合,先在65℃下进行融合,作为模板,用引物1和引物6进行融合扩增。PCR反应体系包括两个DNA片段各20ng,5μM引物1、6各1μl,5μl10倍PCR缓冲液,5μl2mMdNTPs,1U Taq酶,加双蒸水至50μl。反应程序与扩增几丁质合成酶基因CHS2 5’端片段,用低熔点琼脂糖电泳回收PCR产物。
用CHS2 5’端片段和选择标记基因URA3编码DNA PCR融合的方法,将CHS2 3’端片段和选择标记基因URA3编码DNA融合。
用PEG转化法将上述两个融合PCR产物转化感受态酵母细胞。用选择性平板上筛选目的重组子(URA+
Figure A0215203400072
CHS2),即酵母的几丁质合成酶基因CHS2编码区大部分被选择标记基因取代的重组子。这些重组子CHS2被阻断,不能合成CHS2。
重组子鉴定采用PCR方法。以重组子的DNA为模板,用引物5和6作为特异性引物进行PCR反应。PCR条件和程序和扩增选择标记基因URA3一样。用琼脂糖电泳检测PCR产物,如果有目的带,就说明是目的重组子。
选择标记基因的重组消除。因为选择标记基因URA3的两端有添加的100bp的同向重复序列,相对容易发生重组(10-4-10-5),从而丢失选择标记基因URA3。这种重组子(URA-CHS2)用含有5-FOA的培养基筛选到。
最后获得重组子酵母(URA-
Figure A0215203400074
CHS2)。
2.构建酵母( CHS2, CHS1,DmCS-1+
(1).酵母(URA-
Figure A0215203400081
CHS2)中整合表达果蝇几丁质合成酶基因的催化域
果蝇几丁质合成酶基因的催化域是由其编码序列的第一个外显子编码的。设计引物7(5’端有内切酶SacI酶切位点)和引物8(5’端有内切酶NruI酶切位点)用于扩增果蝇几丁质合成酶基因的催化域。设计引物9和10用于扩增酵母几丁质合成酶CHS1的催化域上游的序列,包括部分启动子序列。其中引物10含有与引物7一样的内切酶位点SacI,引物9含有与载体相连的内切酶位点BglII。设计引物11与12用于扩增酵母几丁质合成酶CHS1的催化域下游的序列,包括终止子序列。其中引物11含有与引物8一样的内切酶位点NruI,引物12含有与载体相连的内切酶位点SalI。
以果蝇DNA为模板,用引物7和8扩增果蝇几丁质合成酶基因的催化域,PCR反应条件如下:PCR反应体系包括模板DNA20ng,5μM引物5、4各1μl,5μl10倍PCR缓冲液,5μl2mM dNTPs,IU Taq酶,加双蒸水至50μl。反应程序为94℃变性4分钟,接着30个温度循环(94℃1分钟,50℃30秒,72℃2分钟),再72℃8分钟,最后保持在4℃。以酵母DNA为模板,用引物9和10扩增CHS1的催化域上游的序列,用引物11和12扩增CHS1的催化域下游的序列。PCR反应条件与扩增果蝇几丁质合成酶基因的催化域的PCR反应条件一样。用内切酶消化上述PCR产物,然后用T4连接酶连接。以连接产物为模板,用引物9和12扩增杂合DNA。用琼脂糖电泳回收PCR产物。
用BglII和NmI双酶切回收的PCR产物,用T4连接酶连接到酵母质粒pPICaBglII和NruI双酶切的大片段上,转化大肠杆菌DH5α。挑选转化子,培养提取质粒,得到的质粒即为含有杂合几丁质合成酶基因的表达载体,命名为DmCS-1 Expresion,其结构如图1所示。用内切酶AvaII线性化该表达载体。采用PEG转化法转化感受态酵母细胞( CHS2)。在含有抗生素ZeocinTM的选择性平板上筛选目的重组子。通过PCR方法鉴定重组子。获得重组子酵母(
Figure A0215203400083
URA-
Figure A0215203400084
CHS2,DmCS-1+)。
(2).采用PCR基因阻断技术阻断酵母( CHS2,DmCS-1+)的几丁质合成酶基因
设计引物13和14扩增酵母几丁质合成酶基因CHS1保守域5’端。引物13的5’端20个碱基与选择标记基因URA3的3’端20个碱基互补。设计引物15和16扩增酵母几丁质合成酶基因CHS1保守域3’端。引物15的5’端与选择标记基因URA3的5’端20个碱基互补。
以上述(1)所得到的酵母(URA-CHS2,DmCS-1+)的DNA为模板,用引物13和14扩增出几丁质合成酶基因CHS1保守域5’端片段。用引物15和16扩增出几丁质合成酶基因CHS1保守域3’端片段。以酵母穿梭质粒Ycp50或者其他含有选择标记基因的DNA为模板,用引物5和6扩增出选择标记基因URA3编码DNA。用琼脂糖电泳方法回收PCR产物。
将上述回收的PCR产物中的几丁质合成酶基因CHS1保守域5’端片段和选择标记基因编码DNA混合,先在65℃下进行融合,作为模板,然后加入引物13和引物6以及其他PCR反应需要的试剂,进行融合PCR反应。PCR产物为几丁质合成酶基因CHS1保守域5’端片段和选择标记基因编码DNA的融合DNA片段。用琼脂糖电泳方法回收PCR产物。采用同样的方法,PCR融合回收的PCR产物几丁质合成酶基因CHS1保守域3’端片段和选择标记基因URA3编码DNA。
采用PEG转化法,将上述两个融合片段转化感受态酵母细胞(URA3+
Figure A0215203400087
CHS2,DmCS-1+)。在选择性平板上筛选目的重组子(URA+),即酵母的几丁质合成酶基因CHS1保守域编码区大部分被选择标记基因取代的重组子。这些重组子CHS1保守域被阻断,不能合成有功能的CHS1。通过PCR方法鉴定重组子。获得重组子酵母(URA+CHS2, CHS1,DmCS-1+)。
本实施例中所用到的各引物如下:
    引物1:AGGACTCTCCCTTGGGATG
    引物2:CTGGACCTTGAACGACAAT
    引物3:ATCATTACGACCGAGATTCC
    引物4:GGGTTTCAATTCAATTCATCA
    引物5:TTGTTACTGGGCTGTTGCT
    引物6:GGAATCTCGGTCGTAGTAATGATGCTAACAGCAACTCTCGGT
    引物7:TGATGAATTGAATTGAAACCCGCTGGGGTGATAGATGGTA
    引物8:AGCAACAGCCCAGTAACAATCTCATTGCTCTCCACCTAT
    引物9:AGATCTTCAGTAAGACGCTATTGGAC
    引物10:GGATCCCCATCTTCTGTAGTATTAATCTTA
    引物11:GCTAACAGCAACTCTCGGT
    引物12:TTGTTACTGGGCTGTTGCT
    引物13:ACCGAGAGTTGCTGTTAGCCTTAGTAATGCTAGCGAGCG
    引物14:AGCAACAGCCCAGTAACAAGTCCGTCATATTCCTGTGGC
    引物15:AGATCTCGGGGGAGCGCATACTTTAA
    引物16:GAGCTCCATTGTATAGTTTTTTTGGT
本实施例中所用PEG转化法的具体操作步骤及条件如下:
接种5ml液体YPAD,30℃下振荡过夜。计数过夜培养物细胞密度,以最终5×106个/ml的细胞密度接种YPAD培养液。置30℃,200r/min振荡培养至2×107个细胞/ml。2500r/min离心5min,收获细胞。弃培养液,把细胞悬浮在25ml无菌水中,同上离心。弃水,把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中,转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。高速离心沉淀细胞,吸出醋酸锂。悬浮细胞到最终500μl。将1ml单链担体DNA煮沸5min,快速在冰水中冷却。振荡细胞悬浮液,取50μl样品加到标记的离心管中,离心沉淀细胞,除去醋酸锂。小心按下列顺序加入下列转化混合液:
        240μl PEG(50%w/v),
        36μl  1.0mol/L醋酸锂,
        25μl  单链载体DNA(2.0mg/ml),
        50μl  水和质粒DNA(0.1-10μg);剧烈振荡反应管直到细胞完全混匀,置30℃保温30min。置42℃水浴中热激20-25min。8000r/min离心15秒,除去转化混合液。吸0.2-1.0ml无菌水加到每个反应管中,悬浮沉淀,用等份的200μl转化混合液涂选择平板。
 YPAD培养基:
         酵母粉            10g
         蛋白胨            20g
    葡萄糖        20g
    硫酸腺嘌呤    40mg
    蒸馏水        1000ml
    121℃灭菌15min。
3.将上述获得的重组子酵母(URA-
Figure A0215203400101
CHS2)和酵母(URA+
Figure A0215203400102
CHS2,
Figure A0215203400103
CHS1,DmCS-1+)与现有野生型酵母(W303)一起作为指示菌,构成酵母模型,用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂。实施例2:用酵母模型筛选产抑制昆虫几丁质合成酶活性物质的微生物
(1).用96孔板微量培养供试微生物,培养基(LP)成分为淀粉1%、蛋白胨1%、牛肉膏0.3%。30℃振荡培养72小时,8000r/min离心10分钟。
(2).培养指示菌酵母A(W303)、酵母B(URA-
Figure A0215203400104
CHS2)和酵母C(URA+CHS2, CHS1,DmCS-1+)。培养基(YNP)为1%硫酸铵、1%硫酸钾、0.5硫酸镁、0.05硫酸钙、0.5%磷酸氢二钾、0.8%磷酸二氢钾和0.02%YPN溶液。30℃振荡培养至OD610为2-4时,加入96孔板,每个孔加100μl。
(3).在有指示酵母的96孔板中加微量(每个孔30μl)上述(1)培养的供试微生物上清液(供试物质),以10uM尼可霉素作正对照,培养12小时,用酶标仪测定OD610。如果供试物质和尼可霉素一样只抑制酵母C的生长,对酵母A和酵母B没有抑制作用,说明供试物质能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性,即供试微生物能产生抑制昆虫的几丁质合成酶的活性物质;如果供试物质同时抑制酵母C和酵母B的生长,对酵母A没有抑制作用,说明供试物质(供试微生物产生的活性物质)可能不但能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性也能抑制酵母几丁质合成酶的活性。整个流程如图2所示。实施例3:用酵母模型筛选抑制昆虫几丁质合成酶的化合物
(1).用培养基(YNP)培养指示菌酵母A、酵母B和酵母C。方法和条件与实施例2步骤(2)相同。
(2).在有指示酵母的96孔板中加50ppm对硫磷、10uM尼可霉素(每个孔30μl),培养12小时,用酶标仪测定OD610。尼可霉素只抑制酵母C的生长,对酵母A和酵母B没有抑制作用,说明尼可霉素抑制昆虫的几丁质合成酶的活性。酵母C、酵母A和酵母B都不受对硫磷抑制,说明对硫磷杀虫的活性是作用在其他的靶标。

Claims (9)

1.用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型,由指示菌酵母A(W303)、酵母B( CHS2)和酵母C(
Figure A0215203400022
CHS2, CHS1,DmCS-1+)三种不同基因型的酵母组成。
2.根据权利要求1所述的酵母模型,其特征是:其中所说的指示菌酵母A(W303)A是现有酵母(W303);指示菌酵母B(
Figure A0215203400024
CHS2)是阻断酵母几丁质合成酶CHS2基因的基因工程菌酵母( CHS2);指示菌酵母C( CHS2,
Figure A0215203400027
CHS1,DmCS-1+)是整合表达昆虫几丁质合成酶催化域和阻断酵母几丁质合成酶CHS1和CHS2基因的基因工程菌酵母( CHS2,
Figure A0215203400029
CHS1,DmCS-1+)。
3.权利要求1所述酵母模型的构建方法,包括:
(1).用现有的PCR基因阻断技术阻断酵母(W303)的几丁质合成酶基因CHS2,获得重组子酵母( CHS2);
(2).在(1)获得的酵母(
Figure A02152034000211
CHS2)中整合表达果蝇几丁质合成酶基因,得到重组子酵母(
Figure A02152034000212
CHS2,DmCS-1+);再采用现有的PCR基因阻断技术阻断该酵母(
Figure A02152034000213
CHS2,DmCS-1+)的几丁质合成酶基因CHS1,获得重组子酵母( CHS2, CHS1,DmCS-1+):
(3).将现有酵母(W303)与上述获得的重组子酵母(
Figure A02152034000216
CHS2)和酵母(
Figure A02152034000217
CHS2, CHS1,DmCS-1+)一起作为指示菌,构成用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型。
4.按照权利要求3所述的方法,其特征是构建酵母( CHS2)的具体方法是:
用PCR方法扩增酵母几丁质合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段,大小为100到500;通过PCR融合或者用酶切连接,将酵母几丁质合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段分别与选择标记基因融合,产生两段融合DNA;将上述两个融合片段转化酵母(W303)感受态细胞;在选择性平板上筛选酵母的几丁质合成酶基因CHS2编码区大部分被选择标记基因取代的重组子;通过PCR或者Northern杂交鉴定重组子,获得重组子酵母(
Figure A02152034000220
CHS2)。
5.按照权利要求3所述的方法,其特征是构建酵母( CHS2,
Figure A02152034000222
CHS1,DmCS-1+)的具体方法是:
(1).用PCR方法扩增果蝇几丁质合成酶基因DmCS-1的催化域编码序列;用PCR方法扩增酵母几丁质合成酶CHS1的催化域上游的编码序列和催化域下游的编码序列;通过PCR融合或者用酶切连接方法,将CHS1催化域上游的编码序列、果蝇几丁质合成酶基因的催化域编码序列、CHS1催化域下游的编码序列按顺序连接起来;连接产物克隆到整合型表达载体,得到含有杂合几丁质合成酶基因的表达载体;用内切酶线性化该含有杂合几丁质合成酶基因的表达载体,转化酵母( CHS2)感受态细胞;在选择性平板上筛选目的重组子;通过PCR或者Northern杂交鉴定重组子,获得重组子酵母( CHS2,DmCS-1+):
(2).用PCR方法扩增酵母几丁质合成酶基因CHS1保守域的5’端和3’端片段,大小为100到500;通过PCR融合或者用酶切连接,将酵母几丁质合成酶基因CHS1保守域的5’端和3’端片段分别与选择标记基因融合,产生两段融合DNA;将上述两个融合片段转化酵母(
Figure A02152034000225
CHS2,DmCS-1+)感受态细胞;在选择性平板上筛选酵母的几丁质合成酶基因CHS1编码区大部分被选择标记基因取代的重组子;通过PCR或者Northern杂交鉴定重组子,获得重组子酵母( CHS2, CHS1,DmCS-1+)。
6.权利要求1或2的酵母模型用于筛选抑制昆虫几丁质合成酶的物质。
7.按照权利要求6所述的应用,其特征是:同时以酵母A(W303)、酵母B(
Figure A0215203400033
CHS2)、酵母C( CHS2, CHS1,DmCS-1+)作为指示菌,以已知的昆虫几丁质合成酶抑制剂为正对照;分别将正对照抑制剂和供试物质加入培养有指示菌的细胞培养板,继续培养一段时间;根据指示菌生长状况,按以下筛选供试物质:如果供试物质与正对照抑制剂一样只抑制酵母C的生长,对酵母A和酵母B没有抑制作用,说明供试物质能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性,可以用于开发为昆虫生长调节剂;如果供试物质同时抑制酵母C和酵母B的生长,对酵母A没有抑制作用,说明供试物质不但能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性也能抑制酵母几丁质合成酶的活性,可以用于开发为杀菌剂或者杀虫剂。
8.按照权利要求6所述的应用,其特征是用所述的酵母模型筛选产抑制昆虫几丁质合成酶活性物质的微生物。
9.按照权利要求8所述的应用,其特征是:同时以酵母A(W303)、酵母B(
Figure A0215203400036
CHS2)、酵母C(
Figure A0215203400037
CHS2,
Figure A0215203400038
CHS1,DmCS-1+)作为指示菌,以已知的昆虫几丁质合成酶抑制剂为正对照,以供试微生物培养物上清液为供试物质;分别将正对照抑制剂和供试物质加入培养有指示菌的细胞培养板,继续培养一段时间;根据指示菌生长状况,按以下筛选供试物质:如果供试物质与正对照抑制剂一样只抑制酵母C的生长,对酵母A和酵母B没有抑制作用,说明供试微生物能产生抑制昆虫的几丁质合成酶的活性物质,可以用于开发生产昆虫生长调节剂;如果供试物质同时抑制酵母C和酵母B的生长,对酵母A没有抑制作用,说明供试微生物产生的活性物质不但能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性,也能抑制酵母几丁质合成酶的活性,可以用于开发生产杀菌剂或者杀虫剂。
CN 02152034 2002-11-25 2002-11-25 用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用 Pending CN1428432A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 02152034 CN1428432A (zh) 2002-11-25 2002-11-25 用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 02152034 CN1428432A (zh) 2002-11-25 2002-11-25 用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1428432A true CN1428432A (zh) 2003-07-09

Family

ID=4752079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 02152034 Pending CN1428432A (zh) 2002-11-25 2002-11-25 用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1428432A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1909779B (zh) * 2003-12-29 2010-05-05 科学与工业研究会 用于筛选神经活性物质及相关神经可塑性的方法
CN101314779B (zh) * 2007-05-30 2011-05-25 哈尔滨师范大学 同化甲醛基因植物表达载体
CN105087630A (zh) * 2015-08-28 2015-11-25 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种靶向真菌细胞壁几丁质合成酶下调剂细胞筛选模型
CN106614793A (zh) * 2016-12-11 2017-05-10 孙祎 一种果树生物杀虫剂的制备方法
CN115747298A (zh) * 2022-10-10 2023-03-07 浙江大学 昆虫烟酰胺酶抑制剂及鉴定方法及用于杀虫剂的用途

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1909779B (zh) * 2003-12-29 2010-05-05 科学与工业研究会 用于筛选神经活性物质及相关神经可塑性的方法
CN101314779B (zh) * 2007-05-30 2011-05-25 哈尔滨师范大学 同化甲醛基因植物表达载体
CN105087630A (zh) * 2015-08-28 2015-11-25 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种靶向真菌细胞壁几丁质合成酶下调剂细胞筛选模型
CN105087630B (zh) * 2015-08-28 2019-01-15 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种靶向真菌细胞壁几丁质合成酶下调剂细胞筛选模型
CN106614793A (zh) * 2016-12-11 2017-05-10 孙祎 一种果树生物杀虫剂的制备方法
CN115747298A (zh) * 2022-10-10 2023-03-07 浙江大学 昆虫烟酰胺酶抑制剂及鉴定方法及用于杀虫剂的用途
CN115747298B (zh) * 2022-10-10 2023-10-27 浙江大学 昆虫烟酰胺酶抑制剂及鉴定方法及用于杀虫剂的用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Okafor et al. Modern industrial microbiology and biotechnology
Bialek et al. Diagnosis and monitoring of murine histoplasmosis by a nested PCR assay
Ge et al. Evaluating viral interference between Influenza virus and Newcastle disease virus using real-time reverse transcription–polymerase chain reaction in chicken eggs
CN104774825B (zh) 腈水解酶突变体及其应用
Kontogiannatos et al. Biomass and cordycepin production by the medicinal mushroom Cordyceps militaris—A review of various aspects and recent trends towards the exploitation of a valuable fungus
CN101809160B (zh) 河豚毒素的生物合成方法
Wang et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia
CN104109666A (zh) 小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用
Liu et al. Genetic diversity, virulence, race profiling, and comparative genomic analysis of the Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans strains infecting cabbages in China
CN109161480A (zh) 拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法
CN107916232A (zh) 重组广谱性绿僵菌及其制备方法和应用
CN104046586B (zh) 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用
Abd Allah AbdAl-Aziz et al. Molecular identification of a novel inulinolytic fungus isolated from and grown on tubers of Helianthus tuberosus and statistical screening of medium components
Zampieri et al. Marker-assisted pyramiding of blast-resistance genes in a japonica elite rice cultivar through forward and background selection
CN1428432A (zh) 用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用
Kim et al. Characterization of nivalenol-producing Fusarium culmorum isolates obtained from the air at a rice paddy field in Korea
CN104745557B (zh) 来源于嗜清洁细小杆菌卤醇脱卤酶突变体及其应用
CN104762242B (zh) 甲羟戊酸的生产菌以及生产甲羟戊酸的方法
CN1284864C (zh) 用于检测梨火疫病菌的一步双重pcr方法
Ogden et al. Residues of the rotavirus RNA-dependent RNA polymerase template entry tunnel that mediate RNA recognition and genome replication
CN1715915A (zh) 一种镰刀菌毒素的分子检测方法
Storfie et al. Fungal pathogen emergence: investigations with an Ustilago maydis× Sporisorium reilianum hybrid
Liu et al. Characterisation of Pythium aristosporum Oomycete—A Novel Pathogen Causing Rice Seedling Blight in China
CN105936911A (zh) 一种定点敲除几丁质合成酶基因的方法
Chen et al. RAPD variation and genetic distances among Tibetan, Inner Mongolia and Liaoning Cashmere goats

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication